Nghiên cứu phân lập một số chất đối chiếu từ thân hành trinh nữ hoàng cung crinum latifolium l , amaryllidaceae

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
---------***--------

NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU
TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG
Crinum latifolium L., Amaryllidaceae

Luận văn Thạc sĩ Dược học

Thành phố Hồ Chí Minh - 2018

.


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
-----------------

NGUYỄN THỊ NGỌC HÀ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU
TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG

Crinum latifolium L., Amaryllidaceae

Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất
Mã số: 8720210

Luận văn Thạc sĩ Dược học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy
PGS. TS. Võ Thị Bạch Huệ

Thành phố Hồ Chí Minh - 2018

.


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong
luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Nguyễn Thị Ngọc Hà

.


Luận văn thạc sĩ – Khóa 2016 -2018
Ngành: Kiểm nghiệm thuốc và độc chất

Mã ngành: 8720210

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP MỘT SỐ CHẤT ĐỐI CHIẾU
TỪ THÂN HÀNH TRINH NỮ HOÀNG CUNG
Crinum latifolium L., Amaryllidaceae
Nguyễn Thị Ngọc Hà
Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy, PGS.TS. Võ Thị Bạch Huệ
Từ khóa: Thân hành, Trinh nữ hồng cung (TNHC), Crinum latifolium, kaempferol,
daucosterol.
Mở đầu: Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) là cây thuốc
quý được lưu truyền trong y học dân gian, với tác dụng kháng viêm, kháng khối u,
chống oxi hóa, giảm đau… Alcaloid và flavonoid là hai nhóm hợp chất được nghiên
cứu nhiều trong TNHC. Ở Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu thành phần
flavonoid trong thân hành TNHC. Đề tài được thực hiện với mục tiêu phân lập các
hợp chất tinh khiết và thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cao ethyl acetat chiết
từ thân hành TNHC.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nguyên liệu: Thân hành TNHC. Phương
pháp nghiên cứu: Xác định hàm lượng polyphenol trong thân hành TNHC bằng thuốc
thử Folin-ciocalteu. Khảo sát quy trình chiết flavonoid tồn phần. Từ cao flavonoid
tồn phần, bằng kỹ thuật sắc ký cột, các kỹ thuật tinh chế để phân lập các hợp chất
tinh khiết. Xác định cấu trúc bằng phổ UV, NMR, MS. Sàng lọc tác dụng kháng
khuẩn, kháng nấm và xác định MIC của cao chiết từ thân hành TNHC.
Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng polyphenol trong thân hành
TNHC bằng thuốc thử Folin – ciocalteu. Phân lập được 2 hợp chất daucosterol và
kaempferol từ thân hành TNHC. Cao ethyl acetat chiết từ thân hành có tác dụng kháng
khuẩn, kháng nấm.
Kết luận: Phân lập được hai hợp chất từ thân hành TNHC, tuy nhiên hàm lượng
flavonoid trong thân hành rất ít. Cao ethyl acetat từ thân hành TNHC cho tác dụng
kháng khuẩn, kháng nấm

.


Master’s Thesis – Academic course: 2016 -2018
Specialty: Drug Quality control & Toxicology - Code: 8720210

ISOLATION OF REFERENCE SUBSTANCES
FORM THE BULBS OF CRINUM LATIFOLIUM (L.)
Nguyen Thi Ngoc Ha
Supervisor: Dr. Nguyen Huu Lac Thuy, Assoc. Prof. Dr. Vo Thi Bach Hue
Keywords: bulbs, Crinum latifolium, kaempferol, daucosterol.
Introduction: Crinum latifolium is a widely used traditional herb in Viet Nam, which
has a number of other valuable biological effects such as antitumor, antioxidant, antiinflammatory, detoxification… Most studies have been focused on alkaloids and
flavonoids in C. latifolium. However in Vietnam, there is no study about flavonoids
in the bulbs of C.latifolium. The aim of this study to isolate pure compounds and test
for antibacterial and antifungal.
Materials and methods: Material: bulbs of C.latifolium. Methods: determination of
the total phenolic content from the bulbs of C. latifolium by Folin-ciocalteu reagent.
Investigation of flavonoid extraction process. By column chromatography,
purification techniques isolate pure compounds from ethyl acetate extract.
Identification of structure by UV, NMR and MS. Screen for antibacterial, antifungal
activity and determine the MIC of the extract from the bulbs of C. latifolium.
Results: Develop and validate procedure to determine the total phenolic content from
the bulbs of C. latifolium (L.) by Folin-ciocalteu reagent. Daucosterol and kaempferol
were isolated from the ethyl acetate extract. The ethyl acetate extract showed slight
activity against bacterial and fungal.
Conclusion: Two compounds were isolated from the bulbs of C. latifolium, the
results showed the content of flavonoids in the bulbs was low. The ethyl acetate
extract showed slight activity against bacterial and fungal.

