Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương pháp hplc với đầu dò pda

.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
PARACETAMOL, DEXTROMETHORPHAN
HYDROBROMID, LORATADIN, PHENYLEPHRIN
BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DÒ PDA
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Phan Thanh Dũng

Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018

.


.

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
PARACETAMOL, DEXTROMETHORPHAN
HYDROBROMID, LORATADIN, PHENYLEPHRIN
BITARTRAT TRONG VIÊN SỦI BỌT
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC VỚI ĐẦU DỊ PDA
Mã số:
Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 09/2018

.


.

DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA

PGS.TS Võ Thị Bạch Huệ
Ds.  Nguyễn Thị Như Ngọc

.


.

MỤC LỤC
CHƯƠNG I. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC ............ 1

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI.................................................................................................... 1
TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI ................................................................................ 1
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 3
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ ................ 3
2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 4
2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol,
dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA .............................................. 4
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 14
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI
PARACETAMOL, DEXTROMETHORPHAN HYDROBROMID, LORATADIN,
PHENYLEPHRIN BITARTRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ PDA ........................................................................... 14
3.1.1. Xử lý mẫu .............................................................................................. 14
3.1.2. Điều kiện sắc ký .................................................................................... 14
3.1.3.

Thẩm định

quy

trình định lượng đồng thời paracetamol,

dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA ............................................ 24
CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN .................................................................................. 42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO

.

.

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Chữ nguyên

Nghĩa tiếng Việt

ACN

Acetonitril

Acetonitril

ASEAN

Association of Southeast Asian Nations

Hiệp hội các quốc gia
Đông Nam Á

BP

The British Pharmacopoeia

DĐVN
DEX

Dược điển Anh
Dược điển Việt Nam

Dextromethorphan hydrobromid

Dextromethorphan
hydrobromid

EP

The European Pharmacopoeia

Dược điển châu Âu

HPLC

High-performance liquid chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LOR

Loratadin

Loratadin

MeOH

Methanol

Methanol

PAR

Paracetamol

Paracetamol

PDA

Photodiod Array Detector

Đầu dò dãy diod quang

PHE

Phenylephrin bitartrat

Phenylephrin bitartrat

RP

Reversed-phase

Pha đảo

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

S
SD

Diện tích pic
Standard Deviation

TCNSX

Độ lệch chuẩn
Tiêu chuẩn nhà sản xuất

TEA

Triethylamin

Triethylamin

TFA

Trifloroacetic acid

Acid trifloroacetic

THF

Tetrahydrofuran

Tetrahydrofuran

TNHH

Trách nhiệm hữu hạn

USP

United States Pharmacopeia

Dược điển Mỹ

UV-Vis

Ultra Violet - Visible

Tử ngoại – khả kiến

.


.

i

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Trang
Hình 3.1. Biểu đồ hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu … .......... 15
Hình 3.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện ................................................................. 16
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát ............... 17

Hình 3.4. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient khảo sát (tiếp) ...... 18
Hình 3.5. Sắc ký đồ với pha động ACN - TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0/pH 2,/ pH
2,1 bằng TFA ........................................................................................................... 19
Hình 3.6. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch TFA pH 2,1 ......................... 20
Hình 3.7. Sắc ký đồ với pha động ACN – dung dịch acid phosphoric pH 2,1 ....... 20
Hình 3.8. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn cột sắc ký ................................................... 22
Hình 3.9. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu .......................................................... 24
Hình 3.10. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu (tiếp) ............................................... 25
Hình 3.11. Phổ UV-Vis các pic tại thời gian lưu trong mẫu chuẩn và mẫu thử. ..... 26
Hình 3.12. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt .................................... 26
Hình 3.13. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp)............................ 27
Hình 3.14. Sắc ký đồ các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt (tiếp)............................ 28
Hình 3.15. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ ........... 32

.


.

