Tải bản đầy đủ (.pdf) (72 trang)

Xây dựng mô hình toán học giúp nhận biết chất ức chế Enzym Histon Deacetylase 2 có tác dụng chống ung thư

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.44 MB, 72 trang )

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
<b>KHOA Y DƢỢC </b>


<b>NGUYỄN THỊ HIỀN </b>


<b>XÂY DỰNG MƠ HÌNH TOÁN HỌC </b>


<b>GIÚP NHẬN BIẾT CHẤT ỨC CHẾ </b>


<b>ENZYM HISTON DEACETYLASE 2 </b>



<b>CÓ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ </b>



<b>KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC </b>


</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
<b>KHOA Y DƢỢC </b>


Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HIỀN


<b>XÂY DỰNG MƠ HÌNH TỐN HỌC </b>


<b>GIÚP NHẬN BIẾT CHẤT ỨC CHẾ </b>


<b>ENZYM HISTON DEACETYLASE 2 </b>


<b> CÓ TÁC DỤNG CHỐNG UNG THƢ</b>



<b>KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC </b>


Khóa: QH.2012.Y


Người hướng dẫn: 1. TS. LÊ THỊ THU HƢỜNG
<b>2. TS. PHẠM THẾ HẢI </b>


</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

<b>LỜI CẢM ƠN </b>



<i>Trước hết, tơi xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc và gửi lời cảm ơn chân thành </i>
<i>tới <b>TS. Lê Thị Thu Hường</b>, công tác tại bộ môn Dược liệu và Dược học cổ </i>
<i>truyền - khoa Y Dược Trường Đại học Quốc gia Hà Nội là người thầy tận </i>
<i>tình chỉ bảo, động viên, hướng dẫn để tơi hồn thành luận văn. </i>


<i>Tôi xin chân thành cảm ơn <b>TS.Phạm Thế Hải</b> công tác tại Trường Đại </i>
<i>học Dược Hà Nội đã chỉ bảo tận tình cho tơi từ những bước đi ban đầu khi </i>
<i>nhận đề tài. </i>


<i>Bên cạnh đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới lãnh đạo, thầy cô Khoa Y </i>
<i>Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện để tôi được làm </i>
<i>khóa luận, được học tập, nghiên cứu, rèn luyện tại Khoa suốt 5 năm học qua. </i>


<i>Sau cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, anh chị em và </i>
<i>bạn bè ln sát cánh, đồng hành, ủng hộ động viên tơi trong q tình học tập, </i>
<i>nghiên cứu hoàn thành luận văn. </i>


<i>Dù đã rất cố gắng nhưng kiến thức, kỹ năng và thời gian thực hiện cịn </i>
<i>hạn hẹp, tơi khó tránh khỏi những thiếu sót. Tơi rất mong nhận được những ý </i>
<i>kiến đóng góp của các thầy cơ để khóa luận của tơi được hồn thiện hơn. </i>


<i>Tơi xin chân thành cảm ơn. </i>


Hà Nội, Ngày 8 tháng 6 năm 2017
Sinh Viên


</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

<b>DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT </b>


<b>Tên viết tắt </b> <b>Tên Tiếng Anh </b> <b>Tên Tiếng Việt </b>



CSDL Cơ sở dữ liệu


FDA Food and Drug


Administation


Cơ quan Quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm
Hoa Kỳ


HAT Enzym Histon


Acetyltransferase


HDAC Histon deacetylase


HDAC2 Histon deacetylase 2


IC50 The half maximal


inhibitory concentration


Nồng độ ức chế 50%


MLR Multiple Linear


Regression


Phương pháp hồi quy


tuyến tính đa biến


Q2 Hệ số tương quan chéo


Q2ext Hệ số xác định cho tập


kiểm tra


QSAR Quantitative Structure –
Activity Relationship


Tương quan định lượng
cấu trúc – tác dụng


R2 Hệ số xác định


SAHA Suberoylanilide


hydroxamic acid


Te Test set Tập kiểm tra


</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

TSPT Tham số phân tử


UHDAC Chất ức chế histon


</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

<b>DANH MỤC HÌNH VẼ </b>


<b>STT Kí hiệu </b> <b>Tên hình </b> <b>Trang </b>



<b>1 </b> <b>Hình 1.1 </b> Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động
phiên mã. (a) Sự methyl hóa và deacetyl
hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn
nhiễm sắc thể và ức chế phiên mã. (b) Sự
acetyl hóa và demethyl hóa histon làm tháo
xoắn nhiễm sắc thể và cho phép phiên mã.


<b>7 </b>


<b>2 </b> <b>Hình 1.2 </b> Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC
nhóm I, II, IV


<b>8 </b>


<b>3 </b> <b>Hình 2.1 </b> Cấu trúc hóa học của 45 dẫn xuất của acid
hydroxamic thu thập được.


<b>19 </b>


<b>4 </b> <b>Hình 3.1 </b> Miền ứng dụng của mơ hình QSAR xác
định hợp chất có khả năng ức chế HDAC2


<b>28 </b>


<b>5 </b> <b>Hình 3.2 </b> Tóm tắt quy trình sàng lọc <i>in silico</i> chất ức
chế HDAC2 từ CSDL PubChem


</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

<b>DANH MỤC BẢNG </b>


<b>STT </b> <b>Ký hiệu </b> <b>Tên bảng </b> <b>Trang </b>



<b>1 </b> <b>Bảng 1.1 </b> Các nhóm thuốc chống ung thư <b>5 </b>
<b>2 </b> <b>Bảng 1.2 </b> Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm


lâm sàng.


<b>12 </b>


<b>3 </b> <b>Bảng 2.1 </b> Giá trị IC50 thực nghiệm của 45 hợp
chất trong CSDL.


<b>20 </b>


<b>4 </b> <b>Bảng 3.1 </b> Kết quả đánh giá nội và đánh ngoại mơ
hình QSAR.


<b>28 </b>


</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8>

<b>MỤC LỤC </b>


<b>DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT </b>
<b>DANH MỤC HÌNH VẼ </b>


<b>DANH MỤC BẢNG </b>


<b>MỞ ĐẦU ... 1 </b>


<b>Chƣơng 1- TỔNG QUAN ... 3 </b>


1.1. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư ... 3



1.1.1. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới ... 3


1.1.2. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam ... 4


1.2. Thuốc điều trị ung thư ... 4


1.3. Tổng quan histon deacetylase ... 6


1.3.1. Khái niệm histon deacetylase ... 6


1.3.2. Phân loại các HDAC ... 7


1.3.3. HDAC2 và vai trò trong ung thư ... 8


1.3.4. Các chất ức chế HDAC ... 11


1.3.5. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC ... 13


1.4. Tổng quan phương pháp QSAR ... 13


1.4.1. Lịch sử QSAR ... 13


1.4.2. Đại cương về QSAR ... 14


1.4.3. Quy trình xây dựng mơ hình QSAR ... 15


<b>Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 19 </b>


2.1. Nguyên liệu ... 19



2.1.1. Cơ sở dữ liệu ... 19


2.1.2. Phần mềm sử dụng ... 20


2.2. Phương pháp nghiên cứu ... 20


2.2.1 Tính tốn tham số mơ tả phân tử ... 20


2.2.2. Phân chia tập huấn luyện / Tập kiểm tra ... 21


</div>
<span class='text_page_counter'>(9)</span><div class='page_container' data-page=9>

2.2.4. Sàng lọc và dự đốn hoạt tính một số dẫn xuất HDAC2 sử dụng mơ


hình QSAR đã xây dựng được ... 21


<b>Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ... 23 </b>


3.1. Kết quả ... 23


3.1.1. Mơ hình tốn học thu được ... 23


3.1.2. Đánh giá mơ hình theo các tiêu chí của OECD ... 27


3.1.3. Sàng lọc ảo đánh giá khả năng ức chế HDAC2 sử dụng mơ hình
xây dựng được ... 29


3.2. Bàn luận ... 34


3.2.1. Về mơ hình QSAR ... 34



3.2.2. Về quy trình sàng lọc ảo. ... 35


<b>KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 37 </b>
<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO </b>


</div>
<span class='text_page_counter'>(10)</span><div class='page_container' data-page=10>

<b>MỞ ĐẦU </b>


Theo thống kê của tổ chức Y tế giới (WHO), ung thư đã trở thành căn
bệnh giết người hàng đầu thế giới, với khoảng 14 triệu ca mới phát hiện và
8,2 triệu trường hợp tử vong mỗi năm (số liệu tính đến hết năm 2012). So với
thế giới thì Việt Nam thuộc nhóm nước có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất đối với
nhiều loại ung thư. ớc tính mỗi năm tại Việt Nam có khoảng 150 - 200
nghìn người phát hiện bị ung thư, trong đó 70.000 trường hợp tử vong.


