Nghiên cứu ứng dụng quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


HỒNG KIM DUNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ
XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA
MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


HỒNG KIM DUNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG VÀ
XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA
MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM

BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc & Độc chất
Mã số: 8720210

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. HÀ MINH HIỂN

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2018


i

MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................1
1.1. KHÁNG SINH ....................................................................................................1
1.1.1. Khái niệm chất kháng sinh .......................................................................1
1.1.2. Định nghĩa ................................................................................................ 2
1.1.3. Nguồn gốc ................................................................................................ 2
1.2. KHÁNG SINH MUPIROCIN ............................................................................. 3
1.2.1. Dƣợc lý và cơ chế tác dụng .....................................................................3
1.2.2. Dƣợc động học ......................................................................................... 4
1.2.3. Chỉ định ....................................................................................................4
1.3. SINH TỔNG HỢP MUPIROCIN .......................................................................5
1.3.1. Sinh tổng hợp hợp chất Polyketid ............................................................ 6
1.3.2. Quá trình sinh tổng hợp Polyketid ........................................................... 6
1.3.3. Quá trình sinh tổng hợp Mupirocin ......................................................... 7
1.4. CÁC TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN .......................................10
1.4.1. Công thức cấu tạo và danh pháp ............................................................ 11

1.4.2. Con đƣờng phát sinh tạp ........................................................................12
1.5. QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA
MUPIROCIN THEO USP 40 ................................................................................... 14
1.5.1. Chuyên luận Mupirocin calcium ........................................................... 14
1.5.2. Chuyên luận kem Mupirocin calcium .................................................... 16
1.6. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN ĐẾN ĐỊNH LƢỢNG MUPIROCIN VÀ
TẠP CHẤT LIÊN QUAN BẰNG PHƢƠNG PHÁP HPLC TRÊN THẾ GIỚI .....20
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 22
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ ............... 22


ii

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 23
2.2.1 Khảo sát các điều kiện khắc nghiệt để tạo ra tạp Mupirocin Impurity 1,
Mupirocin Impurity 2, Mupirocin Impurity 3 và Mupirocin Impurity 4 .......... 23
2.2.2- Xây dựng quy trình định lƣợng và xác định tạp chất liên quan của
Mupirocin bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dị PDA. ....26
2.2.3 Thẩm định quy trình xác định tạp chất liên quan của Mupirocin ............ 30
2.2.4.Thẩm định quy trình định lƣợng Mupirocin ............................................ 33
2.2.5 Ứng dụng quy trình đã thẩm định tiến hành định lƣợng và xác định
tạp chất liên quan trên 3 mẫu thuốc trên thị trƣờng .......................................... 37
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN .............................. 36
3.1. KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN KHẮC NGHIỆT ĐỂ TẠO RA TẠP............... 36
3.2. XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN
QUAN CỦA MUPIROCIN ....................................................................................... 44
3.2.1 Khảo sát từ điều kiện sắc ký ban đầu là chƣơng trình sắc ký 2 ............... 44
3.2.2. Khảo sát từ điều kiện sắc ký ban đầu là chƣơng trình sắc ký 1 .............. 46
3.3 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN ................ 56
3.4 THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG MUPIROCIN .............................. 62

3.5. ĐỊNH LƢƠNG MẪU TRÊN THỊ TRƢỜNG .................................................. 68
3.6 DỰ THẢO QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP CHẤT LIÊN QUAN
CỦA MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM ............................................................ 70
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


