Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dpph và xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic a trong bào tử nấm linh chi (ganoderma lucidum spore)

.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


PHAN THÀNH TRÍ

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA DPPH
VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG
ACID GANODERIC A TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI
(Ganoderma lucidum spore)

LUẬN VĂN CAO HỌC
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã ngành: 8720210

Thành phố Hồ Chí Minh – 2019

.


.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH


PHAN THÀNH TRÍ

KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA DPPH
VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A
TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI
(Ganoderma lucidum spore)

LUẬN VĂN CAO HỌC
Chuyên ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã ngành: 8720210

Thầy hướng dẫn: TS. NGUYỄN HỮU LẠC THỦY

Thành phố Hồ Chí Minh – 2019

.


.

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả
được trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất
kỳ cơng trình nào khác.
Người cam đoan

Phan Thành Trí

.


.

i

Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học - Khóa: 2017 -2019
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA DPPH
VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID GANODERIC A
TRONG BÀO TỬ NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum spore )
Học viên: Phan Thành Trí
Thầy hướng dẫn: TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy
Mở đầu: Hiện nay bào tử nấm Linh chi được sử dụng ngày càng nhiều, với mong
muốn góp phần vào việc kiểm tra chất lượng cũng như nghiên cứu thêm một số hoạt
tính sinh học của cao chiết từ bào tử, đề tài tiến hành xây dựng quy trình định lượng
acid ganoderic A, xây dựng một số chỉ tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi và khảo
sát hoạt tính chống oxy hóa cao chiết từ bào tử
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu:
Đối tượng: acid ganoderic A và các cao chiết từ bào tử nấm Linh chi.
Phương pháp nghiên cứu: Acid ganoderic A được định lượng bằng phương pháp
HPLC với kỹ thuật rửa giải đẳng dòng. Xây dựng và đề xuất một số chỉ tiêu kiểm
nghiệm bào tử nấm Linh chi dựa vào các chuyên luận trong Dược điển Việt Nam V.
Khảo sát hoạt tính chống oxy với thuốc thử là DPPH các cao chiết từ bào tử.
Kết quả: Quy trình định lượng đạt tính tương thích hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng
tuyến tính (5,0 – 60,0 ppm, R ≥ 0,995), độ chính xác (RSD ≤ 2,0 %), độ đúng (98,07
– 104,5 %). Xây dựng được một số chỉ tiêu kiểm nghiệm cảm quan; mất khối lượng
do làm khô; độ tro; định tính; định lượng acid ganoderic A. Phân đoạn cao chiết bằng
aceton có khả năng chống oxy hóa mạnh nhất IC50 là 335,7 ppm.

Kết luận: Xây dựng được quy trình định lượng acid ganoderic A và đề xuất được một
số chỉ tiêu kiểm nghiệm bào tử nấm Linh chi. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy
hóa với thuốc thử DPPH cho thấy phân đoạn cao chiết bằng aceton cho khả năng
chống oxy hóa mạnh nhất (kém vitamin C 19,8 lần).

.


.

Master’s Thesis – Academic course: 2017 – 2019
INVESTIGATE ANTIOXIDANT ACTIVITY DPPH AND
DEVELOPING A QUANTITATIVE PROCESS OF GANODERIC A ACID
IN SPORE OF GANODERMA LUCIDUM.
Phan Thanh Tri
Supervisor: PhD. Nguyen Huu Lac Thuy

Introduction: Currently, spore of Ganoderma lucidum are being used more and
more, with the desire to contribute to the quality control and study some more
biological activities of spore extract, the thesis also developed a quantitative process
of ganoderic A acid, develop some criteria for testing spore of Ganoderama lucidum
and investigate antioxidant activity extracted from spores.
Matericals and Methods:
Materical: ganoderic A acid and extracts from spore of Ganoderma lucidum.
Method: ganoderic A acid is quantified by HPLC with isocratic elution technique,
some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed based on
monographs in Vietnamese Pharmacopoeia V. The antioxidant activity of spore of
Ganoderma lucidum were investigated in vitro by 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl
(DPPH) free radical scavenging assay.
Results: The method was validated in terms of system suitability, selectivity, linearity

(5.0 – 60.0 ppm, R ≥ 0.995), precision (RSD ≤ 2,0 %), and accuracy (recovery: 98.07
– 104.5 %). some criteria for testing spore of Ganoderma lucidum were developed:
description, loss on drying, total ash, determination, assay of ganoderic A acid.
Acetone extract showed the highest antioxidant activity (IC50 = 335.7 ppm)
Conclusion: The quantitative process of ganoderic A acid and some criteria for
testing spore of Ganoderma lucidum were developed. The results of investigation of
antioxidant activity showed that acetone extract has highest activity (below than
Vitamin C 19.8 times)

.


.