Trước tình hình đó, việc nghiên cứu và phát triển các thuốc mới chống
lại ung thư luôn là mối quan tâm hàng đầu của ngành công nghiệp dược phẩm
thế giới và Việt Nam. Tuy nhiên, quá trình nghiên cứu phát triển thuốc nói
chung và các thuốc điều trị ung thư nói riêng hiện nay vẫn chủ yếu dựa trên
các phương pháp kinh điển hay phương pháp “<i>thử và lỗi</i>” với nhược điểm là
tốn thời gian, tiền bạc và cho hiệu quả thấp [22]. Ngoài ra, các thuốc điều trị
ung thư hiện đang gặp rất nhiều vấn đề liên quan đến độc tính và tỷ lệ kháng
thuốc cao. Do đó yêu cầu cấp bách đặt ra là phải nghiên cứu và phát triển
thuốc chống ung thư mới, có tác dụng chọn lọc trên đích phân tử nhằm phát
huy tối đa hiệu quả, lâu bị kháng và ít độc hơn.


Histon deacetylase (HDAC) là một trong những đích phân tử được ch
hiện nay, enzym này x c tác cho q trình deacetyl hố nhóm -N acetyl
lysine amino acid ở phần đi của histon. Người ta đã chứng minh được trong
nhiều tế bào ung thư có sự huy động quá mức các enzym HDAC, gây nên
hiện tượng giảm sự acetyl hoá của histon. Các chất ức chế HDAC có thể ngăn


chặn q trình này thông qua việc làm thay đổi biểu hiện gen gây ung thư hay
các gen ức chế khối u do gây cường acetyl hóa các protein histone [32]. Hiện
nay người ta đã biết đến 18 loại HDAC khác nhau, chia thành 4 nhóm, trong
đó HDAC2 thuộc nhóm I được đánh giá là một đích phân tử quan trọng do có
vai trị trong q trình deacetyl hố của các histon H3K56 và H4K16 xảy ra
trong hầu hết các dòng tế bào ung thư người [7,10].


</div>
<span class='text_page_counter'>(11)</span><div class='page_container' data-page=11>

quan mối quan hệ cấu trúc – tác dụng dược lý xuất hiện từ năm 1868, được
biết đến là mơ hình tốn học định lượng mối liên quan tác dụng dược lý và
cấu trúc hóa học của hợp chất hay còn gọi là QSAR. Xây dựng mơ hình
QSAR để dự đốn hoạt tính của những phân tử chưa từng được kiểm tra. Từ
đó gi p tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, tối ưu hóa cấu
tr c các hợp chất này nhằm tăng hoạt tính sinh học, giảm độc tính, tăng các
tính chất dược động học của thuốc. Phương pháp này nhìn chung nhanh có
tính kinh tế và hỗ trợ rất tốt cho các nghiên cứu thực nghiệm, giúp nâng cao
tỷ lệ thành công của nghiên cứu.


Từ các vấn đề nêu trên, mục tiêu chung của nghiên cứu này là “<i>Xây dựng </i>
<i>mơ hình tốn học giúp nhận biết chất ức chế enzym histon deacetylase 2 có </i>
<i>tác dụng chống ung thư</i>”. Với mục tiêu cụ thể:


- Xây dựng mơ hình QSAR mới sử dụng phương pháp hồi quy tuyến tính
nhằm dự đốn khả năng ức chế HDAC2.


- Đánh giá mơ hình xây dựng được theo các tiêu chí của Tổ chức kinh tế


thế giới (OECD).


</div>
<span class='text_page_counter'>(12)</span><div class='page_container' data-page=12>

<b>Chƣơng 1- TỔNG QUAN </b>
<b>1.1. Thực trạng ung thƣ và tử vong do ung thƣ </b>



<i><b>1.1.1. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư trên thế giới </b></i>


Ung thư là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trên
tồn thế giới. Trong năm 2012, có khoảng 14 triệu trường hợp ung thư được
phát hiện mới và có đến 8,2 triệu ca tử vong liên quan đến ung thư [40].
Trong đó, số lượng các ca tử vong do các ung thư chủ yếu là: ung thư phổi
(1,59 triệu ca), ung thư gan (745000 ca), ung thư dạ dày (723000 ca), ung thư
đại trực tràng (694000 ca), ung thư v (521000 ca), ung thư thực quản
(400000 ca) [40].


Số lượng các ca ung thư mới được dự đoán sẽ tăng khoảng 70% trong
vịng hai thập kỉ tới. Dự đốn số trường hợp ung thư hàng năm sẽ tăng từ 14
triệu trong 2012 lên 22 triệu trong vòng hai thập kỉ tới [2]. Hơn 60% số các ca
ung thư mới hàng năm trên thế giới xảy ra ở Châu Phi, Châu Á, Trung và
Nam Mỹ, chiếm 70% số các ca tử vong ung thư thế giới [40].


Đối với nam giới, 5 ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán trong năm
2012 là ung thư phổi, tuyến tiền liệt, đại trực tràng, dạ dày và gan. Đối với nữ
giới, 5 ung thư phổ biến nhất được chẩn đoán là ung thư v , đại trực tràng,
phổi, cổ tử cung, dạ dày.


</div>
<span class='text_page_counter'>(13)</span><div class='page_container' data-page=13>

<i><b>1.1.2. Thực trạng ung thư và tử vong do ung thư ở Việt Nam </b></i>


Ở Việt Nam, trong năm 2012, số lượng các ung thư gặp phổ biến ở nam
giới là gan 16.815 ca, phổi 16.082 ca, dạ dày 9.406 ca, đại trực tràng 4.561 ca
và mũi họng 3.301 ca; còn các ung thư gặp phổ biến ở nữ giới là: vú 11.067
ca, phổi 5.783 ca, gan 5.182 ca, cổ tử cung 5.146 ca và dạ dày 4.797 ca [39].


Ở Việt Nam, tổng số ca tử vong do ung thư năm 2012 là 91.600 ca,


trong đó: số nam giới tử vong do ung thư là 58.200 ca: ung thư gan chiếm
26,9%, phổi 24,4%, dạ dày 14,5%, miệng - thực quản 5,8%, đại trực tràng
5,2% và do ung thư khác là 23,2%; số nữ giới tử vong do ung thư là 33.400
ca: ung thư phổi chiếm 14,5%, gan 13,7%, v 12,5%, dạ dày 12,1%, đại trực
tràng 8% và do ung thư khác là 39,3% [39].


<b>1.2. Thuốc điều trị ung thƣ </b>


Ngày nay có nhiều phương pháp điều trị ung thư, gồm có phẫu thuật,
vật lí trị liệu (xạ trị liệu), hóa trị liệu (dùng thuốc điều trị ung thư), nội tiết,
miễn dịch [1]. Tuy nhiên áp dụng phương pháp nào để điều trị có hiệu quả
cịn tuỳ thuộc vào giai đoạn, vào sức chịu đựng của cơ thể, vào khả năng của
cơ sở điều trị và một phần vào kinh nghiệm của thầy thuốc chuyên khoa.


</div>
<span class='text_page_counter'>(14)</span><div class='page_container' data-page=14>

Có khoảng hơn 200 loại thuốc chống ung thư trên lâm sàng [1]. Theo
cơ chế hoạt động, các thuốc chống ung thư được phân loại như bảng 1.1 [1].