iii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Chữ nguyên

ACN

Acetonitrile

ASEAN

Association of Southeast Asian Nations

Nghĩa tiếng Việt
Hiệp hội các quốc gia
Đông Nam Á
Dƣợc điển Anh

BP

British Pharmacopoeia

DĐVN

Dƣợc điển Việt Nam

EP

European Pharmacopoeia

Dƣợc điển châu Âu

HPLC

High-performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MeOH

Methanol

Mu imp 1 Mupirocin impurity 1
Mu imp 2 Mupirocin impurity 2
Pseu D

Pseudomonic acid D

Pseu B

Pseudomonic acid B

Pseu C

Pseudomonic acd C

Pseu E

Pseudomonic acid E

Mu imp 3 Mupirocin impurity 3
Mu imp 4 Mupirocin impurity 4
THF

Tetrahydrofuran

USP

United States Pharmacopeia

Dƣợc điển Mỹ

SKĐ

Sắc ký đồ

Sắc ký đồ

UV-Vis

Ultra Violet - Visible

Tử ngoại – khả kiến


iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 1.1. Các nhóm chức năng của một modul PKS đơn giản nhất .......................... 6
Hình 1.2. Quá trình sinh tổng hợp polyketid .............................................................. 7
Hình 1.3. Giai đoạn kéo dài trong quá trình tổng hợp polyketid ................................ 7
Hình 1.4. Cơng thức các pseudomonic acid ............................................................... 8
Hình 1.5. Gen sinh tổng hợp Mupirocin và con đƣờng tổng hợp Mupirocin ............. 9
Hình 1.6. Sơ đồ tạo vịng pyran của acid monic ....................................................... 10
Hình 1.7. Pseudomonic acid B …............................................................................. 11
Hình 1.8. Tap B Pseudomonic acid C ......................................................................11
Hình 1.9. Pseudomonic acid D ................................................................................ 12
Hình 1.10. Mupirocin impurity 1 ............................................................................. 12
Hình 1.11. Mupirocin impurity 2… .......................................................................... 12
Hình 1.12. Pseudomonic acid E ................................................................................ 12
Hình 1.13. Mupirocin impurity 3 .............................................................................. 13
Hình 1.14. Mupirocin impurity 4 .............................................................................. 13
Hình 1.15. Pseudomonic acid F ............................................................................... 13
Hình 1.16. Sản phẩm phân hủy của Mupirocin ........................................................ 13
Hình 1.17. Cơng thức cấu tạo Mupirocin .................................................................14
Hình 3.1. Sắc ký đồ phân hủy mupirocin 20h trong mơi trƣờng acid pH2 .............. 36
Hình 3.2. Sắc ký đồ phân hủy mupirocin trong môi trƣờng acid ............................. 37
Hình 3.3. Sắc ký đồ mupirocin khi phân hủy dƣới ánh sáng mặt trời 4h ................. 39
Hình 3.4. Sắc ký đồ mupirocin khi phân hủy trong môi trƣờng H2O2 3% .............. 41

Hình 3.5. Sắc ký đồ phân hủy trong mơi trƣờng kiềm , nhiệt độ 700C. ................... 42
Hình 3.6. Sắc ký đồ phân hủy ở nhiệt độ 700C trong bể cách thủy .......................... 42
Hình 3.7. Sắc ký đồ phân hủy trong môi trƣờng acid pH 2, nhiệt độ 700C .............. 42
Hình 3.8. Sắc ký đồ phân hủy trong mơi trƣờng pH2, nhiệt độ 500C ...................... 42
Hình 3.9. Sắc ký đồ phân hủy trong môi trƣờng pH2, nhiệt độ 450C ...................... 42


v

Hình 3.10. Sắc ký đồ phân hủy mẫu nồng độ Mupirocin 5mg/ml, pH2,
nhiệt độ 450C ............................................................................................................ 42
Hình 3.11 Sắc ký đồ phân hủy mẫu nồng độ Mupirocin 5mg/ml, pH 2................... 43
Hình 3.12. Sắc ký đồ phân hủy dung dịch Mupirocin nồng độ 5mg/ml................... 43
Hình 3.13. Sắc ký đồphân tích theo USP 40 ............................................................. 43
Hình 3.14 Sắc ký đồ các chƣơng trình gradient A ................................................... 46
Hình 3.15 Sắc ký đồ các chƣơng trình gradient B ................................................... 47
Hình 3.16 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dịng................................................................ 49
Hình 3.17 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dịng 0,7 ml/p ................................................. 50
Hình 3.18 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng 0,5 ml/p ................................................. 51
Hình 3.19 SKĐ theo các điều kiện phù hợp ............................................................. 52
Hình 3.20 Sắc ký đồ các chƣơng trình gradient dung mơi .......................................53
Hình 3.21 Sắc ký đồ các chƣơng trình gradient dung mơi và tốc độ dịng............... 55
Hình 3.22 SKĐ mẫu A theo chƣơng trình sắc ký của USP 40 .................................55
Hình 3.23 Tính đặc hiêu của phƣơng pháp xác định giới hạn tạp ............................ 63
Hình 3.24 Tính đặc hiệu phƣơng pháp định lƣợng mupirocin .................................64
Hình 3.25 Tuyến tính Mupirocin .............................................................................. 66


