Nghiên cứu thành phần hóa học hướng tác dụng chống oxy hóa của lá cây trứng cá (muntingia calabura l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH

-----------------

LÊ THỊ THU HỒNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA
LÁ CÂY TRỨNG CÁ (Muntingia calabura L.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH

-----------------

LÊ THỊ THU HỒNG

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA CỦA

LÁ CÂY TRỨNG CÁ (Muntingia calabura L.)
Ngành: Dược học cổ truyền
Mã số: 8720206

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. VÕ VĂN LẸO

Thành phố Hồ Chí Minh - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng
trình nào khác. Tơi xin cam đoan rằng các thơng tin trích dẫn trong Luận văn đã
được chỉ rõ nguồn gốc.

Lê Thị Thu Hồng


TĨM TẮT
Luận văn thạc sĩ – Khóa 2016-2018
Ngành: Dược liệu- Dược cổ Truyền – Mã số: 8720206
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC HƢỚNG TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA LÁ CÂY TRỨNG CÁ (MUNTINGIA CALABURA L. )
Lê Thị Thu Hồng
Thầy hướng dẫn: TS. Võ Văn Lẹo
Mở đầu và đặt vấn đề:
Trứng c Mungtingia calabura L. à
t c y c nguồn gốc nhiệt ới ch u M . Ở Việt

Nam cây Trứng c ược trồng r ng rãi, phổ biến ở nhiều n i. Thành phần hóa học chính
của cây Trứng cá là flavonoid, methyl gallat, β –sitosterol, stigmasterol[1] và acid hữu c .
Trong y học cổ truyền Việt Nam, lá trứng c ược sắc uống ể lợi kinh và trị các bệnh về
gan[2]. Tuy nhi n cho ến nay ở Việt Na chưa c công bố nào về h a thực vật của c y
này. Do
ề tài này ược thực hiện với mục tiêu chiết xuất, phân lập và x c ịnh cấu
trúc hóa học m t số thành phần c t c dụng chống oxy h a ạnh từ lá Trứng cá
(Muntingia calabura L.).
Đối tƣợng: Lá Trứng cá thu hái tại thành phố Biên Hòa, tỉnh Đồng Nai vào tháng 06/2017.
Phƣơng pháp nghiên cứu:
Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa các cao phận oạn lá Trứng c theo phư ng ph p DPPH.
Sử dụng phư ng ph p chiết ngấm kiệt với cồn 80%, phân bố lỏng – lỏng, sắc ký c t pha
thuận, sắc ký rây phân tử và c c phư ng ph p tinh chế kh c ể phân lập các hợp chất tinh
khiết từ ph n oạn có hoạt tính chống oxy hóa mạnh. X c ịnh cấu trúc của các chất ã
phân lập bằng phư ng ph p phổ học (UV, MS, NMR).
Kết quả và bàn luận
Ở nồng
20 µg/ml, các cao có hoạt tính chống oxy hóa giảm dần từ cao ethyl acetat
(92,09%) > cao nước (79,93 %) > cao cồn 80 (73,85%) > cao cloroform (49,17%) > cao nhexan (28,32%). Từ 10 kg b t dược liệu chiết ngấm kiệt, loại chlorophyll, lắc phân bố
lỏng-lỏng, loại dung ôi thu ược cao n-hexan (8,02 g), cao cloroform (49,06 g), cao ethyl
acetat (261,26 g). Từ 60 g cao ethyl acetat qua quá trình phân lập thu ược 6 flavonoid và
4 hợp chất phenol lần ượt là: kaempferol (42 mg), acid trans-p-coumaric (35 mg), ethyl
gallat (75 mg), quercetin (232 mg), acid gallic (870 mg), tilirosid 6 (91 mg), 6”-O-galloyl
astragalin (42 mg), davidiin (90 mg), chrysin 7-O-β-D-glucosid (4 mg) và isoquercitrin (25
mg). Trong
hợp chất 6”-O-galloyl astragalin, davidiin lần ầu ti n ược phân lập từ loài
M. calabura L.. Acid trans-p-coumaric, tilirosid có hoạt tính chống oxy hóa rất yếu. IC50
của kaempferol (27,41 mol/l), ethyl gallat (8,79 mol/l), quercetin (9,04 mol/l), acid
gallic (9,35 mol/l), 6”-O-galloyl astragalin (9,5 mol/l), davidiin (4,03 mol/l),
isoquercitrin (10,04 mol/l) so với chất ối chiếu acid ascorbic à 24 43 mol/l). Đặc biệt

davidiin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh h n acid ascorbic gấp 6 lần.
Kết luận
Từ cao phận oạn ethyl acetat có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất ã ph n ập ược 10
hợp chất lần ượt là: kaempferol, acid trans-p-coumaric , ethyl gallat, quercetin, acid gallic,
tilirosid, 6”-O-galloyl astragalin, davidiin, chrysin 7-O-β-D-g ucosid và isoquercitrin.
Trong
c 2 hợp chất lần ầu ược phân lập từ lá Trứng c à 6”-O-galloyl astragalin và
davidiin. Các hợp chất ethy ga at quercetin acid ga ic 6”-O-galloyl astragalin, davidiin,
isoquercitrin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh h n acid ascorbic.