DANH MỤC BẢNG BIỂU – SƠ ĐỒ
Trang
Bảng 2.1. Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu ............................. 3
Bảng 2.2. Thông tin các chất chuẩn ........................................................................... 4
Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị sử dụng ......................................................... 4
Bảng 2.4. Các chương trình gradient khảo sát định lượng 4 hoạt chất ...................... 6
Bảng 2.5. Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng ........ 11
Bảng 2.6. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4 hoạt chất ................. 12
Bảng 2.7. Chương trình gradient (-1%) của độ thơ ................................................. 13
Bảng 2.8. Chương trình gradient (+1%) của độ thô ................................................ 13
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu ........................................ 14

Bảng 3.2. Hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu ............................ 14
Bảng 3.3. So sánh độ phân giải khi thay đổi pH dung dịch B ................................. 21
Bảng 3.4. So sánh hệ số bất đối As với dung dịch B là TFA pH 2,1 và TEA 0,01%
chỉnh pH 2,1 bằng TFA ............................................................................................ 21
Bảng 3.5. So sánh cột Inersustain C8 và Inersustain C18 ....................................... 23
Bảng 3.6. Chương trình gradient tối ưu được lựa chọn ............................................ 23
Bảng 3.7. Kết quả tính thích hợp hệ thống quy trình định lượng ............................ 29
Bảng 3.8. Kết quả thẩm định độ lặp lại ................................................................... 30
Bảng 3.9. Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian ............................................ 30
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát diện tích pic các hoạt chất theo nồng độ ................... 31
Bảng 3.11. Kết quả thống kê hồi quy tuyến tính các hoạt chất ............................... 31
Bảng 3.12. Kết quả thẩm định độ đúng paracetamol ............................................... 32
Bảng 3.13. Kết quả thẩm định độ đúng phenylephrin bitartrat ............................... 33
Bảng 3.14. Kết quả thẩm định độ đúng dextromethorphan HBr ............................. 33
Bảng 3.15. Kết quả thẩm định độ đúng loratadin .................................................... 34
Bảng 3.16. Khoảng xác định của các hoạt chất ....................................................... 34
Bảng 3.17. Kết quả thẩm định độ thơ - tốc độ dịng 0,9 ml/phút ............................ 35
Bảng 3.18. Kết quả thẩm định độ thô - tốc độ dòng 1,1 ml/phút ............................ 35

.


.

Bảng 3.19. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 23 oC ...................................... 36
Bảng 3.20. Kết quả thẩm định độ thô - nhiệt độ cột 27 oC ...................................... 36
Bảng 3.21. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,0 ........................................................ 37
Bảng 3.22. Kết quả thẩm định độ thô - pH 2,2 ........................................................ 37
Bảng 3.23. Kết quả thẩm định độ thơ - chương trình gradient (-1%) ...................... 38
Bảng 3.24. Kết quả thẩm định độ thơ - chương trình gradient (+1%) ..................... 38

Bảng 3.25. Kết quả thẩm định độ thô - cột Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm) ... 39
Bảng 3.26. Kết quả thẩm định độ thô - vị trí đặt lọ chứa mẫu trong hệ thống tiêm
mẫu tự động .............................................................................................................. 39
Bảng 3.27. Kết quả thẩm định độ thơ - độ ổn định của dung dịch phân tích .......... 40

.


.

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
- Paracetamol (acetaminophen hay N - acetyl - p - aminophenol) là chất
chuyển hóa có hoạt tính của phenacetin, là thuốc giảm đau - hạ sốt hữu hiệu. Tác
động lên vùng dưới đồi gây hạ nhiệt, tỏa nhiệt tăng do giãn mạch và tăng lưu lượng
máu ngoại biên. Khả năng ức chế enzym cyclo oxygenase yếu nên không có tác
dụng kháng viêm. Dextromethorphan là thuốc giảm ho do tác dụng lên trung tâm ho
ở hành não dùng để điều trị triệu chứng do do họng hoặc phế quản bị kích thích khi
cảm lạnh thơng thường hoặc hít phải chất kích thích. Phenylephrin là thuốc chủ vận
chọn lọc

1

receptor, gây co mạch tăng huyết áp, có tác dụng kéo dài hơn

Epinephrin do ít bị enzym COMT thủy phân làm giảm nghẹt mũi và chảy mũi do có
tác dụng chống sung huyết mũi, giảm sưng của các mạch máu trong mũi. Loratadin
làm giảm nhẹ triệu chứng của viêm mũi dị ứng và mày đay, chống ngứa, khơng có
tác dụng an thần [3]. Sự kết hợp đồng thời paracetamol, dextromethorphan,
loratadin, phenylephrin trong một chế phẩm không những làm nâng cao hiệu quả,

giảm chi phí mà cịn mang lại sự thuận tiện cho bệnh nhân trong quá trình điều trị
và cho bác sỹ khi kê đơn.
- Hiện nay, công ty TNHH HASAN - DERMAPHARM hiện đang nghiên cứu
sản xuất viên sủi bọt chứa đồng thời paracetamol, dextromethorphan hydrobromid,
loratadin, phenylephrin bitartrat và chưa xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho sản phẩm
này. Vì vậy, chúng tơi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời
paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat
trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC”. Để xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm
cho chế phẩm này.

