Nghiên cứu sự phân bố của các chủng vi sinh vật sinh phytase trong một số loại đất tại huyện hòa vang, thành phố đà nẵng

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
---------------------------------------

BÙI THỊ NGUYÊN NỮ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG
VI SINH VẬT SINH PHYTASE TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐẤT
TẠI HUYỆN HÒA VANG, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ
SINH THÁI HỌC

Đà Nẵng – Năm 2018


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
---------------------------------------

BÙI THỊ NGUYÊN NỮ

NGHIÊN CỨU SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC CHỦNG
VI SINH VẬT SINH PHYTASE TRONG MỘT SỐ LOẠI ĐẤT
TẠI HUYỆN HÒA VANG, THÀNH PHỐ ĐÀ NẴNG
Chuyên ngành : SINH THÁI HỌC
Mã số

: 8420120

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. NGUYỄN HUY THUẦN
2. PGS. TS ĐỖ THU HÀ

Đà Nẵng – Năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả luận văn

BÙI THỊ NGUYÊN NỮ




DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CFU

: Colony Foming Unit (Đơn vị khuẩn lạc)

CT

: Công thức

HSCC

: Hệ sợi cơ chất

HSKS

: Hệ sợi khí sinh

MT

: Mơi trường

NM

: Nấm mốc

STT

: Số thứ tự

TB

: Trung bình

TP

: Thành phố

VK

: Vi khuẩn

VKTSHK

: Vi khuẩn tổng số hiếu khí

VSV

: Vi sinh vật

VSVHK

: Vi sinh vật hiếu khí

VSVTS

: Vi sinh vật tổng số

VSVTSHK

: Vi sinh vật tổng số hiếu khí


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số hiệu
bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Phytase từ những nguồn khác nhau

12

2.1

Thành phần phản ứng PCR

26

2.2

Mã số trình tự 18S rARN của một số loài nấm mốc

28

Số lượng, thành phần các chủng VSV sinh phytase trong đất tại
3.1

một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (từ

30

tháng 03/2017 đến tháng 05/2017)
Số lượng, thành phần các chủng VSV sinh phytase trong đất tại
3.2

một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (từ

31

tháng 06/2017 đến tháng 08/2017)
3.3

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số
xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 03/2017)

34

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số
3.4

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 04/2017)

Phụ lục

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số
3.5

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 53/2017)

Phụ lục

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số
3.6

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 04/2017)

Phụ lục

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số
3.7

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 07/2017)

35

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số
3.8

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 08/2017)

Phụ lục

Số lượng vi sinh vật sinh phytase phân bố trong đất tại một số
3.9

xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (tháng 09/2017)

36

Số lượng VSV sinh phytase theo thành phần cơ giới đất tại một
3.10

số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

37

Số hiệu

Tên bảng

bảng

Trang

Số lượng nấm môc sinh phytase theo thời gian (tháng) tại một
3.11

số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng (x 104

39

CFU/g)
Số lượng nấm mốc sinh phytase theo độ ẩm đất tại một số xã
3.12

thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

43

Khả năng sinh enzyme phytase của một số chủng NM và VK
3.13

trên mơi trường PSM có bổ sung CaCl2

47

Đặc điểm ni cấy và hình thái chủng VK-2 sinh phytase
3.14

mạnh

52

Đặc điểm hình thái chủng nấm mốc NM-1, NM-4 sinh phytase
3.15

mạnh

53

Hoạt độ enzyme của chủng MN-1, MN-4 và VK -2
3.16

qua các thời gian ni cấy

57

Chiều cao trung bình cây lúa qua các công thức sau 7 ngày
3.17

gieo trồng

62


DANH MỤC CÁC HÌNH

Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

1.1

Phản ứng xúc tác của enzyme phytase

8

1.2

Bản đồ hành chính huyện Hịa Vang, thành phố Đà Nẵng

18

2.1

Chương trình chạy PCR

27

3.1
3.2

Một số chủng nấm mốc sinh phytase trong đất phân lập được tại

một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng
Một số chủng vi khuẩn sinh phytase trong đất phân lập được tại
một số xã thuộc huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng

33
33

3.3

Động thái nấm mốc sinh phytase theo thời gian (tháng)

40

3.4

Động thái nấm mốc sinh phytase theo độ ẩm

44

3.5

Tỉ lệ % các chủng vi khuẩn, nấm mốc có khả năng sinh phytase
mạnh

48

3.6

Hai chủng vi khuẩn có khả năng sinh phytase mạnh

49

3.7

Bốn chủng nấm mốc có khả năng sinh phytase mạnh

49

3.8
3.9
3.10
3.11
3.12

Phân giải acid phytate của chủng NM-1 và NM-4 phân lập được
từ mẫu đất tại xã Hòa Tiến và Hòa Châu
Phân giải acid phytate của chủng NM-6 và NM-7 phân lập được
từ mẫu đất tại xã Hoà Khương
Phân giải acid phytate của chủng VK-2 và VK-4 phân lập được
từ mẫu đất tại xã Hòa Châu và Hịa Sơn
Khuẩn lạc của chủng VK2 trên mơi trường LB sau 3 ngày ni
cấy
Hình ảnh ống giống của chủng VK2 sau 3 ngày nuôi cấy