ABSTRACT
Master’s thesis – Academic course: 2016 – 2018
Speciality: Pharmacognosy – Traditional Pharmacy Speciality code: 8720206
BIOACTIVITY-GUIDED ISOLATION OF ANTIOXIDANT CONSTITUENTS
FROM THE LEAVES OF MUNTINGIA CALABURA L.
LE THI THU HONG
Supervisors: Dr. VO VAN LEO
Introduction:
Muntingia calabura L. is a native plant of Tropical America. In Vietnam, this plant is grew
everywhere. The main components of leaves are flavonoids, methyl gallat, β –sitosterol,
stigmasterol and organic acids. In Traditional Vietnamese Medicine, Muntingia calabura
L. has been used for it’s ana gesic and hepatoprotective effects. However unti now in
Vietnam there are few reports on this plant. So the thesis was carried out to isolate the
components from leaves of M. calabura which have antioxidant activities on DPPH assay.
Materials: Leaves of Muntingia calabura were collected in Bien Hoa in June, 2017.
Methods:
The antioxidant activities of extracts, fractions and isolated compounds is tested by in-vitro
DPPH assay.
Percolation, liquid-liquid distribution, column chromatography and other purification

methods are used for extracting and separating.
Structure determination was based on UV, MS and NMR spectrometric methods.
Results and Discussion:
Screening to choose the highest antioxidant fraction: at the concentration of 20 μg/
the
antioxidant activities of extracts decrease in order: ethyl acetate (92.09%), water (79.93%),
80% ethanol (73.85%), chloroform (49.17%) and n-hexane extract (28.32%).
Dried leaves of M. calabura (10 kg) were extracted with 80% ethanol (70 L). Solvent was
removed to get the ethanol extract. The extract was diluted and successively partioned with
solvents to obtain n-hexan extract (8.02 g), chloroform (49.06) and ethyl acetate extract
(261.26 g).
From ethyl acetate extract, 6 flavonoids and 4 other phenolic compounds were isolated:
kaempferol, trans-p-coumaric acid, ethyl gallate, quercetin, gallic acid, tiliroside, 6”-Ogalloyl astragalin, davidiin, chrysin 7-O-β-D-g ucoside và isoquercitrin. Among them, for
the first time, 6”-O-galloyl astragalin and davidiin were reported to be constituents of
Muntingia calabura. The IC50 values of isolated compounds in comparison with ascorbic
acid were as follows: kaempferol (27,41 mol/l), ascorbic (24,43 mol/l), isoquercitrin
(10,04  o / 6”-O-galloyl astragalin (9,5 mol/l), gallic acid (9,35 mol/l), quercetin
(9,04 mol/l), ethyl gallate (8,79 mol/l) and davidiin (4,03 mol/l). The antioxidant
activity of davidiin is 6 times higher than ascorbic acid.
Conclutions: 10 compounds: kaempferol, trans-p-coumaric acid, ethyl gallate, quercetin,
gallic acid, tiliroside, 6”-O-galloyl astragalin, davidiin, chrysin 7-O-β-D-glucoside and
isoquercitrin were isolated from the ethyl acetate extract. The compound 6”-O-galloyl
astragalin and davidiin were isolated for the first time from M. calabura L. The antioxidant
activites of ethy ga ate quercetin ga ic acid 6”-O-galloyl astragalin, davidiin and
isoquercitrin are higher than ascorbic acid.


i
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ..................................................... iv

DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ vii
Chư ng 1
1.1 Đặc iể

T NG QU N TÀI LIỆU....................................................................2
thực vật ...............................................................................................2

1.1.1

Vị tr ph n oại ...............................................................................................2

1.1.2

Ph n bố ..........................................................................................................3

1.1.3

Đặc iể

thực vật họ Muntingiaceae ............................................................3

1.1.4

Đặc iể

thực vật của chi Muntingia ............................................................3

1.1.5

Đặc iể

thực vật của oài Muntingia calabura L........................................3

1.2 Thành phần h a học của Muntingia calabura L. ...............................................4
1.3 T c dụng dược

..............................................................................................12

1.3.1

Hoạt t nh chống oxy h a ..............................................................................12

1.3.2

Hoạt t nh g y

1.3.3

Hoạt t nh kh ng khu n .................................................................................14

1.3.4

Hoạt t nh kh ng vi

1.3.5

Tác dụng chống loét, bảo vệ dạ dày ............................................................16

1.3.6

Tác dụng hạ ường huyết trong bệnh tiểu ường........................................17

1.3.7

T c dụng hạ huyết p ...................................................................................17

1.3.8

Tác dụng bảo vệ tim ....................................................................................19

1.3.9

Tác dụng giả

c tế bào ..............................................................................13
..................................................................................15

au ......................................................................................19

1.3.10 Tác dụng bảo vệ gan ....................................................................................20
1.4 Công dụng ........................................................................................................21
1.5 Tổng quan phư ng ph p
x c ịnh hà

nh gi hoạt tính chống oxy hóa ............................21
ượng MDA ......................................................22

1.5.1

Thử nghiệ

1.5.2

Thử nghiệ

nh gi khả năng oại gốc tự do DPPH .................................22

1.5.3

Thử nghiệ

nh gi khả năng chống oxy hóa với hệ thống β-caroten/acid

linoleic 23
1.5.4

Thử nghiệ

activity) 23

nh gi khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating


ii
1.5.5

Thử nghiệ

nh gi khả năng oại gốc superoxyl O2•- (Superoxide anion

scavenging activity assay) .........................................................................................24
1.5.6

Thử nghiệ

nh gi khả năng khử ion sắt III Phư ng ph p FR P –

Ferric ion Reducing Antioxydant Power) .................................................................24
1.5.7

Thử nghiệ

o ường các chất chống oxy hóa bẫy hồn tồn các gốc TRAP

(Total Radical-Trapping Antioxydant Paramether) ..................................................24
1.5.8

Thử nghiệ

o khả năng hấp thụ gốc oxy ORAC (Oxygen Radical

Absorbance Capacity) ...............................................................................................25
Chư ng 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................26

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..........................................................................26
2.1.1

Nguyên liệu..................................................................................................26

