Nghiên cứu chiết xuất hợp chất alkaloid từ rễ trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l amaryllidaceae

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT HỢP CHẤT ALKALOID
TỪ RỄ TRINH NỮ HOÀNG CUNG
CRINUM LATIFOLIUM L. AMARYLLIDACEAE

Mã số: <Mã số đề tài>

Chủ nhiệm đề tài: ThS Lê Ngọc Tú

Tp. Hồ Chí Minh, 14 tháng 9 năm 2018

.


.

MỤC LỤC
1. ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3
2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG .................................... 3
2.1.1 Danh pháp và phân loại [1], [7],[12], [9] ........................................................... 3
2.1.2 Mô tả thực vật [1], [2],[12] ................................................................................. 3
2.1.3 Phân bố địa lý [1] ............................................................................................... 4

2.1.4 Bộ phận dùng [2] ................................................................................................ 5
2.1.5. Thành phần hóa thực vật [1], [3], [17],[20], [24] .............................................. 5
2.1.6 Tác dụng trị liệu.................................................................................................. 5
2.2 ALKALOID ..................................................................................................... 8
2.2.1 Định nghĩa [8], [23] ............................................................................................ 8
2.2.2 Tính chất hóa học [8].......................................................................................... 8
2.2.3 Phân loại alkaloid [8], [31] ................................................................................. 9
2.2.4 Chiết xuất alkaloid [8], [18] ............................................................................. 10
2.2.5 Alkaloid của TNHC[5], [10], [11], [17], [24],[30]. ......................................... 11
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT HÓA HỌC ................. 15
2.3.1 Phương pháp sắc ký để tách các chất tinh khiết [28] ....................................... 15
2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc ........................................................................ 17
3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 19
3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ........................................................................ 19
3.1.1 Nguyên vật liệu................................................................................................. 19
3.1.2 Dung môi .......................................................................................................... 19
3.1.3 Trang thiết bị .................................................................................................... 19
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................. 19
3.2.1 Chiết xuất alkaloid từ cao cồn rễ TNHC .......................................................... 19
3.2.2 Tách các alkaloid bằng phương pháp sắc ký cột nhanh ................................... 21
3.3.3 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ các phân đoạn sắc ký cột ....................... 22
3.3.4 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được .......................................... 22
4. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM ................................................................................ 24
4.1 CHIẾT XUẤT CÁC ALKALOID TỪ CAO CỒN RỄ TNHC ....................... 24
4.2 PHÂN TÁCH CÁC ALKALOID BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ CỘT
NHANH ............................................................................................................... 24

.

.

4.2.1 Chuẩn bị ......................................................................................................... 24
4.2.2 Tiến hành ........................................................................................................ 24
4.2.3 Kết quả ........................................................................................................... 25
4.3 PHÂN LẬP VÀ TINH KHIẾT HÓA CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHÂN
ĐOẠN SẮC KÝ CỘT NHANH ........................................................................... 28
4.3.1 Phân đoạn F2 .................................................................................................. 28
4.3.2 Phân đoạn F4 .................................................................................................. 30
4.3.3 Phân đoạn F5 .................................................................................................. 31
4.3.4 Phân đoạn F6 .................................................................................................. 33
4.4 XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC .................. 37
5. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................................................... 44
5.1 KẾT QUẢ ...................................................................................................... 44
5.2 BÀN LUẬN .................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 45
PHỤ LỤC 1 ......................................................................................................................
PHỤ LUC 2 ......................................................................................................................
PHỤ LỤC 4 ......................................................................................................................
PHỤ LỤC 5 ......................................................................................................................
PHỤ LỤC 6..................................................................................................................................
PHỤ LỤC 7..................................................................................................................................
PHỤ LỤC 8..................................................................................................................................

.


.

1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thời đại mà ngành khoa học dược phẩm phát triển không ngừng, những hướng
nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên hay bán tổng hợp vẫn giữ một vị trí quan trọng.
Đặc biệt, ở những nước đang phát triển như Việt Nam, việc sử dụng phổ biến những
phương thuốc cổ truyền được tạo điều kiện phát triển bởi hiệu quả tốt, giá cả hợp lý và
sự gần gũi với cuộc sống thường ngày.
Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới, Việt Nam sở hữu hệ động thực vật phong phú. Điều
đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu và phát triển các hợp chất thiên nhiên
quý nhằm điều trị các bệnh nan y.
Trong số những cây thuốc đó, Trinh nữ hồng cung (TNHC) từ lâu đã nổi lên như là
một phương thuốc đầy hứa hẹn trong việc điều trị một số bệnh như phì đại tuyến tiền
liệt, u xơ tử cung, u nang buồng trứng,..
Nhờ những tính chất q giá đó, TNHC là mục tiêu của nhiều nghiên cứu, chủ yếu
được thực hiện trên lá, hoa và thân hành. Tuy nhiên, những nghiên cứu các hợp chất
trên rễ vẫn còn hạn chế. Đặc biệt là những hợp chất alkaloid được biết đến với những
tác dụng kháng ung thư, gây độc tế bào,...
Với những lý do nêu trên, đề tài « Nghiên cứu chiết xuất hợp chất alkaloid từ rễ
Trinh nữ hoàng cung Crinum latifolium L. Amaryllidaceae » đã được thực hiện với
những mục tiêu cụ thể như sau:
❖ Rễ TNHC được rửa sạch, phơi khô, xay nhuyễn, ngấm kiệt với cồn 70%, cô thu
hồi cồn thu được cao cồn toàn phần của rễ.
❖ Xây dựng quy trình chiết alkaloid tồn phần từ cao cồn rễ TNHC.
❖ Phân lập các phân đoạn alkaloid từ cao cồn rễ TNHC bằng phương pháp sắc ký
cột nhanh thu được 10 phân đoạn. Các phân đoạn chọn lọc có khối lượng cao
hoặc có nhiều alkaloid được tiến hành sắc ký cột cổ điển thu được các hợp chất
alkaloid. Kiểm tra độ tinh khiết của các hợp chất phân lập được bằng SKLM và
HPLC.