MỤC LỤC
MỤC LỤC ..................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .......................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ ..............................................................x
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................3
1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI .............................................................................. 3
1.2. TỔNG QUAN VỀ BÀO TỬ NẤM LINH CHI .............................................................. 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ ACID GANODERIC A ................................................................. 12
1.4. TỔNG QUAN VỀ TÁC DỤNG CHỐNG OXY HÓA ................................................ 15

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................18
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ...................................................................................... 18
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................ 20

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................29
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG GAA TRONG BTNLC
– DỰ THẢO QUY TRÌNH ................................................................................................. 29

.


i.

3.2. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG GAA TRONG MỘT SỐ MẪU BTNLC ...................... 43
3.3. XÂY DỰNG MỘT SỐ CHỈ TIÊU KIỂM NGHIỆM BTNLC ..................................... 45
3.4. DỰ THẢO TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM BTNLC ................................................. 47
3.5. KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA VỚI THUỐC THỬ DPPH CỦA CAO
CHIẾT TỪ BTNLC ............................................................................................................. 50

3.6. BÀN LUẬN .................................................................................................................. 59

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................62
4.1. KẾT LUẬN................................................................................................................... 62
4.2. ĐỀ NGHỊ ...................................................................................................................... 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................64
PHỤ LỤC

.


.

i

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Danh mục chữ viết tắt

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu và chữ viết tắt Từ nguyên

Tiếng Việt

ACN

Acetonitril

Acetonitrile

BTNLC

Bào tử nấm Linh chi

DC

Dịch chiết

DM

Dung môi

DPPH

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

GAA

Ganoderic acid A

HPLC

High performance liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

chromatography
IC50

Nồng độ ức chế 50%

N

Số đĩa lý thuyết

PDA

Photodiode array

PĐ

Dãy điod quang
Phân đoạn

Rt

Retention time

Thời gian lưu
Diện tích pic

S
SEM

Scanning electron microscope

Kính hiển vi điện tử quét

SKĐ

Sắc ký đồ

TP

Toàn phần
Ultraviolet – Visible

UV-Vis

Quang phổ tử ngoại – khả
kiến

.

ii
.
Luận văn Thạc sĩ Dược học

Danh mục các bảng

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Tác dụng, điều trị của một số hoạt chất trong nấm Linh chi.......................5
Bảng 1.2. Hàm lượng % hoạt chất chính trong thể quả và bào tử Linh chi. ..............7
Bảng 1.3. Các nghiên cứu phân lập polysaccharid từ bào tử .....................................9
Bảng 2.4. Pha dãy dung dịch chuẩn khảo sát khoảng tuyến tính .............................24
Bảng 2.5. Dãy dung dịch thử để xác định IC50 của cao BTNLC..............................28
Bảng 3.6. So sánh lượng GAA chiết được từ các mẫu bào tử ..................................31
Bảng 3.7. Kết quả khảo sát dung môi chiết GAA ....................................................32
Bảng 3.8. So sánh GAA chiết được của phương pháp siêu âm và đun hồi lưu .......33
Bảng 3.9. So sánh GAA chiết được trong những khoảng thời gian khác nhau ........33
Bảng 3.10. Các thông số sắc ký trong các điều kiện pH khác nhau .........................34
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá tính tương thích hệ thống ...........................................38
Bảng 3.12. Kết quả khoảng tuyến tính .....................................................................41
Bảng 3.13. Kết quả độ chính xác và chính xác trung gian .......................................42
Bảng 3.14. Kết quả độ đúng ....................................................................................43
Bảng 3.15. Kết quả định lượng GAA trong một số mẫu BTNLC ............................43
Bảng 3.16. Kết quả chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô ..........................................45
Bảng 3.17. Kết quả chỉ tiêu tro toàn phần ................................................................45
Bảng 3.18. Kết quả chỉ tiêu chất chiết được trong dược liệu ...................................46
Bảng 3.19. Kết quả định lượng GAA của 3 lô khác nhau ........................................47
Bảng 3.20. Hiệu suất chiết cao toàn phần, cao phân đoạn từ bào tử Linh chi .........51
Bảng 3.21. Kết quả khảo sát độ ổn định của dung dịch DPPH ................................51
Bảng 3.22. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của vitamin C .........52

Bảng 3.23. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao TP cồn 96 % .. 53
Bảng 3.24. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao TP methanol. . 54

.


x.
Luận văn Thạc sĩ Dược học

Danh mục các bảng

Bảng 3.25. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ n-hexan .... 55
Bảng 3.26. Kết quả đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ cloroform ............55
Bảng 3.27. Kết quả đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ aceton ..................56
Bảng 3.28. Kết quả xây dựng đường tuyến tính xác định IC50 của cao PĐ methanol .. 57
Bảng 3.29. So sánh IC50 vitamin C và các loại cao ..................................................58