.


i

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... iii
MỤC LỤC ....................................................................................................... vi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................ vii
DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................ viii
DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................. x
DANH MỤC SƠ ĐỒ ....................................................................................... x
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 2
1.1. Tổng quan về cây Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L.
Amaryllidaceae) .......................................................................................................... 2
1.2. Tổng quan về flavonoid trong chi Crinum và TNHC .......................................... 5
1.3. Phương pháp Folin–ciocalteu xác định hàm lượng polyphenol toàn phần .......... 9
1.4. Phương pháp khảo sát tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm ............................ 10

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 12
2.1. Nguyên liệu ........................................................................................................ 12
2.2. Vi sinh vật và môi trường thử nghiệm ............................................................... 12
2.3. Dung mơi và hóa chất ........................................................................................ 13
2.4. Thiết bị và dụng cụ ............................................................................................. 13
2.5. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................... 14

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................... 22
3.1. Xác định hàm lượng polyphenol trong thân hành TNHC .................................. 22

3.3. Khảo sát quy trình chiết và tách flavonoid ........................................................ 34
3.4. Khảo sát cấu trúc bằng phương pháp phổ nghiệm ............................................. 48
3.5. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ...................................................... 52

CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ............................................................................. 58
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 63
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 67

.


i

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Chữ tắt

Từ nguyên

Ý nghĩa tiếng Việt

13

13

Cộng hưởng từ hạt nhân C13

1

C-NMR

H-NMR

1

C-Nuclear Magnetic Resonance

H-Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân
proton

br

broad

Đỉnh rộng

d

doublet

Đỉnh đôi

DMSO

Dimethyl sulfoxid

EtOAc

Ethyl acetat

FC

Folin-Ciocalteu

HPLC

High performance liquid
chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IR

Infrared spectroscopy

Phổ hồng ngoại

MeOH

Methanol

Methanol

MHA

Mueller Hinton Agar

MHB

Mueller Hinton Broth

MIC

Minimum inhibitory concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

MS

Mass spectrum

Phổ khối

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

ppm

parts per million

Phần triệu

s

singlet

Đỉnh đơn

SKC

Sắc ký cột

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

TNHC

Trinh nữ Hoàng cung

UV- Vis

Ultraviolet - visible

Tử ngoại – khả kiến

VLC

Vacuum liquid chromatography

Sắc ký cột chân không

VS

Vanilline- sulfuric acid

.

Ethyl acetat


ii

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo nhóm flavon, flavan, chalcon. .......................................3
Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo Euflavonoid, Isoflavonoid và Neoflavonoid ................5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC ........................7
Hình 2.1. Quy trình xác định MIC bằng phương pháp pha loãng trên đĩa thạch......21
Hình 3.1. Phổ UV - Vis của mẫu chuẩn và mẫu thử .................................................23
Hình 3.2. Động học phản ứng của mẫu chuẩn và mẫu thử .......................................24
Hình 3.3. Kết quả phân tích ANOVA của quy trình tối ưu hóa................................26
Hình 3.4. Kết quả đánh giá các hệ số của phương trình hời quy tuyến tính .............26
Hình 3.5. Ảnh hưởng của yếu tố khảo sát lên hàm lượng polyphenol......................27
Hình 3.6. Các thơng số tối ưu dự đốn bởi MODDE 5.0..........................................28
Hình 3.7. Động học phản ứng của quy trình tối ưu...................................................29
Hình 3.8. Phổ UV-Vis đánh giá độ đặc hiệu .............................................................30
Hình 3.9. Sự phụ thuộc giữa độ hấp thu và nờng độ mẫu chuẩn (µg/ml) .................31
Hình 3.10. Sắc ký đồ so sánh điều kiện chiết flavonoid ở cao n-hexan ...................34
Hình 3.11. Sắc ký đờ so sánh điều kiện chiết flavonoid ở cao cloroform ................35
Hình 3.12. Sắc ký đồ so sánh điều kiện chiết flavonoid ở cao ethyl acetat ..............35
Hình 3.13. Sắc ký đờ so sánh phân đoạn EtOAc của 2 quy trình chiết flavonoid ....39
Hình 3.14. Sắc ký đồ kiểm tra 7 phân đoạn thu được từ cột chân khơng (VLC) .....41
Hình 3.15. Sắc ký đờ kiểm tra các phân đoạn rửa giải than hoạt ..............................42
Hình 3.16. Các phân đoạn sắc ký cột ........................................................................45
Hình 3.17. Sắc ký đồ kiểm tra PĐ F2.6 tinh chế bằng cột pha đảo ..........................46

Hình 3.18. Sắc ký đờ hợp chất (1).............................................................................46
Hình 3.19. Sắc ký đờ HC-2 .......................................................................................46
Hình 3.20. Sắc ký đờ kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất (1) và (2) ........................47
Hình 3.21. Phổ MS hợp chất (1) ...............................................................................48
Hình 3.22. Phổ UV – Vis hợp chất (1) ......................................................................48
Hình 3.23. Sắc ký đờ so sánh HC-1 với kaempferol chuẩn. .....................................49
Hình 3.24. Phổ MS hợp chất (2) ...............................................................................50

.


Hình 3.25. Cấu trúc daucosterol ................................................................................52
Hình 3.26. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm cao F1 ..................53
Hình 3.27. Kết quả sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm các phân đoạn......54
Hình 3.28. Mẫu chứng âm xác định MIC vi khuẩn (1) và vi nấm (2) ......................55
Hình 3.29. Kết quả thử MIC vi khuẩn của cao F1 ....................................................55
Hình 3.30. Kết quả thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.4 ......................................56
Hình 3.31. Kết quả thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.5 ......................................56
Hình 3.32. Kết quả thử MIC vi nấm cao phân đoạn F1 ............................................56
Hình 3.33. Kết quả thử MIC vi nấm cao phân đoạn F1.6 .........................................56
Hình 3.34. Kết quả thử MIC vi khuẩn cao phân đoạn F1.7 ......................................57

.