vi

DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ
Trang
Bảng 1.1. Chƣơng trình gradient định lƣơng tạp theo USP 40 ............................... ...5
Bảng 1.2. Giới hạn cho phép của các tạp theo USP 40 ........................................... .13
Bảng 1.3 Các nghiên cứu liên quan đên định lƣợng Mupirocin và tạp liên quan.... 12
Bảng 2.1. Thành phần mẫu placebo ......................................................................... 21
Bảng 2.2. Trang thiết bị dùng trong nghiên cứu ...................................................... 22
Bảng 2.3. Các chƣơng trình gradient A ( THF: đệm) .............................................. 22
Bảng 2.4. Các chƣơng trình gradient dung môi THF: đêm: nƣớc ........................... 26
Bảng 2.5. Các chƣơng trình gradient dung mơi ....................................................... 31
Bảng 2.6. Các chƣơng trình gradient dung mơi và tốc độ dịng .............................. 32
Bảng 2.7. Cách pha chuẩn khảo sát tính tuyến tính định lƣợng Mupirocin............. 33
Bảng 2.8. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng Mupirocin ................. 34
Bảng 3.1. So sánh thời gian lƣu tƣơng đối của tạp với tiêu chuẩn USP 40 ............. 44
Bảng 3.2. Chƣơng trình sắc ký ban đầu ................................................................... 44
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát các chƣơng trình sắc ký A ........................................... 51
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát các chƣơng trình sắc ký B ........................................... 51
Bảng 3.5. Tổng kết Rs theo tốc độ dòng và nhiệt độ ............................................... 53
Bảng 3.6. Hệ số phân giải của Mu imp 1 và 2 tại các tỷ lệ % THF ......................... 53
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát các chƣơng trình sắc ký gradient dung môi ................. 53
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát các chƣơng trình gradient dung mơi và tốc độ dòng ... 54
Bảng 3.9. Bảng thời gian lƣu tƣơng đối điều chỉnh lại ............................................ 55
Bảng 3.10. Bảng kết quả tính phù hợp hệ thống ...................................................... 56
Bảng 3.11. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 1 ........................... 57
Bảng 3.12. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 2 ........................... 57
Bảng 3.13. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu D ................................ 58
Bảng 3.14. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu B ................................ 59
Bảng 3.15. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 3 ........................... 59

vii

Bảng 3.16. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Mu imp 4 ........................... 60
Bảng 3.17. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu C ................................ 60
Bảng 3.18. Kết quả tính phù hợp hệ thống đối với tạp Pseu E ................................ 61
Bảng 3.33. Kết quả tính phù hợp hệ thống Mupirocin ............................................ 62
Bảng 3.34. Kết quả khảo sát tính tuyến tính Mupirocin ......................................... 65
Bảng 3.35. Kết quả thẩm định độ lặp lại Mupirocin ................................................ 66
Bảng 3.36. Kết quả độ chính xác trung gian Mupirocin .......................................... 66
Bảng 3.37. Kết quả thẩm định độ đúng Mupirocin .................................................. 67
Bảng 3.38. Kết quả định lƣợng các mẫu thị trƣờng ................................................. 67
Bảng 3.39. Kết quả định lƣợng tạp trong các mẫu thị trƣờng.................................. 68
Bảng 3.40. Kết quả định lƣợng tạp trong các mẫu thị trƣờng (tiếp theo) ................ 69
Bảng 3.41. Phần trăm hàm lƣợng các tạp trong mẫu thị trƣờng .............................. 69


viii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Kết quả, số liệu nghiên cứu trong luận văn là trung thực và
khơng trùng với bất kì cơng trình khác.
Tác giả

Hồng Kim Dung


LỜI CẢM ƠN

Em xin gửi lời cảm ơn đến Thầy TS. Hà Minh Hiển đã nhiệt tình hướng dẫn, góp
ý, hỗ trợ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp này.
Em xin gửi lời cảm ơn thầy PGS. TS. Trần Việt Hùng và thầy PGS. TS. Nguyễn
Đức Tuấn đã dành thời gian nhận xét, phản biện và góp ý kiến để giúp luận văn của em
được hồn chỉnh hơn.
Em xin gửi lời cảm ơn cô PGS. TS. Võ Thị Bạch Huệ đã dành thời gian nhận xét
và đóng góp ý kiến để giúp luận văn của em được hoàn chỉnh hơn.
Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí
Minh, Phịng đào tạo Sau Đại học trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh, Khoa Dược
trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện giúp tơi hồn thành luận văn.
Tơi xin cảm ơn ban lãnh đạo Viện Kiểm Nghiệm thuốc Tp. Hồ Chí Minh, và đặc
biệt là các anh chị em trong phòng Kiểm nghiệm Đông dược đã hỗ trợ tôi rất nhiều trong
quá trình nghiên cứu thực nghiệm
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến quý đồng nghiệp Trung Tâm Kiểm Nghiệm
tỉnh Khánh Hịa.
Và cuối cùng tơi cũng xin cảm ơn đến gia đình đã ln động viên và ủng hộ tơi
trong suốt quá trình học tập và làm luận văn.