<b>Bảng 1.1. Các nhóm thuốc chống ung thư </b>


<b>Nhóm tác nhân </b> <b>Mục tiêu </b> <b>Cấu trúc hóa học </b>


Các tác nhân ngăn
chặn tổng hợp DNA
bằng alkyl hóa có
nguồn gốc tổng hợp
(các tác nhân alkyl
hóa)


Liên kết chéo DNA Nitrogen mustard
Ethyle limin



Sulfonic acid ester
Epoxide


Nitrosourea


Halogenated hexitol
Hợp chất platinum
Kháng sinh kháng u Xen giữa DNA làm đứt gãy


DNA


Anthracyclin,
Actinomycin D,
Mitomycin C,
Bleomycin
Các kháng chuyển


hóa


Sinh tổng hợp acid nhân Các kháng acid Folic,
kháng Purin, kháng
Pirimidin, các ức chế
tổng hợp protein và acid
amin


Các ức chế giai
đoạn gián phân hình
thoi



Ngăn cản hình thức thoi
trong kì gián phân


Alkaloid nhóm vinca
Podophylin


Colchicin


Hỗn hợp Khơng xác định Alkylamin (HMM,
PMM)*


Dacarbazin
Procarbazin
Các Taxane Làm đông cứng các vi quản


</div>
<span class='text_page_counter'>(15)</span><div class='page_container' data-page=15>

Các camptothecin Ức chế men topoisomerasa I Camptothecin, CPT - 11
Các hormone Androgen


Estrogen
Steroid
Progestin


Các thuốc tác dụng lên tuyến
yên


Antiandrogen


Estrogen Antiestrogen
Antisteroid



* HMM: Hexamethylmelamine
PMM: Pentamethylmelamine
<b>1.3. Tổng quan histon deacetylase </b>


<i><b>1.3.1. Khái niệm histon deacetylase </b></i>


Nhiễm sắc thể là phức hợp gồm 3 thành phần: ADN, protein histon và
protein không phải histon [21]. Đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể là
nucleosom. Mỗi nucleosom gồm 146 cặp base ADN được gói trong một
protein histon octame [16] tạo bởi 4 thành phần: H2A, H2B, H3, H4 [13].


Các đầu amino của protein histon thường bị biến đổi bởi các quá trình
methyl hóa, phosphoryl hóa hoặc acetyl hóa sau dịch mã. Quá trình acetyl hố
là một trong những cơ chế điều hồ chính của biểu thị gen. Kiểm sốt q
trình biểu thị gen này phụ thuộc vào sự cân bằng giữa hoạt động của enzym
histon acetylase và enzym histon deacetylase, nhờ vào sự điều hồ q trình
acetyl hố lysin ở phần đi histon [6].


Histon acetyltrasferase (HAT) là enzym acetyl hóa nhóm -NH2 trong
gốc lysin (đầu N tận) của histon, làm trung hịa điện tích dương trên lysin, do
đó giảm khả năng tương tác của histon với ADN (tích điện âm) tạo cấu trúc
mở chromatin. Vì vậy, sự acetyl hóa histon tạo điều kiện cho quá trình phiên
mã, dịch mã xảy ra (hình 1.1b) [6,21].


</div>
<span class='text_page_counter'>(16)</span><div class='page_container' data-page=16>

<i><b>Hình 1.1. </b>Cấu trúc nhiễm sắc thể điều hòa hoạt động phiên mã. (a) Sự </i>
<i>methyl hóa và deacetyl hóa histon dẫn tới hình dạng đóng xoắn nhiễm sắc thể </i>


<i>và ức chế phiên mã. (b) Sự acetyl hóa và demethyl hóa histon làm tháo xoắn </i>
<i>nhiễm sắc thể và cho phép phiên mã. </i>



<i><b>1.3.2. Phân loại các HDAC </b></i>


Hiện nay người ta đã biết đến 18 loại HDAC khác nhau, được chia
thành 4 nhóm: I, II, III, IV. HDAC nhóm I, II và IV được gọi là các HDAC
“kinh điển” và thường được sử dụng để sàng lọc và thiết kế các chất ức chế
HDAC mới [43].


Nhóm I: HDAC1, HDAC2, HDAC3, HDAC8. Các enzym này có ở
phần nhân của nhiều loại tế bào.


Nhóm II: gồm nhóm IIa và nhóm IIb. Trong đó nhóm IIa có HDAC4,
HDAC5, HDAC7, HDAC9, nhóm IIb có HDAC6, HDAC10. Các enzym này
biểu thị mơ đặc trưng, có khả năng di chuyển giữa bào tương và nhân.


Nhóm III: Các protein điều hồ chuỗi thơng tin 2 (SIRT): SIRT 1 – 7,
chúng có ở bào tương, ty thể và nhân.


Nhóm IV: HDAC11, có ở phần nhân của nhiều loại tế bào.


</div>
<span class='text_page_counter'>(17)</span><div class='page_container' data-page=17>

Trung tâm hoạt động HDAC gồm 2 phần chính (Hình 1.2): ion Zn2+ là
coenzyme của HDAC và kênh enzym dạng túi hình ống. Cấu trúc rất linh
động, có thể biến đổi phù hợp với chiều dài cơ chất khác nhau. Trên miệng túi
có một vành nhỏ được tạo nên từ một vài vòng xoắn protein, phần vành này
sẽ tương tác với nhóm nhận diện bề mặt HDAC [18].


<i><b>Hình 1.2</b>. Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC nhóm I, II, IV. </i>


<i><b>1.3.3. HDAC2 và vai trò trong ung thư </b></i>


Histon deacetylasa 2 (HDAC2) thuộc HDAC nhóm I. HDAC2 hoạt


động như một chất ức chế phiên mã thơng qua loại bỏ nhóm lysine ở đầu N
của protein histon (H2A, H2B, H3 và H4). Tuy nhiên HDAC2 không liên kết
với ADN nên chúng sẽ được chọn lọc bởi các yếu tố phiên mã như YY1,
SP1/SP3, gen ức chế khối u p53 và BRCA1. HDAC2 cũng có thể được gắn
vào ADN như là một phần của phức hợp CoREST, mSin3 và NuRD. Những
phức hợp là mục tiêu với các trình tự gen đặc hiệu bằng các tương tác với các
yếu tố phiên mã trình tự đặc hiệu. Ví dụ, các HDAC2/HDAC1 chứa phức hợp
Sin3-SAP chọn lọc họ E2F của các yếu tố phiên mã để ức chế phiên mã [17].


</div>
<span class='text_page_counter'>(18)</span><div class='page_container' data-page=18>

chẳng hạn như MeCp2 – là một protein có nhóm liên kết methyl. Các enzyme
vận chuyển nhóm methyl DNA DNMT1, DNMT3A và DNMT3B, sự methyl
transferases histone SUVAR39H1 và G9a và histon bị bỏ đi nhóm methyl
(LSD1), cho thấy một cách khác mà HDAC2 quy định biểu hiện gen và sửa
chữa nhiễm sắc.


HDAC2 cũng quy định biểu hiện gen thông qua sự deacetyl của yếu tố
phiên mã cụ thể bao gồm STAT3 và SMAD7. HDAC2 là một chìa khóa quan
trọng của gen điều hịa chu kỳ tế bào, q trình tế bào tự tiêu diệt, kết dính tế
bào và di cư. Cùng với HDAC1, HDAC2 quy định việc phiên mã của các gen
liên quan đến quá trình tạo máu, biệt hóa tế bào biểu mơ, phát triển tim và tế
bào thần kinh [34].


Các đột biến có thể có ở HDAC2 xuất hiện ở tế bào soma. HDAC2 bị
đột biến trong các khối u lẻ tẻ và trong các khối u phát sinh ở người có ung
thư biểu mô đại trực tràng không polyp di truyền. Đột biến này do sự cắt bỏ 9
adenin ở exon1 tạo thành protein không hoạt động. Sự biểu hiện các dạng đột
biến của HDAC2 gây ra sự kháng với tác dụng của các chất ức chế HDAC.
Việc thiếu các biểu hiện và chức năng HDAC2 tạo nên sự tăng điều chỉnh gen
th c đẩy tăng trưởng khối u [5,25].