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật ......................................22
Bảng 3.2. Pha mẫu xác định bước sóng cực đại .......................................................23
Bảng 3.3. Pha mẫu đo động học phản ứng ................................................................24
Bảng 3.4. Xác định mức giới hạn của các yếu tố khảo sát .......................................25

Bảng 3.5. Kết quả 15 thí nghiệm trong thiết kế tối ưu hóa .......................................25
Bảng 3.6. Kết quả lặp lại 3 lần quy trình tối ưu ........................................................28
Bảng 3.7. Độ hấp thu động học phản ứng của quy trình tối ưu ................................29
Bảng 3.8. Pha mẫu đo độ đặc hiệu ............................................................................29
Bảng 3.9. Kết quả đánh giá tính tuyến tính mẫu chuẩn ............................................30
Bảng 3.10. Kết quả độ lặp lại ....................................................................................32
Bảng 3.11. Kết quả đánh giá độ chính xác trung gian ..............................................32
Bảng 3.12. Kết quả đánh giá độ đúng .......................................................................33
Bảng 3.13. Hiệu suất chiết (%) .................................................................................36
Bảng 3.14. So sánh cao ethyl acetat của 2 quy trình chiết flavonoid .......................39
Bảng 3.15. Các phân đoạn qua VLC .........................................................................41
Bảng 3.16. Các phân đoạn rửa giải than hoạt ...........................................................42
Bảng 3.17. Các phân đoạn qua sắc ký cột .................................................................44
Bảng 3.18. So sánh phổ 13C- NMR hợp chất (2) và tài liệu ......................................51
Bảng 3.19. Kết quả định tính kháng khuẩn và kháng nấm .......................................52
Bảng 3.20. Kết quả xác định MIC các mẫu có hoạt tính ..........................................55

DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đờ 2.1. Sơ đờ tổng qt quy trình chiết flavonoid (khơng tách alcaloid) ............17
Sơ đờ 3.1. Quy trình chiết flavonoid khơng tách alkaloid ........................................37
Sơ đờ 3.2. Quy trình chiết cao flavonoid tồn phần (có tách alcaloid) .....................38
Sơ đờ 3.3. Quy trình chiết cao ethyl acetat F1 ..........................................................40
Sơ đờ 3.4. Quy trình tinh chế cao F1 (loại tạp bằng than hoạt) ................................43

.


ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Trinh Nữ Hoàng cung (Crinum latifolium L. Amaryllidaceae) từ lâu đã là cây
thuốc quý đã được lưu truyền trong y học dân gian, thường được sử dụng với cơng

dụng kháng viêm, kháng khối u, chống oxi hóa, giảm đau… Do đó, nhiều cơng trình
nghiên cứu về thành phần hóa học và chứng minh tác dụng sinh học của các hợp chất
trong cây Trinh nữ hoàng cung (TNHC) [29], [30], [32].
Các cơng trình tập trung nghiên cứu thành phần alcaloid trong TNHC và đã có hơn
40 alcaloid được phân lập và định danh. Các hợp chất alcaloid trong TNHC đã được
chứng minh bằng thực nghiệm về tác dụng chống phân bào, ức chế sự phát triển của
các tế bào ung thư, kích thích sinh sản và hoạt hóa tế bào lypmpho T [8].
Một công dụng khác của TNHC được biết đến là khả năng kháng viêm, chống oxi
hóa của nhóm hợp chất flavonoid trong lồi này. Flavonoid là thành phần chiếm tỉ lệ
cao trong hợp chất tự nhiên có trong TNHC.
Tại Việt Nam nghiên cứu về flavonoid chưa được thực hiện trên thân hành TNHC.
Mặt khác, trên thị trường hiện nay có nhiều chế phẩm thuốc từ TNHC. Một yêu cầu
đặt ra là phải đánh giá chất lượng nguồn nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm.
Với mong muốn góp phần nghiên cứu các hợp chất trong thân hành TNHC với mục
tiêu chính là hợp chất flavonoid và mở rộng nguồn nguyên liệu thiết lập chất đối chiếu
ứng dụng trong kiểm nghiệm dược liệu, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân
lập một số chất đối chiếu từ thân hành Trinh Nữ Hoàng cung - Crinum latifolium
L., Amaryllidaceae” với các mục tiêu cụ thể sau:
1. Xây dựng quy trình định lượng polyphenol trong thân hành TNHC.
2. Khảo sát quy trình chiết flavonoid từ thân hành TNHC và phân lập các hợp chất
tinh khiết từ cao thân hành.
3. Khảo sát tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm của cao ethyl acetat và các cao phân
đoạn chiết từ thân hành TNHC.

.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (CRINUM
LATIFOLIUM L. AMARYLLIDACEAE)

1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Crinum latifolium L., Họ Thủy Tiên (Amaryllidaceae)
Tên gọi khác: Náng lá rộng, Hoàng cung trinh nữ, Tỏi lơi lá rộng
Phân loại thực vật
Theo hệ thống phân loại A. L. Takhtajan (2009) [13], TNHC có vị trí như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Hành (Liliopsida)
Phân lớp hành (Liliidae)
Liên bộ hành (Lilianae)
Bộ Thủy Tiên (Amaryllidales)
Họ Thủy tiên (Amaryllidaceae)
Chi Crinum L.
Cây Trinh nữ hồng cung (Crinum latifolium L.)
Mơ tả thực vật
TNHC là cây thân thảo, sống lâu năm nhờ thân hành hay thân rễ.
Thân hành như củ hành tây, đường kính 10–15cm, bao phủ bởi những vảy hình bản
to dai và khơ xác ở bên ngồi. Từ thân hành mọc ra nhiều củ con có thể tách ra để
trồng riêng dễ dàng.
Bẹ lá úp vào nhau thành thân giả dài khoảng 10-5 cm, có nhiều lá mỏng kéo dài từ
80-110 cm, rộng 3-8 cm, hai bên mép lá nguyên, có lượn sóng, đầu lá nhọn hoặc tù.
Gân lá song song, mặt trên lá lõm thành rãnh, mặt dưới lá có một sống lá nổi rất rõ.