.


x.
Luận văn Thạc sĩ Dược học

Danh mục các hình vẽ, sơ đồ

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Nấm Linh chi 40 ngày tuổi .........................................................................4
Hình 1.2. Nấm Linh chi trưởng thành (có lớp bào tử) ...............................................4
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của lanosterol .................................................................4
Hình 1.4. Bào tử sản sinh vào cuối giai đoạn tăng trưởng của nấm Linh chi ...........6

Hình 1.5. Bào tử nấm Linh chi ...................................................................................6
Hình 1.6. Các triterpenoid có tính oxy hóa cao trong bào tử .....................................8
Hình 1.7. Triterpenoid được phân lập từ dịch chiết ether ..........................................8
Hình 1.8. Cấu trúc của acid ganoderic A .................................................................13
Hình 2.9. Bào tử nấm Linh chi thu thập từ thể quả ..................................................18
Hình 3.10. BTNLC sau khi được thu thập và kiểm tra tính đúng ngun liệu ........29
Hình 3.11. Kết quả kháo sát điều kiện phá vỡ bằng SEM .......................................30
Hình 3.12. So sánh SKĐ SKLM các mẫu BTNLC ..................................................31
Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu chuẩn GAA với pha động là ACN - H3PO4 pH 3,5 .......34
Hình 3.14. Sắc ký đồ mẫu chuẩn GAA với pha động là ACN - H3PO4 pH 4,0 .......34
Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu chuẩn GAA với pha động là ACN - H3PO4 pH 5,0 .......34
Hình 3.16. Sắc ký đồ mẫu thử với pha động là ACN - H3PO4 pH 3,5 (35 : 65) ......35
Hình 3.17. Sắc ký đồ mẫu thử với pha động là ACN - H3PO4 pH 3,5 (40 : 60) .....35
Hình 3.18. Sắc ký đồ mẫu thử với cột Inerstil C8 (250 x 4,6 mm; 5 µm) ...............36
Hình 3.19. Sắc ký đồ mẫu thử với cột Ultra BiPh (250 x 4,6 mm; 5 µm) ...............36
Hình 3.20. Sắc ký đồ mẫu thử với cột ZORBAX Eclipse XDD C18........................36
Hình 3.21. Sắc ký đồ mẫu trắng (methanol).............................................................39
Hình 3.22. Sắc ký đồ mẫu chuẩn ..............................................................................39
Hình 3.23. Sắc ký đồ mẫu thử ..................................................................................39
Hình 3.24. Sắc ký mẫu thử thêm chuẩn ...................................................................40
Hình 3.25. Phổ UV của pic GAA trong mẫu chuẩn và mẫu thử ..............................40

.


i.
Luận văn Thạc sĩ Dược học

Danh mục các hình vẽ, sơ đồ

Hình 3.26. Đường biểu diễn diện tích pic theo nồng độ GAA .................................41
Hình 3.27. Sắc ký đồ mẫu BTNLC A ......................................................................44
Hình 3.28. Sắc ký đồ mẫu BTNLC B.......................................................................44
Hình 3.29. Sắc ký đồ mẫu BTNLC mẫu thẩm định .................................................44
Hình 3.30. (a): nguyên liệu bào tử; (b): bào tử chụp dưới kính hiển vi ...................45
Hình 3.31. (c): dung dịch đối chiếu GAA; (1): thử 1; (2): thử 2; (3): thử 3 ............46
Hình 3.32 Phổ UV-Vis của dung dịch DPPH ..........................................................51
Hình 3.33. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần
trăm khả năng chống oxy hóa của vitamin C. ...........................................................52
Hình 3.34. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần
trăm khả năng chống oxy hóa của cao TP cồn 96 % BTNLC ..................................53
Hình 3.35. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần
trăm khả năng chống oxy hóa của cao tồn phần methanol BTNLC .......................54
Hình 3.36. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần
trăm khả năng chống oxy hóa của cao phân đoạn aceton. ........................................56
Hình 3.37. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính giữa nồng độ dung dịch và phần
trăm khả năng chống oxy hóa của cao phân đoạn methanol. ....................................57
Hình 3.38. So sánh IC50 giữa các cao BTNLC .........................................................58

.