<i>HDAC2 liên quan đến nhiều bệnh ung thư khác nhau: </i>


Việc điều hòa về biểu hiện hoạt động HDAC2 có liên quan đến sự phát
triển ung thư. HDAC2 biểu hiện quá mức trong các loại ung thư khác nhau
bao gồm cả đại tràng, dạ dày, cổ tử cung, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư phổi
không tế bào nhỏ và ung thư biểu mô tế bào gan. HDAC2 biểu hiên quá mức
liên quan đến ung thư một phần thông qua việc chọn lọc sai lầm của nó và sự
im lặng của các gen ức chế khối u. Sự ức chế của gen p21WAF1 ức chế khối
u ở vùng khởi động và có thể được đảo ngược bởi việc điều trị bằng thuốc ức
chế HDAC [31]. Biểu hiện HDAC2 tương quan với tiên lượng xấu khi bệnh ở
giai đoạn tiên triển trong ung thư đại trực tràng, tuyến tiền liệt, dạ dày và biểu
mơ tế bào gan.


</div>
<span class='text_page_counter'>(19)</span><div class='page_container' data-page=19>

tìm thấy ở mức độ protein và mRNA chỉ ra rằng HDAC2 quá mức là do hoạt
hóa phiên mã. Các nghiên cứu cho thấy trong loại khối u này sự phiên mã
HDAC2 được điều chỉnh bởi tín hiệu beta-catenin-TCF-myc đã bị xóa bỏ
trong bệnh ung thư đại tràng. HDAC2 biểu hiện quá mức tương quan với tiên
lượng xấu và bệnh ở giai đoạn tiến triển trong ung thư đại trực tràng. Tuy
nhiên, Ropero và các cộng sự tìm thấy một sự đột biến bất hoạt của HDAC2
trong ung thư đại tràng với bất ổn microsatellite [29].


Ung thư v : Các nghiên cứu khác nhau cho thấy vai trò quan trọng của
HDAC2 trong ung thư v . HDAC2 gây lão hóa trong tế bào ung thư v . Hơn
nữa sự mất hoạt tính của HDAC2 kéo theo q trình chết tế bào (apoptosis)
của tamoxifen trong estrogen/ progesterone tế bào ung thư v dương tính
[27].


Bệnh ung thư tuyến tiền liệt: Theo nghiên cứu của Weichert và các
cộng sự thấy rằng HDAC2 được biểu hiện mạnh mẽ trong hơn 70% các
trường hợp phân tích ung thư tuyến tiền liệt. Sự gia tăng trong biểu hiện


HDAC2 có liên quan với tăng cường tăng sinh tế bào khối u [5].


Ung thư biểu mô tế bào gan: HDAC2 quy định chu kỳ tế bào và sự
phân chia của HDAC2 gây ra ngừng chuyển pha G1/S trong chu kỳ tế bào.
Trong quá trình chuyển đổi G1/S, sự phân chia đích của HDAC2 có tính
chọn lọc gây ra các biểu hiện của p16 (INK4a) và p21 (WAF1/Cip1), và đồng
thời ức chế sự biểu hiện của cyclin D1, CDK4 và CDK2. Do đó, sự ức chế
HDAC2 dẫn đến sự giảm điều chỉnh của gen đích E2F/DP1 thơng qua việc
giảm sự phosphoryl hóa protein PRB [5].


</div>
<span class='text_page_counter'>(20)</span><div class='page_container' data-page=20>

đích E2F/DP1 của các tế bào A549. HDAC2 trực tiếp điều chỉnh biểu hiên
p21WAF/Cip1 không phụ thuộc p53 [5].


Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD): giảm hoạt động và biểu hiện
HDAC2 được tìm thấy trong bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD). Việc
giảm hoạt động của HDAC2 làm tăng điều hòa các gen liên quan đến phản
ứng viêm và kháng corticosteroid trong COPD [5].


<i><b>1.3.4. Các chất ức chế HDAC </b></i>


</div>
<span class='text_page_counter'>(21)</span><div class='page_container' data-page=21>

<i><b>Bảng 1.2. </b>Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm lâm sàng. </i>


<b>Nhóm </b> <b>Hợp chất </b> <b>Pha </b> <b>Loại ung thƣ </b>


Acid carboxylic Butyrat


AN-9 (tiền thuốc)
Acid valproic
Phenyl butyrate
I, II


I, II
I, II
I


Ung thư đại tràng
Thể rắn, NSCLC


Thể rắn, ung thư máu, AML,
MDS, CTCL, u trung biểu


Thể rắn, AML/MDS


Acid hydroxamic SAHA


PXD101
NVP-LAQ824
LBH-589
ITF-2357
SB-939
CRA 024781
JNJ-16241199
Đã c/m
I, II
II
I
II, III
II
I
I


I
CTCL


Thể rắn, ung thư máu
Ung thư máu


Thể rắn, ung thư máu
Thể rắn, AML, ALL,
MDS


U lympho Hodgkin
Thể rắn, ung thư máu


Các benzamid SNDX-275


(MS-275)
CI-994
MGCD-0103
I, II
I, II
II


Thể rắn, u lympho, AML, u
hắc sắc tố ác tính di căn tiến
triển


Thể rắn, NSCLC, tế bào
thận, tuỵ


Thể rắn, ung thư bạch cầu,


MDS


Peptid vòng Depsipeptid


(FK228)


I, II Thể rắn, CLL, AML, CTCL,


</div>
<span class='text_page_counter'>(22)</span><div class='page_container' data-page=22>

Trong đó:


NSCLC (Non-Small Cell Lung Cancer) : Ung thư phổi không tế bào nhỏ
AML (Acute Myeloid Leukemia): Bệnh bạch cầu myeloid cấp tính
MDS (Myelodysplastic Syndrome ): Hội chứng rối loạn sinh tủy
CTCL (Cutaneous T Cell Lymphoma): U lympho tế bào T da
NHL (non-Hodgkin's lymphoma): Ung thư hạch không Hodgkin
RAI (Radioactive iodine): Iod phóng xạ


Tuy nhiên, mỗi nhóm nêu trên đều có những hạn chế nhất định như:
các acid hydroxamic bị chuyển hoá nhanh, ức chế không chọn lọc lên các loại
enzym HDAC; các benzamid và acid béo có hiệu lực kém; các peptid vịng
khó tạo thành về mặt hố học và FK-228 có phần gắn kết với ion Zn2+ chứa
thiol [26].


<i><b>1.3.5. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC </b></i>


Các chất ức chế HDAC có tác dụng chống ung thư do tác động lên
nhiều giai đoạn quan trọng của chu trình tế bào làm mất sự điều hòa trong
tế bào ác tính. Trong đó, yếu tố then chốt quyết định hoạt tính chống ung
thư của ch ng là th c đẩy sự biệt hóa, ức chế chu trình tế bào và th c đẩy
sự chết tế bào. Ngồi ra, hoạt hóa đáp ứng miễn dịch và ức chế sự tạo


mạch cũng là vai trò rất quan trọng của các UHDA, gián tiếp ức chế sự
phát triển của các khối u. Ngoài ra các chất ức chế HDAC ngăn cản các đi
histon có nhóm acetyl tiến đến vị trí xúc tác [7,9].


Vai trị sinh học của HDAC và các nghiên cứu về các chất UHDA cho
thấy nó là một mục tiêu quan trọng cần hướng tới trong điều trị ung thư. Do
đó, việc tìm kiếm các hợp chất mới có tiềm năng ức chế HDAC là một hướng
đi nhằm tìm kiếm các hợp chất mới với khả năng ức chế cao hơn, ít độc tính
hơn đang là một hướng đi được nhiều nhà khoa học quan tâm [21].


<b>1.4. Tổng quan phƣơng pháp QSAR </b>


<i><b>1.4.1.</b></i> <i><b>Lịch sử QSAR </b></i>


</div>
<span class='text_page_counter'>(23)</span><div class='page_container' data-page=23>

rằng sự khác nhau về tác dụng sinh học là do sự thay đổi về tính chất lí hóa.
Đến năm 1935, một phương trình quan trọng của Hammett được coi là mơ
hình đầu tiên biểu diễn mối quan hệt hoạt tính và cấu trúc:


<i>Log</i> <i> </i>


Với K, Ko là hằng số acid,  là hằng số Hammett, thơng số hóa l đặc
trưng cho khả năng h t hoặc đấy điện tử của nhóm thế.