51
51
52
54
54

Chủng nấm mốc NM-1 nuôi cấy trên môi trường PDA
3.13

sau 2 ngày nuôi cấy

55

3.14

Cơ quan sinh sản của chủng nấm mốc NM-1 dưới kính hiển vi

55

3.15

Chủng nấm mốc NM-4 nuôi cấy trên môi trường PDA

56


Số hiệu

Tên hình

hình

Trang

Sau 2 ngày ni cấy
3.16

3.17
3.18
3.19
3.20

Cơ quan sinh sản của chủng nấm mốc NM-4 dưới kính hiển vi
Thu dịch lỏng nuôi cấy các chủng tuyển chọn qua thời gian nuôi
cấy
Dịch nuôi cấy lỏng qua 120 giờ nuôi cấy
Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của mẫu
NM1
Kết quả phản ứng PCR nhân gen mã hóa18S rARN của mẫu
NM4

56
57
57
59
59

Giản đồ phả hệ chủng nấm NM1, NM4 và một số chủng nấm
3.21

khác dựa trên so sánh trình tự nucleotide của gen mã hóa 18S

60

rARN
3.22
3.23

Các khay CT1, CT2, CT3, CT4 theo thứ tự lần lượt từ 1, 2, 3, 4
sau 7 ngày gieo trồng
Chiều cao các cây ngẫu nhiên của các khay CT1, CT2, CT3, CT4
theo thứ tự lần lượt từ 1, 2, 3, 4

63
63


1

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Phospho là một chất dinh dƣỡng quan trọng đối với sự sinh trƣởng và phát
triển của thực vật, nhƣng hầu hết phospho có trong đất cây trồng không hấp thu
đƣợc do sự cố định nhanh chóng của các thành phần hữu cơ và vơ cơ trong đất [20].
Sự thiếu hụt phospho dẫn đến một số thay đổi về hình thái và sinh lý, ảnh hƣởng
đến sự tăng trƣởng, năng suất và sự sống còn của cây trồng, điều này là một điểm
yếu cho ngành nơng nghiệp trên tồn thế giới. Ngày nay, việc sử dụng rộng rãi các
loại khoáng chất để sản xuất phân bón hóa học bổ sung phospho cho cây trồng trở
nên phổ biến. Dựa trên mức sử dụng hiện tại, ƣớc tính trữ lƣợng khống chất sẽ bị
cạn kiệt trong vịng 50 năm tới [15]. Chính vì vậy, nghiên cứu chế phẩm sinh học
cải thiện sự hấp thụ và sử dụng phospho của thực vật sẽ tác động đáng kể đối với
ngành nông nghiệp và môi trƣờng.
Phytate là dạng lƣu trữ chính của phospho (60-90%) trong thực vật và là
nguồn ơ nhiễm phospho chủ yếu trong phân gia súc [11]. Các dạng phytate khác
nhau tồn tại dƣới dạng đất sét hoặc kết tủa dƣới dạng các muối sắt, muối nhơm có
tính axit hoặc các muối canxi khơng hồ tan trong đất. Hơn nữa, phytate có khả
năng tạo phức với các ion kim loại cần thiết cho độ phì của đất nên có ảnh hƣởng

xấu đến sự tăng trƣởng của thực vật [25].
Phytase là enzyme có tác dụng thủy phân phytate tạo thành phospho và myoinositol, vì thế có thể sử dụng phytase để thay thế các chất bổ sung phosphate hiện
có. Phytase cũng có thể đƣợc khai thác vì khả năng hịa tan các khống chất thiết
yếu trong đất và có tác dụng chống lại khả năng tạo phức của phytate [25]. Vào năm
2002, Idriss cũng đƣa ra các dữ liệu để chứng minh lƣợng phytase đƣợc tiết ra từ vi
khuẩn Bacillus amyloliquefaciens FZB45 kích thích sự phát triển của cây bắp con
trồng trong hệ thống vô trùng chứa môi trƣờng kiểm soát phosphate bằng cách bổ
sung acid phytate [29]. Những nghiên cứu này có ý nghĩa quan trọng trong việc
chứng minh vi sinh vật sản sinh enzyme phytase trong đất có ảnh hƣởng tích cực
đến dinh dƣỡng phospho trong cây. Các nghiên cứu còn chỉ ra rằng, enzyme


2

phytase cịn góp phần giúp cho cây có thể hấp thụ nguồn nitơ và kali tốt hơn, và
đƣợc xem nhƣ một nguồn thay thế phân bón hóa học [39].
Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy ở nhiều lồi vi sinh
vật, mơ thực vật và động vật. Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thƣờng thấy nhất ở
nấm mốc đặc biệt ở các loài thuộc chi Aspergillus. Phytase cũng đã đƣợc tìm thấy
trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter aerogene, Pseudomonas sp, Bacillus
subtilis,