.

i

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Lời cảm ơn

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được nói lời cảm ơn đến TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy đã giúp đỡ
em rất nhiều trong quá trình em thực hiện luận văn.
Em xin cảm ơn rất nhiều đến Thầy ThS.Trương Văn Đạt, Cô PGS.TS. Trần Phi
Hồng Yến và các q Thầy, Cơ, Anh Chị kỹ thuật viên trong bộ mơn Phân tích –
Kiểm nghiệm đã giúp đỡ, hỗ trợ em rất nhiều.
Cảm ơn sự giúp đỡ chân thành, nhiệt tình quý giá của các em Võ Linh Tử, Trần
Hồng Khánh Linh, Trần Thị Bích Phương, Lê Phương Thảo, Nguyễn Thanh Thảo,
bạn Đoàn Xuân Tuyền, chị Lưu Lệ Khanh, Nguyễn Hoàng Duy trong suốt thời gian
vừa qua.
Em cũng xin được cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm
Bình Dương, các anh chị em đồng nghiệp luôn hổ trợ, tạo mọi điều kiện thuận giúp
đỡ em trong suốt thời gian em thực hiện luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn.

Phan Thành Trí

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Đặt vấn đề

ĐẶT VẤN ĐỀ
Nấm Linh chi (Ganoderma lucidum Ganodermataceae) là vị thuốc quý được sử dụng
phổ biến từ lâu trên khắp thế giới. Các sản phẩm từ nấm Linh chi được sử dụng để
hỗ trợ điều trị hạ đường huyết, tăng cường miễn dịch, bảo vệ gan, hen suyễn, tiểu

đường, cao huyết áp và đặc biệt trong hỗ trợ điều trị ung thư, … [30].
Trước đây, bộ phận sử dụng chủ yếu của nấm Linh chi là thể quả, nhưng trong vài
năm trở lại đây, bào tử nấm Linh chi (Ganoderam lucidum spore) đã bắt đầu được
quan tâm. Trên thế giới, đã có một số cơng trình nghiên cứu cho thấy hàm lượng các
chất đặc trưng cho tác dụng dược lý trong bào tử cao hơn so với thể quả [18], [29].
Trong thành phần hóa học của bào tử nấm Linh chi, nhóm triterpen có vai trị quan
trọng tạo nên các tác dụng dược lý kể trên cũng như tác dụng bảo vệ tế bào gan, hạ
đường huyết, chống tăng huyết áp, kháng histamin và chống nhiễm trùng [5], trong
đó acid ganoderic A (GAA) là chất điển hình trong nhóm. Chun luận thể quả nấm
Linh chi trong USP 41 sử dụng GAA làm dung dịch chuẩn để định tính và chỉ tiêu
định lượng hàm lượng triterpenoid cũng được đánh giá dựa trên GAA [38]. Do đó,
GAA có thể được xem như một chất đánh dấu để đánh giá chất lượng loại nấm này.
Những phương pháp định lượng GAA đã được cơng bố thì đa phần là phương pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao với kỹ thuật rửa giải gradient, thời gian phân tích thường
kéo dài.
Hiện nay, chưa có tài liệu nào quy định tiêu chuẩn chất lượng cũng như là phương
pháp kiểm tra đánh giá chất lượng đối với bào tử nấm Linh chi. Vì vậy, việc xây dựng
quy trình định lượng hoạt chất, cụ thể là GAA và tiêu chuẩn hóa bào tử nấm Linh chi
là cần thiết.
Bên cạnh đó, kết quả từ những nghiên cứu về thử nghiệm hoạt sinh học là cơ sở giúp
cho việc định hướng sử dụng và sản xuất bào chế các sản phẩm từ bào tử nấm Linh
chi được hiệu quả hơn.

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Đặt vấn đề

Do đó, với mong muốn góp phần vào cơng tác kiểm tra đánh giá chất lượng và cung
cấp thêm những bằng chứng khoa học về hoạt tính sinh học của bào tử, chúng tơi
thực hiện đề tài:
“Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa DPPH và xây dựng quy trình định lượng
acid ganoderic A trong bào tử nấm Linh chi”
với các mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng quy trình định lượng acid ganoderic A từ bào tử nấm Linh chi bằng
phương pháp HPLC.
2. Tiêu chuẩn hóa bào tử nấm Linh chi.
3. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa với thuốc thử DPPH của cao chiết từ bào tử
nấm Linh chi.

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ NẤM LINH CHI
Hiện nay, nấm Linh chi là dược liệu được ưa chuộng, phổ biến ở châu Á và đang có
xu hướng phát triển ra khắp thế giới
Tên khoa học, phân loại
Tên khoa học: Ganoderma lucidum (Leyss ex.Fr) Karst, Ganodermataceae.
Tên gọi khác: linh chi thảo, thuốc trường thọ, nấm lim, vạn niên nhung.

Tên tiếng Anh: Lingzhi hoặc Reishi.
Vị trí phân loại trong giới thực vật:
Giới

Fungi

Ngành

Basidiomycota

Phân ngành Agaricomycotina
Lớp

Agaricomycetes

Bộ

Polyporales

Họ

Ganodermataceae
Chi
Lồi

Ganoderma
Ganoderma lucidum

Chu trình phát triển
Linh chi là một loại nấm hóa gỗ sống một năm hay nhiều năm. Nấm Linh chi (thể

quả) gồm phần cuống và mũ nấm.
Chu trình phát triển của nấm Linh chi qua từng giai đoạn được tóm tắt ở Sơ đồ 1.1 .