QSAR thực sự được nghiên cứu bởi C.L. Corwin Hansch từ
những năm 60 của thế kỉ 20. Mơ hình QSAR Hansch thường sử dụng phương
pháp hồi quy tuyến tính đa biến để biểu thị mối tương quan giữa các tham số
hóa lí và hoạt tính sinh học, ví dụ một phương trình của ơng như sau:


Log (1/C) = k1+ k22+ k3



Trong đó: C là nộng độ mol mà tại đó hoạt chất thể hiện hoạt tính sinh
học, : hằng số kỵ nước, : hằng số thế Hammett, k1,k2,k3 là các hệ số hồi
quy.


Kể từ đây, đã có nhiều phương trình QSAR cùng với những phương
pháp xây dựng đa dạng đã ra đời và chiếm một vai trò quan trọng trong
nghiên cứu và phát triển dược phẩm.


<i><b>1.4.2. Đại cương về QSAR </b></i>


Về mặt toán học, mơ hình QSAR (Quantitative Structure-Activity
Relationships) biểu diễn mối tương quan định lượng giữa cấu trúc phân tử và
hoạt tính thơng qua phương trình:


<i>Y = f(x1) + f(x2) + ... + f(xn) </i> <i>(1.4.2) </i>


Trong đó, <i>Y </i>là biến phụ thuộc, phản ánh hoạt tính sinh học của các hợp
chất. Giá trị của <i>Y </i>được xác định thông qua các nghiên cứu thực nghiệm, ví
dụ như nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzym (IC50), MIC (Minimum


</div>
<span class='text_page_counter'>(24)</span><div class='page_container' data-page=24>

tác dụng tối đa... <i>Y </i>cũng có thể nhận giá trị rời rạc, ví dụ như có hay khơng có
hoạt tính, hoạt tính mạnh hay yếu. Các biến <i>x </i>trong mơ hình QSAR được gọi
là các tham số phân tử (TSPT), mô tả một đặc điểm cấu tr c nào đó của phân
tử hóa học.Hàm <i>f </i>là một hàm mơ tả mối tương quan giữa <i>Y </i>và các biến <i>x. </i>Để
xây dựng được hàm <i>f</i>, cần áp dụng các thuật toán thống kê (statistical) hoặc
học máy (machine learning). Một số kỹ thuật thống kê thường được sử dụng
trong xây dựng mơ hình QSAR có thể kể đến như bình phương tối thiểu từng
phần (Partial Least Squares), hồi quy đa biến tuyến tính (Multiple Linear
Regression), phân tích thành phần chính (Principal Component Analysis).



<i><b>1.4.3. Quy trình xây dựng mơ hình QSAR </b></i>


Các bước để xây dựng mơ hình QSAR [19] gồm:


1) Xây dựng cơ sở dữ liệu (CSDL); 2) Tính tốn tham số mơ tả phân tử đặc
trưng cho cấu trúc; 3) Xây dựng mơ hình QSAR: Sử dụng các phương pháp
xác suất thống kê và các kỹ thuật của trí tuệ nhân tạo để xây dựng mối liên hệ
giữa các tham số phân tử (TSPT) và các giá trị đại lượng biểu diễn hoạt tính;
4) Đánh giá mơ hình; 5) Giải thích các kết quả và sử dụng mơ hình trong q
trình sàng lọc ảo (nếu có thể).


<i><b>Xây dựng cơ sở dữ liệu</b>:</i> CSDL thường là cấu trúc của các hợp chất
hoá học đã được chứng minh hoạt tính sinh học <i>in vitro</i>. Để hạn chế các yếu
tố gây sai số cho mô hình, CSDL thường sẽ được làm sạch dựa trên sự tương
đồng về cấu trúc, về protocol,...


<i><b>Tính tốn tham số mô tả phân tử đặc trưng cho cấu trúc: </b></i>


Tham số mô tả phân tử là một số thu được từ một q trình tốn học và
lơgic chuyển đổi thông tin được mã hóa trong cấu trúc hóa học [37]. Trong
nghiên cứu này, các tham số được tính tốn sử dụng phần mềm Dragon [37].


</div>
<span class='text_page_counter'>(25)</span><div class='page_container' data-page=25>

<i><b>Đánh giá mơ hình</b></i>: Đánh giá mơ hình là giai đoạn quan trọng liên quan
đến khả năng ứng dụng của mơ hình. Đánh giá mơ hình thường sử dụng 5
nguyên tắc của OECD [28].


<b>- </b> <i>Nguyên tắc 1:</i> Có đích xác định (defined end-points).


Đích là những giá trị thực nghiệm về hoạt tính sinh học thu được từ
CSDL. Nếu toàn bộ CSDL đều sử dụng một protocol để xác định giá trị của


đích, thì mơ hình xây dựng được có độ tin cậy cao, có thể dùng để dự đốn
hoạt tính các hợp chất mới (nếu thực nghiệm dùng theo quy trình này). Cịn
nếu CSDL sử dụng nhiều protocol khác nhau thì mơ hình sẽ khơng có độ tin
cậy cao.


<b>- </b> <i>Nguyên tắc 2:</i> Các thuật tốn sử dụng được mơ tả rõ ràng.


Các thuật tốn sử dụng để xây dựng mơ hình cần được mơ tả rõ ràng,
có khả năng ứng dụng để xây dựng các mơ hình khác.


<b>- </b> <i>Ngun tắc 3:</i> Có miền cấu trúc ứng dụng xác định.


Miền cấu trúc ứng dụng là khoảng không gian cấu tr c được xác định
bởi các hợp chất trong tập huấn luyện để xây dựng mơ hình. Những hợp chất
thuộc tập huấn luyện nếu có cấu trúc nằm ngồi miền cấu trúc ứng dụng sẽ
ảnh hưởng đến độ chính xác của mơ hình. Những hợp chất thuộc tập dự đốn,
nếu có cấu trúc nằm ngồi miền này sẽ cho kết quả dự đốn khơng chính xác.
Các phương pháp xác định miền ứng dụng thường gặp như: phương pháp đòn
bẩy, phương pháp ba lân cận gần nhất,...


<b>- </b> <i>Nguyên tắc 4:</i><b> Có độ khớp, độ ổn định, và khả năng dự đốn tốt. </b>


 Độ khớp hay độ tuyến tính được đánh giá thông qua giá hệ số xác định
R2, R2 càng cao thì mức độ khớp (tuyến tính) của mơ hình với các giá trị thực
nghiệm càng tốt. R2> 0,6 thì mơ hình mới có nghĩa. Cơng thức tính hệ số
xác định như sau:


<i>R2 = 1- </i>


∑ <i>yi</i><i>y</i>^<i>i</i>



</div>
<span class='text_page_counter'>(26)</span><div class='page_container' data-page=26>

Trong đó n là số các quan sát của tập huấn luyện; yi,<i>yi</i>


^


, lần lượt là giá
trị thực tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; <i>y</i>là giá trị thực
tế trung bình của biến phụ thuộc.


 Độ ổn định được đánh giá thông qua hệ số tương quan chéo Q2


, Q2
được đánh giá dựa trên phương pháp tham số chéo (cross validation leave one
out) bằng cách lần lượt loại 1 quan sát ra khỏi tập huấn luyện, giữ nguyên các
biến đã lựa chọn và tính tốn lại các thơng số của mơ hình. Q2 càng gần 1,
tính tổng qt hóa của mơ hình càng cao, mơ hình càng ổn định. Thơng
thường, u cầu Q2


> 0,5 thì mơ hình mới bền vững. Cơng thức hệ số tương
quan chéo tính như sau:


<i>Q2 = 1 </i>


-∑<sub> </sub> <i>y<sub>i</sub></i><i>y</i>^<i><sub>i</sub></i><sub>/</sub><i><sub>i</sub></i>


∑<sub> </sub> (<i>y<sub>i</sub></i><i>y</i>)


Trong đó n là số các quan sát tập huấn luyện; yi, là giá trị thực tế của


quan sát thứ i; <i>y</i>^<i>i</i>/<i>i</i> giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i sử dụng



mơ hình đã loại biến i; <i>y</i>là giá trị thực tế trung bình của biến phụ thuộc.