Klebsiella,

Escherichia

coli,

Enterobacter

sp

và

Bacillus

amyloliquefaciens. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là những chủng thuộc về
chi Bacillus và Enterobacter [6] [10].
Thành phố Đà Nẵng có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm rất thuận lợi cho vi sinh vật
nói chung và vi sinh vật sinh phytase nói riêng phát triển. Vì vậy tại thành phố Đà
Nẵng có thể tìm thấy nhiều chủng vi sinh vật có khả năng sinh nhiều enzyme, chất
kích thích sinh trƣởng thực vật, chất kháng sinh quý hiếm. Do đó việc phân lập khu
hệ vi sinh vật đất tại Đà Nẵng sẽ có tiềm năng lớn trong tuyển chọn đƣợc các chủng
vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase mạnh, đồng thời, tìm kiếm các nguồn
gen quý nhằm phục vụ cho các công tác nghiên cứu chế phẩm sinh học thay thế
phân bón hóa học cung cấp phospho cho cây trồng tại địa phƣơng.
Xuất phát từ những lí luận khoa học và thực tiễn nêu trên, thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu sự phân bố của các chủng vi sinh vật sinh phytase trong một số loại
đất tại huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng”.
2. Mục tiêu đề tài
Xác định sự phân bố của các chủng vi sinh vật sinh phytase trong một số loại
đất tại huyện Hòa Vang, thành phố Đà Nẵng làm cơ sở khoa học cho việc đề xuất
các biện pháp ứng dụng các chủng vi sinh vật có khả năng sinh phytase mạnh tại địa
phƣơng một cách hợp lý.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
- Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho các nghiên cứu trƣớc về sự phân bố của
các chủng vi sinh vật sinh phytase.


3

- Các chủng vi sinh vật phân lập sẽ là nguồn giống để ứng dụng tạo chế phẩm
sinh học thay thế phân bón hóa học bổ sung phospho cho cây trồng tại địa phƣơng
một cách hợp lí.
4. Cấu trúc của luận văn
Luận văn có 72 trang gồm các phần sau:
- Mở đầu (3 trang)
- 3 chƣơng:
+ Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu (16 trang)
+ Chƣơng 2: Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu (9 trang)
+ Chƣơng 3: Kết quả và biện luận (36 trang)
- Kết luận và kiến nghị (2 trang)
- Tài liệu tham khảo (6 trang)
- Phần phụ lục


4

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. SỰ PHÂN BỐ CỦA VI SINH VẬT TRONG ĐẤT [2], [8], [12]
Đất và VSV đất có mối quan hệ mật thiết với nhau. Đất là mơi trƣờng thích
hợp nhất đối với VSV. Ngồi ra, nhiệt độ, độ ẩm, pH đất cũng ảnh hƣởng đến sự
phát triển của VSV, số lƣợng và kết cấu khu hệ VSV thƣờng xuyên thay đổi tùy
theo từng vùng sinh thái, từng loại đất, độ cao…[12]. Sự phân bố của VSV trong
đất có thể chia ra theo các kiểu phân loại sau đây:
1.1.1. Phân bố theo đặc điểm và tính chất của đất
Các loại đất khác nhau có điều kiện dinh dƣỡng, độ ẩm, độ thống khí, pH
khác nhau. Vì vậy sự phân bố của VSV cũng khác nhau. Đất giàu dinh dƣỡng,

thống khí, có độ ẩm, độ pH thích hợp thì VSV phát triển tốt, dẫn đến số lƣợng
nhiều. Ngƣợc lại, đất nghèo dinh dƣỡng, khô cằn, kết cấu đất chặt thì VSV ít. Đất
vùng đồi núi do bị rửa trơi, xói mịn mạnh, đất nghèo dinh dƣỡng nên số lƣợng VSV
ít hơn đất vùng đồng bằng [2], [12].
Ở đất lúa nƣớc, tình trạng ngập nƣớc lâu ngày làm ảnh hƣởng đến độ thống
khí, chế độ nhiệt, chất dinh dƣỡng trong đất... Chỉ có một lớp mỏng ở trên, khoảng
0 - 3 cm là có q trình ơxy hóa. Cịn ở tầng dƣới q trình khử ơxy chiếm ƣu thế.
Bởi vậy, trong đất lúa nƣớc các loại VSV kị khí phát triển mạnh và có số lƣợng
nhiều hơn VSV hiếu khí.
Ở đất trồng hoa màu, khơng khí lƣu thơng tốt, q trình ơxy hóa chiếm ƣu thế,
do vậy các lồi VSV hiếu khí phát triển mạnh hơn các lồi VSV kị khí. Tỷ lệ giữa
vi khuẩn hiếu khí và kị khí thƣờng lớn hơn 1.
1.1.2. Phân bố theo chiều sâu
Số lƣợng và thành phần VSV trong đất thay đổi theo độ sâu của các tầng đất.
Trên bề mặt đất chịu tác động trực tiếp của ánh nắng mặt trời và độ ẩm khơng thích
hợp nên số lƣợng và thành phần VSV rất ít do khơng phát triển hoặc bị tiêu diệt.
VSV thƣờng tập trung nhiều nhất ở tầng canh tác, ở độ sâu 5 - 20cm so với bề mặt.
Bởi đây, là nơi tập trung các rễ cây, chất dinh dƣỡng, có cƣờng độ chiếu sáng, nhiệt


5

độ, độ ẩm thích hợp nhất. Càng xuống sâu VSV càng ít, chủ yếu là loại kị khí, chịu
đƣợc áp suất lớn. Riêng đối với đất bạc màu, ở tầng đất 20 - 40cm có số lƣợng VSV
nhiều hơn tầng 5 - 20cm do có nhiều chất hữu cơ vì ít có hiện tƣợng rửa trơi. Tuy
nhiên, sau đó giảm dần ở các tầng đất dƣới.
Thành phần VSV cũng thay đổi theo tầng đất: ở tầng mặt vì có nhiều ơxy nên
thƣờng tập trung các nhóm VSV hiếu khí nhƣ vi khuẩn hiếu khí, vi nấm, xạ khuẩn.
Càng xuống sâu, các nhóm VSV hiếu khí càng giảm mạnh. Ngƣợc lại, các nhóm vi
khuẩn hị khí nhƣ vi khuẩn phản nitrat hóa phát triển mạnh ở độ sâu 20 - 40cm.