Đảm

Thể quả

Thể quả

Phối nhân trong đảm

Sợi nấm đa nhân

Đảm và bào tử

Sợi nấm đơn nhân

Sơ đồ 1.1. Quá trình phát triển của nấm Linh chi

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Hình 1.1. Nấm Linh chi 40 ngày tuổi

Tổng quan tài liệu

Hình 1.2. Nấm Linh chi trưởng thành
(có lớp bào tử)

Thành phần hóa học
Nước chiếm tới 90% trọng lượng nấm Linh chi tươi. Trong nấm Linh chi khơ, protein
và chất xơ là hai thành phần chính với tỉ lệ lần lượt là 10 – 40% và 3 – 32%, ngồi ra
cịn có carbohydrat, chất béo,.. Polysaccharid, peptidoglycan và triterpen là ba thành
phần có tác dụng chính trong trong nấm Linh chi. Tuy nhiên, hàm lượng ba nhóm
chất này thay đổi đáng kể theo mùa, vùng trồng và cách trồng [16].
1.1.3.1. Triterpen
Đây là thành phần tạo nên vị đắng đặc biệt cho Linh chi và giúp đánh giá sơ bộ chất
lượng nấm [37]. Ở Ganoderma lucidum, cấu trúc hóa học của triterpen dựa trên
lanostan, một chất chuyển hóa của lanosterol. Năm 1982, Kubota và cộng sự đã phân
lập các triterpen đầu tiên là acid ganoderic A và B. Kể từ đó, hơn 130 triterpen đã
được phân lập, chia thành 4 nhóm: acid ganoderic, ganoderiol, acid ganolucidic và
acid lucidenic. Trong đó hơn 50 triterpen là chất mới và duy nhất ở nấm Linh chi
[16].

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của lanosterol

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

1.1.3.2. Polysaccharid và peptidoglican

Polysaccarid chiếm 10 – 50% trọng lượng thể quả khơ. Có hơn 200 polysaccharid đã
được phân lập từ thể quả, bào tử, sợi nấm và từ môi trường nuôi cấy [28].
Các peptidoglycan với hoạt tính sinh học khác nhau cũng đã được phân lập từ G.
lucidum, bao gồm proteoglycan với hoạt tính chống virus, chất điều hịa miễn dịch
GLIS, glycopeptide PGY phân tách và tinh chế từ dịch chiết thể quả [28].
1.1.3.3. Các hợp chất khác
G.lucidum chứa nhiều nguyên tố vi lượng như silic, kali, calci, magnesi, mangan và
strontium. Các enzym như metallicoprotease; các nucleosid, nucleotid (adenosin,
guanosin) cũng được phân lập [16]. Hàm lượng protein trong nấm Linh chi khô
khoảng 7 – 8 (%), thấp hơn so với nhiều loại nấm khác. Các phân tử protein có tác
dụng dược lý đã được chứng minh gồm LZ-8, một loại protein ức chế miễn dịch được
tinh chế từ sợi nấm; peptide (GLP) thể hiện các hoạt động chống oxy hóa bảo vệ gan
và ganodermin có tác dụng chống nấm được phân lập từ thể quả [16].
Tác dụng dược lý
Tác dụng sinh học của nấm Linh chi theo thành phần hoạt chất được thể hiện trong
Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Tác dụng, điều trị của một số hoạt chất trong nấm Linh chi [27].
Hoạt chất

Tác dụng dược lý
Chống kết tập tiểu cầu, độc tế bào, bảo vệ tế bào gan, giảm

Triterpen

cholesterol và triglycerid, kháng virus và cải thiện trí nhớ.
Cải thiện miễn dịch, kháng ung thư, chống oxy hóa và giảm

Polysaccharid

đường huyết

Protein LZ-8 và

Điều hòa miễn dịch, kháng ung thư

sterol
Chống kết tập tiểu cầu
Adenosin

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

1.2. TỔNG QUAN VỀ BÀO TỬ NẤM LINH CHI
Lớp bào tử được sản sinh vào cuối giai đoạn tăng trưởng của nấm Linh chi. Bào tử
đóng vai trị là cơ quan sinh sản, gặp điều kiện thích hợp thì nảy mầm, phát triển
thành sợi nấm, các sợi nấm phân chia và phát triển thành thể quả.