2.1.2

Dung môi và hóa chất ..................................................................................26

2.1.3

Dụng cụ, trang thiết bị .................................................................................26

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................27
2.2.1

Nghiên cứu thực vật học ..............................................................................28

2.2.2

Thử tinh khiết ..............................................................................................28

2.2.3

X c ịnh chất chiết ược trong dược liệu....................................................28

2.2.4

Ph n t ch s b thành phần hóa thực vật .....................................................29

2.2.5

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các cao lá Trứng cá bằng phư ng

pháp DPPH ................................................................................................................29
2.2.6

Chiết cao toàn phần và t ch cao ph n oạn bằng chiết phân bố lỏng - lỏng...
.....................................................................................................................31

2.2.7

Phân lập và tinh chế các chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa. ...............32

2.2.8

X c ịnh cấu trúc của hợp chất phân lập ược. ...........................................33

2.2.9

X c ịnh khả năng chống oxy hóa của các chất tinh khiết..........................34

Chư ng 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU................................................................36

3.1 NGHIÊN CỨU THỰC VẬT HỌC ..................................................................36
3.1.1

Đặc iểm hình thái lá Trứng cá ...................................................................36

3.1.2

Đặc iểm vi phẫu của lá Trứng cá ...............................................................36

3.1.3

Soi b t lá Trứng Cá .....................................................................................39

3.2 THỬ TINH KHIẾT ..........................................................................................40
3.2.1

X c ịnh

m ............................................................................................40


iii
3.2.2

X c ịnh

tro ............................................................................................40

3.3 HÀM LƯỢNG CHẤT CHIẾT ĐƯỢC TRONG LÁ TRỨNG CÁ .................41
3.4 NGHIÊN CỨU HÓA HỌC ..............................................................................41
3.4.1

Ph n t ch s b thành phần hóa thực vật .....................................................41

3.4.2

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa của các cao chiết ph n oạn lá Trứng cá

bằng phư ng ph p DPPH ..........................................................................................43
3.4.3

Chiết xuất và thử hoạt tính chống oxy hóa các cao lá .................................45

3.4.4

Phân lập chất từ cao EA ..............................................................................47

3.4.5

Kiể

tra

tinh khiết các chất phân lập ược bằng SKLM .......................58

3.4.6

Kiể

tra

tinh khiết các chất phân lập ược bằng UPLC ........................61

3.4.7

X c ịnh cấu trúc của hợp chất phân lập ược ............................................66

3.5 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CHẤT
TINH KHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP DPPH ...............................................90
3.5.1

Định tính bằng SKLM .................................................................................90

3.5.2

Thử HTCO in vitro của các chất phân lập bằng phư ng ph p DPPH ........90

Chư ng 4

. BÀN LUẬN ....................................................................................92

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................94
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................96
PHỤ LỤC

.........................................................................................................101


iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT

Chữ nguyên

Ý nghĩa

C-Nuclear Magnetic Resonance

C ng hưởng từ hạt nhân 13C

Chữ tắt

1

13

2

1

3

br

broad

Đỉnh r ng

4

d

doublet

Đỉnh ôi

5

DĐVN

Dược iển Việt Nam

6

DEPT

Distortionless Enhancement
Polarization Transfer

7

DMSO-d6

Dimethyl sulfoxxide

8

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

9

GAE

Gallic acid equivalent

10

EA

Ethyl acetat

11

ED50

Effective dose 50%

12

HMBC

Heteronuclear
Correlation

13

HSQC

Heteronuclear
Correlation

14

HTCO

Hoạt tính chống oxy hóa

15

IC50

Inhibitor concentration 50%

Nồng

16

IR

Infrared Spectroscopy

Phổ hồng ngoại

17

J

Coupling constant

Hằng số ghép

18

m

multiplet

Đỉnh phức tạp

19

MBC

Minimum inhibitory concentration

20

MDA

Malonyl dialdehyde

21

MeOH

Methanol

22

MHz

Mega Hertz

23

MS

Phổ khối

24

MIC

Mass Spectroscopy
Minimum inhibitory concentration

25

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

C ng hưởng từ hạt nhân

C-NMR

H-NMR

13
1

C ng hưởng từ hạt nhân
proton

H-Nuclear Magnetic Resonance

Liều hiệu quả 50%

Multiple
Single

by

Bond
Quantum

ức chế 50%


v
STT

Chữ tắt

Ý nghĩa

Chữ nguyên

26

ppm

parts per million

Phần triệu

27

PDA

Photodiode Array

Dãy diod quang

28

s

singlet

Đỉnh

29

SKC

Sắc ký c t

30

SKĐ

Sắc k

31

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

32

t

triplet

33

TLTK

Tài liệu tham khảo

34

TT

Thuốc thử

35

UPLC

Ultra
Performance
Chromatography

36

UV-Vis

Ultraviolet and Visible

Tử ngoại khả kiến

37

VLC

Vacuum liquid chromatography

Sắc ký (c t) chân không

38

VS

Vanilline- sulfuric acid

n

ồ
Đỉnh ba

Liquid

vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. M t số f avonoid ph n ập ược từ Muntingia calabura L. .................................. 5
Bảng 2.1. Cách pha mẫu o của phư ng ph p DPPH ......................................................... 31
Bảng 2.2. Cách pha mẫu o của phư ng ph p DPPH ......................................................... 35
Bảng 3.1. Kết quả thử tinh khiết của b t lá Trứng cá .......................................................... 41
Bảng 3.2. Hà

ượng chất chiết ược của dược liệu lá Trứng cá (%) ................................ 41

Bảng 3.3. Kết quả phân tích s b thành phần hóa thực vật ................................................ 42
Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm HTCO bằng phư ng ph p DPPH tr n c c