.

.

❖ Xác định cấu trúc của các hợp chất alkaloid tinh khiết phân lập được bằng các
phương pháp phổ nghiệm như UV, IR, MS, NMR.

.


.

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG
2.1.1 Danh pháp và phân loại [1], [7],[12], [9]

Tên khoa học: Crinum latifolium L. Amaryllidaceae
Tên tiếng Việt: Trinh nữ hoàng cung, Tỏi lơi, Tỏi lơi lá rộng, Tỏi Thái Lan, Náng lá
rộng.
Tên tiếng Pháp: Crinole pourprée, crinole à feuille large,…
Phân loại :
Plantae
Cormobionta
Magnoliophyta
Liliopsida
Liliidae
Amaryllidales
2.1.2 Mô tả thực vật [1], [2],[12]

Amaryllidaceae

Crinum

Crinum latifolium L. là một loại cỏ, sống nhiều năm, thân phủ một lớp hành với đường
Crinum
L. Bên
kính thân khoảng 10-15 cm, vùi sâu trong đất. Một thân giả dài
khoảnglatifolium
10-15 cm.
ngoài thân hành, có những vỏ màu nâu được tạo thành từ các vảy mọng nước, màu
trắng, bao bọc và tạo thành lớp bảo vệ. Lá có mép lượn sóng, mỏng, đỉnh nhọn hình
giáo, dài 80-100 cm, rộng 3-8 cm, có ống con ở phần dưới, mở rộng và có bẹ ôm thân
ở đáy. Hai mặt lá có gân song song, mặt trên có màu tối hơn mặt dưới. Cụm hoa gồm
6-12 hoa trắng, đơi khi có một vài điểm có màu hồng, được bao bọc bởi một lá bắc
trắng dạng thìa. Tràng hoa được cấu tạo bởi 6 cánh hoa màu hồng dài 10-15 cm, rộng
2,5 cm, dính nhau ở một phần ba chiều dài dưới tạo thành một ống hẹp. Bộ nhị gồm 6
nhị, được gắn vào bên trong ống của bao hoa thành 2 vịng. Mỗi nhị có dạng sợi cong

.


.

dài khoảng 7-8 cm. Nhụy có dạng sợi dài đính vào bầu nhụy được tạo thành bởi 3 lá
noãn bên trong. Quả có dạng hình cầu.

Cây

Lá

Hoa

Quả

Thân hành

Rễ

Hình 2. 1. Một số bộ phận của TNHC
2.1.3 Phân bố địa lý [1]

Bắt nguồn từ Ấn Độ, Crinum latifolium L. chủ yếu phân bố ở những vùng nhiệt đới.
Hiện nay, TNHC được trồng nhiều ở các nước Đông Nam Á như Thái Lan, Lào,
Malaysia, Campuchia, Việt Nam,.., và ở phía nam Trung Quốc.
Ở Việt Nam, TNHC được trồng ở cả 3 miền, nhưng chủ yếu là ở các tỉnh ven biển như
Quảng Nam, Bình Định, Bình Thuận, Vũng Tàu.
TNHC sinh trưởng và phát triển mạnh vào mùa xuân ở miền Bắc và đầu mùa mưa ở
miền Nam. Là loại cỏ phù hợp với điều kiện nóng ẩm và nhiều ánh sáng. Nó cho mỗi
năm từ 6-8 lá mới, 3-5 thân hành. Ra hoa hằng năm nhưng chúng không cho quả ở
Việt Nam, nơi mà chúng được nhân giống bằng thân hành. Trong khi ở Ấn Độ và Thái
Lan, chúng được nhân giống bằng quả và hạt.

.


.

2.1.4 Bộ phận dùng [2]

Bộ phận dùng là lá và thân hành tươi hoặc khơ. Một số nước, học cịn dùng cánh hoa
sấy khơ.
2.1.5. Thành phần hóa thực vật [1], [3], [17],[20], [24]

Các hợp chất hóa học của TNHC được nghiên cứu từ những năm 1980 bởi nhiều nhà
khoa học Ấn Độ, Nhật Bản và Việt Nam. Những hợp chất của chúng chủ yếu thuộc 2
nhóm lớn : alkaloid và flavonoid.
Khoảng 180 alkaloid thuốc những nhóm khác nhau đã được phân lập và định danh.
Phần lớn trong số đó có khung crinine (5,10-b-enthanophenanthridin), lycorine
(benzopyrano- (3,4-g) - indole) và tazettine (2-benzopyrano- (3.4 c) -indole).
Khoảng 100 hợp chất không phải alkaloid được phân lập và đinh danh. Chúng thuộc
các nhóm flavonoid, nhóm mang màu, coumarin, terpen, steroid, alcool, aldehyd,
ceton, acid, ester hay hydrocarbon mạch dài. Phenolique là nhóm chính trong số những
hợp chất khơng alkaloid.
Năm 1997, Nguyễn Hồng và cộng sự đã phân lập được 11 alkaloid, 11 acid hữu cơ và
acid amin là phenylalanin, l-leucin, dl-valin và l-arginin.
Mai Đình Trị, Nguyễn Cơng Hào cũng tìm thấy trong dịch chiết lá TNHC 2 flavonol
glycosid

là

kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosid

et

kaempferol-3-4’-di-O-β-D-

glucopyranosid.
Sự tồn tại của những phenylpropanoid ((E)-p-hydroxycinnamat methyl, (E)-3,4dihydroxycinnamat

ethyl),

một

coumarin

(senecioyloxymethyl-3,4-

dimethoxycoumarin) và hai hợp chất cycloartenol đã được ghi nhận.
2.1.6 Tác dụng trị liệu

Nhiều nhà nghiên cứu đã công bố nhiều tác dụng dược lý của TNHC trong việc điều
trị một số bệnh như : bệnh tiết niệu, mụn nhọt,bệnh phụ khoa, ung thư cổ tử cung, phì
đại tuyến tiền liệt,…

.