Hình 1.4. Bào tử sản sinh vào cuối giai đoạn tăng trưởng của nấm Linh chi [31]
Đặc điểm hình thái cấu trúc
BTNLC có dạng bột mịn, màu nâu, mùi đặc trưng. Quan sát dưới kính hiển vi, bào
tử có hình trứng, thn ở đỉnh, chiều rộng từ 6,5 – 8,0 (µm), chiều dài từ 9,6 – 12,6
(µm), lỗ nẩy mầm có hình gai nhọn. Vỏ bào tử kiểu kép, vỏ ngoài màu vàng nhạt dày
0,8 – 1,1 (µm), vỏ trong dày màu vàng nâu dày 1,1 – 1,4 (µm) . Quan sát dưới kính
hiển vi ta thấy được lỗ thủng trên bề mặt lớp vỏ ngoài và mấu lồi nhỏ ở đầu đối diện
với lỗ nảy mầm – tức là ở đáy bào tử [34].

(a)

(b)

(c)

(d)

Hình 1.5. Bào tử nấm Linh chi [34]
(a) Quan sát kính hiển vi (b) Bề mặt (b) Mặt cắt dọc (c) Lớp thành kép
Thành phần chính của vỏ bào tử là hỗn hợp β-1,3, β-1,6-glucan và α-glucan dưới dạng
các amylopectin, amylose, amylodextrin và glycogen. Theo Oliviera và Zangan, các

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

glucan liên kết với nhau, liên kết với chitin tạo nên lớp vỏ bền và không thấm giúp
bảo vệ thành phần bên trong bào tử [31].
Thành phần hóa học
Mặc dù thể quả của nấm Linh chi được sử dụng rộng rãi, BTNLC chỉ được nhận ra
và sử dụng từ thế kỷ XX nhờ những kết quả trong các nghiên cứu về phương pháp
phá vỡ bào tử. Bào tử nấm có thành phần các chất tương tự như ở thể nấm trưởng
thành, tuy nhiên hàm lượng các thành phần này trong bào tử cao hơn rất nhiều. Do

đó, tác dụng sinh học của bào tử có thể cao hơn cả thể quả khi vỏ bào tử được phá vỡ
[24].
Hàm lượng nhóm hoạt chất chính có trong thể quả, bào tử ngun vẹn và bào tử đã
được phá vỡ được trình bày trong Bảng 1.2
Bảng 1.2. Hàm lượng % hoạt chất chính trong thể quả và bào tử Linh chi [18].
Nhóm chính

Thể quả

Bào tử

Bào tử được phá vỡ

% Triterpenoid

0,44 – 1,42

0,09 – 0,12

1,89 – 3,15

% Polysaccharid 0,25 – 1,42

0,41 – 0,91

1,03 – 2,25

1,82 – 3,67

0,78 – 0,90

0,96 – 1,04

% Protein
1.2.2.1. Triterpen

Đã có 29 triterpenoid được phân lập và xác định cấu trúc từ bào tử, trong đó acid
ganoderic A, acid ganoderic B, acid ganoderic C1, acid ganoderic E và
ganodermanontriol được phân lập từ dịch chiết ether [25].
Các triterpen có tính chống oxy hóa cao là acid ganoderic γ, acid ganoderic δ, acid
ganoderic ε, acid ganoderic ξ, acid ganoderic θ, acid ganoderic η cùng với acid
ganolucidic D và acid ganoderic C2 cũng được phân lập từ bào tử Linh chi [25].
Triterpenoid thường lẫn với các acid béo trong bào tử, cả hai đều là thành phần kém
phân cực do đó việc phân lập triterpenoid gặp nhiều khó khăn hơn các thành phần
hóa học khác [25]. Các dung môi dùng để chiết xuất triterpen gồm: methanol, ethanol,
aceton, cloroform, ether hoặc các hỗn hợp dung môi [16].

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

Công thức cấu tạo một số triterpenoid trong bào tử được thể hiện qua Hình 1.6 và
Hình 1.7.

Hình 1.6. Các triterpenoid có tính oxy hóa cao trong bào tử

(6): acid ganoderic δ; (7): acid ganoderic ε; (8): acid ganoderic ζ
(9): acid ganoderic η; (10): acid ganoderic θ; (11): acid ganolucidic D

Hình 1.7. Triterpenoid được phân lập từ dịch chiết ether
(1): acid ganoderic A; (2): acid ganoderic B; (3): acid ganoderic C1
(4): acid ganoderic E; (5): ganodermanontriol
1.2.2.2. Polysaccharid
Polysaccharid thường được chiết bằng nước nóng, sau đó kết tủa bằng ethanol hoặc
methanol, cũng có thể chiết bằng nước acid và kiềm. Các phân tích cấu trúc của các
polysaccharid cho thấy glucose là thành phần đường chính, tuy nhiên cũng có thể
chứa các đường khác như mannose, galactose, xylose, fucose [28].
Kết quả một số công trình phân lập polysaccharid từ bào tử Ganoderma lucidum được
trình bày trong Bảng 1.3.

.


.