.


.

MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan
hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương
pháp HPLC.
Tiến hành thăm dò các điều kiện phân tích như:
- Lựa chọn pha động
- pH pha động
- Tỉ lệ pha động, thăm dị chương trình gradient hóa dung mơi
- Tốc độ dịng
- Bước sóng phát hiện
Đưa ra qui trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan
hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat.

TÓM TẮT NỘI DUNG ĐỀ TÀI
- Xây dựng quy trình định lượng đồng thời paracetamol, dextromethorphan

hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat trong viên sủi bọt bằng phương
pháp HPLC. Thăm dò qui trình tốt nhất để định lượng 4 hoạt chất trên.
- Thẩm định qui trình phân tích để ứng dụng vào việc định lượng đồng thời
paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin và phenylephrin bitartrat
trong viên sủi bọt bằng phương pháp HPLC.







Tính đặc hiệu
Tính tuyến tính
Độ chính xác
Độ đúng
Khoảng xác định của phương pháp
Độ thô

.


.

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU – HÓA CHẤT – TRANG THIẾT BỊ
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Sản phẩm nghiên cứu: Viên sủi bọt PARAHASAN MULTI SYMPTOMS
Bảng 2.1. Thành phần và công thức của viên sủi bọt nghiên cứu
Hàm lượng

(mg/viên)

STT Tên nguyên phụ liệu

Tiêu chuẩn

Dược chất
1
2
3
4

Paracetamol
Dextromethorphan hydrobromid
Phenylephrin bitartrat
Loratadin
Tá dược
5
Manitol
6
Acid citric khan
7
Natri hydrocarbonat khan
8
Natri carbonat khan
9
Povidon K30
10 Betacyclodextrin
11 Sucralose
12 Natri benzoat

13 PEG 6000
14 Natri docusat
15 Simethicon
16 Bột hương chanh
17 Ethanol tuyệt đối (*)
Tổng cộng
(*) Mất đi trong quá trình pha chế

500,0
15,0
11,7
5,0

EP 8
USP 38
USP 38
EP 8

330,0
950,0
810,0
270,0
30,0
140,0
12,0
80,0
20,0
1,2
5,1
20,0

280,0
3200,0

DĐVN IV
BP 2016
DĐVN IV
BP 2016
BP 2016
USP 38
USP 38
DĐVN IV
BP 2016
USP 38
USP 38
TCNSX
BP 2016

2.1.2. Dung mơi, hóa chất, chất chuẩn
- ACN, MeOH loại dùng cho HPLC (Baker).
- TEA, TFA, acid formic, acid phosphoric, natri butansulfonat, acid nitric, amoniac,
sắt (II) sulfat, hydrogen peroxyd, natri hydroxyd, acid hydrocloric, kali
dihydrophosphat, dinatri hydrophosphat đạt tiêu chuẩn phân tích.

.


.

Bảng 2.2. Thơng tin các chất chuẩn
Chất chuẩn

Số kiểm sốt

Hàm lượng (%)

Nguồn gốc

Phenylephrin bitartrat

F003M0

100,00

USP

Paracetamol

QT009 170916

99,68

Dextromethorphan HBr

QT015 090616

95,80

Loratadin

QT070 100916

99,90

Viện kiểm
nghiệm thuốc
thành phố Hồ
Chí Minh

4-aminophenol

QT216 040916

99,80

2.1.3. Trang thiết bị
Bảng 2.3. Danh mục các trang thiết bị sử dụng
STT

Tên thiết bị

Nguồn gốc

1

Máy HPLC Hitachi Chromaster PAD-5430 (Phần mềm xử lý số
liệu EZChrom Elite)

Nhật

2

Cân phân tích Shimadzu AUW 120D
(Max = 120 g; Min = 10 mg, e = 1 mg, d = 0,1 mg)