.

Tác dụng kháng acetylcholinesterase [14], [26], [27]
Hoạt tính kháng acetylcholinesterase của lá TNHC chứng minh rằng tác dụng ức chế
acetylcholinesterase giảm theo độ phân cực của các hợp chất alkaloid. Crinamidin có
hoạt tính ức chế trung bình trong khi 6-hydroxycrinamidin có hoạt tính rất yếu.
Dịch chiết methanol từ thân hành Crinum jagus (45,1%) và Crinum glaucum (40,8%)
với nồng độ 100 µg/ml có tác dụng kháng acetylcholinesterase liên quan đến sự hiện
dienj của các nhóm hydroxyl trong cấu trúc của các alkaloid.
Dịch chiết tứ thân hành của Crinum bulbispermum có tác dụng kháng
acetylcholinesterase với IC50 = 0,14 ± 0,039 µg/ml và dịch chiết của Crinum moorei
có tác dụng ức chế với IC50 = 21,5 ± 8,40 µg/ml. Hoạt tính này được giải thích bởi các
alkaloid.
Tác dụng chống oxy hóa [22]

Liên quan đến hoạt tính chống oxy hóa của flavonoid của TNHC, isoquercitrin đã

chứng minh khả năng chống oxy hóa và dập tắt gốc tự do tốt hơn astraglin, tương
đương 50% so với vitamin E cũng như khả năng ức chế tiến trình peroxyd tốt hơn
astragalin và vitamin E.
In vitro, khả năng chống oxy hóa của dịch chiết nước đã được đánh giá bắng cách sử
dụng phép thử ORAC (khả năng dập tắt các chất oxy hóa thơng qua hệ thống vận
chuyển proton) và đã mang đến kết quả đáng chú ý là 1610 ±150 μmol Trolox đương
lượng/g.
Dịch chiết methanol của Crinum moorei có tác dụng chống oxy hóa với EC50 = ,06 ±
1,54 µg/ml tương ứng với vitamin C với EC50 = 5,06 ± 0,2 µg/ml.
Tác dụng kháng khối u và kích thích miễn dịch [1], [17],[19], [22], [25].

Năm 2011, Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự đã công bố rằng dịch chiết nước của
Crinum latifolium L. có khả năng ức chế tính miễn dịch của các tế bào bạch cầu mono
máu ngoại biên và sự tăng simh của các tế bào ung thư tuyến tiền liệt. Thực tế, đã đo
được liều phụ thuộc của tác dụng ức chế của dịch chiết này dựa trên dự tăng sinh tế
bào di căn cao : ở những tế bào ung thư biểu mô tuyến tiền liệt người PC3 (IC50 = 4,5

.


.

± 0,8 mg / ml), ở những tế bào nhạy cảm hormon LNCaP (IC50 = 2,1 ± 0,04 mg / ml)
và ở những tế bào tăng sinh tuyến tiền liệt lành tính BPH-1 (IC50 = 2,1 ± 0,04 mg /
ml). Theo nghiên cứu này, sự ức chế sự tăng sinh các tế bào ung thư và sự phục hồi
chức năng các tế bào của hệ thống miễn dịch là hai yếu tố quan trọng trong đặc tính
kháng ung thư của loài này.
In vitro, dịch chiết nước của Crinum latifolium L. (1 – 8 mg/ml) cho hoạt tính kích
thích miễn dịch, đặc biệt sự kích thích trực tiếp các tế bào TCD4+ của các bạch cầu
mono thu được từ máu ngoại biên.

Dịch chiết lá ức chế tế bào NF-κB (Nuclear factor-kappa B), liên quan tới tác dụng
kháng ung thư và kháng viêm.
Panacrin (một hợp chất của 3 loài Crinum latifolium L., Panax proto-ginseng, Carica
papaya) đã được nghiên cứu tác dụng kháng khối u. In vivo, panacrin làm giảm kích
thước khối u (tế mà sarcoma TG-180 ở chuột), làm giảm tỷ lệ sự phân bào ung thư ác
tính. Do đó, làm ức chế sự di căn. Panacrin dùng cho những bệnh nhân mắc ung thư dạ
dày, ung thư gan hoặc ung thư bạch cầu, đã chứng minh được những lợi ích (tác dụng
tốt, ít tác dụng phụ) so với nhóm chứng sau 3 tháng sử dụng. Thế nhưng, vì thiếu bệnh
nhân nên kết quả khơng có ý nghĩa thống kê.
Lycorin, một alkaloid chính trong họ Amaryllidaceae, ức chế mạnh sự tổng hợp
protein và ADN của tế bào chuột, sự tăng sinh các khối u cổ trướng được cấy trên
chuột. In vitro, lycorin làm giảm một cách đáng kể khả năng sống của các tế bào ung
thư. Vả lại, nó cịn có tác dụng ức chế sự tổng hợp vitamin C trong cây.
Tác dụng giảm đau [25]

Nhờ có cấu trúc giống morphin hay codein, một số alkaloid của TNHC có tính chất
giảm đau.
Bảng 2. 1. Tác dụng giảm đau của một số alkaloid
Tác dụng giảm đau
6,2
14,7

Alkaloid
Buphanidrin
(±) Crinan

.