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

Bảng 1.3. Các nghiên cứu phân lập polysaccharid từ bào tử
STT

Chiết xuất - phân lập Khung carbon KLPT

TLTK

1

Loại chất béo bằng β-(1-3)-glucan

[4]

1,0 x 104

ethanol 95%, chiết với
nước, loại protein sắc
ký

cột

DEAE

–

cellulose và Sephacryl
S – 200HR
2

Loại chất béo bằng β-(1-6)-glucan

1,03 x 104 [9]

ethanol 95%, chiết với
nước nóng, tủa bằng
ethanol và sắc ký cột
DEAE – cellulose,

Sephacryl S300
1.2.2.3. Các hợp chất khác
Hàm lượng dầu béo trong bào tử từ 0,07 – 0,24%. Tuy nhiên, với bào tử đã qua xử lý
phá vỏ, hàm lượng dầu béo tăng 150 – 340 lần, lên đến 27,54 – 34,17%. Thành phần
chủ yếu của dầu béo là các acid béo khơng bão hịa. Acid oleic chiếm 53,26 – 58,16%
và acid linoleic chiếm 10,69 -16,87% [22].
Các sterol chính trong bào tử gồm có ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol, ergosterol
peroxid và ergosta-7,22-dien-3β-yl pentadecanoat. Trong đó ergosterol là chất tiêu
biểu trong nhóm. Ngồi ra trong bào tử nấm Linh chi cịn có lectin, protein, peptid,
amino acid và các nguyên tố vi lượng [44].
Các nghiên cứu về tác dụng dược lý của bào tử
Phục hồi hệ thần kinh: Qin L.H. và cộng sự đưa ra các bằng chứng chứng minh rằng
bột bào tử Ganoderma lucidum có hiệu quả và an toàn trong điều trị Alzheimer [35].
Nghiên cứu của Wang G.H. và cộng sự cho rằng bột bào tử có tác dụng có lợi làm

.


0.
Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

giảm tần suất động kinh hàng tuần ở các bệnh nhân động kinh. Tuy nhiên, kết luận
này vẫn cần củng cố bởi các thử nghiệm sâu hơn [39].
Chống oxy hóa: Robert M. L. và cộng sự thông qua các thử nghiệm in vivo, kết luận
bào tử đã phá vỏ có tác dụng bảo vệ chức năng bàng quang rất tốt, dựa trên khả năng
chống oxy hóa của các hoạt chất có trong bào tử [19].
Ức chế tăng sinh tế bào ung thư, ức kế khối u: Dịch chiết từ BTNLC ức chế đáng kể
sự tăng sinh của tế bào ung thư, đặc biệt là bào tử sau khi được phá vỡ lớp vỏ có hiệu

quả hơn bào tử nguyên [41]. Tác dụng ức chế khối u của BTNLC đã được chứng
minh do các thành phần triterpenoid, acid béo và tinh dầu.
Kết quả từ nghiên cứu của Kang Li và cộng sự cho thấy các triterpenoid có trong cao
chiết ethanol bào tử đã phá vỏ là tác nhân chống ung thư đầy triển vọng trong điều trị
ung thư đại trực tràng, thông qua các cơ chế: gây độc tế bào, ức chế sự di chuyển của
tế bào ung thư, thúc đẩy chu kỳ tiêu hủy tế bào [22]. Pei Gao đã chứng minh được
hiệu quả ức chế khối u của các acid béo 19 carbon chiết được từ BTNLC bằng ethanol.
Hai trong số chúng được xác định là acid nonadecanoic và acid cis-9-nonadecenoic
[12]. Ở Trung Quốc, một số thực phẩm chức năng có thành phần là tinh dầu bào tử
nấm linh chi được chứng minh là một liệu pháp hỗ trợ điều trị hiệu quả trong nhiều
loại bệnh ung thư [13].
Kháng virus HIV: Byung-Sun Min và cộng sự đã phân lập được các triterpen gồm
ganoderic acid beta, lucidumol B, ganodermanondiol, ganodermanontriol và
ganolucidic acid A từ BTNLC, chứng minh được tác dụng ức chế sự phát triển virus
HIV thông qua ức chế enzym 1-protease [6].
Ngăn ngừa béo phì và đái tháo đường type 2: GAA trong bào tử điều chỉnh các gen
liên quan quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa cholesterol, acid béo và triglycerid
trong các mơ gan hoặc mỡ. Do đó có thể trực tiếp góp phần vào cải thiện lipid huyết
và tình trạng kháng insulin. GAA có thể là một hợp chất hàng đầu tiềm năng để phát
triển các loại thuốc để ngăn ngừa béo phì và kháng insulin [47].

.