Luận văn Thạc sĩ- Khóa: 2016-2018
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất; Mã số : 8720210
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG VÀ XÁC ĐỊNH TẠP
CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN TRONG THUỐC KEM BẰNG PHƢƠNG
PHÁP SẮC KÝ LỎNG
Hoàng Kim Dung
Hướng dẫn khoa học: TS. Hà Minh Hiển
Từ khóa: Mupirocin, mupirocin impurity, HPLC
Mở đầu: Mupirocin là một kháng sinh mới, có phổ kháng khuẩn rộng kể cả những chủng
đề kháng methicillin, được bào chế dưới dạng thuốc kem bôi da. Dược điển USP 40 đã có
chuyên luận về định lượng và xác định tạp chất của mupirocin trong thuốc kem. Tuy

nhiên khi áp dụng vào thực tế còn gặp một số khó khăn do những trang thiết bị và mơi
trường của mỗi phịng thí nghiệm là khác nhau. Do đó đề tài này được thực hiện với mục
tiêu nghiên cứu ứng dụng quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của
mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng.
Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu: Mẫu thành phẩm thuốc kem mupirocin 2% của công ty dược.
Phương pháp nghiên cứu: Mupirocin được để trong những điều kiện môi trường khắc
nghiệt để tạo ra 4 tạp phân hủy là mupirocin impurity 1,2,3 và 4. Khảo sát các điều kiện
sắc ký để tách mupirocin và 8 tạp chất liên quan. Xây dựng quy trình định lượng và xác
định tạp chất liên quan của mupirocin. Quy trình sau đó được thẩm định theo hướng dẫn
của ICH.
Kết quả:Đã xây dựng được quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của
mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng. Điều kiện sắc ký bao gồm ct
Agilent C8 (250xì 4,6 mm, 5 àm), pha ng: m amoni acetat pH5,7 và tetrahydrofuran
theo chương trình gradient. Quy trình đã được thẩm định đạt yêu cầu chung của một quy
trình phân tích.
Kết luận: Đã xây dựng được quy trình định lượng và xác định tạp chất liên quan của
mupirocin trong thuốc kem bằng phương pháp sắc ký lỏng.Quy trình có thể được ứng
dụng để kiểm tra chất lượng các mẫu thuốc kem mupirocin lưu hành trên thị trường.


Master’s Thesis – Academic course: 2016-2018
Specialty: Drug Quality Control & Toxicology – Code: 8720210
STUDY ON APPLICATION OF HPLC METHODS FOR THE
DETERMINATION OF MUPIROCIN AND ITS RELATED SUBSTANCES IN
MUPIROCIN CREAM
Hoang Kim Dung
Supervisor: Dr. Ha Minh Hien
Keyword: Mupirocin, mupirocin impurity, HPLC
Introduction : Mupirocin is a topical antibiotic useful against superficial skin infections

with broad spectrum even against superficial methicillin-resistant Staphylococcus aureus
(MRSA). It is used as a cream or ointment applied to the skin. The monograph of
mupirocin cream has been existed in United States Pharmacopeia including the methods
of analysis for related substances and assay. However, they need to be verified or
modified depending on the availability of the quality control laboratories. Therefore, this
sudy on application of HPLC methods for the determination of mupirocin and its related
substances in mupirocin cream has been conducted.
Materials and Methods:
Material: Mupirocin cream, 2 % manufactured by a pharmaceutical company
Method: Mupirocin was stored in a stressed conditions to obtain the related substances of
mupirocin impurity 1, 2, 3 and 4. Study on difference mobile phase and gradient elution
to obtain a satisfactory separation of the impurities. Establish and validate the methods
following the ICH guidelines.
Results: A reverse-phase HPLC methods for assay and determination of related
compounds in mupirocin cream were developed: Column – Agilent C8 (25 cm × 4.6 mm,
5 μm); detector - UV (240 nm); column temperature: 250C; mobile phase:
tetrahydrofuran and pH 5.7 ammonium acetate buffer, elute in gradient; flow rate – 1.0
ml/min. The method was validated following the ICH guidelines.
Conclusion: Suitable methods for assay and determination of related substances in
mupirocin cream were established for routine testing which can be used to control the
quality of mupirocin cream circulated in the market.


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nghiên cứu, sản xuất thuốc, ngoài việc nghiên cứu tác dụng dƣợc lý của các hoạt
chất chính, các nhà nghiên cứu còn phải khảo sát tác dụng dƣợc lý của các tạp chất có thể
phát sinh trong nguyên liệu hoặc thành phẩm do nguyên liệu đầu vào cịn lẫn tạp hoặc tạp
chất phân hủy trong q trình sản xuất và lƣu hành. Những tạp chất phát sinh có thể làm