ẫu cao lá Trứng

cá (mẫu sàng lọc) ................................................................................................................ 44
Bảng 3.5. Kết quả thử nghiệm HTCO bằng phư ng ph p DPPH tr n c c

ẫu cao lá Trứng

cá (mẫu lớn) ........................................................................................................................ 46
Bảng 3.6. C c ph n oạn của cao E thu ược qua VLC-1................................................ 48
Bảng 3.7. C c ph n oạn của PĐ15 thu ược qua VLC-2 .................................................. 56
Bảng 3.8. Kết quả kiể

tra

tinh khiết Mun-1-10 ............................................................ 59

Bảng 3.9. Kết quả phân tích UPLC của Mun 1-10 .............................................................. 66
Bảng 3.10. So sánh dữ liệu phổ NMR của Mun-1 (DMSO-d6) và kaempferol (DMSO-d6). 68
Bảng 3.11. So sánh dữ liệu phổ NMR của Mun-2 (DMSO-d6) và acid trans- coumaric
(DMSO-d6)........................................................................................................................... 69
Bảng 3.12. So sánh dữ liệu phổ NMR của Mun-3 (DMSO-d6) và ethyl gallat (DMSO-d6)71
Bảng 3.13. So sánh dữ liệu phổ NMR của Mun-4 (DMSO-d6) và quercetin (DMSO-d6) .. 72
Bảng 3.14. So sánh dữ liệu phổ NMR của Mun-5 (DMSO-d6) và acid gallic (DMSO-d6). 74
Bảng 3.15. So sánh dữ liệu phổ NMR của Mun-6 và tilirosid (DMSO-d6)......................... 77
Bảng 3.16. So sánh dữ liệu phổ NMR của 6”-O-galloyl astragalin (DMSO-d6) và Mun-6
(DMSO-d6)........................................................................................................................... 80
Bảng 3.17. So sánh dữ liệu phổ davidiin (DMSO-d6) và Mun-08 (DMSO-d6) ................... 83
Bảng 3.18. So sánh dữ liệu phổ của chrysin 7-O-β-D-glucosid (DMSO-d6) và Mun-09
(DMSO-d6)........................................................................................................................... 86
Bảng 3.19. So sánh dữ liệu phổ NMR của isoquercitrin (DMSO-d6) và Mun-10 (DMSOd6) ......................................................................................................................................... 89
Bảng 3.20. IC50 của Aicd ascorbic, cao EA và các chất phân lập ược .............................. 91
Bảng 5.1. Các chất phân lập ược từ cao ethyl acetat của M. calabura .............................. 94


vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. S

ồ vị tr ph n oại của C y Trứng c

Hình 1.2. Cơng thức h a học

Muntingia calabura L.) ........................ 2

t số f avonoid của M. calabura ........................................ 11

Hình 1.3. Cơng thức hóa học m t số chất phân lập từ M. calabura .................................... 12
Hình 1.4. Phản ứng trung hịa gốc DPPH ............................................................................ 22
Hình 2.1. S

ồ nghiên cứu chung ...................................................................................... 27

Hình 2.2. S

ồ chu n bị mẫu chiết cao lá Trứng cá ........................................................... 30

Hình 3.1. L Trứng cá Muntingia calbura L. Muntigiaceae ............................................... 36
Hình 3.2. Chi tiết vi phẫu cuống
Hình 3.3. Vi phẫu và s

ồ cấu tạo

Trứng c ....................................................................... 37
c y Trứng c ............................................................ 38

Hình 3.4. Cấu tạo giải phẫu lá Trứng Cá ............................................................................. 39
Hình 3.5. Cấu tử có trong b t lá Trứng cá ........................................................................... 40
Hình 3.6. S

ồ chu n bị mẫu thử cao Lá Trứng c

ể thử hoạt tính chống oxy hóa ......... 43

Hình 3.7. SKĐ của c c cao ph n oạn lá Trứng cá với TT DPPH hệ dung môi khai triển
CHCl3 - MeOH (8:2)............................................................................................................ 43
Hình 3.8. Biểu ồ kết quả thử HTCO của c c ph n oạn cao chiết .................................... 44

Hình 3.9. S

ồ chiết phân bố lỏng – lỏng với cao chiết lá Trứng cá ................................. 45

Hình 3.10. SKĐ của c c cao ph n oạn Lá Trứng cá với TT DPPH hệ dung môi khai triển
CHCl3 - MeOH (8:2)............................................................................................................ 46
Hình 3.11. Biểu ồ kết quả thử HTCO của c c ph n oạn cao chiết .................................. 47
Hình 3.12. SKĐ c c ph n oạn của cao EA qua c t VLC-1 hệ dung môi EtOAcbh HCOOH (95:5) .................................................................................................................... 49
Hình 3.13. SKĐ tủa T01 PĐ3 C O E

hệ dung mơi khai triển CHCl3-EtOAc-HCOOH

(2:8:0,5)................................................................................................................................ 50
Hình 3.14. SKĐ của Mun-1, Mun-2 hệ dung mơi khai triển CHCl3-EtOAc-HCOOH
(2:8:0,5)................................................................................................................................ 51
Hình 3.15. SKĐ của Mun-3 PĐ4 cao E

hệ dung mơi khai triển CHCl3-EtOAc-HCOOH

(2:8:0,5)................................................................................................................................ 52
Hình 3.16. SKĐ của Mun-4 PĐ 5 Cao E hệ dung mơi khai triển CHCl3-EtOAc-HCOOH
(2:8:0,5)................................................................................................................................ 52
Hình 3.17. SKĐ của Mun-5 PĐ7 Cao E

hệ dung môi khai triển EtOAcbh-HCOOH (9,5 :