 Khả năng dự đoán ngoại


Khả năng dự đoán ngoại được đánh giá thông qua giá trị Q2ext, Q
2


ext


càng lớn mơ hình càng cho thấy độ tuyến tính của tập kiểm tra và do vậy
chứng tỏ khả năng dự đốn của mơ hình cao.


2


<i>ext</i>


<i>Q</i> <i> = 1 </i>


-∑ <i>yi</i><i>y</i>^<i>i</i>


∑<sub> </sub>(<i>y<sub>i</sub></i><i>y</i>)
Trong đó n là số các quan sát tập kiểm tra; yi,


^


<i>y</i>, lần lượt là giá trị thực
tế, giá trị dự đoán của biến phụ thuộc ở quan sát thứ i; <i>y</i>là giá trị thực tế
trung bình của biến phụ thuộc.



<b>- </b> <i>Nguyên tắc 5:</i> Giải thích được cơ chế (nếu có thể).


</div>
<span class='text_page_counter'>(27)</span><div class='page_container' data-page=27></div>
<span class='text_page_counter'>(28)</span><div class='page_container' data-page=28>

<b>Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU </b>
<b>2.1. Nguyên liệu </b>


<i><b>2.1.1. Cơ sở dữ liệu</b></i>


Cơ sở dữ liệu (CSDL): gồm 45 hợp chất ức chế HDAC2 lựa chọn từ dữ
liệu xây dựng bởi 6 bài báo khoa học đã cơng bố trước đó cùng với giá trị IC50


được xác định bằng phương pháp giống nhau (sử dụng Kit định lượng
Bioscence®) [8,14,15,24,36,38]. Cơng thức hóa học mơ tả như hình 2.1 và
giá trị IC50 tương ứng được nêu trong bảng 2.1.



N
O
O
O
NHOH
O
X
1. X=H
2. X=Cl
3. X=F
4. X=Br
5. X=H3C
6. X=H3CO
N
O


O
O
NHOH
O
Cl
(7)
(1-6)
O
H
N
N
O
N OH
OH
X 8. X=H<sub>9. X=F</sub>


10. X=Cl
11. X=Br
12. X=H3C
13. X=H3CO
O
H
N OH
N
O
N OH
Cl
(8-13) (14)
O
H


N
N
O
N O
CH3
OH
X
15. X=H
16. X=F
17. X=Cl
18. X=Br
19. X=H3C
20. X=H3CO
O
H
N OH
N
O
N O
CH3
Cl
(15-20) (21)
HOHN
N
O


O2S


X



HOHN


N
O


O2S


OCH3
OCH3
22. X=H3CO
24. X=F
25. X=NO2
(22,24,25) <sub>(23)</sub>
HOHN
N
O
(26)
N
O
H
N
OH
O O
N
O
H
N
OH
O O
F


N
O
H
N
OH
O O
N
HN
O
H
N
OH
O O
(27)
(29)
(30)
(28)
N
O
O
O
NHOH
O
X
31. X=H
32. X=F
33. X=Cl
34. X=Br
35. X=NO2
36. X=H3C

37. X=H3CO
N
O
O
O
NHOH
O
Cl
(31-37) (38)
N
S
S
O
NHOH
O
N
S
S
O
NHOH
O
H3C


N
H
N
NHOH
O
O
O


H
N
NHOH
O
O
H
N
H
N
NHOH
O
O
H
N
NHOH
O
O
H
N
NHOH
O
O
(39) (40)
(41) (42)
(43) (44)
(45)


</div>
<span class='text_page_counter'>(29)</span><div class='page_container' data-page=29>

<i><b>Bảng 2.1. </b>Giá trị IC50 thực nghiệm của 45 hợp chất trong CSDL.</i>
<b>STT </b> <b>IC50 </b>



<b>(µM) </b>


<b>STT </b> <b>IC50 </b>


<b>(µM) </b>


<b>STT </b> <b>IC50 </b>


<b>(µM) </b>


<b>STT </b> <b>IC50 </b>


<b>(µM) </b>


<b>STT </b> <b>IC50 </b>


<b>(µM) </b>
<b>1 </b> 0,308 <b>10 </b> 0.116 <b>19 </b> 0.175 <b>28 </b> 0.310 <b>37 </b> 0.120
<b>2 </b> 0,284 <b>11 </b> 0.152 <b>20 </b> 0.254 <b>29 </b> 0.190 <b>38 </b> 0.150
<b>3 </b> 0,891 <b>12 </b> 0.086 <b>21 </b> 1,399 <b>30 </b> 0.192 <b>39 </b> 0.320
<b>4 </b> 0,460 <b>13 </b> 0.120 <b>22 </b> 0.3618 <b>31 </b> 0.160 <b>40 </b> 0.260
<b>5 </b> 0,358 <b>14 </b> 0.179 <b>23 </b> 0.002 <b>32 </b> 0.060 <b>41 </b> 2,457
<b>6 </b> 0,870 <b>15 </b> 0.117 <b>24 </b> 0.199 <b>33 </b> 0.030 <b>42 </b> 1,987
<b>7 </b> 1,779 <b>16 </b> 0.447 <b>25 </b> 0.189 <b>34 </b> 0.030 <b>43 </b> 2,015
<b>8 </b> 0.116 <b>17 </b> 0.472 <b>26 </b> 0.381 <b>35 </b> 0.080 <b>44 </b> 0.105
<b>9 </b> 0.152 <b>18 </b> 0.267 <b>27 </b> 0.270 <b>36 </b> 0.160 <b>45 </b> 5.784


<i><b>2.1.2. Phần mềm sử dụng </b></i>


Danh sách các phần mềm sử dụng bao gồm:



1. ChemDraw phiên bản 10.0 2. Dragon 6.0
3. Mobydigs 1.0 4. Microsoft Excell 2007
5. STATISTICA 10.0


<b>2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu </b>


<i><b>2.2.1 Tính tốn tham số mơ tả phân tử </b></i>


</div>
<span class='text_page_counter'>(30)</span><div class='page_container' data-page=30>

Entry System) bằng việc sử dụng phần mềm ChemDraw phiên bản 10.0 [33].
Căn cứ vào các mã code, hơn 2000 mô tả phân tử thuộc họ 0D, 1D và 2D
được tính tốn bằng phần mềm Dragon phiên bản 6.0 [3].


<i><b>2.2.2. Phân chia tập huấn luyện / Tập kiểm tra </b></i>


Sau khi tính tốn mơ tả phân tử, CSDL được chia ngẫu nhiên thành tập
huấn luyện (Tr - training set) và tập kiểm tra (Te – test set). Tập huấn luyện
(chiếm 75% CSDL) được sử dụng cho việc xây dựng (huấn luyện) mơ hình.
Tập huấn luyện cho phép phát hiện mối quan hệ có khả năng dự đốn. Cịn
tập kiểm tra bao gồm các phân tử mà mơ hình chưa bao giờ gặp được sử dụng
để đánh giá độ mạnh và khả năng ngoại suy của các mơ hình xây dựng được.


<i><b>2.2.3. Xây dựng mơ hình QSAR </b></i>


Tập huấn luyện gồm 75% số hợp chất trong CSDL được lựa chọn ngẫu
nhiên để xây dựng mơ hình QSAR. Các hợp chất còn lại được xếp vào tập
kiểm nghiệm để đánh giá mô hình. Các mơ hình được xây dựng bằng các
phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính (MLR) sử dụng phần mềm
STATISTICA 10.0, lựa chọn TSPT bằng phương pháp thuật giải di truyền
(Genetic algorithm) sử dụng phần mềm Mobydigs 1.0, sau đó đánh giá để lựa


chọn mơ hình tốt nhất.


<i><b>2.2.4. Sàng lọc và dự đốn hoạt tính một số dẫn xuất HDAC2 sử dụng mơ </b></i>
<i><b>hình QSAR đã xây dựng được </b></i>


</div>
<span class='text_page_counter'>(31)</span><div class='page_container' data-page=31>

quả thu được dãy các dẫn xuất của hydroxamic, lựa chọn các hợp chất
chưa từng được nghiên cứu tác dụng ức chế HDAC2.