.


Hoa mọc thành tán gồm 6-18 hoa, trên một cán hoa dài 30-60 cm. Cánh hoa màu
trắng pha hồng, bao hoa gồm 6 phiến bằng nhau, hàn liền 1/3 thành ống hẹp, khi nở
phiến quăn lại. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 3. Nhị 6, khơng đều, rời dính, đính trên
miệng ống bao hoa thành vịng 2. Bộ nhụy gờm 3 lá nỗn tạo thành bầu dưới 3 ơ, mỗi

ơ chứa 6-8 nỗn, đính nỗn trung trụ [2], [6].
Bộ phận dùng: Lá và thân hành
Phân bố và sinh thái: được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Thái Lan, Trung Quốc… Ở Việt
Nam cây được trồng chủ yếu ở các tỉnh từ Quảng Nam–Đà Nẵng trở vào. TNHC là
cây ưa ẩm, ưa sáng hoặc có thể chịu bóng một phần, sinh trưởng và phát triển ở khí
hậu nóng, ẩm của vùng nhiệt đới. Trung bình mỗi năm cây có thể sinh ra 6-8 lá mới
và đẻ thêm 3-5 hành con. Cây ra hoa hàng năm vào tháng 6-8 [2], [6].

1.1.2. Thành phần hóa học
Thành phần được nghiên cứu trong TNHC chủ yếu là các hợp chất alcaloid
Alcaloid : chủ yếu thuộc khung crinin, lycorin, ngồi ra cịn có các hợp chất thuộc
khung belladin, cheryllin [8].
Flavonoid: đã có 8 hợp chất được phân lập từ TNHC, chủ yếu thuộc các nhóm sau:

Flavon

Flavan

Chalcon

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo nhóm flavon, flavan, chalcon.
Nhóm coumarin: 4-senecioyloxymethyl-3,4-dimethoxycoumarin được phân lập từ
dịch chiết methanol của TNHC [28].

.


Nhóm carbohydrat: rễ chứa 2 glucan là glucan A và glucan B. Glucan A gờm 12
đơn vị glucose, cịn glucan B có khoảng 110 gốc của glucose.

1.1.3. Tác dụng dược lý
Tác dụng kháng khối u, độc tế bào
Dịch chiết C. latifolium và các phân đoạn alcaloid ức chế tế bào u lympho chuột và
kích hoạt hoạt động chống khối u của đại thực bào in vitro [30].
Dịch chiết nước TNHC có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào của các tế bào ung thư
biểu mô tuyến tiền liệt di căn ở người (IC50 = 4,5 ± 0,8 mg/ml), tế bào tuyến tiền liệt
nhạy cảm androgen LNCaP (IC50 = 2,3 ± 0,1 mg/ml) và tế bào tăng sản tuyến tiền
liệt BPH-1 (IC50 = 2,1 ± 0,04 mg/ml) [21].
Cao chiết bằng nước nóng có tác dụng kích thích sự sản sinh của tế bào lympho T, và
đặc biệt có tác dụng kích thích trực tiếp các tế bào CD4 + T trong thử nghiệm in vitro
trên bạch cầu đơn nhân to ngoại vi lấy từ máu ngoại vi của chuột thử nghiệm [18].
Tác dụng chống oxi hóa
Dịch nước C. latifolium cho thấy khả năng thu hồi gốc peroxyl mạnh, với giá trị
ORAC là 1610 ± 150 µmol TE/g [21].
Tác dụng kháng viêm
Tác dụng chống viêm của dịch chiết C. latifolium thể hiện bằng khả năng ức chế
indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO), ở liều IC50 241 ± 57 µg/ml ức chế tryptophan
suy thối và ở liều 92 ± 20 µg/ml ức chế sự phân chia các tế bào máu đơn nhân
(PBMC) [21].
Tác dụng kháng khuẩn
Dịch chiết methanol C. latifolium cho thấy tác dụng kháng S. aureus và E. coli, Tuy
nhiên tác dụng kháng khuẩn thể hiện yếu [32].

.


1.2. TỔNG QUAN VỀ FLAVONOID TRONG CHI CRINUM VÀ TNHC
1.2.1. Tổng quan về flavonoid
Flavonoid là hợp chất lớn trong thực vật, các hợp chất flavonoid thường có màu. Các
hợp chất được xếp vào nhóm flavonoid có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 gờm 2

vịng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon.
Người ta chia flavonoid thành các loại sau:
Euflavonoid bao gờm các nhóm lớn flavon, flavonol, flavanol, flavanolon, chalcon.
Isoflavonoid bao gờm các nhóm lớn Isoflavon, Isoflavan, Isoflavandiol, Isoflaven,
Coumestan, Pterocarpan.
Neoflavonoid chỉ giới hạn trong một số loài thực vật và bao gờm các nhóm 4-phenyl
chroman và 4-phenyl coumarin.