0,5) ....................................................................................................................................... 53
Hình 3.18. SKĐ của Mun-6 PĐ9 Cao E

hệ dung mơi khai triển EtOAcbh-HCOOH (9,5 :

0,5) ....................................................................................................................................... 54


viii
Hình 3.19. SKĐ của Mun-7 PĐ11 Cao E

hệ dung mơi khai triển EtOAcbh-HCOOH (9,5

: 0,5) ..................................................................................................................................... 54
Hình 3.20. SKĐ của Mun-8 PĐ14 Cao E

hệ dung môi khai triển EtOAcbh-HCOOH (9,5

: 0,5) ..................................................................................................................................... 55
Hình 3.21. SKĐ của PĐ 15 sau khi triển khai qua sắc ký c t hệ dung môi khai triển
Cloroform - MeOH - HCOOH (7:3:0,5) .............................................................................. 56
Hình 3.22. Sắc k

ồ của Mun-9 PĐ15C PĐ15 hệ dung môi khai triển CHCl3-MeOH-

HCOOH (8:2:0,5). ............................................................................................................... 57
Hình 3.23. Sắc k

ồ của Mun-10 PĐ15E PĐ15 hệ dung mơi khai triển CHCl3-MeOH-

HCOOH(8:2:0,5). ................................................................................................................ 58
Hình 3.24. S

ồ phân lập các hợp chất từ c c ph n oạn c t VLC ................................... 58

Hình 3.25. Sắc k

ồ kiểm tinh khiết của các chất phân lập ược ...................................... 60

Hình 3.26. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 1 ........................................... 61

Hình 3.27. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 2 ........................................... 62

Hình 3.28. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 3 ........................................... 62

Hình 3.29. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 4 ........................................... 63

Hình 3.30. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 5 ........................................... 63

Hình 3.31. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 6 ........................................... 64

Hình 3.32. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 7 ........................................... 64

Hình 3.33. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 8 ........................................... 65

Hình 3.34. Sắc k

ồ UPLC kiể

tra

tính khiết của Mun 10 ......................................... 65

Hình 3.35 Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-1 ................................ 67
Hình 3.36. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-2 ............................... 69
Hình 3.37. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-3 ............................... 71
Hình 3.38. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-4 ............................... 73
Hình 3.39. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-5 ............................... 74
Hình 3.40. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-6 ............................... 78
Hình 3.41. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-7 ............................... 81
Hình 3.42. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-8 ............................... 83
Hình 3.43. Cơng thức hóa học của khung HHDP ................................................................ 83
Hình 3.44. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-9 ............................... 87
Hình 3.45. Cơng thức hóa học và tư ng t c HMBC ch nh của Mun-10 ............................. 88
Hình 3.46. SKĐ của các chất ược phân lập với TT DPPH ................................................ 90
Hình 3.47. Biểu ồ so sánh IC50 (mol/l) của các mẫu thử theo phư ng ph p DPPH ........ 91

1

MỞ ĐẦU
Xã h i càng hiện ại b n cạnh những

ặt tốt thì con người c ng bị ảnh hưởng của các

iều kiện sống như bị ô nhiễm quá nhiều, stress ối sống t vận
gốc tự do hay tình trạng stress oxy h a”.
trong c thể khi c sự

tr

ng… à

oxy h a” à hiện tượng xuất hiện

ất c n bằng giữa việc sản xuất c c gốc tự do và hoạt

chất chống oxy h a. Điều này à nguy n nh n của nhiều bệnh nguy hiể
ung thư c c bệnh về ti
Parkinson

gia tăng

ạch c c bệnh suy giả

ng của

hiện nay như

về thần kinh

zhei er

ão h a sớ . Việc bổ sung c c chất chống oxy h a từ thi n nhi n à rất cần

thiết. F avonoid à

t trong c c chất chống oxy h a tự nhi n hiệu quả. Ở Việt Na

c rất nhiều c y thuốc chứa f avonoid và c hoạt t nh chống oxy h a. Trong

c c y

Trứng c .
Trứng c

Mungtingia calabura L. à

Việt Na

c y này ược trồng rất phổ biến và chưa c nhiều nghi n cứu về thành phần

h a học t c dụng dược

t c y c nguồn gốc nhiệt ới ch u M . Ở

. Vì vậy ề tài

ghiên cứu thành ph n h a h c hư ng

chống oxy h a của lá Trứng cá (Muntingia calabura L. ” ược tiến hành nhằ
c c

vào

ục ti u sau:

 Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro bằng phư ng ph p

nh bắt gốc tự do DPPH

của các cao ph n oạn từ lá c y Trứng c .
 Ph n ập và x c ịnh cấu trúc của c c hợp chất chính từ cao có tác dụng chống oxy
h a

ạnh qua sàng ọc tr n

ơ hình DPPH.

 Thử hoạt tính chống oxy hóa của chất tinh khiết thu ược sau khi phân lập.


2

Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Đ C ĐIỂM THỰC V T

1.1.1 V t í ph n

i

Theo hệ thống Takhtajan (2009), cây Trứng c có vị trí phân loại ược trình bày ở
s

ồ ở hình 1.1 [45].
Giới Plantae Giới thực vật
Ngành Magnoliophyta Ngành Ngọc lan)
Lớp Magnoliopsida Lớp Ngọc an
Phân ớp Dilleniidae (Phân ớp Sổ)
B Malvales (B Bông)
Họ Muntingiaceae ( Họ Trứng c )
Chi Muntingia
Lồi Muntingia calabura L.
Hình 1.1. Sơ đồ

phân

C

Muntingia calabura L.)