Thời gian (phút)
106

108

Nhận xét
LD50 8,9
LD50 36,4


.

(-) Crinin
Galanthamin
Lycoramin

29,4
2,7
21,3

132
141
133

LD50 11,1
LD50 89

2.2 ALKALOID
2.2.1 Định nghĩa [8], [23]

Meissner : Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có nitơ, có phản ứng kiềm và có nguồn
gốc từ thực vật.
Konig (1880) : Alkaloid là những base có vịng pyridin, được tìm thấy trong tự nhiên.

Năm 1910, Polonovski đã đưa ra một khái niệm mà còn được sử dụng đến ngày nay :
« Alkaloid là những hợp chất hữu cơ :
-

Có nitơ, phần lớn có khung dị vịng, có phản ứng kiềm ;

-

Hiện diện chủ yếu trong thực vật, hiếm gặp ở động vật ;

-

Có hoạt tính dược lực mạnh ;

-

Có phản ứng với các thuốc thử chung của alkaloid ».

2.2.2 Tính chất hóa học [8]

Alkaloid phần lớn là những amin, chúng dễ bị oxy hóa trong khơng khí thành dạng Noxyd nên chúng dễ bị phá hủy, chuyển thành hợp chất màu vàng từ những chất khơng
màu. Do đó, chúng nên được bảo quản dưới dạng muối bền hơn (tartrat, citrat, sulfat
hay clohydrat).
Là những tinh thể rắn có nhiệt độ nóng chảy xác định ngoại trừ nicotin là coniin ở
dạng lỏng. Một vài chất trong số chúng tồn tại dưới dạng gơm. Là những chất khơng
màu trừ khi có sự hiện diện trong cấu trúc những vòng thơm liên hợp.
Để nhận biết sự hiện diện của các alkaloid, có thể sử dụng các thuốc thử :
-

Thuốc thử Bertrand

-

Thuốc thử Scheibler

-

Thuốc thử Try-Sonenschein

-

Thuốc thử Schulze

-

Thuốc thử Bouchardat

-

Thuốc thử Valse-Mayer

.


.

-

Thuốc thử Dragendorff

-

Thuốc thử K2IO4.

-

Acid picric.

-

Tanin.

2.2.3 Phân loại alkaloid [8], [31]

Hiện nay, có nhiều cách khác nhau để phân loại các alkaloid như sự phân loại theo tác
dụng dược lý, phân loại theo nguồn gốc thực vật, phân loại theo bậc nitơ, phân loại
theo sinh nguyên, phân loại theo cấu trúc hóa học,…Trong số đó, sử dụng phổ biến sự
phân loại dựa trên nguồn gốc và cấu trúc hóa học. Theo cách phân loại này, những
nhóm lớn có thể được sắp xếp theo nguồn gốc (các proto-alkaloid, các alkaloid thực và
các pseudo-alkaloid) và sự sắp xếp các phân nhóm nhỏ dựa vào cấu trúc hóa học của
chúng.
Phân các alkaloid thành 3 nhóm tùy theo chúng có nguồn gốc từ các acid amin hay
khơng, có hay khơng ngun tử nitơ trong dị vòng.
Bảng 2.2. Sự phân loại alkaloid theo sinh nguyên
Dẫn xuất của acid amin
Dị vòng nitơ
Proto-alkaloid
+
Alkaloid thực
+

+
Pseudo-alkaloid
Các proto-alkaloid là những amin đơn giản, khơng có ngun tử nitơ trong dị vòng.
Chúng là các dẫn xuất của các acid amin và thường được gọi là các « amin sinh học ».
tan được trong nước.
Các alkaloid thực, là nhóm có số lượng lớn nhất, có độc tính và có phổ tác dụng sinh
học rộng. Chúng là những chất có tính kiềm. Tính kiềm của chúng liên quan đến
nguyên tử nitơ dị vòng (ngoại trừ colchinchin khơng có tính kiềm và khơng có nitơ dị
vịng). Chúng có nguồn gốc từ các acid amin, tồn tại dưới dạng muối của các acid khác
nhau trong cây.
Các pseudo-alkaloid không phải là dẫn xuất của các acid amin. Phần lớn là các base.
Các alkaloid steroid là các purin là các đại diện chính của nhóm này.

.


.

2.2.4 Chiết xuất alkaloid [8], [18]

Nguyên tắc : các alkaloid base tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực, các alkaloid
dạng muối tan trong alcool, nước và hỗn hợp của chúng.
Các phương pháp chiết xuất alkaloid thay đổi tùy theo độ tan của chúng dựa trên bản
chất và dạng tồn tại (base/muối), nhưng nhận thấy có 3 phương pháp chiết điển hình :
chiết bằng dung mơi hữu cơ kém phân cực trong môi trường kiềm, chiết bằng dung
môi phân cực (nước acid hoặc alcool acid) trong môi trường acid.
Chiết bằng dung mơi hữu cơ

Dược liệu
Kiềm hóa (NH4OH, Na2CO3,

NaOH)
Chiết bằng dung môi hữu cơ

Lớp dung môi hữu cơ
Lắc với dung dịch acid lỗng (HCl, H2SO4)

Dung dịch acid
Kiềm hóa
Lắc với dung mơi hữu cơ
Lọc
Bay hơi dung mơi

Alkaloid tồn phần
Sơ đồ 2.1. Chiết xuất alkaloid bằng dung môi hữu cơ trong môi trường kiềm

.