</div>
<span class='text_page_counter'>(32)</span><div class='page_container' data-page=32>

<b>Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN</b>
<b>3.1. Kết quả </b>


<i><b>3.1.1. Mơ hình tốn học thu được </b></i>


Mơ hình QSAR là mơ hình biểu thị mối liên hệ định lượng giữa cấu
trúc và hoạt tính của các hợp chất. Mơ hình QSAR được biểu diễn dưới dạng
một phương trình tốn học (<i>1.4.2</i>). QSAR sử dụng các TSPT, các kỹ thuật xác
suất thống kê và trí tuệ nhân tạo để xây dựng các mơ hình. QSAR được xây
dựng dựa trên giả thuyết là cấu trúc của một phân tử phải chứa những đặc
điểm cấu trúc liên quan tới tính chất hóa học, vật lý, sinh học và dựa trên khả
năng các mô tả phân tử. Bởi các mơ hình QSAR, hoạt tính sinh học của một
phân tử mới hoặc chưa được kiểm nghiệm có thể được suy ra từ cấu trúc của
các hợp chất tương tự trong đó tính chất của ch ng đã được kiểm nghiệm
[37].


Phương pháp QSAR xây dựng các mơ hình tốn học nhằm dự đốn
hoạt tính của các hợp chất dựa trên cấu trúc hóa học của chúng, là các kỹ
thuật nhằm dự đoán các kết quả trước khi các thử nghiệm được tiến hành
trong phịng thí nghiệm. QSAR cung cấp thơng tin dự đốn về kết quả có thể
có của một thử nghiệm nào đó và khả năng mới này cung cấp các yếu tố liên
quan để thiết lập thứ tự ưu tiên cho một chất mới cho các thử nghiệm [35].



Như vậy, để có thể xây dựng được các mơ hình này thì cả cấu trúc và
hoạt tính đều phải được định lượng hóa. Trong nghiên cứu này, các cấu trúc
được định lượng thông qua các TSPT (biến x), biến Y là giá trị logIC50 với


IC50 là nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzym HDAC2, được đánh giá bằng


các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm sử dụng Kit định lượng
Bioscence®). Giá trị logIC50 thu được bằng cách xử lí dữ liệu IC50 bằng phần


mềm Microsoft Excell 2007. IC50 càng nhỏ hoạt tính ức chế enzym HDAC2


của chất đó càng mạnh.


</div>
<span class='text_page_counter'>(33)</span><div class='page_container' data-page=33>

mềm Dragon [37]. Dragon là một phần mềm được phát triển bởi công ty
Talete của Italia vào năm 1993, được sử dụng rất rộng rãi hiện nay trong các
nghiên cứu hóa tin và thiết kế thuốc. Dragon tính tốn được hơn 5000 TSPT
khác nhau . Các mô tả phân tử thường được phân loại dựa vào chiều thông
tin mô tả cấu trúc. (i) Tham số 0D mô tả thành phần cấu tạo nên cấu trúc, còn
được gọi là các tham số đếm nguyên tử, như số lượng C, N... (ii) Tham số 1D
mô tả cấu tr c dưới dạng chuỗi, như vân tay cấu trúc (fingerprint), hay số
lượng các mảnh cấu tr c, như số lượng nhân thơm, nhóm carboxylic... (iii)
Tham số 2D mơ tả cấu tr c dưới dạng hình học topo, cho phép xác định chính
xác thứ tự, vị trí của nguyên tố hay mảnh cấu trúc trong phân tử. Các tham số
2D thường được tính tốn dựa trên lý thuyết về graph. (iii) Tham số 3D mô tả
đặc điểm cấu trúc của phân tử trong không gian. Các tham số 3D có thể được
tính tốn dựa trên các phương pháp l thuyết như MoRSE, GETAWAY, tính
tốn lượng tử, mơ tả bề mặt hoặc thể tích phân tử...


Trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn tham số phân tử 2D để mô tả


cấu trúc các hợp chất. Bởi so với các mơ tả phân tử 3D thì mơ tả phân tử 2D
không cần tới các thông tin về cấu trúc 3D của phân tử, có tính ổn định cao
hơn do các hợp chất được mô tả dưới dạng 3D thường có độ linh động về cấu
dạng.


Kết quả: Sử dụng phần mềm Dragon 6.0 tính tốn được 3764 TSPT cho
mỗi phân tử trong CSDL. Sau khi xử lí loại bỏ TSPT gây nhiễu, 1632 TSPT
cịn lại được kiểm tra quan hệ phi tuyến với biến đáp ứng LogIC50. Cuối cùng


các hợp chất được tính toán với 534 TSPT 2D và lưu dưới dạng file.txt.
<b>- </b> <i><b>Phân chia tập huấn luyện / tập kiểm tra </b></i>


Sử dụng phương pháp phân chia ngẫu nhiên chia 45 hợp chất trong
CSDL thành 34 hợp chất được phân vào tập huấn luyện, 11 hợp chất được
phân vào tập kiểm tra.


</div>
<span class='text_page_counter'>(34)</span><div class='page_container' data-page=34>

STATISTICA 10.0 để xác định tương quan hoạt tính ức chế với tham số mơ
tả phân tử Dragon.


 Lựa chọn TSPT thích hợp: tất cả các biến không phải được đưa
hết vào mơ hình. Mặc dù việc thêm biến độc lập vào làm tăng hệ số tương
quan R2, nhưng nó chỉ tốt khi chúng có liên hệ mạnh với biến phụ thuộc. Mơ
hình được chọn ứng với mô hình có Q2


cao nhất. Thực hiện thuật giải di
truyền để chọn mơ hình có các biến tối ưu bằng phần mềm Mobydigs 1.0.


Thuật giải di truyền dựa trên cơ chế của chọn lọc tiến hóa trong tự
nhiên: “Trong mọi thế hệ, một tập mới các sinh vật được tạo ra bằng cách lai
ghép những nhân tố thích hợp nhất với môi trường của những sinh vật trong


thế hệ cũ cùng với sự xuất hiện đột biến ngẫu nhiên của các cá thể trong thế
hệ mới”. Vận dụng cơ chế này, đầu tiên thuật toán sẽ mã hoá tất cả các tham
số của cấu tr c ban đầu trong một nhiễm sắc thế - biểu diễn bằng một vec tơ.
Từ nhiễm sắc thể ban đầu này, tạo ngẫu nhiên một quần thể. Quần thể này
được đánh giá và từ đó các nhiễm sắc thể thích nghi nhất (tức là có hàm mục
tiêu Q2 cao nhất) được chọn làm khung để tạo ra quần thể tiếp theo. Quy trình
này làm tăng Q2


của toàn bộ nhiễm sắc thể bằng cách truyền các đặc tính cấu
trúc thuận lợi từ một quần thể này sang một quần thể khác. Sau một số chu kỳ
tìm kiếm và đánh giá, cuối cùng ta sẽ tìm được một nhiễm sắc thể (mơ hình)
phù hợp với giá trị Q2 cao nhất.


Các bước thực hiện thuật giải di truyền:


(1). Khởi tạo một quần thể ban đầu (file đầu vào được lưu dưới dạng
file.mdd chứa các dữ liệu về tên, các mơ tả phân tử được tính toán bằng phần
mềm Dragon 6.0, giá trị log IC50 của các hợp chất trong tập huấn luyện).


(2). Xác định hàm mục tiêu (fitness) cho mỗi cá thể trong quần thể.
Hàm mục tiêu trong nghiên cứu này là giá trị Q2.


</div>
<span class='text_page_counter'>(35)</span><div class='page_container' data-page=35>

(4). Các cá thể trong quần thể mới được sinh ra thay thế cho các cá thể
trong quần thể cũ.


(5). Nếu điều kiện dừng, giải thuật dừng lại và trả về cá thể tốt nhất
cùng với giá trị hàm mục tiêu của nó.


Kết quả đã lựa chọn được 6 tham số mô tả phân tử có thể xây dựng mơ
hình tốt nhất. Đó là ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm),


SM09_AEA(dm), B06[N-O].