Nhật

3

Bể siêu âm Elmasonic S 180 H

Đức

4

Máy đo pH Eutech 510

5

Cân kỹ thuật Shimadzu BL 220

Nhật

6

Bếp cách thủy Memmert WNB14

Đức

7

Tủ sấy Memmert UNB400

Đức

8

Đèn tử ngoại Spectronics CM-10

USA

9

Bộ lọc hút chân không

10

Các dụng cụ thủy tinh đạt yêu cầu chính xác dùng trong phân tích

Singapore

2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời paracetamol,
dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin bitartrat bằng
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA
2.2.1.1. Điều kiện phân tích ban đầu
 Xử lý mẫu
Dung mơi pha mẫu: Nước - acetonitril (85:15)
Mẫu chuẩn: Cân chính xác 12,5 mg loratadin; 29,3 mg phenylephrin bitartrat; 37,5
mg dextromethorphan hydrobromid các chất chuẩn cho vào bình định mức 50 ml

.


.

(bình 1) và định mức cho tới vạch bằng dung mơi pha mẫu. Cân chính xác 25 mg
paracetamol chuẩn cho vào bình định mức 50 ml (bình 2). Hút chính xác 1 ml dung
dịch từ bình 1 cho vào bình 2 và định mức bằng dung môi pha mẫu cho tới vạch để
thu được nồng độ các chuẩn paracetamol, dextromethorphan hydrobromid,
loratadin, phenylephrin bitartrat về nồng độ tương ứng 0,500 mg/ml; 0,015 mg/ml;
0,005 mg/ml; 0,012 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm
đuổi khí.
Mẫu thử: Cân 20 viên, xác định khối lượng trung bình viên, nghiền thành bột mịn.
Cân một lượng bột viên tương ứng với khối lượng trung bình viên cho vào bình
định mức 100 ml, thêm từ từ một lượng khoảng 60 ml dung mơi pha mẫu (tránh
mẫu sủi mạnh trào ra khỏi bình định mức), chờ cho đến khi mẫu sủi hết, siêu âm
trong khoảng 15 phút, để nguội, định mức cho đến vạch bằng dung môi pha mẫu.
Lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được
cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu để có
nồng độ paracetamol, dextromethorphan hydrobromid, loratadin, phenylephrin
bitartrat cuối cùng tương ứng khoảng 0,500 mg/ml; 0,015 mg/ml; 0,005 mg/ml;
0,012 mg/ml. Lọc qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí. Tiến
hành sắc ký lần lượt mẫu thử và chuẩn theo điều kiện sắc ký khảo sát.
 Điều kiện sắc ký
Dựa vào cấu trúc hóa học của paracetamol, dextromethorphan hydrobromid,
loratadin, phenylephrin bitartrat đều là những chất phân cực có nối đơi liên hợp và
có các nhóm mang màu nên có thể sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao pha
đảo với pha tĩnh kém phân cực, pha động phân cực và sử dụng đầu dò PDA để định
lượng các hoạt chất này với điều kiện sắc ký ban đầu như sau:
+ Cột sắc ký: Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)

+ Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút
+ Thể tích tiêm: 20 μl
+ Nhiệt độ cột: 25 oC
+ Bước sóng phát hiện: lựa chọn bước sóng phát hiện được cả bốn chất và cho tín
hiệu tốt nhất.
+ Pha động:
o Dung môi A: Acetonitril

.


.

o Dung dịch B: Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 3,0 bằng TFA
2.2.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký
+ Bước sóng phát hiện
Lựa chọn bước sóng phát hiện đồng thời cả bốn chất và cho tín hiệu tốt nhất.
+ Chương trình gradient
Bảng 2.4. Các chương trình gradient khảo sát định lượng 4 hoạt chất
Chương trình
gradient

Thời gian
(phút)
0
2,0
6,0
6,1
11,0
11,1

13,0
13,1
15,0
0
7,0
7,1
12
12,1
20
0
3
7,0
7,1
13,0
13,1
15
0
12
15
20

1

2

3

4

Dung mơi A

(%)
15
70
55
60
60
0
0
15
15
5
55
40
60
5
5
10
10
55
60
60
10
10
5
55
5
5

+ Thay đổi pH và thành phần dung dịch B
Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,5 bằng TFA

Dung dịch TEA 0,01% điều chỉnh pH 2,1 bằng TFA
Dung dịch TFA pH 2,1
Dung dịch acid phosphoric pH 2,1
+ Cột sắc ký

.

Dung dịch B
(%)
85
85
45
40
40
100
100
85
85
95
45
60
40
95
95
90
90
45
40
40
90

90
95
45
95
95

Tốc độ dòng
(ml/phút)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

1
1
1
1


.