.

Chiết bằng cồn acid

Dược liệu
Làm ẩm và chiết bằng cồn acid 5%(HCl,
H2SO4)

Dịch chiết cơng acid
Trung tính hóa đến pH 5-6 (nếu cần)
Bay hơi cồn
Hịa tan trong dung dịch acid lỗng

Dịch chiết acid
Kiềm hóa đến pH 9-10
Lắc với dung mơi hữu cơ
Lọc
Bay hơi dung mơi

Alkaloid tồn phần
Sơ đồ 2.2. Chiết alkaloid bằng cồn acid
Chiết bằng nước acid

Dược liệu
Chiết bằng dung dịch acid lỗng

Dịch chiết acid
Kiềm hóa đến pH 9-10
Lắc với dung mơi hữu cơ
Lọc

Dịch chiết alkaloid
Bay hơi dung mơi

Alkaloid tồn phần
Sơ đồ 2.3. Chiết alkaloid bằng nước acid
2.2.5 Alkaloid của TNHC[5], [10], [11], [17], [24],[30].

Từ những năm 1980, nhiều nhà nghiên cứu Ấn Độ, Nhật Bản, Bungari và Việt Nam đã
phân lập được nhiều hợp chất hóa học của Crinum latifolium L., trong đó các alkaloid

.

.

chiếm một vị trí quan trọng. Khoảng 20 alkaloid được tìm thấy và xác định cấu trúc
bằng các kỹ thuật phổ.
Đầu thế kỷ 21, Nguyễn Thị Ngọc Trâm và cộng sự đã thực hiện một nghiên cứu về
alkaloid trên lá TNHC bằng phương pháp GC-MS. Theo nghiên cứu này, trong số 16
alkaloid đã được định danh (1 alkaloid không chắc chắn), tìm thấy 3 alkaloid : 6hydroxycrinamidin, 6-hydroxypowellin et undulatin so với 7 alkaloid đã phân lập được
trước đó trong lá. Tuy nhiên, trong số những chất còn lại, 9 alkaloid đã được tìm ra lần
đầu tiên trong cây. Nó cũng là lần đầu tiên ghi nhận sự tồn tại của 3 alkaloid khác
(ambelin, 1,2β-époxyambellin, powellin) trong lá ; đã được tìm thấy trong những bộ
phận khác của TNHC.
Ghosal và cộng sự đã phân lập thành công 1 glucoalkaloid (latisolin) mà aglycon của
nó là latisodin và 2 alkaloid mới có khung pyrrolophenanthrindin (2-epilycorin et 2epipancrassin) từ hoa. Nhóm nghiên cứu cũng tìm ra những alkaloid khác từ thân
hành,

như :

lyconrin,

ambellin,

hippadin

và

2

alkaloid

mới

có

khung

pyrrolophenanthridon (pratorimin et pratosin).
Năm 2000, trong luận án tiến sĩ dược học, Võ Thị Bạch Huệ đã phân lập được 1
alkaloid hoàn toàn mới được đặt tên 6-hydroxycrinamidin. Đây là một hợp chất mới
được tìm thấy trong tự nhiên và khơng tìm thấy trong những loài Crinum khác cho đến
bây giờ.
Năm 2003, Nguyễn Hữu Lạc Thủy đã phân lập thành công 2 alkaloid : undulatin và 6hydroxyundulatin, những hợp chất lần đầu được tìm thấy trong TNHC.
Cho đến hiện tại, có khoảng 36 alkaloid của TNHC đã được phân lập và xác định cấu
trúc. Phần lớn trong số đó có khung crinin và lycorin.
Bảng 2.3. Alkaloid của Crinum latifolium L.
Tên alkaloid

CTPT
R1
Khung crinin

R2

R3

(I)

.

R4


.

11-Oacetylambellin
Ambellin
Crinafolin
Crinin
Powellin
6 –hydroxy
buphanidrin

1
2
3
4
5
6

C20H23NO6

OMe

H

OMe

OAc

C18H21NO5
C18H21NO6
C16H17NO3
C17H19NO4

OMe
OMe
OMe
OH

H
OH
H
H

OMe
OMe
H
OMe

OH
OH
H
H

C18H21NO5

OMe

OH

OMe

H

(II)

7
8
9
10
11
12

13
14
15

11-O-Acetyl-1,2-βepoxyambellin
1,2-βepoxyambellin
Undulatin
6-hydroxy
undulatin
Crinamidin
6-hydroxy
crinamidin

Crinamin
Hamyan
Hamyan-3-O-acetyl

C20H23NO6

OMe

H

OMe

OAc

C18H21NO6

OMe

H

OMe

OH

C18H21NO5

OMe

H

OMe

H

C18H21NO6

OMe

OH

OMe

H

C17H19NO5

OH

H

OMe

H

C17H19NO6

H

OH

OMe

H

C17H19NO4
C16H17NO4
C18H19NO5

Me
H
Ac

H
H
H

(III)

(IV)

16

Crinafolidin

C19H23NO6
Khung lycorin
(V)

17
18
19
20

Lycorin-4,5dehydroanhydro
Pratorimin
Pratorinin
Pratosin

.

C16H11NO2

H

H

C16H11NO3
C16H11NO3
C17H13NO3

O
O
O

H
H
H

-CH2H
Me
Me

Me

H
Me


.