Euflavonoid

Isoflavonoid

Neoflavonoid

Hình 1.2: Cơng thức cấu tạo Euflavonoid, Isoflavonoid và Neoflavonoid

1.2.2. Các nghiên cứu về hợp chất polyphenol và flavonoid trong thân hành
chi Crinum
Thân hành là dạng thân bị biến đổi với đoạn thân thẳng đứng mọng nước và ngắn,
được bao phủ bởi các lá biến dạng mọng nước và dày gọi là vảy. Thân hành là cơ
quan dự trữ chất dinh dưỡng của cây. Ở giữa mỗi thân hành có 1 chời non ra hoa, có
các rễ mọc ở phía dưới đáy.
Các cơng trình nghiên cứu về thành phần flavonoid trong các cây thuộc chi Crinum:

.


Năm 1990, tác giả Ramadan đã phân lập được ba flavonoid là (-)-4’-hydroxy-7methoxy-8-methylflavan từ phân đoạn ether dầu hỏa và 2’,4,4’-trihydroxychalcon;
2’,4,4’-trihydroxy-3’-methylchalcon từ phân đoạn ethyl acetat trong thân hành
Crinurn augusturn Roxb [19].

Năm 2000, Ramadan sử dụng kỹ thuật sắc ký cột nhanh, và sắc ký lỏng điều chế phân
lập từ thân hành Crinum bulbispermum Milne được 4-hydroxy-2',4'-dimethoxydihydrochalcon; 4'-hydroxy-7-methoxy flavan-3-ol; 2(S),3',4'-dihydroxy-7-methoxy
flavan; isolarrien; isoliquiritigenin và liquiritigenin từ phân đoạn cloroform [33].
Năm 2009, Qian Sun và cộng sự đã phân lập được ba flavonoid là (2S)-3’,7dihydroxy-4’-methoxyflavan; 7-hydroxyflavanon; 4’,7-dihydroxy-flavon từ phân
đoạn cloroform và ethyl acetat của dịch chiết ethanol từ thân hành Crinum asiaticum
L. var. sinicum. Ngồi ra, nhóm tác giả cịn phân lập được 5 hợp chất phenolic gồm
trans-caffeic acid; 4-coumatic acid; 4-hydroxy benzoic acid; ethyl–4-hydroxyl
benzoat và 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-1,3-benzodioxol–5-carboxaldehyd [31].
Năm 2015, Sanjay jagtap đã tìm thấy rutin, isoquercetin, astragalin, phenolic acid and
kaempferol trong dịch chiết thân hành Crinum woodrowii bằng kỹ thuật HPTLC [20].
Năm 2018, acetovanillon (apocynin) and 4-hydroxyacetophenon (piceol) được phân
lập từ thân hành Crinum buphanoides và Crinum graminicola [26].

1.2.3. Các nghiên cứu về polyphenol và flavonoid trong TNHC
So với nhóm alcaloid, thì số hợp chất flavonoid TNHC được cơng bố ít hơn. Các
flavonoid TNHC được phân lập chủ yếu từ lá, hoa, chưa có cơng trình nghiên cứu
thành phần flavonoid trong thân hành.
Nhóm tác giả Nguyễn Hải Nam đã phân lập từ dịch chiết methanol được 5 hợp chất
flavonoid

là

4',7-dihydroxyflavan;

trihydroxydihydrochalcon;

4',7-dihydroxy-3'-methoxyflavan;

3',5,6-trihydroxy-4',7,8-trimethoxyflavon

và

2',4',74',7-

dihydroxy-3'-vinyloxyflavan; trong đó có 3',5,6-trihydroxy-4',7,8-trimethoxyflavon
đã được chứng minh là có tác dụng sinh học [7], [28], [29].

.


Năm 2005, nhóm tác giả thuộc phân viện hóa học các hợp chất tự nhiên tại thành phố
Hờ Chí Minh đã chiết tách được 2 flavonoid là kaemferol-3-O--D glucopyranosid
và kaemferol-3,4-O--D glucopyranosid từ dịch chiết ethanol lá TNHC [9].
Năm 2014, isoquercitrin là lần đầu được phân lập từ lá TNHC [8].

4’,7-dihydroxyflavan

4’,7-dihydroxy-3’-methoxyflavan

4’,7-dihydroxy-3’-vinyloxyflavan

5,6,3’-trihydroxy-7,8,4’-trimethoxyflavon

2’,4’,7-trihydroxydihydrochalcon

Kaempferol-3-O-β-D-glucopyranosyl

Isoquercetrin
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học các hợp chất flavonoid trong cây TNHC

.


Để chiết dược liệu với số lượng lớn dùng cho phân lập, thì phương pháp chiết thường
được sử dụng là ngấm kiệt, ngâm. Ngoài ra, phương pháp chiết siêu tới hạn đang
được ứng dụng với ưu điểm giảm thiểu dung mơi chiết, hiệu quả kinh tế.
Từ cao tồn phần, tiến hành tách thành các phân đoạn nhỏ bằng kỹ thuật sắc ký cột.
SKC chân không là một kỹ thuật biến đổi của sắc ký cột cổ điển. Về bản chất SKC
chân không là một dạng sắc ký hấp phụ trên cột pha thuận với tốc độ nhanh. Pha tĩnh
thường được sử dụng là silicagel. Dung môi khan triển n-hexan, cloroform, ethyl
acetat đến methanol. Sau đó, tinh chế hoặc tách flavonoid được dựa vào tính chất, độ
tan trong các dung mơi, dùng nhiệt độ để kết tinh các flavonoid tinh khiết.