1.2. ĐỘNG THÁI CỦA VI SINH VẬT ĐẤT [12]
Một trong những đặc tính của VSV trong đất là tính mẫn cảm đối với môi
trƣờng sống, bởi vậy những thay đổi của mơi trƣờng sống đều ảnh hƣởng đến q
trình hoạt động sống của VSV đất.
Thành phần và số lƣợng VSV trong đất diễn biến rất phức tạp, nó phụ thuộc
nhiều yếu tố khác nhau nhƣ nhiệt độ, độ ẩm đất, độ ẩm khơng khí, theo địa hình, độ
sâu của loại đất, thành phần cơ giới đất,…
1.2.1. Động thái của vi sinh vật theo thời gian
Thành phần và số lƣợng VSV đất đạt cực đại vào mùa xuân, khoảng tháng 3,
4; sau đó giảm vào mùa hè và tiếp tục tăng dần vào mùa thu và đạt cực tiểu vào
chính đơng. Lý do của sự tăng giảm này là do thời tiết, khí hậu nhƣ nhiệt độ và độ
ẩm trong đất, ngồi ra cịn phụ thuộc rất lớn vào q trình khống hóa trong đất.
Theo nhiều nghiên cứu cho thấy, vào mùa xuân, tổng số VSV đạt 107 – 109
TB/g đất vào tháng 3 đến tháng 5. Lúc này nhiệt độ trong đất rất thích hợp cho VSV
phát triển, sẽ làm gia tăng hoạt động sống của VSV làm cho quá trình khống hóa
đất sẽ tăng theo, đồng thời cũng làm tăng sự hịa tan của các chất khống - sản
phẩm cuối cùng của q trình phân hủy, chuyển hóa trên cho ra rất nhiều dinh
dƣỡng, cung cấp cho VSV phát triển mạnh, dẫn đến số lƣợng VSV đạt cực đại.
Vào mùa hè, trời hanh khơ, nóng bức, khơng thích hợp cho sự sinh trƣởng,
phát triển của VSV, nhất là trên đất xám bạc màu. Thời tiết khô hạn ảnh hƣởng xấu
đến VSV, dẫn đến số lƣợng VSV vào mùa hè (tháng 7, 8) thấp hơn ở chính giữa


6

mùa xuân.
Vào mùa thu, thời tiết dịu mát, không nắng gay gắt nhƣ mùa hè làm cho hoạt
động sống của VSV cũng có phần đƣợc cải thiện, dẫn đến số lƣợng VSV ở màu thu
cao hơn chút ít so với mùa hè.
Vào mùa đông, tiết trời lạnh, ảnh hƣởng xấu đến hoạt động sống của VSV,

dẫn đến số lƣợng VSV vào mùa đông là thấp nhất trong năm. Ở trên một số loại đất,
kết quả phân tích chỉ đạt 104 – 105 TB/g đất.
1.2.2. Động thái của vi sinh vật theo độ ẩm
Động thái của VSV dao động rất lớn theo độ ẩm khơng khí và độ ẩm mơi
trƣờng đất. VSV trong đất phát triển mạnh ở độ ẩm môi trƣờng khoảng 50 – 60%,
nằm ngoài khoảng độ ẩm này đều ảnh hƣởng đến hoạt động sống của VSV [4].
Độ ẩm quá thấp hoặc quá cáo đều ức chế VSV, chỉ có nấm mốc và xạ khuẩn là
có thể phát triển đƣợc ở điều kiện khô. Ở các ruộng lúa nƣớc, các loại vi khuẩn đã
thích hợp với độ ẩm cao, tuy nhiên, những ruộng có tính thấm nƣớc cao đƣợc làm
ải, sự phát triển của VSV cũng tốt hơn, đặc biệt là cân đối đƣợc tỉ lệ giữa VSV hiếu
khí và VSV kị khí [1] [2].
Theo Lê Xuân Phƣơng: độ ẩm trong đất cũng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và
phát triển của VSV đất. Đất vùng nhiệt đới thƣờng có độ ẩm 30 – 85%, thích hợp
với đa số VSV [12]. Vì thế, trong mỗi gam đất thƣờng có hàng chục triệu đến hàng
tỉ tế bào VSV bao gồm nhiều nhóm, khác nhau về vị trí phân loại cũng nhƣ hoạt
tính sinh lý, sinh hóa.
Ngồi ra, VSV cịn góp phần tham gia duy trì độ ẩm cho đất. Các nhà khoa
học thuộc Viện Công nghệ sinh học đã phân lập đƣợc một bộ going VSV màng
nhầy có khả năng này. Ví dụ chủng nấm men Lipomyces PT7.1 đƣợc phân lập từ
vùng đất trống đồi trọc tại huyện Hạ Hịa, tỉnh Phú Thọ có ƣu điểm là tạo màng
nhầy trong điều kiện đất khô hạn và sinh trƣởng ở nhiệt độ cao, đặc biệt hỗ trợ cho
việc phủ xanh đất trống đồi trọc [7].