Cột Inertsustain C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)
Cột Inertsustain C18 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)
Yêu cầu: Lựa chọn điều kiện sắc ký có các pic đạt các thơng số sắc ký theo quy
định. Đối với định lượng hỗn hợp đa thành phần, đặc biệt ưu tiên độ phân giải (RS
1,5), hệ số đối xứng (0,8 AS 1,5), độ tinh khiết pic.
2.2.1.3. Khảo sát quá trình xử lý mẫu
Sử dụng điều kiện sắc ký xây dựng được để khảo sát q trình xử lý mẫu:
+ Dung mơi pha mẫu: khảo sát 4 dung môi pha mẫu sau:
Nước
Nước - ACN (90:10)
Nước - ACN (85:15)
Nước - ACN (80:20)
Yêu cầu: Lựa chọn dung mơi pha mẫu có thời gian siêu âm làm mẫu tan hết bằng
cảm quan nhanh nhất.
+ Thời gian siêu âm mẫu: khảo sát các khoảng thời gian siêu âm mẫu sau:
10 phút, 15 phút, 20 phút
Yêu cầu: Lựa chọn thời gian siêu âm mẫu có hàm lượng các hoạt chất khác nhau có
ý nghĩa thống kê so với các khoảng thời gian khác.
2.2.1.4. Thẩm định quy trình định lượng
Sau khi đã lựa chọn được điều kiện phân tích tối ưu, tiến hành thẩm định quy trình
đã xây dựng được theo hướng dẫn của ASEAN 2008 [3], [9]:
a. Tính đặc hiệu

Chuẩn bị dung môi pha mẫu, mẫu giả dược (placebo), mẫu chuẩn riêng lẽ, mẫu
chuẩn hỗn hợp, mẫu thử, mẫu thử thêm chuẩn, các mẫu thử ở điều kiện khắc nghiệt:
- Mẫu được oxy hoá bởi H2O2 3% trong 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho
vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch H2O2 3%, chờ sủi bọt hết,
siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch H2O2 3%,, lắc đều. Dung
dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Lắc đều, lọc qua giấy
lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình

.


.

định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc
0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.
- Mẫu thủy phân trong NaOH 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc
cho vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch NaOH 0,5 N, chờ sủi
bọt hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch NaOH 0,5 N, lắc
đều. Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Lắc đều, lọc
qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho
vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua
màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.
- Mẫu thủy phân trong HCl 0,5 N trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho
vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung dịch HCl 0,5 N, chờ sủi bọt
hết, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung dịch HCl 0,5 N, lắc đều.
Dung dịch thu được được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ. Lắc đều, lọc qua
giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào
bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng
lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.
- Mẫu chiếu ánh sáng trực tiếp trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải

thành một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới ánh sáng mặt trời trong 48 giờ. Sau
đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu,
siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua
giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào
bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng
lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.
- Mẫu chiếu tia UV trong vòng 24 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành
một lớp mỏng trong đĩa petri và để dưới đèn UV 254 nm trong 24 giờ. Sau đó cho
bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, siêu
âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều, lọc qua giấy
lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào bình
định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng lọc
0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.

.


.

- Mẫu đặt ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc, trải thành
một lớp mỏng trong đĩa petri và cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 60 oC

2 oC trong 48

giờ. Sau đó cho bột thuốc vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi
pha mẫu, siêu âm 20 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều,
lọc qua giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được
cho vào bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc
qua màng lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.
- Mẫu đun cách thủy 60 oC trong 48 giờ: Cân khoảng 3200 mg bột thuốc cho vào