T n Việt na : Trứng c
T n kh c: Mật s

[4]

T n khoa học: Muntingia calabura L. [4]

Họ Muntingaceae có 3 chi: Muntingia, Neotessmannia, Dicraspidia. Muntingia
calabura L. à oài duy nhất thu c chi Muntingia [15].


3
1.1.2 Ph n ố
C y Trứng c c nguồn gốc ở nhiệt ới trung M

Na

M

bắc Mexico. Hiện nay

c y này trồng r ng rãi ở c c v ng nhiệt ới tr n thế giới [27]. Ở Việt Na
Trứng c

ược trồng r ng rãi à

1.1.3 Đặc điể

c y b ng

à ở c y non. Lá:

thân cây có nhiều ơng hình sao ông tiết ặc biệt

ọc c ch thành 2 dãy c cuống gốc phiến

hình ch n vịt

p

răng cưa;

khơng c ở chi Neotessmannia). Hoa:
hoặc thành cụ
ti n khai van

ọc ở những bãi ất hoang.

thực vật h Muntingiac a

C y bụi hoặc c y g nhỏ ến nh
g n

t và hay

c y

k

dạng sợi hoặc

ọc ở n ch

hình ti
àng

ọc ệch

ỏng hình khi n

ph a tr n ngọn cành

ọc

n

vài hoa hoa ều ư ng t nh cuống hoa nhỏ. Đài h a: 4 -5- 7

ều d nh nhau ở

tồn tại. T àng h a: 4 -5- 7

y thành ống hình ch n hoặc dĩa rụng sớ

ều rời tiền khai ợp dài h n

ài

hoặc

ỏng rụng sớ

p c nh hoa ượn s ng. Nh : nhiều nhị chỉ nhị hình sợi rời hoặc gần như vậy bao
phấn 2 ô

nh

y hoặc

nh giữa nứt dọc. ầu nhụ : bầu thượng tới hạ

d nh tạo thành 5 tới nhiều ô thỉnh thoảng

t ô gi

noãn không c

Neotessmannia) dạng th y r xuống dày thỉnh thoảng không c ; ầu nhụy:
c rãnh; noãn: nhiều noãn ngược

noãn

nh noãn trung trụ. Quả:

ở
ập

ọng chứa nhiều hạt

nhỏ [15].
1.1.4 Đặc điể
Lá: L k

thực vật của chi Muntingia
t b n. Hoa

ọc

n

hoặc thành từng cụ

trắng tới hồng bao phấn ph t triển ầy ủ nứt dọc.
c

ế hoa bao quanh. Quả

1.1.5 Đặc điể
C y Trứng c

cả 2
n

ặt; c

r ng 1-6 c
k

hoặc thành cụ

Bầu thượng nhưng

ài Muntingia calabura L.

ph t triển nhanh chiều cao khoảng 3-12

nh nh nhiều t n ngang r ng. Lá

dài 4-15 c

nhụ

àu

ọng [15].

thực vật của
àc yg

vài hoa c nh hoa

n

gốc phiến

ảnh dài 5
2-3 hoa ở n ch

cành ph n

ọc c ch thành 2 hàng hình trứng thuôn dài
ọc ệch

ỉnh nhọn nhiều ông d nh c ở

rụng sớ . Hoa ư ng t nh r ng 2 c
5

ài

àu xanh 5 c nh hoa

hình trứng ngược nhiều nhị chỉ nhị hình sợi bao phấn

ọc

àu trắng

àu vàng bầu nhụy chia 5


4
ô

ầu nhụy chia 5 cạnh tồn tại. Quả

khi non c

àu xanh khi ch n c

ọng hình cầu

àu ỏ

ề

ường k nh khoảng 1-1 5 c

nhiều thịt rất ngọt nhiều hạt nhỏ

àu vàng nhạt [15], [27].

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA MUNTINGIA CALABURA L.
Nă

1990 b o c o ầu ti n ã ph n ập ược 4 f avon từ lá M. calabura. Tiếp

nă

1991, từ dịch chiết

12 f avonoid trong

ethano của rễ M. calabura ở Th i Lan ã ph n ập ược

c 7 f avan 3 f avon và 2 biflavan. Nhiều nghi n cứu sau

ã tiếp tục ph n ập từ c c b phận kh c nhau như

th n quả. Kết quả ã ph n ập

ược nhiều flavonoid kh c khoảng 75 f avonoid ã ược ph n ập chủ yếu à nh
flavan, flavon và cha con [26], [48], [41], [18], [17], [25], [30], [40], [19].
Ngoài f avonoid từ M. calabura ã ph n ập ược c c hợp chất kh c như:
-

Các acid hữu c và dẫn chất: acid linoleic, acid palmitic, acid α-linolenic, acid
3,4,5-trihydroxybenzoic,

acid

2α,3β-dihydroxy-olean-12-en-28-oic,

acid

syringic, acid vanillic, tetracosyl ferulat, methyl 4-hydrobenzoat, acid
isovanillic, p-nitro-phenol, methyl gallat, acid gallic, acid (E)-felluric, transmethyl p-coumarat, acid ellagic, methyl 4-hydroxybenzoat.
-

β-amyrenon, α-tocopherylquion, δ-tocopherol, α-tocospiro A, α-tocospiro B, 3hydroxy-1-(3,5-dimethoxy-4-hydroxyphenyl) propan-1-on 1-tetracosano và 1hexacosanol.

-

C c

steroid:

stigmasterol.

β-sitostenon,

6-β-hydroxystigmast-4-en-3-on,

β–sitosterol,


5
đ

Bảng 1.1.

STT

Năm

1

1990

2

1991

3

1993

Thái Lan

4

2003

Peru

v

m

Ấ đ

Muntingia calabura L.