21

22
23
24
25
26

Pratorin

1,2-O-Diacetyllycorin
Lycorin
Lycorin-1-OAc
Lycorin-2-epi
Lycorin-1-O-β-DGlucosid

C16H9NO3

O

H

C20H21NO6

Ac

βOAc

C16H17NO4
C18H19NO5
C16H17NO4

H
Ac
H

βOH
βOH
αOH

C22H27NO9

Glc

βOH

-CH2-

(VI)

(VII)

27

2-Epipancrassidin

C16H17NO5
Khung belladin

(VIII)

28
29
30
31

Belladin
Ryllistin
Latisodin
Latisolin

C19H24NO3
Me
C19H25NO4
Me
C17H21NO3
H
C24H31NO8
Glc
Khung lycorenin

H
Ome
H

H

Me

H
H
H

(IX)

32

Hippeastrin

C17H17NO5
Khung augustamin

(X)

33

Augustamin

.

C17H19NO4
Khung cheryllin

Me
Me

Me
Me


.

(XI)

34
35

Cheryllin
Latifin

C17H19NO3
OH
C17H19NO3
H
Khung clivimin

H
OH

(XII)

36

Latindin

C41H31N3O10

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT HÓA HỌC
2.3.1 Phương pháp sắc ký để tách các chất tinh khiết [28]

Sắc ký cột
Sắc ký cột là một phương pháp quan trọng để tách các sản phẩm có chứa các tạp chất
mà rất khó khăn để loại bỏ các tạp bằng chưng cất hoặc kết tinh. Kỹ thuật này cũng
dùng để tách các sản phẩm hữu cơ trong một hỗn hợp. Trong khi các phương pháp sắc
ký khác được sử dụng cho việc phân tích và phân tách số lượng rất nhỏ các sản phẩm,
sắc ký cột cho phép phân tách các thành phần của một hỗn hợp, và có thể phân tách
các mẫu khối lượng tới vài gram.
Mô tả và nguyên tắc

Đây là một kỹ thuật dựa trên hiện tượng hấp phụ. Pha rắn, thường là nhôm hoặc silic,
lấp đầy một cột có chiều dài và rộng thích hợp. Các mẫu dưới dạng dung dịch đậm
đặc, được đưa vào ở trên cùng của cột và sự phân tách là kết quả của dòng chảy liên
tục chất rửa giải qua cột dưới trọng lực hoặc dưới áp suất thấp. Có thể sử dụng một
dung môi rửa giải đặc biệt hay tăng dần sự phân cực của dung môi để đẩy nhanh sự di
chuyển của các hợp chất.
Các phân tử đi xuống ở tốc độ khác nhau theo ái lực đối với chất hấp phụ và độ hịa
tan trong dung mơi. Sắc ký cột được hoạt động bằng cách hình thành một dải các vùng
hình trụ tách ra và di chuyển xuống. Mỗi vùng chảy ra từ cột được thu lại.

.


.

Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân tách

Chất hấp phụ
Sử dụng nhiều nhất là nhôm. Tuy nhiên, nhôm được giới hạn sử dụng trong trường
hợp phân tách các hợp chất hữu cơ ổn định, ví dụ : nhơm có thể gây ra tình trạng mất
nước của este.
Các gel silica cũng thường được sử dụng để tách các hợp chất mà khơng có ổn định đủ
để sử dụng phương pháp tách bằng nhơm.
Kích thước hạt của chất hấp phụ phải lớn hơn so với các chất hấp phụ được sử dụng
trong sắc ký lớp mỏng. Kích thước của chúng thường là giữa 50 và 200 µm.
Lượng chất hấp phụ phụ thuộc vào độ khó của q trình phân tách và khối lượng mẫu.
Chất rửa giải
Chất rửa giải thường là một hỗn hợp của hai dung môi. Bắt đầu rửa giải với các dung
mơi ít phân cực để kéo theo các chất bám kém trên chất hấp phụ (phân cực kém). Sau
đó, thay đổi thành phần của chất rửa giải bằng cách bổ sung dần dần các dung môi
phân cực hơn. Các hợp chất phân cực nhất giữ lại trên chất hấp phụ, sẽ dần dần di
chuyển xuống cột theo sự phân bố gradient nồng độ.
Kích thước cột
Cột được thiết kế đặc biệt cho mục đích này gồm một tấm kính hoặc sứ cho phép dòng
chảy tự do của chất rửa giải đồng thời ngăn chặn không cho các vật liệu hấp phụ thơng
qua. Cũng có thể sử dụng một buret, dưới đáy buret được đặt thêm bông và cát.
Lượng chất hấp phụ cho vào chiếm một chiều cao tương đương với khoảng 10 lần
đường kính của cột. Cũng phải có một không gian khoảng 10 cm trên chất hấp phụ để
đặt các dung môi.
Tốc độ rửa giải
Tốc độ rửa giải phải càng cố định càng tốt. Nó phải đủ chậm để cho các chất tan đạt
được các trạng thái cân bằng giữa pha lỏng và hấp phụ. Rửa giải không được q chậm
bởi vì nếu khơng các chất sẽ khuếch tán vào dung môi và ta thu được các dải càng
ngày càng rộng và sẽ không tách được các chất.
Nhồi cột
Đây là quy trình cần sự cẩn thận nhất vì nhồi cột phải càng đồng nhất càng

.