thay đổi hoặc làm giảm hiệu quả lâm sàng và đặc tính an tồn của thuốc hoặc gây các tác
dụng khác nhau với hậu quả không lƣờng trƣớc đƣợc. Việc kiểm soát các tạp chất liên
quan trong nguyên liệu và đặc biệt là trong chế phẩm tƣơng ứng đã đƣợc quy định chặt
chẽ đối với phần lớn chuyên luận trong Dƣợc điển các nƣớc (EP, USP, BP).
Mupirocin là một kháng sinh mới, phổ diệt khuẩn rộng có hoạt tính chống lại hầu hết các
vi khuẩn gây nhiễm trùng da. Thuốc này dễ sử dụng, có hiệu quả tốt và ít tác dụng phụ, ít
thấy có sự đề kháng của vi khuẩn. Vì thế, một số nhà sản xuất trong nƣớc đã nghiên cứu
phát triển sản phẩm kem thuốc chứa mupirocin. Tuy nhiên, để thiết lập hồ sơ đăng ký
thuốc theo sổ tay hƣớng dẫn đăng ký thuốc thì cần phải có quy trình phân tích. Dƣợc điển
USP 40 đã có quy trình phân tích định lƣợng và xác định giới hạn tạp chất liên quan cho
chế phẩm thuốc kem Mupirocin, tuy nhiên 1 quy trình phân tích trong dƣợc điển nói
chung muốn đƣa vào áp dụng thì phải khảo sát lại theo điều kiện trang thiết bị của từng
cơ sở kiểm nghiệm. Hơn nữa nền mẫu dạng kem là rất phức tạp và rất khác nhau đối với
từng hãng bào chế, phƣơng pháp phân tích địi hỏi phải đảm bảo các thành phần đệm,
chất làm phân tán và các chất bảo quản trong công thức bào chế phải tách khỏi các tạp
chất liên quan cần xác định. Vì thế, đề tài ―
nh giới hạn tạp chấ
pháp sắc ký lỏ

kem bằ

ơ

” đƣợc thực hiện với các mục tiêu sau:

1) Khảo sát các tạp chất liên quan của mupirocin
2) Xây dựng và thẩm định quy trình định lƣợng mupirocin trong thuốc kem
3) Xây dựng và thẩm định quy trình xác định giới hạn tạp chất liên quan của mupirocin
trong thuốc kem

2

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 . KHÁNG SINH
1.1.1. Khái niệm chất kháng sinh
Thuật ngữ ―chất kháng sinh‖ lần đầu tiên đƣợc Pasteur và Joubert (1877) sử dụng
để mô tả hiện tƣợng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis
trên động vật nhiễm bệnh.
Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc
tính tổng hợp đƣợc các hợp chất hố học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối
kháng.
Nicolle (1907) là ngƣời đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus
subtilis có liên quan đến q trình hình thành loài bào tử.
Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng
điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn và ơng là ngƣời đầu
tiên xây dựng hồn thiện phƣơng pháp tìm kiếm và phát hiện vi sinh vật sinh tổng
hợp chất kháng sinh trong tự nhiên.
Năm 1929 thuật ngữ ―chất kháng sinh‖ mới đƣợc Alexander Fleming mô tả một
cách đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin
Năm 1931, các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo
phƣơng pháp lên men bề mặt. Năm 1938 ở Oxford, Ernst Boris Chain và Howara
Walter Florey đã tiếp tục triển khai nghiên cứu này, các ông đã tinh chế đƣợc một
lƣợng lớn penicillin (1939) đủ để thử nghiệm trên các loạt động vật thí nghiệm.
Ngày 25/05/1940 penicillin đã đƣợc thử nghiệm rất thành cơng trên chuột và chính
thức đƣợc dùng điều trị thành công trên ngƣời (1941) trong nỗ lực cuối cùng nhằm
cứu sống các thƣơng binh bị nhiễm khuẩn nặng trong chiến tranh thế giới thứ hai.
Trong thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bƣớc tiến vƣợt bậc của
ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh non trẻ nhƣ:
* Khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh nhƣ: griseofulvin (1939), gramicidin S

(1942), streptomycin (1943), bacitracin (1945), chloramphenicol và polymycin


3

(1947), clotetracyclin và cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin
và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), vancomycin (1956),
kanamycin và rifamycin (1957),...
* Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến đã tạo ra những
biến chủng công nghiệp có năng lực ―siêu tổng hợp‖ các chất kháng sinh cao gấp
hàng vạn lần các chủng ban đầu.
* Triển khai thành cơng cơng nghệ lên men chìm quy mơ sản xuất cơng nghiệp để
sản xuất penicillin G (1942) và hồn thiện công nghệ lên men này trên những sản
phẩm khác trong những năm tiếp theo.
* Năm 1959, phát hiện và tinh chế sử dụng thành công 6-aminopenicillinic acid
(6APA) làm nguyên liệu để sản xuất các chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp
1.1.2. Định nghĩa
Ngày nay chất kháng sinh hiểu theo nghĩa đầy đủ là các chất hố học xác định,
khơng có bản chất enzyme, có nguồn gốc từ vi sinh vật, bán tổng hợp hoặc tổng
hợp hóa học với đặc tính ngay ở nồng độ thấp có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc
tiêu diệt đƣợc các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo đƣợc an toàn cho ngƣời
hay động vật đƣợc điều trị
* Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ƣu thế phát triển cạnh tranh có
lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm đƣợc sự
phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó.
* Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả
năng sống sót cao cho chủng sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên, nhất là đối
với các lồi có bào tử.
1.1.3. Nguồn gốc
Kháng sinh có thể có 3 nguồn gốc:

+ Kháng sinh tự nhiên: ví dụ nhóm Lipopeptid (daptomycin) chiết xuất từ mơi
trƣờng ni cấy Streptomyces reseosporus, hoặc Fusidic acid: chiết xuất từ nấm


4

Fusidium coccineum, penicilin G là kháng sinh tự nhiên, đƣợc chiết xuất từ môi
trƣờng nuôi cấy Penicilium …
+ Kháng sinh bán tổng hợp:
Các cephalosporin khác nhau đƣợc hình thành bằng phƣơng pháp bán tổng hợp.
Sự thay đổi các nhóm thế sẽ dẫn đến thay đổi đặc tính và tác dụng sinh học của
thuốc, clindamycin là kháng sinh bán tổng hợp từ lincomycin…
+ Kháng sinh tổng hợp hóa hoc:
Các kháng sinh nhóm quinolon tồn bộ đƣợc sản xuất bằng tổng hợp hóa học.
Kháng sinh nhóm 5-nitro-imidazol là dẫn xuất của 5-nitro imidazol, có nguồn gốc
tổng hợp hóa học, thiamphenicol cũng là kháng sinh tổng hợp…
1.2.

KHÁNG SINH MUPIROCIN
Mupirocin là một kháng sinh có cấu trúc Polyketid, có nguồn gốc từ Pseudomonas
fluorescens. Cơ chế tác dụng của mupirocin chƣa rõ hoàn toàn, nhƣng khác với cơ
chế của các thuốc kháng sinh hiện có. Vì thế mupirocin ít bị kháng chéo với các
nhóm kháng sinh khác in vitro. Thuốc ức chế tổng hợp protein của vi khuẩn do
gắn thuận nghịch vào isolecyl ARNt synthetase là enzym xúc tác sự tạo thành
isoleucyl-ARNt từ isoleucin và ARNt. [16].
Mupirocin ảnh hƣởng không đáng kể đến sự tổng hợp ADN của vi khuẩn và tổng
hợp peptidoglycan ở thành tế bào vi khuẩn, khơng tác động đến q trình
phosphoryl oxy hóa của vi khuẩn.

1.2.1 Dƣợc lý và cơ chế tác dụng:

Mupirocin là sản phẩm lên men của Pseudomonas fluorescens. Thuốc có tác dụng
kìm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở nồng độ cao. Sau khi bôi kem
mupirocin calci hoặc mỡ mupirocin 2 %, thuốc đạt nồng độ diệt khuẩn tại da. Các
nghiên cứu in vitro cho thấy mupirocin tác dụng tốt nhất ở môi trƣờng acid yếu, vì
vậy pH thơng thƣờng của da khoảng 5,5 đƣợc coi là yếu tố thuận lợi cho tác dụng
của thuốc khi bơi. Mặt khác, mupirocin có phổ kháng khuẩn hẹp, chủ yếu trên vi
khuẩn Gram dƣơng . Hầu hết các chủng Staphylococci nhƣ Staphylococcus aureus


5

(kể cả các chủng kháng methicillin và đa kháng), Staphylococcus epidermidis,
Staphylococcus saprophyticus đều nhạy cảm với thuốc [23]. Nồng độ ức chế tối
thiểu (MIC) của mupirocin đối với các chủng Staphylococcus aureus nhạy cảm
dao động từ 0,04 – 0,32 µg/ml, với các chủng Staphylococcus aureus kháng
methicilin là 0,03 – 2 µg/ml. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của mupirocin
đối với Staphylococcus aureus thƣờng cao gấp 3 – 32 lần nồng độ ức chế tối thiểu.
Thuốc có tác dụng trên phần lớn các chủng Streptococcus pneumoniae,
Streptococcus pyogenes, Streptococcus adalactiae, Streptococcus viridans với
nồng độ ức chế tối thiểu khoảng 0,12 – 2 µg/ml. Các chủng Enterococci kể cả
Enterococcus faecalis đã kháng với mupirocin. Mupirocin cũng có tác dụng trên
Listeria monocytigenes (nồng độ ức chế tối thiểu khoảng 8 µg/ml), Erysipelothrix
rhusiopathiae (nồng độ ức chế tối thiểu 2 – 8 µg/ml).
Nói chung các vi khuẩn Gram âm ƣa khí ít nhạy cảm với thuốc. Tuy nhiên,
mupirocin tác dụng tốt trên Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae,
Neisseria meningitidis, Branhamella catarrhalis, Bordetella pertussis, Pasteurella
multocida.
Thuốc khơng có tác dụng đối với các vi khuẩn kị khí kể cả Gram dƣơng và Gram
âm, Chlamydia và nấm.
Kháng thuốc: có một số rất ít chủng S. aureus đã kháng thuốc tự nhiên, nhƣng đã