1.
Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

Một số phương pháp phá vỡ bào tử

Theo thử nghiệm của Zhang và cộng sự, lượng hoạt chất một người hấp thu được từ
bào tử còn nguyên vẹn chỉ bằng khoảng 12% lượng hoạt chất có thể hấp thu từ bào
tử đã qua xử lý phá vỡ [46]. Do đó, để tối đa hóa sự hấp thu các hoạt chất, cần có các
phương pháp phá vỡ lớp vỏ bảo vệ. Lớp vỏ bào tử có khả năng chống lại acid và
kiềm, cũng như chống các tác nhân oxy hóa [26].
Một số phương pháp phá vỡ bào tử đã được nghiên cứu như sau:
1.2.4.1. Phương pháp CO2 siêu tới hạn
Năm 2009, Yu-Jie Fu đã nghiên cứu phương pháp phá vỡ bào tử bằng CO2 siêu tới
hạn. Các điều kiện này của quá trình phá vỡ đã được tối ưu hóa bằng thiết kế ma trận
trục giao (OAD) và kiểm tra hiệu quả phá vỡ dưới kính hiển vi điện tử quét (SEM)
với các điều kiện áp suất 35 Mpa ở 25 C trong vòng 4 h với tốc độ dòng CO2 là 10
kg/h. Bào tử sau khi được xử lý, hiệu suất chiết polysaccharide đạt 2,98 % so với bào
tử chưa xử lý là 0,94 % [11].
1.2.4.2. Phương pháp lên men
Lactobacillus plantarum đã được áp dụng để lên men phá vỡ túi bào tử. Hiệu quả phá
vỡ được đánh giá bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM). Các bào tử bị phá vỡ sau 5
– 7 ngày lên men. Kỹ thuật này đơn giản, ít chi phí và có thể được sử dụng để sản
xuất nước ép lên men với lợi khuẩn từ acid lactic kết hợp bào tử G. lucidum. Hiệu
quả phá vỡ được kiểm tra qua hình ảnh chụp được bằng kính hiển vi điện tử [7].
1.2.4.3. Phương pháp phản ứng hóa học
Các loại kiềm mạnh như natri hydroxyd được sử dụng để phá vỡ lớp vỏ bào tử dựa
vào phản ứng giữa các phân tử như chitin, lignin, cellulose ở lớp vỏ bào tử với kiềm
mạnh làm cho lớp vỏ mềm đi và dể tan rã. Ngoài ra ure và alcol hữu cơ có tác dụng
làm chất xút tác để tăng tốc độ phản ứng [40].

.


2.
Luận văn Thạc sĩ Dược học

Tổng quan tài liệu

1.2.4.4. Phương pháp siêu âm
Đây là phương pháp sử dụng rộng rãi vì đơn giản, dể thực hiện. Siêu âm làm thay đổi
cấu trúc của lớp vỏ, đồng thời sự tạo bọt khí trong lúc siêu âm tạo điều kiện thuận lợi
giúp cho dung môi thấm sâu vào trong lớp vỏ, làm tăng khả năng chiết xuất [40].
1.2.4.5. Phương pháp làm lạnh ở nhiệt độ thấp
Trong điều kiện nhiệt độ thấp, các phân tử nhỏ ở lớp vỏ bào tử thường có khuynh
hướng liên kết với các đại phân tử bằng liên kết hydro. Sự kết hợp này dẫn đến phá
vỡ các liên kết giữa các đại phân tử trước đó, làm cho lớp vỏ bào tử trở nên khơ và
giịn hơn [40].
Trên đây là một số nghiên cứu về phương pháp phá vỡ lớp vỏ BTNLC.
Mỗi phương pháp có những ưu điểm riêng nhưng vẫn có những khuyết điểm như thời
gian thực hiện kéo dài, kỹ thuật áp dụng phức tạp, chi phí cao khó áp dụng rộng rãi,
phổ biến.
Với mong muốn phá vỡ bào tử hướng tới làm nguyên liệu đóng nang, đề tài chọn
phương pháp làm lạnh ở nhiệt độ thấp kết hợp nghiền cơ học để khảo sát.

1.3. TỔNG QUAN VỀ ACID GANODERIC A
GAA thuộc nhóm hợp chất triterpenoid được tìm thấy duy nhất trong nấm Linh chi.
Chuyên luận bột quả thể nấm Linh chi trong USP sử dụng GAA làm dung dịch chuẩn
để định tính và chỉ tiêu định lượng hàm lượng triterpenoid cũng được đánh giá dựa
trên GAA [38]. Do đó, GAA có thể được xem như một đánh dấu để đánh giá chất
lượng loại nấm này.
Tính chất
Tên IUPAC: (7β,15α,25R)-7,15-dihydroxy-3,11,23-trioxolanost-8-en-26-oic acid.
Cơng thức phân tử: C30H44O7
Khối lượng phân tử: 516,675 g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 690,1 ± 55,0 (°C)

.