.

tốt và khơng chứa bọt khí. Các bề mặt trên và dưới của các vật liệu hấp phụ
phải được hoàn toàn bằng phẳng.
2.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp quang phổ UV-Vis [13]

Sự hấp thu bức xạ ánh sáng của vật chất trong phạm vi quang phổ từ vùng tử ngoại
đến hồng ngoại, giữa 180 và 1100 nm, đã được nghiên cứu rộng rãi. Dải phổ nằm
trong vùng "UV / Vis" vì nó bao gồm bức xạ có thể thấy bằng mắt người. Nói chung,
nó cung cấp rất ít thơng tin về cấu trúc, tuy nhiên, nó có nhiều ứng dụng trong phân
tích định lượng. Ví dụ như tính toán nồng độ theo định luật Lambert Beer và các
phương pháp đo màu. Phương pháp này có thể sử dụng trong tất cả các phịng thí
nghiệm. Điều này khơng chỉ áp dụng cho các hợp chất có quang phổ hấp phụ trong
vùng khả kiến mà còn dùng cho phản ứng với thuốc thử tạo dẫn xuất có thể đo độ hấp
phụ. Phương pháp hấp phụ có thể được thực hiện với một thiết bị có bộ so màu và bộ
ghi màu đơn giản, máy đo quang phổ tự động thích hợp để phân tích đa thành phần.
Ngồi ra, phương pháp sắc ký lỏng và điện di mao quản đã được khuyến khích sử
dụng đầu dị UV / Vis, là một đầu dò phổ biến của sắc ký, kèm theo định tính và định
lượng các chất
Phương pháp quang phổ hồng ngoại [13]

Quang phổ hồng ngoại dựa trên sự hấp thu các bức xạ hồng ngoại của các phân tử.
Năng lượng sử dụng chính là năng lượng quay và năng lượng dao động.
Tuy nhiên chỉ quan sát được sự dao động (các pic mạnh hơn sự quay) với 2 dạng : dao
động co dãn và dao động biến dạng.
Sự phân tích thực hiện bởi sự quét các bước sóng để thu được một phổ hồng ngoại thể

hiện các băng hấp thu. Sự phân tích các nhóm chức hữu cơ hiện diện trong phân tử
được thực hiện nhờ bảng các nhóm chức với các số sóng đo được. Một liên kết có thể
có những kiểu dao động khác nhau và xuất hiện các băng hấp thu khác nhau. Điều này
dẫn đến sự phân tích phổ đơi khi rất khó khăn.

.


.

Khối phổ [4]

Khối phổ (MS) là một kỹ thuật phân tích đóng vai trị quan trọng trong việc phân tích
các saponin nhờ vào độ nhạy cao và khả năng phát hiện cao. Nó cung cấp thơng tin
như khối lượng phân tử của hợp chất cũng như thông tin về sự phân mảnh của các hợp
chất.
Nguyên tắc : khối phổ là kỹ thuật phân tích cho phép phát hiện và xác định các phân tử
bằng sự đo khối lượng phân tử của chúng và xác định cấu trúc hóa học.
Nguyên tắc của nó nằm trong việc phân chia các phân tử ở pha khí (ion) dựa trên tỷ lệ
khối lượng / điện tích (m / z). Khối phổ được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực khoa
học vật lý, vật lý thiên văn học, hóa học pha khí, hóa học hữu cơ, khảo nghiệm, sinh
học, y học, ...
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) [4]

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là kỹ thuật lợi dụng từ tính của một số hạt nhân nguyên
tử. Nó dựa trên hiện tượng cộng hưởng từ hạt nhân.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân chỉ rõ đặc tính của một số hạt nhân ngun tử có spin hạt
nhân (ví dụ 1H,

13

C,

19

F,

31

P,

129

Xe,…) được sắp xếp trong vùng từ trường. Khi bị

chiếu xạ điện từ (tần số vô tuyến), hạt nhân nguyên tử có thể hấp thụ năng lượng bức
xạ và sau đó giải phóng nó để trở về trạng thái cơ bản. Năng lượng liên quan đến hiện
tượng này cộng hưởng tương ứng với một tần số rất cụ thể, tùy thuộc vào từ trường và
các yếu tố phân tử khác. Hiện tượng này cho phép quan sát từ tính của hạt nhân trong
pha khí, lỏng hoặc rắn. Chỉ có nguyên tử mà hạt nhân có một mômen từ làm gia tăng
sự cộng hưởng.

.


.

3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
3.1.1 Nguyên vật liệu

Rễ TNHC được thu hái ở Bình Định tháng 3/2016. Rễ TNHC được rửa sạch,
phơi khô, xay nhuyễn, ngấm kiệt với cồn 70%, cô thu hồi cồn thu được cao cồn
tồn phần của rễ.
3.1.2 Dung mơi

Dung mơi chiết xuất: n-hexan, chloroform, ethyl acetat, methanol, n-butanol xuất xứ
Trung Quốc và Việt Nam.
Dung môi sắc ký lỏng: methanol, acetonitril, acid phosphoric của Merk (Đức).
3.1.3 Trang thiết bị

Bảng 3. 1. Các trang thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
Trang thiết bị
1
2
3

Máy cất nước
Bể siêu âm
Bếp cách thủy
Cân phân tích điện tử (giới hạn cân 320g
4
với độ chính xác 0,001g)
Cân kỹ thuật (giối hạn cân 410 g với độ
5
chính xác 0,01 g)
6 Đèn UV 254 & 365 nm
7 Máy đo pH
8 Máy cô quay
Hệ thống HPLC, modèle 2695, kèm với

những bộ phận sau :
9
Detecteur PDA, modèle 2996.
Cột 5u C18 110A (250 × 4,6 mm ; 5 μm).
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Chiết xuất alkaloid từ cao cồn rễ TNHC

3.2.1.1 Nguyên tắc

.