có một số sau khi điều trị kháng thuốc, nhất là sau khi điều trị lâu dài. Sự kháng
thuốc này có thể xảy ra do isoleucyl transfer-RNA synthetase bị biến đổi[3].
Kháng thuốc mạnh qua trung gian plasmid (nồng độ ức chế tối thiểu > 1024
microgam/ml) của một số chủng Staphylococcus aureus và Staphylococcus
coagulase âm tính (kể cả Staphylococcus epidermidis) đã đƣợc thông báo.
1.2.2 Dƣợc động học
Khi bôi ngoài da hoặc vào niêm mạc mũi, một lƣợng thuốc rất nhỏ đƣợc hấp thu
vào vịng tuần hồn chung.
Thuốc chuyển hóa nhanh thành acid monic, một chất khơng có hoạt tính kháng
khuẩn tại gan và đƣợc thải trừ hầu hết qua thận.


6

1.2.3 Chỉ định:
Nhiễm khuẩn ngồi da do vi khuẩn có nhiều khả năng nhạy cảm.
Chốc lở, viêm da: chỉ điều trị tại chỗ khi có ít tổn thƣơng. Nếu tổn thƣơng rộng,
cần điều trị tại chỗ phối hợp với kháng sinh thích hợp tồn thân.
Viêm nang lơng, lở lt.
Tổn thƣơng da nhiễm khuẩn sau chấn thƣơng (tổn thƣơng da dài tối đa 10 cm hoặc
rộng 100 cm2).
1.3 SINH TỔNG HỢP MUPIROCIN
1.3.1 Sinh tổng hợp hợp chất Polyketid
Mupirocin là một hợp chất Polyketid [17].
Hợp chất Polyketid (PK) là một tập hợp các đơn vị có cấu trúc carboxylic [22]. PK
là sản phẩm của chuỗi phản ứng tổng hợp do một hay nhiều enzyme đặc hiệu chịu
trách nhiệm, đó là enzyme polyketid synthase (PKS). PKS là những enzyme phân
tử lớn đƣợc cấu tạo bởi nhiều modul, mỗi modul lại gồm nhiều nhóm có chức
năng khác nhau[19]. Cấu trúc của PKS tùy thuộc vào số lƣợng và trình tự các
modul cũng nhƣ loại nhóm chức hiện diện trong từng modul.

Đối với một PKS điển hình, trình tự đơn giản nhất của các nhóm chức thuộc
modul chịu trách nhiệm kéo dài cấu trúc bao gồm: một nhóm ketoacyl synthase
hay ketosynthase (KS), một nhóm acyltransferase (AT) và một nhóm acyl carrier
protein (ACP). AT xúc tác q trình vận chuyển nhóm acyl RCO- từ đơn vị cấu
trúc đến ACP trên cùng một modul. ACP sau khi liên kết với nhóm acyl tiếp tục
tham gia phản ứng Claisen với KS, giả phóng CO2. Ngồi ra , cấu trúc của
polyketid có thể đƣợc thay đổi do các nhóm nhƣ keto-reductase (KR)- chuyển keto
thành hydroxyl, nhóm dehydratase (DH)- có nhiệm vụ loại phân tử nƣớc và nhóm
enoyl redutase (ER)- chuyển liên kết đôi thành liên kết đơn. Mỗi modul chịu trách
nhiệm gắn kết một đơn vị cấu trúc vào chuỗi polyketid do gắn malonyl-CoA hay
dẫn chất tƣơng tự


7

Hình1.1 Các nhóm chức năng của một modul PKS đơn giản nhất

Các modul và nhóm chức năng của một PKS hồn chỉnh thƣờng có trình tự nhƣ
sau: modul khởi đầu AT-ACP- hay KS-AT- ACP-, modul kéo dài- KS-AT-(KRDH-ER)-ACP- và modul kết thúc- TE.
1.3.2 Quá trình sinh tổng hợp polyketid
Quá trình sinh tổng hợp polyketid gồm 3 giai đoạn
-Giai đoạn đầu, nhóm carboxy của đơn vị khởi đầu- thƣờng là acetyl-CoA hay
propyonyl-CoA- lien kết với nhóm 5’ phosphopantetheinyl SH của ACP (Hình 2)