7

1.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PHYTASE
1.3.1. Enzyme từ vi sinh vật [6], [7], [10]
Tế bào VSV có chứa rất nhiều enzyme. Trong q trình ni cấy các enzyme
đƣợc tạo thành trong tế bào VSV gọi là enzyme nội bào và một số tiết vào môi

trƣờng là enzyme ngoại bào để phân huỷ cơ chất giúp cho tế bào dễ đồng hoá. VSV
là nguồn sản xuất enzyme tƣơng đối lý tƣởng, nó có nhiều ƣu việt so với các nguồn
động vật và thực vật.
Vì tốc độ sinh sản của VSV rất nhanh, có thể thu đƣợc một khối lƣợng lớn tế
bào trong thời gian ngắn, kích thƣớc tế bào VSV nhỏ khối lƣợng nhỏ nên tỷ lệ
enzyme trong tế bào là tƣơng đối lớn. Trong một thời gian ngắn có thể sản xuất
đƣợc số lƣợng lớn chế phẩm enzyme.
Các enzyme của VSV có hoạt tính rất cao, ngƣời ta đã tính rằng trong 24 giờ
có những VSV có thể chuyển hố một lƣợng thức ăn gấp từ 30 đến 40 lần so với
trọng lƣợng cơ thể của chúng.
Những nguyên liệu dùng để nuôi cấy VSV thƣờng rẻ tiền nhƣ bã thải cơng
nghiệp, ngun liệu tự nhiên (dầu mỏ, khí đốt...)
Có thể điều khiển các điều kiện tối ƣu trong quá trình ni cấy để có thể thu
đƣợc hiện suất cao trong sản xuất. Trong nhiều năm qua các chế phẩm enzyme từ
VSV đã dần dần thay thế chế phẩm enzyme lấy từ động vật, thực vật.
Các chế phẩm enzyme đƣợc sản xuất từ VSV đã đƣợc ứng dụng trong trên 30
ngành cơng nghiệp khác nhau. Những enzyme đó chủ yếu là các enzyme thuỷ phân:
Phytase, Amylase, Protease, phosphatase, xenlulase,… [14].
1.3.2. Khái quát về enzyme phytase
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc
biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy
phân từng bƣớc acid phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các
myo-inositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [23]. Trong một vài
trƣờng hợp phản ứng có thể giải phóng myo-inositol tự do (Hình 1.1).


8

Hình 1.1. Phản ứng xúc tác của enzyme phytase
Ủy ban danh pháp enzyme thuộc Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (The Enzyme

Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry) phân loại
phytase thành hai dạng là:
Dạng 1: kí hiệu (EC 3.1.3.8)
Tên đề xuất: 3-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 3 phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-3-phosphatase
Dạng 2: kí hiệu (EC 3.1.3.26)
Tên đề xuất: 6-phytase
Tên phân loại: myo-inositol-hexakisphosphate 6 phosphohydrolase
Tên khác: phytase; phytate-6-phosphatase
Sự phân loại này dựa trên cơ sở vị trí nhóm phosphat đầu tiên bị phytase tấn
công. Enzyme 3-phytase (EC 3.1.3.8) tấn công vào nhóm phosphat ở vị trí thứ 3;
đây là dạng phytase điển hình của vi sinh vật và enzyme 6-phytase (EC 3.1.3.26)
tấn cơng đầu tiên vào nhóm phốt phát số 6; đây là dạng điển hình cho phytase từ
thực vật [24].
Dựa trên pH hoạt động tối ƣu, phytase đƣợc chia thành 3 loại: phytase ƣa acid,
ƣa kiềm và trung tính.
Ngồi ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase
đƣợc phân thành 3 loại khác nhau là: histidine acid phosphatase (HAP) phytases, ßpropeller phytase (BPP) và purple acid phosphatase (PAP) phytase [19].


9

Phytase đƣợc phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và
các loài vi sinh vật. Phytase có mặt ở nhiều lồi vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn,
nấm, nấm men và động vật nguyên sinh [10]. Từ các nguồn thu enzyme khiến điều
kiện hoạt động của phytase không giống nhau. Các enzyme phytase từ thực vật
thƣờng hoạt động tốt ở nhiệt độ 45-60oC, trong khi phytase thu từ vi sinh vật hoạt
động ở phạm vi nhiệt độ rộng hơn, từ 35oC đến 63oC [17].
Khối lƣợng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa (trừ phytase

từ Klebsiella aerogenes là có 2 dạng phân tử cảm ứng). Phytase từ eukaryote nhƣ
nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thƣờng đƣợc glycosyl hóa và có khối lƣợng
phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm mốc, khoảng 500
kDa đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và
động vật [20].
Enzyme phytase đƣợc biết đến rất sớm, tuy nhiên, áp dụng quy mô sản xuất
thƣơng mại chỉ mới đƣợc tiến hành vào năm 1990 [17].
Hiện nay, phytase còn đƣợc sử dụng nhiều trong việc phục hồi đất và bán tổng
hợp peroxydase [10]. Các vi sinh vật sử dụng enzyme phytase để giải phóng các
nguồn phospho tự do. Từ đó giúp cây dễ dàng hấp thụ các nguồn phospho trong đất,
cải thiện và kích thích sự sinh trƣởng, phát triển của các loại cây trồng. Hơn nữa
phytate còn tạo phức với một số kim loại trong đất, điều này giúp cho enzyme
phytase khi đƣợc bổ sung vào đất, sẽ giúp đất tăng dinh dƣỡng và độ phì nhiêu.
Phytase đƣợc xem nhƣ là nguồn phân bón sinh học có thể thay thế phân bón
hóa học trong tƣơng lai [32].
Ngồi ra phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau tập trung chính vào 2 lĩnh
vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công nghiệp [11],
[36].
1.3.3. Nguồn phytase
Phytase rất phổ biến trong tự nhiên, nó đã đƣợc tìm thấy từ mơ thực vật, động
vật và rất nhiều lồi vi sinh vật.
* Phytase có nguồn gốc từ vi sinh vật