1.2.4. Tổng quan tác dụng sinh học hợp chất flavonoid TNHC
Các hợp chất flavonoid được biết đến là những hợp chất có tác dụng chống oxi hóa
với khả năng dập dập tắt các gốc tự do và tạo phức với ion kim loại mà chính các ion
kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa khử. Ngồi ra, flavonoid còn
được chứng minh là tác dụng bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virus,
kháng khối u, chống huyết khối, chống lỗng xương [11], [23].
Ngồi tác dụng chống oxi hóa, các hợp chất flavonoid được phân lập từ TNHC được
chứng minh là có tác dụng kháng viêm, kháng khối u, kháng khuẩn...
3',5,6-trihydroxy-4',7,8-trimethoxyflavon có tác dụng ức chế yếu đối với sự hình
thành tế bào hình ống, được thực hiện trên tế bào HUVEC [28].
Astragalin ức chế tế bào viêm gây ra bởi 20 μM H2O2 và ức chế dày thành khí quản
và khí phế thũng gây ra bởi 20 μg của ovalbumin (OVA) ở chuột. Với liều uống 20
mg/kg astragalin giảm cảm ứng của F4/80/CD68/CD11b trong đường hô hấp, làm
giảm sự phát triển của α-SMA trong các đường dẫn khí xảy ra viêm và đảo ngược sự
dày lên trong đường thở. Do đó, astragalin có thể là một tác nhân điều trị chống hen
suyễn và các bệnh phổi tắc nghẽn [22].
Isoquercitrin có sinh khả dụng cao hơn quercetin và cho một số tác dụng bảo vệ hóa

học cả in vitro và in vivo, chống lại sự oxy hóa, ung thư, rối loạn tim mạch, tiểu đường
và phản ứng dị ứng. Điều trị bằng isoquercitrin đối với các tế bào KU812 kích thích

.


PMACI làm giảm đáng kể việc sản xuất histamin và các cytokine pro-inflammatory,
như interleukin (IL)-6, IL-8, IL-1β và yếu tố hoại tử khối u (TNF - tumor necrosis
factor)–α. Isoquercitrin đã ức chế sự kích hoạt NF-κB qua trung gian PMACI trong
tế bào cơ thể người [25].
Kaempferol là hợp chất polyphenol chống oxi hóa, đã được báo cáo có biểu hiện
chống lại các khối u ác tính khác nhau. Kaempferol ức chế sự biểu hiện COX-2 do
UVB gây ra ở tế bào biểu bì da JB6 P + và làm suy yếu hoạt động phiên mã của UVB
gây COX-2 và AP-1. Thử nghiệm in vitro và ex vivo kinase chứng minh rằng
kaempferol ức chế hoạt tính của Src kinase, từ đó cho thấy kaempferol là một tác
nhân chống ung thư da thông qua sự tương tác ức chế với Src. [24]. Kaempferol có
tác dụng ức chế Enterococcus faecalis ATCC 29212 với MIC 130 µg/ml [16].

1.3. PHƯƠNG PHÁP FOLIN–CIOCALTEU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG
POLYPHENOL TOÀN PHẦN
Một số phương pháp dùng xác định hàm lượng polyphenol toàn phần như Prussian
blue, Folin - Denis và Folin–Ciocalteu Reagent. Phương pháp Folin - Ciocalteu được
sử dụng phổ biển hơn với ưu điểm dễ thực hiện, nhạy hơn một số phương pháp định
lượng khác. Nhược điểm của phương pháp là ngồi hợp chất phenol ra cịn có những
hợp chất khác phản ứng với thuốc thử Folin–Ciocalteu như đường glucose, acid
ascorbic, amin thơm, sulfit, sulfur oxid ... [12].
Nguyên tắc:
Dựa trên phản ứng oxy hóa khử trong mơi trường kiềm của thuốc thử Folin–Ciocalteu
với hợp chất phenol trong đó acid phosphotungstic và acid phosphomolybdic bị khử
bởi hợp chất phenol tạo các oxyd có màu xanh lam của tungsten và molybden

(Mo8O23 – W8O23), đo độ hấp thu của dung dịch thu được sau phản ứng .
Mo(VI)/W(VI) (vàng) + e- → Mo(V)/W(V) (xanh lam)
Pha chế
Hòa tan 100 g natri tungstat (Na2WO4.2H2O) và 25 g natri molybdat
(Na2MoO4.2H2O) vào 700 ml nước cất. Thêm 100 ml acid hydrochlorid đậm đặc và

.