Hình 1.2:(a)Đơn vị khởi đầu (b)đơn vị kéo dài (c)giai đoạn khởi đầu trong quá trình tổng hợp polyketid

-Giai đoạn kéo dài, chuỗi polyketid di chuyển từ nhóm ACP sang nhóm KS của
modul kế tiếp và đƣợc gắn thêm một đơn vị cấu trúc – thƣờng là malonyl-CoA hay
dẫn chất. Trong q trình này, cơng thức của polyketid có thể đƣợc bổ sung các
nhóm chức hóa học tùy thuộc vào sự hiện diện của các nhóm chức năng. Nhƣ vậy

phân tử polyketid trung gian trong quá trình tổng hợp sẽ dịch chuyển từ modul này
sang modul kế tiếp cho đến khi cơng thức hồn chỉnh. (Hình 3).


8

-Giai đoạn kết thúc, thioesterase (TE) giải phóng polyketid hồn chỉnh khỏi nhóm
ACP của modul cuối cùng [4]

Hình 1.3: Giai đoạn kéo dài trong quá trình tổng hợp polyketid. Các nhóm chức năng được đánh dấu là
các nhóm tùy chọn thêm

1.3.3 Quá trình sinh tổng hợp Mupirocin
Mupirocin là este của acid monic và acid 9-hydroxynonanoic [26]. Mupirocin là
hỗn hợp của 4 acid pseudomonic : Pseudomonic acid A ( mupirocin) (PA-A)
khoảng 90%, pseudomonic acid B (PA-B) chiếm khoảng 8%, pseudomonic acid C
(PA-C) chiếm ít hơn 2%, pseudomonic acid D (PA-D) chiếm ít hơn 2%. [9]
Hình 1.1 thể hiện cơng thức các pseudomonic acid.


9

Hình 1.4 Cơng thức các pseudomonic acid.
Pseudomonic acid B có nhóm hydroxyl ở C8, mà nó có thể là sản phẩm oxy- hóa
tiếp theo của pseudomonic acid A ( mupirocin). Pseudomonic acid C có một nối
đơi tại C10-C11, thay vì là một vịng epoxide nhƣ Pseudomonic acid A, mà nó có
thể là do thiếu đi tiến trình hoạt đơng của MupO ( đƣợc cho là một P450
oxygenase). Pseudomonic acid D có một nối đơi C4′-C5′ ở chuỗi acid 9 cacbon,
mà có thể đƣợc sinh ra do sự ngƣng tụ của phân tử malonate thứ 2 với 3-hydroxypropionate không đƣợc khử hoàn toàn bởi ER (enoyl reductase). [32]
Gene sinh tổng hợp Mupirocin là một đoạn AND dài 74kb đƣợc sắp xếp theo trình

tự. Nó gồm 35 khung đọc mở tltk Sơ đồ tổng hop Mu) trong đó có 6 khung đọc
mở lớn (ORF: open reading frames) : mmpA-F, những gen riêng biệt mupA- X và
macp A-E [37]. MmpD đƣợc cho là chứa 4 modul, mmpA chứa 3 modul [17]


10

Hình1.6 Sơ đồ tạo vịng pyran của acid monic [17]

1.4 CÁC TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MUPIROCIN
1.4.1. Công thức các tạp- danh pháp [28]
Theo USP 40 có 9 tạp liên quan của Mupirocin:

Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo Pseudomonic acid B


11

Danh pháp: 9-{(E)-3-Methyl-4-[(2S ,3R ,4S ,5R )-3,4,5-trihydroxy-5-({(2S ,3S )-3[(2S ,3S )-3-hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl}methyl)tetrahydro-2H -pyran-2-yl]but-2enoyloxy}nonanoic acid.

Hình 1.8 Cơng thức cấu tạo Pseudomonic acid C
Danh pháp: 9-((E)-4-{(2S ,3R ,4R ,5S )-3,4-Dihydroxy-5-[(4R ,5S ,E)-5-hydroxy-4methylhex-2-enyl]tetrahydro-2H -pyran-2-yl}-3-methylbut-2-enoyloxy)nonanoic
acid.

Hình 1.9 Công thức cấu tạo Pseudomonic acid D
Danh pháp: (E)-9-{(E)-4-[(2S ,3R ,4R ,5S )-3,4-Dihydroxy-5-({(2S ,3S )-3-[(2S ,3S
)-3-hydroxybutan-2-yl]oxiran-2-yl}methyl)tetrahydro-2H -pyran-2-yl]-3-methylbut2-enoyloxy}non-4-enoic acid.

Hình 1.10 Công thức cấu tạo Mupirocin impurity 1