Lá
Hoa

R

Et2O

Lá
Thân

EA

TL
TK

4’,3,5,7-trihydroxyflavon (Kaempferol,1)
3’,4’,3,5,7-tetrahydroxyflavon (Quercetin,2)
Kaempferol-3-O-β-D-galactosid (3)
Quercetin-O-β-D-galactosid (4)

[5]

(2S)-5’-hydroxy-7,3’,4’-trimethoxyflavan (5)
(2S)-7,8,3’,4’,5’-pentamethoxyflavan (6)
(2S)-2’-hydroxy-7,8,3’,4’,5’-pentamethoxyflavan (7)
(2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-tetramethoxyflavan (8)

(2S)-8-hydroxy-7,3’,4’,5’-tetramethoxyflavan (9)
(2S)-8,2’-dihydroxy-7,3’,4’,5’-tetramethoxyflavan (10)
(2S)-8,5’-dihydroxy-7,3’,4’-trimethoxyflavan (11)
7,8,3’,4’,5’-pentamethoxyflavon (12)
(M),(2S),(2”S)-(P),(2”S),(2S)-8,8”-5’-trihydroxy7,7’,3’,3”’,4’,4”’,5”’-heptamethoxy-5,5”-biflavan (13)
5’-hydroxy-7,8,3’,4’ -tetramethoxyflavon (14)
(M),(2S),(2”S)-(P),(2S),(2”S)-8,8”-5-5”’-tetrahydroxy7’,7”-3’,3”’-4’,4”’-hexamethoxy-5’,5”’-biflavan (15)
8,5’-dihydroxy-7,3’,4’-trimethoxyflavon (16)

[25]

5,7-dihydroxyflavon (chrysin, 17)
2’,4’-dihydroxychalcon (18)
Galangin-3,7-dimethyl ether (19)
8-methoxy-5,7-dihydroxyflavon (20)
Kaempferol 3-O-β-D- 6”-O-(E)-pcoumaroyl)glucopyranosid (Tilirosid, 21)
Kaempferol 7-O-β-D- 6”-O-(E)-p-coumaroyl)
glucopyranosid (Buddlenosid A, 22)

[30]

(2R,3R)-7-methoxy-3,5,8-trihydroxyflavanon (23)
(2S)-7-hydroxyflavanon (24)
(2S)-5,7-dihydroxyflavanon (pinocembrin, 25)
(2R,3R)-3,5,7-trihydroxyflavanon (pinobanksin, 26)
(2S)-5-hydroxy-7-methoxyflavanon (pinostrobin, 27)
7-hydroxyflavon (28)
5,7-dihydroxyflavon (chrysin, 29)
3-methoxy-5,7,4’-trihydroxyflavon (isokaemferid, 30)
3,3’-dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavon (31)

3,8-dimethoxy-5,7,4’-trihydroxyflavon (32)
3,5-dihydroxy-7,4’-dimethoxyflavon (ermanin, 33)
3,5-dihydroxy-7,8-dimethoxyflavon (gnaphaliin, 34)
5-hydroxy-3,7,8-tri-methoxyflavon (35)
5,4’-dihydroxy-3,7,8-dimethoxyflavon (36)
5-hydroxy-3,7,8,4’-tetramethoxyflavon (37)

[40]


6
2’,4’-dihydroxychalcon (38)
4,2’,4’-trihydroxychalcon (isoli-quiritigenin, 39)
7-hydroxyisoflavon (30)
7,3’,4’-tri-methoxyisoflavon (cabreuvin, 41)
(2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-tetramethoxyflavan (4)
2’,4’-dihydroxydihydrochalcon (42)
8-methoxy -3,5,7-trihydroxyflavon (43)
5

CHCl3

8-hydroxy-7,3’,4’,5’-tetramethoxyflavon (44)
8,4’-dihydroxy-7,3’,5’-trimethoxyflavon (45)
6,7-dimethoxy-5-hydroxyflavon (46)
5,7-dimethoxyflavon (47)
3,5-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavon (48)
(2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-tetramethoxyflavan (4)

[19]

CHCl3
nBuOH

(2’,4’-dihydroxy-3’-methoxydihydrochalcon (49)
3’-methoxy-2,’4’, β-trihydroxydihydrochalcon (50)
(2S)-(-)-5’-hydroxy-7,3’,4’-trimethoxyflavanon (51)
8-hydroxy-10-methoxy-5H-isochromenochromen-7on (muntingon, 52)
7-hydroxyflavanon (24)
2’,4’-dihydroxychalcon (38)
6,7-dimethoxy-5-hydroxyflavon (46)
3,5-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavon (48)
5-hydroxy-7-methoxyflavon (53)
3,7-dimethoxy-5-hydroxyflavon (54)
5-hydroxy-3,6,7-trimethoxyflavon (55)
3,5-dihy-droxy-7-methoxyflavon (56)
8-methoxy-3,5,7-trihydroxy-flavon (57)
5,7-dihydroxy-3,8-dimethoxyflavon (58)
3,5,7-trihydroxyflavon (Galangin 59)
Chrysin (17)
7-hydroxy-8-methoxyflavanon (60)
4’-hydroxy-7-methoxyflavanon (61)
2’,4’-dihydroxy-3’-methoxychalcon (62)

[17]

Loan

CHCl3
nBuOH

2,3-dihydroxy-4,3’,4’,5’-tetramethoxydihydrochalcon
(63)
4,2’,4’-trihydroxy-3’-methoxydihydrochalcon (64)
(2R,3R)-(-)-3,5-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavanon (65)
7-methoxyflavon (66)
5,7-dihydroxy-3-methoxyflavon (67),
5,7-dihydroxy-6-methoxyflavon (68)
5,4’-dihydroxy-3,7-dimethoxyflavon (69)
(2S)-7,8,3’,4’,5’-pentamethoxyflavan (2)
(2S)-5’-hydroxy-7,8,3’,4’-tetramethoxyflavan (5)