bình định mức 100 ml, thêm khoảng 60 ml dung môi pha mẫu, chờ mẫu sủi bọt hết,
siêu âm 25 phút, để nguội và định mức bằng dung môi pha mẫu, lắc đều. Dung dịch
sau khi pha được đun cách thủy ở nhiệt độ 60 oC trong 48 giờ. Để nguội, lọc qua
giấy lọc, loại bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 1 ml dịch lọc thu được cho vào
bình định mức 10 ml và định mức đến vạch bằng dung môi pha mẫu. Lọc qua màng
lọc 0,45 μm vào lọ chứa mẫu, siêu âm đuổi khí.
Tiến hành sắc ký các loại mẫu theo quy trình phân tích. Ghi lại các sắc ký đồ. Xác
định thời gian lưu, độ tinh khiết của pic, phổ UV của pic hoạt chất cần phân tích
trong sắc ký đồ mẫu thử và mẫu chuẩn.
Yêu cầu
- Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu placebo phải không xuất hiện pic ở trong khoảng thời
gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn.
- Sắc ký đồ mẫu thử phải cho thời gian lưu tương tự với pic của chất chuẩn trong
sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu thử các pic hoạt chất cần phân tích
tách hoàn toàn khỏi các pic khác.
- Khi thêm một lượng chất chuẩn vào mẫu thử, chiều cao và diện tích pic phải tăng
lên so với trước khi thêm chuẩn.
- Trên sắc ký đồ mẫu thử ở các điều kiện khắc nghiệt, các pic tạp xuất hiện phải
tách ra khỏi các pic của hoạt chất cần phân tích.
- Pic của hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ của các mẫu phải tinh khiết (độ
tinh khiết pic xấp xỉ 100%). Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic chính trong mẫu
thử giống phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic trong mẫu chuẩn.

.


0.

b. Tính thích hợp hệ thống
Sử dụng dung dịch chuẩn có nồng độ 100% so với nồng độ định lượng trong dãy

mẫu chuẩn khảo sát tính tuyến tính tiến hành sắc ký 6 lần, ghi lại các sắc ký đồ và
xác định giá trị thời gian lưu, diện tích pic trung bình và các thơng số khác của pic
(độ phân giải RS, hệ số đối xứng AS, số đĩa lý thuyết N…)
Yêu cầu:
- Giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic phải

2,0%.

- Các pic phải đạt các thông số sắc ký khác (0,8 AS 1,5; RS

1,5, N

2000)

c. Độ chính xác
 Độ lặp lại
Tiến hành chuẩn bị 6 mẫu thử ở nồng độ 100% so với nồng độ định lượng tương tự
mục 2.2.1.1. Xác định hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu theo cơng thức:
X (%/nhãn) =

%

Trong đó:
Sc, St: Diện tích pic các pic trong mẫu chuẩn, mẫu thử.
Dc, Dt: Độ pha loãng của mẫu chuẩn, mẫu thử.
mc, mt: lượng cân của mẫu chuẩn, mẫu thử (mg)
C%: hàm lượng % của chất chuẩn
MW: khối lượng trung bình viên (mg)
T: hàm lượng trên nhãn của hoạt chất trong một viên
Độ lặp lại của phương pháp được xác định bằng giá trị RSD (%) kết quả định lượng

hàm lượng hoạt chất có trong các mẫu.
Yêu cầu:
- Giá trị RSD (%) kết quả định lượng hàm lượng hoạt chất có trong 6 mẫu

2,0%,

nếu lơn hơn 2% cần phải có sự giải thích phù hợp.
 Độ chính xác trung gian
- Tiến hành tương tự như độ lặp lại nhưng do 02 kiểm nghiệm viên khác nhau thực
hiện trên các ngày khác nhau.

.


1.

- Xác định giá trị trung bình và giá trị RSD (%) hàm lượng hoạt chất có trong các
mẫu do mỗi kiểm nghiệm viên phân tích và giữa hai kiểm nghiệm viên.
- Xác định mức độ sai khác kết quả định lượng giữa 2 kiểm nghiệm viên.
Yêu cầu:
- Các kết quả thu được phải khác nhau khơng có ý nghĩa về mặt thống kê (sử dụng F
– test để đánh giá). RSD ≤ 2% và Ftn ≤ F0,05.
d. Tính tuyến tính
Dung dịch chuẩn gốc A: paracetamol 10 mg/ml
Dung dịch chuẩn gốc B: hỗn hợp gồm dextromethorphan hydrobromid 1,5 mg/ml,
phenylephrin bitartrat 1,17 mg/ml, loratadin 0,5 mg/ml.
Từ các dung dịch gốc này pha loãng thành các dung dịch từ 40% đến 140% so với
nồng độ định lượng theo bảng để thu được dãy giai mẫu chuẩn.
Bảng 2.5. Cách pha dãy chuẩn khảo sát tính tuyến tính quy trình định lượng
Dung dịch

40%

60%

80%

100%

120%

140%

Dung dịch chuẩn gốc A (ml)

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

Dung dịch chuẩn gốc B (ml)

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

Thêm dung môi pha mẫu (ml)

Vừa đủ 50 ml

Tiến hành sắc ký các mẫu, ghi lại các sắc ký đồ và xác định diện tích pic của các
mẫu. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, tính hệ số tương quan. Sử dụng trắc
nghiệm t để kiểm tra ý nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy. Sử dụng trắc
nghiệm F để kiểm tra tính thích hợp của phương trình hồi quy.
Yêu cầu: Hệ số tương quan R ≥ 0,999
e. Độ đúng

.