0

50 ml acid phosphoric 85%. Đun sôi hồi lưu trong 10 giờ. Sau đó dừng đun và rửa bộ
ngưng tụ với lượng ít nước, để nguội rời thêm 150 gam lithium sulfat Li2SO4.4H2O
và một vài giọt brom. Đun nóng hỗn hợp (không lắp bộ ngưng tụ) trong khoảng 15
phút để giải đuổi brom dư. Dung dịch thu được phải trong suốt và có màu vàng đậm
khơng có bất kì dấu vết của màu xanh nào (lá cây hay lam). Bổ sung nước vừa đủ
1000 ml và lọc qua phễu thủy tinh. Thuốc thử Folin – Ciocalteu bền vững lâu dài
thậm chí khi pha lỗng nếu được bảo quản tránh các tác nhân khử [34].
Ban đầu quy trình định lượng được thực hiện như sau: hút 1,0 ml mẫu thử, sau đó
thêm ít nhất 60 ml nước cất trong bình định mức 100 ml. Thêm thuốc thử FC (5,0 ml)
và lắc đều. Sau 1- 8 phút, thêm 15,0 ml dung dịch natri carbonat 20%, điền nước cất
đến vạch 100,0 ml và đo độ hấp thu sau khoảng 2 giờ ở bước sóng 760 nm [34].
Hiện nay, tùy vào điều kiện tiến hành, nồng độ thuốc thử FC thay đổi 10-100%, nồng
độ natri carbonat 5-29%. Các chất chuẩn có thể được sử dụng trong phương pháp
Folin-Ciocalteu như acid galic, pyrogallol, catechin, acid tannic, acid chlorogenic,
acid caffeic, acid protocatechuic, acid vanillic, acid ferulic. Bước sóng hấp thu cực
đại thay đổi theo pH mơi trường, hàm lượng polyphenol trong mẫu thử[1], [15], [17].

1.4. PHƯƠNG PHÁP KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN VÀ
KHÁNG NẤM

1.4.1. Phương pháp khuếch tán
Nguyên tắc: Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế do sự khuếch tán của chất kháng
khuẩn từ một lỗ đục/giấy trên mặt thạch vào môi trường xung quanh. Tính kháng
khuẩn được thể hiện thơng qua đường kính vịng kháng khuẩn.
Phương pháp khuếch tán gờm phương pháp đặt giấy và phương pháp đục lỗ.
Ưu điểm :
Nhanh, thực hiện được nhiều mẫu thử cùng lúc
Nhược điểm:
Phương pháp đặt giấy: dễ gây âm tính giả do mẫu thử không khuếch tán ra khỏi giấy
tẩm. Phương pháp đục lỗ: đòi hỏi kinh nghiệm khi tiến hành trách rách, nứt thạch.

.


1

Phương pháp khuếch tán trong môi trường rắn được sử dụng chủ yếu trong nghiên
cứu sơ bộ hoạt tính kháng khuẩn.
Đường kính vịng vơ khuẩn (ĐKVK) được tính theo cơng thức:
ĐKVK = ĐKVK mẫu thử - ĐKVK chứng âm
Mức độ ức chế được chia thành bốn cấp độ tùy thuộc vào đường kính trong (mm) của
vùng ức chế, với đường kính trong của đĩa (6 mm):
(+3): ức chế mạnh, đường kính trong lớn hơn 15 mm
(+2): ức chế vừa, đường kính trong 14-10 mm
(+1): ức chế yếu, đường kính trong nhỏ hơn 9 mm
(-): không ức chế

1.4.2. Phương pháp pha lỗng
Phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỏng: Một dãy nồng độ chất thử nghiệm
được pha trong môi trường lỏng, dùng pipet vô khuẩn để đưa vi khuẩn thử nghiệm

vào. Đem ủ ở 37 oC trong vòng 18-24 giờ. Nếu có tác dụng kháng khuẩn, chất thử sẽ
ức chế sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường lỏng, kết quả được đọc dựa trên
độ đục của môi trường. Phương pháp này có ưu điểm là nhanh gọn, chính xác, dễ
thực hiện nhưng chỉ áp dụng được đối với chất tan được trong nước.
Phương pháp pha lỗng trong mơi trường lỗng có thể thể được thực hiện trong ống
nghiệm (macro-broth dilution) hoặc trong đĩa 96 giếng (micro-broth dilution). [14]
Phương pháp pha lỗng trong mơi trường rắn: tạo những bản thạch có chứa chất thử
nghiệm với nờng độ tăng dần. Chấm 1-2 µl vi khuẩn thử nghiệm với nờng độ 106
CFU/ml lên các bản thạch. Sau khi ấp ở 37 ºC trong 24 giờ, quan sát sự tăng trưởng
của vi khuẩn bằng mắt thường. Nồng độ MIC là nồng độ thấp nhất ngăn cản sự tăng
trưởng của vi khuẩn quan sát được bằng mắt thường. Phương pháp có thể áp dùng
cho nhiều chủng vi khuẩn trên cùng đĩa thạch.

.


2

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN LIỆU
Thân hành cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium) được thu hái tại Bình Định
vào tháng 3/2016. Dược liệu được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi hoặc sấy đến độ ẩm thích
hợp, xay thành bột thô để chiết xuất, phân lập.

2.2. VI SINH VẬT VÀ MÔI TRƯỜNG THỬ NGHIỆM
2.2.1. Vi sinh vật
Vi khuẩn
Escherichia coli ATCC 25922
Klebsiella pneumoniae ATCC 35657
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

Staphylococcus aureus ATCC 29213
Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (MRSA) ATCC 43300
Vi nấm
Candida albicans ATCC 10231

2.2.2. Môi trường
Môi trường MHA cho vi khuẩn và môi trường MHA bổ sung glucose 2% cho vi nấm.
Môi trường MHA
Cao thịt

2,0 g

Casein thủy phân

17,5 g

Tinh bột

1,5 g

Agar

17,0 g

Nước cất

vừa đủ 1000 ml

Dung dịch glucose
Glucose

40g

Nước cất

100 ml

1 ml dung dịch glucose dùng cho 20 ml MHA

.