10

Phytase đƣợc tìm thấy nhiều nhất ở nấm mốc đặc biệt ở các loài A.ficuum,
A.carbonarius, A.oryzae, A.niger và A.fumigatus thuộc chi Aspergillus. Ngồi ra
phytase cịn có trong các nhóm vi khuẩn thuộc về chi Bacillus và Enterobacter [6],
[17], [29].

Phytase đƣợc thu từ các loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus đƣợc sử dụng nhƣ
một chế phẩm vi sinh trong việc cải tạo đất trồng. Sự tăng trƣởng đáng kể về kích
thƣớc, chiều dài rễ cũng nhƣ chiều cao cây của các cây gieo trồng khi đƣợc bổ sung
chế phẩm vi sinh chứa enzyme phytase cho thấy đây là một tiềm năng ứng dụng to
lớn [6].
Trong một số loài khác của chi Aspergillus nhƣ A.rugulosus cho thấy việc sử
dụng hiệu quả enzyme phytase trong việc cải thiện hàm lƣợng chất chất khô và sản
lƣợng các các loại ngũ cốc. Ngoài ra phytase từ các nguồn vi sinh vật đã đƣợc bổ
sung vào thức ăn gia súc, gia cầm nhằm giúp vật nuôi có thể hấp thụ đƣợc
phosphoric. Việc bổ sung phytase từ nấm mốc trong chế độ ăn của heo đã giúp việc
hấp thụ phospho tăng từ 52% đến 64% [41]. Một nghiên cứu khác lại cho thấy,
phytase từ nấm mốc bổ sung vào thức ăn của gà giúp chúng hấp thụ phospho tăng
từ 50 đến 60% [14].
Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp phát triển càng giúp cho chất lƣợng
enzyme phytase thu từ nguồn này cải thiện đáng kể. Việc bổ sung các đoạn gen giúp
cho enzyme phytase tăng khả năng chống chịu với các điều kiện từ môi trƣờng bên
ngồi và chống lại sự phân hủy enzyme tiêu hóa trong dạ dày [32].
* Phytase có nguồn gốc từ thực vật
Phytase đƣợc tìm thấy rộng rãi trong giới thực vật. Phytase từ một số cây ngũ
cốc (lúa mỳ, ngô, lúa mạch, lúa…), cây họ đậu (cây đậu xanh, đậu lùn, đậu trắng…)
đã đƣợc tinh sạch và mơ tả. Ngồi ra, phytase cũng đƣợc tìm thấy trong cây mù tạc
trắng, khoai tây, củ cải, rau diếp, rau bina, hạt phấn hoa huệ tây [44].
Một số loại ngũ cốc có chứa enzyme phytase đƣợc kể đến nhƣ lúa mì, cám lúa
mì, lúa mạch, lúa mạch đen. Trong khi một số loại ngũ cốc khác nhƣ ngơ, yến mạch
lại chứa ít hoặc khơng chứa phytase.


11

Một số nghiên cứu cũng đã chứng minh, phytase thu từ lúa mì đã bị mất hoạt

tính một cách đáng kể khi ủ với enzyme tiêu hóa pepsin. Cũng chính do hoạt tính
phytase biến đổi cao nên khơng thể xem nó là nguồn phù hợp để bổ sung vào thức
ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm [17].
1.4. TỔNG QUAN VỀ NẤM MỐC VÀ VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH
ENZYME PHYTASE
1.4.1. Tổng quan về nấm mốc có khả năng sinh enzyme phytase
Nấm mốc là những vi sinh vật có nhân chuẩn thuộc nhóm vi nấm, đƣợc phân
bố khắp nơi nhƣ đất, nƣớc, khơng khí, sản phẩm từ sinh vật, bản thân các sinh vật
kể cả con ngƣời [3], [4]. Nấm mốc có nhiệt độ tối ƣu khoảng 250C, nhƣng cũng có
thể thích nghi với 00C, sống trong mơi trƣờng có pH hơi axít đến trung tính (pH 57) [3].
Khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trƣờng đặc sẽ phát triển thành một hệ
sợi nấm, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy đƣợc gọi là khuẩn lạc
(colony). Tùy theo môi trƣờng cơ chất mà hệ sợi nấm sẽ phát triển thành các dạng
khác nhau. Hình thái, kích thƣớc màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ý nghĩa nhất
định trong việc định tên nấm.
Hầu hết các loại nấm mốc có thể đồng hóa trực tiếp mantose, lactose,
melibiose, rỉ đƣờng...[3]. Các lồi nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau
đối với nguồn thức ăn nitơ, chúng sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ. Nhiều
lồi nấm mốc (thuộc các chi Aspergillus, Penicillium) có khả năng khử nitrat hóa.
Một số lồi nhƣ Aspergillus flavus, Trichoderma lignorum, Myrothecium
verrucaria….. có khả năng đồng hóa trực tiếp nitơ phân tử [4].
Hoạt tính phytase từ vi sinh vật thƣờng thấy nhất ở nấm mốc đặc biệt ở các
loài thuộc chi Aspergillus. Shieh và Ware (1968) đã phân lập và tuyển chọn từ đất
hơn 2000 loài vi sinh vật để sản xuất phytase. Hầu hết các chủng sản sinh phytase
nội bào, chỉ có 30 chủng sinh phytase ngoại bào và chúng đều là nấm sợi, trong đó
28 chủng thuộc về chi Aspergillus, 1 thuộc về chi Penicillum và 1 thuộc về Mucor.
Trong 28 chủng của chi Aspergillus sản sinh phytase, có 21 chủng thuộc về lồi A.