Nhãn hiệu
Aquatron
Elma
Memmert
Sartorius
Sartorius
Vilber Lourmat
Métrohm
Heidolph - Allemagne
Waters
Waters
Phenomenex


.

Sự chiết các hợp chất alkaloid dựa trên nguyên tắc sau: các alkaloid dạng base tan
trong dung môi kém phân cực và ngược lại.
3.2.1.2 Quy trình

Cao cồn được cơ cách thủy đến khô để đuổi cồn. Phần cắn khô được hòa tan trong acid
HCl 1% (siêu âm 10 phút), lặp lại sự hịa tan 4 lần. Sau đó, dịch acid được lọc qua
giấy. Dịch lọc thu được lắc với ethyl acetat, lặp lại 4 lần, thu được dịch ethyl acetat và
lớp acid. Lớp acid tiếp tục được kiềm hóa tới pH = 9-10, sau đó lắc với chloroform,
lặp lại 4 lần. Dịch chiết chloroform được lọc qua giấy lọc với Na 2SO4 khan. Cuối cùng
cô thu hồi dung môi ta thu được alkaloid tồn phần.
Cao cồn
Bay hơi cồn
Cắn khơ

Hịa tan bằng HCl 1% (4 lần)
Lọc
Dịch acid
Lắc với EtOAc (4 lần)
Dịch EtOAc chứa các chất khác

Cô thu hồi dung môi

Cắn

Dịch chiết acid

Kiểm hóa tới pH = 9-10
Chiết với CHCl3
Lọc
Cơ thu hồi dung mơi

Alkaloid tồn phần

Sơ đồ 3. 1. Quy trình chiết alkaloid từ cao cồn

.


.

3.2.2 Tách các alkaloid bằng phương pháp sắc ký cột nhanh
Nguyên tắc

Dựa trên hiện tượng hấp phụ, các phân tử di chuyển về phía đáy cột theo những tốc độ
khác nhau, tùy theo ái lực của chúng với chất hấp phụ và độ tan của chúng trong dung
môi rửa giải. Trong sắc ký cột nhanh, sử dụng một chân không (được tạo ra bởi áp suất
ở đáy cột) để thúc đẩy tốc độ di chuyển của dung môi. Phương pháp này cho phép
phân tách hỗn hợp của nhiều chất thành những phân đoạn đơn giản có độ phân cực
khác nhau trong thời gian ngắn.
Quy trình

Mẫu
Mẫu được chuẩn bị dưới dạng bột khô đồng nhất mà bản chất của chúng là hỗn hợp
của silicagel và cao alkaloid toàn phần.
Chất hấp phụ
Chất hấp phụ là silicagel (Merck) với cỡ hạt trung bình (0,040 – 0,063 mm) để phân
tách. Khối lượng chất hấp phụ được sử dụng thông thường gấp 5-10 lần khối lượng
mẫu.
Cột
Cột thủy tinh (30 x 3 cm) có một lớp borosilica ở đáy và khơng có khóa.
Quy trình
-

Làm đầy cột bằng silicagel.

-

Ổn định cột bằng n-hexan.

-

Thêm một lượng thích hợp silicagel vào cao alkaloid toàn phần. Trộn cẩn thận
và bay hơi dung môi tới khô.

-

Nạp từ từ hỗn hợp này vào cột đã được ổn định bằng n-hexan.

-

Phân tách hỗn hợp bằng các dung mơi có độ phân cực tăng dần: n-hexan
chloroform, ethyl acetat, methanol, n-butanol và hỗn hợp của chúng. sử dụng
50 ml dung môi cho mỗi phân đoạn.

-

Các phân đoạn thu được được kiểm tra nhanh bằng thuốc thử Dragendorff và
sau đó triển khai trên SKLM, phát hiện bằng đèn UV 254 nm, 365 nm và thuốc

.


.

thử Dragendorff.
-

Gộp các phân đoạn có kết quả SKLM giống nhau.

3.3.3 Phân lập và tinh chế các hợp chất từ các phân đoạn sắc ký cột
Phương pháp thay đổi dung môi

Phương pháp phân lập cơ bản được áp dụng là thay đổi dung môi để kết tinh các hợp
chất trong dung môi xác định.
Phương pháp kết tinh phân đoạn

Dựa trên hiện tượng kết tinh phân đoạn, một hợp chất sẽ kết tinh trong dung dịch của
nó ngay khi nồng độ vượt quá độ tan. Sự kết tinh này được thực hiện trong môi trường
lạnh để thúc đẩy sự tạo thành các tinh thể.
Kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC

Tiến hành kiểm tra tính tương thích hệ thống của phương pháp HPLC, phép thử cho
phép kiểm tra độ tin cậy của các kết quả phân tích, được xác nhận như là một bước cần
thiết trước khi thực hiện bất kỳ một phép phân tích nào. Tính tương tích hệ thống được
đánh giá thông qua các giá trị và các thông số kỹ thuật của hệ thống khi áp dụng quy
trình phân tích trên dung dịch mẫu chuẩn với 6 lần tiêm mẫu liên tiếp.
Tính tương thích hệ thống được đánh giá bằng các thông số kỹ thuật như: thời gian lưu
(tR), chiều cao pic (H), diện tích pic (S), số đĩa lý thuyết (N), độ phân giải (R), hệ số
bất đối (T), độ chọn lọc (α), hệ số dung lượng (k’).
Thao tác :
- Tiêm 6 lần liên tiếp một dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ 0,2 mg/ml.
- Tính %RSD của các thông số kỹ thuật.
3.3.4 Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được

Các alkaloid phân lập được sẽ được xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ
nghiệm:
- UV
- IR

.