3

2.3. DUNG MƠI VÀ HĨA CHẤT
- Dung mơi chiết và phân lập flavonoid: Ethanol, n-hexan, cloroform, ethyl acetat,
HCl 1%, dung mơi do Trung Quốc sản xuất.
- Dung mơi hóa chất sử dụng tinh chế flavonoid: Methanol, ethanol, n-hexan,
cloroform, ethyl acetat, diethyl ether, aceton do Merck sản xuất.
- Dung môi và hóa chất dùng cho thử nghiệm bằng phương pháp HPLC: acetonitril,
methanol đạt tiêu chuẩn HPLC do Merck sản xuất.
Chất đối chiếu acid gallic của nhà sản xuất của Trung Quốc (hàm lượng 99,0%)

2.4. THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ
Tên dụng cụ và thiết bị
Các dụng cụ thủy tinh

Nguồn gốc
Duran-Pháp

Bình chiết ngấm kiệt (30 x 50 x180)
Silica gel sắc ký cột

Đức

Đèn soi tử ngoại với bước sóng 254 và 365 nm

Nhật

Máy cơ quay Buchii Rotavapor R-220

Thụy Sĩ

Cột thủy tinh, kích thước 5 x 30 cm
Máy đo phổ khối LC–MS Agilent 1260

Mỹ

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AVANCE 500

Mỹ

Máy đo phổ hờng ngoại FTIR – 8201 PC Shimadzu

Nhật

Cân phân tích Sartorius

Đức

.


4

2.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.5.1. Xác định hàm lượng polyphenol trong thân hành TNHC
2.5.1.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của thân hành TNHC theo quy trình mơ tả
trong giáo trình “Phương pháp nghiên cứu dược liệu” của bộ môn Dược liệu, Khoa
Dược, Đại học Y Dược TP.HCM, năm 2013 [3].

2.5.1.2. Xác định hàm lượng polyphenol trong thân hành TNHC
Xây dựng quy trình định lượng bằng phương pháp Folin-Ciocalteu
Pha chế các dung dịch thử nghiệm
Dung dịch mẫu thử (Dung dịch T)
Cân chính xác 2,0 g bột thân hành TNHC cho vào erlen 100 ml, thêm 70 ml ethanol
70%, siêu âm ở 50 oC trong 60 phút, để lắng, lọc lấy phần dịch trong. Chuyển phần
dịch lọc đã nguội vào bình định mức 100 ml, thêm ethanol 70% vừa đủ 100 ml.
Dung dịch đối chiếu acid gallic (Dung dịch A)
Cân chính xác 25 mg acid gallic vào bình định mức 50 ml. Thêm ethanol 70%, siêu
âm để hòa tan. Để nguội, thêm ethanol 70% đến vạch, lắc đều, được dung dịch đối
chiếu có nờng độ 0,5 mg/ml (500 µg/ml). Từ dung dịch đối chiếu 0,5 mg/ml pha loãng
để được dung dịch chuẩn có nờng độ 75 µg/ml. Bảo quản tránh ánh sáng.
Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại, thời gian phản ứng
Quét phổ UV – Vis từ 400 – 900 nm, để xác định bước sóng hấp thu cực đại với mẫu
trắng là thuốc thử FC, Na2CO3 và ethanol 70%.
Tối ưu hóa quy trình định lượng
Chọn 3 yếu tố với 3 mức độ thấp, vừa, cao. Sử dụng phần mềm MODDE 5.0 theo mơ
hình đáp ứng bề mặt Box – Behken để thiết kế 15 thí nghiệm chọn ngẫu nhiên trong

tổng 27 thí nghiệm.
Thực hiện 15 thí nghiệm đã thiết kế, nhập số liệu thu được và phân tích kết quả dựa
trên các phân tích tốn học của phần mềm MODDE 5.0.

.


5

Thực hiện 3 lần với điều kiện tối ưu, chứng minh giá trị 3 lần đo khác nhau khơng có
ý nghĩa thống kê dựa trên phương pháp so sánh t – test so với giá trị dự đốn.
Tính tốn kết quả
Hàm lượng của polyphenol toàn phần (TP) trong thân hành TNHC được tính:
𝑇𝑃 =

𝐴𝑇
𝑚𝐶 × 𝐶%
𝐷𝑇
×
×
× 100
𝐴𝐶 𝑚 𝑇 × (100 − 𝐻%) 𝐷𝐶

AT : độ hấp thu của mẫu thử,
Ac : độ hấp thu của mẫu chuẩn
mC : khối lượng chuẩn (mg)
mT : khối lượng mẫu thử (g)
C% : độ tinh khiết của chuẩn acid gallic (%)
H% : độ ẩm dược liệu (%)
DC : độ pha loãng của chuẩn

DT : độ pha loãng của thử
Kết quả TP biểu diễn bằng mg acid gallic/ 100 g dược liệu khô (mg GAE/100 g)
Thẩm định quy trình định lượng polyphenol bằng phương pháp FolinCiocalteu:
Tính đặc hiệu
Khảo sát phổ UV –VIS của mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn.
Tính tuyến tính
Pha chế và xác định độ hấp thu của bảy dung dịch chuẩn có nờng độ tăng dần ở bước
sóng cực đại rời vẽ đường biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thu vào nồng độ, xây
dựng phương trình hời quy.
Sử dụng phân tích hời qui với trắc nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của hệ số hời qui
trong phương trình hời qui và trắc nghiệm F để kiểm tra tính tương thích của phương
trình hời qui.

.