12

niger. Những nhóm nghiên cứu khác nhƣ Howson và Davis (1983), Volfova và CS.
(1994) đã khẳng định rằng A. niger là lồi có khả năng sản sinh phytase ngoại bào
tốt nhất [6].
Bảng 1.1. Phytase từ những nguồn khác nhau
Nguồn phytase

Nơi định vị

Tài liệu tham khảo

Từ nấm
Aspergillus niger

Ngoại bào

Wyss và CS. (1999)

A. flavus

Ngoại bào

Shieh và Ware (1968)

A. carbonarius

Ngoại bào

Al asheh và Duvnjak (1995)

A. ficuum

Ngoại bào

Liu và CS. (1999)

A. flavipes

Ngoại bào

Wyss và CS. (1999)

A. terreus

Ngoại bào

Yamada và CS. (1968)

A. carneus

Ngoại bào

Ghareib (1990)

A. oryzae

Ngoại bào

Wyss và CS. (1999)

A. fumigatus

Ngoại bào

Wyss và CS. (1999)

Mucor sp.

Ngoại bào

Shieh và Ware (1968)

Penicillum spp.

Ngoại bào

Wyss và CS. (1999)

Penicillium caseoicolum

Ngoại bào

Amano (1995)

Rhizopus oligosporus

Nội bào và ngoại bào

Sutardi và Buckle (1988)

Emericella nidulans

Chƣa xác định

Wyss và CS. (1999)

Lentines edodes

Chƣa xác định

Wyss và CS. (1999)

Mycleiophthora

Chƣa xác định

Pasamontes và CS.(1997)

Chƣa xác định

Pasamontes và CS.(1997)

Chƣa xác định

Wyss và CS.(1999)

Chƣa xác định

Wyss và CS. (1999)

thermophila
Talaromyces
thermophilus
Thermomyces
lanuginose
Trichoderma reessei


13

Các loài A.ficuum, A.carbonarius, A.oryzae, A.niger và A.fumigatus thuộc chi
Aspergillus đƣợc nghiên cứu có khả năng sản sinh enzyme phytase ngoại bào.
Chúng sử dụng nguồn Glucose-phosphate là cơ chất chính trong các quá trình trao
đổi chất.
Nguồn enzyme phytase sinh ra từ nấm mốc A.rugulosus đã đƣợc nghiên cứu
cho thấy khả năng sinh enzyme phytase giúp cho việc cải thiện chất khô và sản
lƣợng ngũ cốc. A.niger sản sinh enzyme phytase giúp đồng hóa nguồn
glucophosphate, cung cấp nguồn phospho vơ cơ, giúp cây sinh trƣởng và phát triển
mạnh [6], [41].
Trong số các nguồn thu enzyme phytase từ các loài nấm khác thuộc chi
Aspergillus nhƣ A.fumigatus cho thấy có rất nhiều đặc tính nổi trội, phổ hoạt động
rộng và có thể chịu đựng đƣợc với điều kiện pH 2,5, có khả năng hồi tính cao [6].
Tuy nhiên, A.fumigatus là nấm gây bệnh thƣờng gặp nhất ở những đối tƣợng
suy giảm miễn dịch A.fumigatus có bộ gen đơn bội ổn định, khơng có biết rõ chu kỳ
hữu tính của lồi nấm này và sinh sản bằng cách hình thành bào tử dính và giải
phóng vào trong mơi trƣờng. Chúng có khả năng phát triển ở nhiệt độ 37°C (cùng
thân nhiệt của ngƣời), bào tử là các chất ơ nhiễm do hít phải gặp nhiều nhất ở
ngƣời. Nhƣng chúng cũng bị loại trừ nhanh chóng nhờ hệ miễn dịch ở trên những
ngƣời khỏe mạnh [41].
1.4.2. Tổng quan về vi khuẩn có khả năng sinh phytase

Những vi khuẩn sản xuất phytase có thể phân lập từ vùng cạn hoặc từ mơi
trƣờng nƣớc và phytase thì có mặt rộng rãi trong nhiều loại vi khuẩn khác nhau nhƣ
Bacillus, Enterobacteria, vi khuẩn kị khí ở dạ cỏ động vật nhai lại và ở
Pseudomonas [15].
Phytase cũng đã đƣợc tìm thấy trong các nhóm vi khuẩn nhƣ: Aerobacter
aerogenes [Greaves và CS., 1967], Pseudomonas sp. [Irving và Cosgrove, 1971],
Klebsiella sp. [Shah và Parekh, 1990], B. subtilis [Shimizu, 1992], Escherichia coli
[Greiner và CS., 1993], Enterobacter sp. [Yoon và CS., 1996] và B.
amyloliquefaciens [Kim và CS. 1998]. Những vi khuẩn sinh phytase ngoại bào là