[18]

Loan

Malaysia

EA

2’,4’-dihydroxychalcon (38)

[41]

2004
Loan

6

7

8

2005

2007

2013

thân


7
5,7-dihydroxy-3,8-dimethoxyflavon (58)
5-hydroxy-3,7-dimethoxyflavon (70)
3,5,7-trihydroxy-8-methoxyflavon (57)
9

2013

10

2014

Malaysia

PE

V
thân

CH2Cl2

8-hydroxy-6-methoxyflavon (calaburon) (71)
5-hydroxy-3,7,8-trimethoxyflavon (35)
3,7-dimethoxy-5-hydroflavon (54)
2’,4’-dihydroxy-3’-methoxychalcon (62)

[48]

(M),(2S),(2”S)-,(P),(2”S),(2S)7,8,3’,4’,5’,7”,8”,3”’,4”’,5”’-decamethoxy-5,5”-biflavan
(72)
4’-hydroxy-7,7,3’,5’-tetramethoxyflavon (73)
(R)-2’,β-dihydroxy-3’,4’-dimethoxydihydrochalcon
(74)
(2S)-7-hydroxy-8-methoxyflavan (75)
(2S)-5’-hydroxy-7,3’,4’-trimethoxyflavan (1)
(2S)-7,8,3’,4’,5’-pentamethoxyflavan (2)
(M),(2S),(2”S)-(P),(2”S),(2S)-8,8”-5’-trihydroxy7,7’,3’,3”’,4’,4”’,5”’-heptamethoxy-5,5”-biflavan (9)
3’,4’,3,5,7-tetrahydroxyflavon (Quercetin,14)
7,8,3’,4’,5’-pentamethoxyflavon (8)
5-hydroxy-7-methoxyflavon (53)
(2S)-7-hydroxyflavanon (24)

[26]

NHÓM FLAVAN
R1

R2

R3

5

H

H

OH

6

OCH3

H

OCH3

7

OCH3

OH

OCH3

8

OCH3

H

OH

9

H

OH

OCH3

10

OH

OH

OCH3

11

OH

H

OH

R1

R2

R3

24

OH

H

H

25

OH

OH

H

27

OH

OCH3

H

75

H

OH

OCH3

NHÓM FLAVANON


8

41
NHÓM FLAVANONOL

R1

R2

R3

23

H

OCH3

OH

26

OH

OH

OH

54

OCH3

OCH3

H

NHÓM BIFLAVAN

R1

R2

13

OH

OCH3

15

OH

OH

72

OCH3

OCH3

NHÓM CHALCON-DIHYDROCHALCON

R1

R2

R3

42

H

H

H

49

H

H

OCH3

50

OH

H

OCH3

64

H

OH

OCH3


9

R1

R2

38

H

H

39

H

OH

62

OH

H

63
NHÓM ISOFLAVON

40

41
NHÓM FLAVON
R1

R2

R3

8

OCH3

OCH3

OCH3

10

OCH3

OCH3

OH

12

OH

OCH3

OH

44

OH

OCH3

OCH3

45

OH

OH

OCH3

R1

R2

R3

46

OH

OCH3

H

47

OCH3

H

H

53

OH

H

H

61

H

H

OH

66

H

H

H


10
R1

R2

28

H

H

29

OH

H

17

H

OCH3

20

OH

OCH3

R1

R2

R3

68

OH

OH

H

71

H

H

OH

36
NHÓM FLAVONOL

R
48

H

55

CH3

R1

R2

R3

R4

01

OH

H

H

OH

02

OH

H

OH

OH

33

OCH3

H

H

OCH3

34

OCH3

OCH3

H

H

56

OCH3

H

H

H

57

OH

OCH3

H

H

59

OH

H

H

H


11
R1

R2

30

OH

31

OH

32

OH

OCH3

35

OCH3

OCH3

37

OCH3

OCH3

54

OCH3

58

OH

67

OH

69

OCH3

70

R3

R4
OH

OCH3

OH
OH

OCH3

OCH3

OH
OCH3

52

03

04

21

22

Hình 1.2 C

M. calabura


12

Acid vanillic

Tetracosyl ferulat

(E)-felluric acid

Acid caffeic

Acid gallic

Acid ellagic

β–sitosterol

Stigmasterol

Hình 1.3. Cơng th c hóa h c m t s chất phân l p t M. calabura

1.3 TÁC DỤNG DƢỢC LÝ
1.3.1 H t tính chống

yh a

Nhiều nghi n cứu ã chứng

inh M. calabura có hoạt tính chống oxy hóa bằng c c

c c phư ng ph p kh c nhau. Ayesha và c ng sự nghiên cứu tác dụng hoạt tính
chống oxy h a theo phư ng ph p DPPH của dịch chiết methanol lá Trứng cá. Giá
trị IC50 của dịch chiết

ethano à 22 µg/ml, so sánh với acid ascorbic (IC50: 12

µg/ml). Tổng ượng pheno
acid ga ic và 2 90

ược tì

thấy trong dịch chiết khoảng 0 903

t nh theo

t nh theo acid tannic [12].

Nghiên cứu khác của Zakaria và c ng sự về hoạt tính chống oxy hóa của các dịch
chiết

ethano nước, cloroform từ lá Trứng cá ở các nồng

bằng phư ng ph p DPPH
chiết

ethano

20, 100, 500 µg/ml

nh bắt gốc superoxid thì với cả hai phư ng ph p dịch

ều cho hoạt tính mạnh nhất (92,1–99,9%; 85,7–89,0%); tiếp theo là