2.

Bảng 2.6. Cách chuẩn bị các mẫu tự tạo thẩm định độ đúng 4 hoạt chất

Mẫu

tự tạo

Khối lượng
placebo
(mg)

Lượng cân
chuẩn
paracetamol
(99,68%) (mg)

2668,5
2668,9
2668,3
2668,8
2668,5
2668,6
2668,1
2668,5
2668,5

351,0
351,0
351,0
501,4
501,4
501,4
651,6
650,6
651,6

70%

100%

130%

Thể tích
dung dịch
chuẩn gốc
B thêm vào
(ml)
7,0
7,0
7,0
10,0
10,0
10,0
13,0
13,0
13,0

Khối lượng chuẩn thêm vào
(mg)
PAR

PHE

DEX

LOR

349,9
349,9
349,9
499,7
499,7
499,7
649,5
648,5
649,5

8,1
8,1
8,1
11,6
11,6
11,6
15,1
15,1
15,1

10,5
10,5
10,5
15,0
15,0
15,0
19,5
19,5

19,5

3,5
3,5
3,5
5,0
5,0
5,0
6,5
6,5
6,5

Chuẩn bị 3 loại mẫu tự tạo trên trong bình định mức 100 ml, thêm chính xác một
lượng chất chuẩn thích hợp vào các mẫu giả dược. Lượng chất chuẩn thêm vào
tương ứng với 3 mức nồng độ 70%, 100% và 130% so với mức nồng độ định lượng
trong quy trình và nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tại mỗi mức
nồng độ, thực hiện ít nhất 3 mẫu độc lập phân tích theo quy trình đã xây dựng.
Mẫu chuẩn: sử dụng kết quả mẫu chuẩn của tính thích hợp hệ thống.
Phân tích mẫu theo quy trình phân tích. Xác định độ đúng của phương pháp theo
công thức:
Tỷ lệ thu hồi (%)

ượ
ượ




ạ
ạ

ấ
ấ

ồ
ê à

100

Yêu cầu:
- Độ đúng của phương pháp phải nằm trong khoảng 98,0% đến 102,0% và giá trị
RSD

2,0%.

f. Khoảng xác định
Được đánh giá dựa trên sự tương quan của tính tuyến tính, giá trị độ chính xác và
độ đúng của phương pháp.
g. Độ thô
- Độ ổn định của phương pháp phân tích
Khi thay đổi các thơng số liệt kê ở phần này, yêu cầu RSD của diện tích pic  2%.

.


3.

+ Thay đổi tốc độ dòng:

0,1 ml/phút

+ Thay đổi nhiệt độ cột:

2 oC

+ Thay đổi pH dung dịch B:

0,1 độ pH

+ Thay đổi vị trí đặt mẫu trong hệ thống HPLC: 9 vị trí khác nhau trong khay chứa
mẫu
+ Thay đổi cột sắc ký: Inertsil C8 (150 mm; 4,6 mm; 5 μm)
+ Thay đổi tỷ lệ pha động trong chương trình gradient:
Bảng 2.7. Chương trình gradient (-1%) của độ thơ
Thời gian (phút)
0
12
15
20

Dung mơi A (%)
4
54
4
4

Dung dịch B (%)
96
46
96

96

Tốc độ dịng (ml/phút)
1
1
1
1

Bảng 2.8. Chương trình gradient (+1%) của độ thơ
Thời gian (phút)
0
12
15
20

Dung mơi A (%)
6
56
6
6

Dung dịch B (%)
94
44
94
94

Tốc độ dịng (ml/phút)
1
1

1
1

- Độ ổn định của dung dịch phân tích
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch chuẩn theo điều kiện sắc ký đã xây
dựng ở các thời điểm sau khi pha mẫu 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24 giờ. Kiểm tra độ
ổn định.
Tính RSD =



Với S0 là diện tích pic lúc mới pha mẫu
St là diện tích pic ở thời điểm t
Yêu cầu: RSD

2,0%

.