14

những chủng thuộc về chi Bacillus và Enterobacter. Còn phytase từ E. coli lại là
enzyme nội bào (periplasmic enzyme). Một số nấm men nhƣ Saccharomyces
cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces castelii,
Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces fragilis và Schwanniomyces castelii,
cũng có khả năng sản sinh phytase [Nayini và Markakis, 1984; Sequeilha CS.,
1992; Mochizuki và Takahashi, 1999].
Các nghiên cứu của Powar và Jagannathan (1982), Shimizu (1992) cho thấy
Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase ngoại bào. Đến năm 1998, Kim
và các cộng sự nghiên cứu và chứng minh Bacillus amyloliquefaciens cũng có khả
năng sinh tổng hợp phytase. Bên cạnh đó, các chủng vi khuẩn nhƣ Aerobacter
aerogenes, Pseudomonas sp, Escherichia coli, Enterobacter sp cũng có khả năng
sinh tổng hợp phytase [17], [25].
Phytase của các chủng thuộc loài Bacillus amyloliquefaciens là β propeller
phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao với Ca2+. Đây là loại phytase
khá bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhƣng lại biểu hiện rất ít
hoặc khơng có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác. Sự có mặt
của Ca2+ cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này [29].

1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE TRÊN THẾ GIỚI VÀ
VIỆT NAM
1.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, một số chủng nấm mốc sinh thuộc các chi Aspergillus,
Penicillium, Mucor và Rhizopus có khả năng sinh enzyme phytase mạnh đã đƣợc
nghiên cứu. Đối với các chủng vi khuẩn nhƣ Bacillus sp, Escherichia coli,
Enterobacte, Lactobacillus, Klebsiella, Pseudomonas, Citrobacter đều có khả năng
tổng hợp enzyme phytase ngoại bào [25], [29], [41].
Trong những giai đoạn đầu nghiên cứu, hầu hết kết quả của các tác giả tập
trung vào việc phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase.
Vào năm 2000, J Kerovuo đã tiến hành nghiên cứu 21 chủng Bacillus về khả
năng sinh enzyme phytase trên mơi trƣờng LB và mơi trƣờng có bột bắp. Kết quả


15

cho thấy khơng có chủng nào tổng hợp phytase trên mơi trƣờng LB, tuy nhiên trong
mơi trƣờng bột bắp thì có 2 chủng B.amyloliquefaciens và B. subtilis VTT E68013
sản xuất phytase số lƣợng lớn.
Năm 2003, Yadav và Tarafdar đã sử dụng chế phẩm vi sinh đƣợc tổng hợp từ
nấm cho thấy hiệu quả trong việc phân giải phytate trong đất. Sự tăng trƣởng đáng
kể về sinh khối, chiều dài rễ, cây của các cây khi bổ sung chế phẩm giúp mở ra
hƣớng ứng dụng tiềm năng trong lĩnh vực nông nghiệp [20].
Năm 2006, Tarafdar và Gharu tiến hành bổ sung chế phẩm vi sinh phân giải
phytate từ các chủng nấm mốc cho cây lúa mì. Chiều dài cây và sản lƣợng lúa mì có
sự thay đổi đáng kể sau khi bổ sung chế phẩm [20].
Các nghiên cứu những năm tiếp theo bổ sung cho việc tìm ra thành phần dinh
dƣỡng phù hợp nhằm tăng hiệu quả tổng hợp enzyme phytase [25].
Năm 2007, nghiên cứu của Baharak đã chỉ ra hàm lƣợng cacbon và nitơ tốt
nhất để sản xuất phytase tối đa là 1,5% glucose và 0,5% dịch chiết malt, pH ổn định

của các enzyme từ 4-10 nhƣng pH tối ƣu đƣợc tìm thấy là 6 [19].
Cùng với các nghiên cứu về thành phần dinh dƣỡng, ni cấy thích hợp thì
việc đánh giá các yếu tố ảnh hƣởng từ môi trƣờng bên ngoài đến hoạt động của
enzyme cũng dần đƣợc quan tâm.
Năm 2012, nghiên cứu của B. Sasirekha đã bổ sung khoảng nhiệt độ hoạt động
từ 300C đến 500C, trong đó 370C là nhiệt độ enzyme hoạt động mạnh nhất [22].
Năm 2013, Nabil et al đã tiến hành thu enzyme phytase sau 4 ngày ni cấy từ
3 chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp phytase cao, lƣợng phytase tổng
hợp thu đƣợc đánh giá cao với 720 U/ml tại pH = 7 [25].
Vào những năm gần đây, các nghiên cứu enzyme phytase có xu hƣớng tinh
sạch, nâng cao phẩm chất enzyme tái tổ hợp và mở ra nhiều ứng dụng tiềm năng.
Năm 2014, Moushree Pal Roy đã tinh sạch và đánh giá khả năng hoạt động
của phytase từ 2 loài vi khuẩn đƣợc phân lập từ phân bò, kết quả đã chỉ ra enzyme
thu đƣợc có thể giữ đƣợc 80% hoạt tính tại nhiệt độ lên đến 750C [39].