4.

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG
THỜI

PARACETAMOL,

DEXTROMETHORPHAN

HYDROBROMID,

LORATADIN, PHENYLEPHRIN BITARTRAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO VỚI ĐẦU DÒ PDA
3.1.1. Xử lý mẫu
3.1.1.1. Dung môi pha mẫu
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát lựa chọn dung môi pha mẫu
Thời gian siêu âm đến khi mẫu tan hết bằng cảm quan (phút)
Mẫu

Nước – ACN
(90:10)
20
21
21
20,67

Nước

1
2
3
Trung bình

25
24
26
25,00

Nước – ACN

(85:15)
18
18
17
17,67

Nước – ACN
(80:20)
12
11
11
11,33

Nhận xét
Với dung mơi pha mẫu là nước – ACN (80:20) mẫu tan hết bằng cảm quan trong
thời gian siêu âm nhỏ nhất → Chọn dung mơi hịa tan mẫu là nước – ACN (80:20)
để khảo sát tiếp.
3.1.1.2. Thời gian siêu âm mẫu
Tiến hành định lượng các mẫu thử được pha trong dung môi pha mẫu là nước –
ACN (80:20) ở các khoảng thời gian siêu âm mẫu 10 phút, 15 phút, 20 phút. Mỗi
khoảng thời gian chuẩn bị 03 mẫu. Tính giá trị trung bình hàm lượng các hoạt chất
Bảng 3.2. Hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu
Hàm lượng trung bình (%)
10 phút

15 phút

20 phút

Phenylephrin bitartrat

104,88

105,34

105,82

Paracetamol

104,51

105,19

105,54

Dextromethorphan HBr

108,02

109,53

109,42

Loratadin

107,60

108,23

108,64

.


5.

120

Hàm lượng trung bình (%)

110
100
90

10 phút
15 phút

80

20 phút
70
60
50
Phenylephrin
bitartrat

Paracetamol

Dextromethorphan
hydrobromid

Loratadin

Hình 3.1. Biểu đồ hàm lượng các hoạt chất ở các thời gian siêu âm mẫu
Nhận xét
Sử dụng trắc nghiệm thống kê so sánh phương sai và so sánh các trung bình (Phụ
lục 2) cho thấy:
- Phenylephrin bitartrat, dextromethorphan hydrobromid: trung bình hàm lượng ở
các thời gian siêu âm mẫu khơng khác nhau có ý nghĩa thống kê.
- Paracetamol: trung bình hàm lượng ở các thời gian siêu mẫu ở 15 phút và 20 phút
không khác nhau có ý nghĩa thống kê; trung bình hàm lượng ở 20 phút khác nhau
có ý nghĩa so với 10 phút.
- Loratadin: trung bình hàm lượng ở thời gian siêu mẫu ở 15 phút và 20 phút khơng
khác nhau có ý nghĩa thống kê và khác nhau có ý nghĩa so với thời gian siêu âm
mẫu 10 phút.
Nhìn chung, hàm lượng 4 hoạt chất định lượng được ở 15 và 20 phút không khác
nhau và lớn hơn ở 10 phút. Tuy nhiên, để ổn định q trình hịa tan mẫu, chọn thời
gian siêu âm mẫu là 20 phút.
3.1.2. Điều kiện sắc ký

.


6.

3.1.2.1. Bước sóng phát hiện
Phổ UV của dung dịch chuẩn và thử trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm
cho đỉnh hấp thu cực đại của phenylephrin bitartrat là 273 nm; của paracetamol 206
nm và 243 nm; của dextromethorphan HBr là 226 nm và 279 nm; của loratadin là
240 nm và 273 nm. Do paracetamol có nồng độ lớn nên ưu tiên chọn bước sóng

phát hiện cho các chất cịn lại. Ở bước sóng 273 nm, các chất có nồng độ nhỏ đều
có độ hấp thu tốt. Do đó, chọn 273 nm làm bước sóng phát hiện.
226     240       273
Phenylephrin bitartrat

Dextromethorphan HBr

279

Loratadin

Hình 3.2. Lựa chọn bước sóng phát hiện

.


7.

3.1.2.2. Chương trình gradient

Chương trình gradient 1 (Xem bảng 2.4)

Chương trình gradient 2 (Xem bảng 2.4)
Hình 3.3. Sắc ký đồ dung dịch thử ở các chương trình gradient

.