 Lập mô hình với số biến đã chọn bằng phương pháp hồi qui đa
biến tuyến tính (MLR) bằng phần mềm STATISTICA 10.0. MLR là một
trường hợp rất phổ biến trong thực tế, là tổ hợp tuyến tính giữa các biến phụ
thuộc (Y) với nhiều biến độc lập (x). Trong nghiên cứu này x chính là các
TSPT đặc trưng cho cấu trúc các hợp chất trong CSDL, Y là giá trị logIC50


với IC50 là nồng độ ức chế 50% hoạt tính của enzyme HDAC2. Phân tích hồi


qui bao hàm cả nghĩa “ước tính” (Estimating) hay “dự đốn” (Predictive) vì
sau khi sự tương quan tuyến tính giữa x và Y được thiết lập bởi một biểu thức
toán học cụ thể người ta có thể ước tính hay dự đoán giá trị của Y từ một giá
trị của x. Đường biểu diễn biểu thức toán học ấy được gọi là đường hồi qui
của Y theo x.


Kết quả mơ hình MLR xây dựng được gồm 6 biến TSPT như sau:


<i><b>LogIC</b><b>50 = 2.808 + 0.064×</b><b>ATS8m </b></i> – 230.167×<i><b>JGI10</b></i> –


1.072×<i><b>SM15_AEA(bo) </b></i>– 2.821×<i><b>SM08_AEA(dm)</b></i> +
3.519×<i><b>SM09_AEA(dm)</b></i> – 0.700×<i><b>B06[N-O]</b></i>


(3.1)
Trong đó ATS8m, JGI10, SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm),
SM09_AEA(dm), B06[N-O] là các biến tham số phân tử 2D. Hệ số của biến
mang dấu (+), giá trị biến TSPTcàng lớn thì logIC50 càng lớn, IC50 càng lớn


chứng tỏ hoạt tính ức chế enzyme HDAC2 của chất đó càng nhỏ. Và ngược
lại, hệ số biến mang dấu (-), giá trị biến TSPTcàng lớn thì logIC50 càng nhỏ,



</div>
<span class='text_page_counter'>(36)</span><div class='page_container' data-page=36>

<i><b>3.1.2. Đánh giá mơ hình theo các tiêu chí của OECD </b></i>


Đánh giá mơ hình QSAR là cơng việc quan trọng nhất quyết định việc
mơ hình xây dựng được có thể sử dụng để dự đốn sàng lọc hay khơng. Để sử
dụng và được thông qua mơ hình QSAR bởi các cơ quan quản lý, mô hình
phải thỏa mãn các ngun tắc, tiêu chí của OECD (Tổ chức kinh tế thế giới):


<i><b>Tiêu chí 1</b></i>: Tồn bộ CSDL đều sử dụng đích xác định là nồng độ ức
chế 50% (IC50) enzym HDAC2 được tiến hành theo cùng một điều kiện thí


nghiệm là sử dụng Kit định lượng Bioscence®.


<i><b>Tiêu chí 2</b></i>: Thuật tốn áp dụng rõ ràng: Các phương pháp xây dựng mơ
hình trong nghiên cứu chúng tôi đã nêu rõ trong mục 2.2. Do tính rõ ràng và
đ ng đắn của phương pháp mà mơ hình có thể được sử dụng lặp lại để phát
hiện các hợp chất mới ức chế HDAC2.


<i><b>Tiêu chí 3</b></i>: Xác định miền ứng dụng của mơ hình.


Để đạt được khả năng dự đốn tốt trong sàng lọc ảo, việc xác định được
miền ứng dụng của mơ hình QSAR là vô cùng cần thiết. Miền ứng dụng là
khoảng khơng gian cấu trúc bao gổm trong mơ hình. Chỉ những dự đốn đối
với các hợp chất có cấu trúc nằm trong miền cấu trúc này mới đáng tin cậy.


</div>
<span class='text_page_counter'>(37)</span><div class='page_container' data-page=37>

<i>Hình 3.1. Miền ứng dụng của mơ hình QSAR xác định hợp chất có khả năng </i>
<i>ức chế HDAC2.</i>


Sau khi tính tốn tập huấn luyện, ta thấy 34/34 hợp chất đều nằm trong
miền ứng dụng. Với tập kiểm tra, toàn bộ 11 hợp chất đều nằm trong miền


ứng dụng, do đó có thể thấy các dự đốn của mơ hình đối với tập kiểm tra là
hồn tồn đáng tin cậy.


<i><b>Tiêu chí 4</b></i>: Kết quả các đánh giá nội và ngoại được trình bày trong
bảng 3.1.


<i><b>Bảng 3.1.</b> Kết quả đánh giá nội và đánh ngoại mơ hình QSAR. </i>


<b>Thơng số </b> <b>R2 </b> <b>Q2 </b> <b>Q2ext </b>


<b>Giá trị thực tế </b> 0,89 0,81 0,85


Ta có R2 ~ 1,0 chứng tỏ độ chính xác của mơ hình cao, Q2 = 0,81 cho
thấy mơ hình có độ ổn định tốt. Khả năng dự đoán nội 88,85% và khả năng
dự đốn ngoại 84,64% cho thấy mơ hình có khả năng dự đốn hoạt tính tốt.


</div>
<span class='text_page_counter'>(38)</span><div class='page_container' data-page=38>

<i><b>Tiêu chí 5</b></i>: Giải thích cơ chế của mơ hình.


Mơ hình QSAR có sự tham gia của 6 biến, là các tham số phân tử 2D.
Tham số phân tử 2D biểu diễn các cấu tr c theo kích thước, độ phân nhánh,
và hình dạng tổng thể.


Các tham số phân tử 2D trong mơ hình bao gồm ATS8m, JGI10,
SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm), B06[N-O]. Trong đó:


 ATS8m: mô tả tự tương quan Moreau-Broto (ATS) đại diện cho các
tương tác giữa các nguyên tử ở khoảng cách topo 8, (lag 8) theo khối lượng
nguyên tử. Giá trị này dương, hệ số của tham số mang dấu (+) chứng tỏ sự có
mặt của các nguyên tử khối lượng càng lớn càng làm tăng tương tác và càng
giảm hoạt tính ức chế.



 JGI 10: Chỉ số topo trung bình cụm 10. Hệ số của tham số này mang
dấu (+), vì vậy giá trị này càng cao càng làm giảm hoạt tính.


 Các tham số SM15_AEA(bo), SM08_AEA(dm), SM09_AEA(dm)
thuộc nhóm mơ tả Edge adjacency indices. Việc giải thích các biến này gặp
phải khó khăn vì cơ chế của chúng phức tạp đòi hỏi những hiểu biết chuyên
sâu về hóa lượng tử. Bên cạnh đó chưa có nhiều tài liệu tham khảo, do đó
chưa đủ cơ sở để giải thích.


 B06[N-O] = 1 hoặc 0 nếu có mặt hoặc khơng có mặt khoảng cách
giữa 2 nguyên tử Nitơ và Oxi là 6 liên kết (C-C). Hệ số B06[N-O] mang dấu
(-) do đó nếu giá trị này bằng 1 sẽ làm tăng hoạt tính ức chế.


Như vậy mơ hình thỏa mãn các tiêu chí đánh giá của OECD, do đó có
thể ứng dụng mơ hình này để ứng dụng vào dự đốn hoạt tính sinh học của
các hợp chất thiết kế.


<b>3.1.3. Sàng lọc ảo đánh giá khả năng ức chế HDAC2 sử dụng mơ hình xây </b>
<b>dựng đƣợc </b>


</div>
<span class='text_page_counter'>(39)</span><div class='page_container' data-page=39>

<i><b>Hình 3.2.</b> Tóm tắt quy trình sàng lọc in silico chất ức chế HDAC2 từ </i>
<i>CSDL PubChem. </i>


<b>- </b> Sàng lọc sử dụng tìm kiếm đồng dạng trên CSDL PubChem:


PubChem (<i> một CSDL miễn phí về
các cấu trúc hóa học, đặc tính và vai trị sinh học của các hợp chất hóa học và
các chất nói chung. Các hợp chất có nguồn gốc từ khoảng hơn 80 nhà cung
cấp, với khoảng 31 nghìn hợp chất. PubChem giúp tìm kiếm nhanh chóng


các hợp chất hóa học dựa vào các phương pháp tìm kiếm theo sự tương
đồng về cấu trúc. PubChem chứa thông tin về tên, tên gọi khác, các tính chất:
cấu trúc hóa học, tên đoạn, cấu trúc hóa học, khối lượng phân tử, logP, và các
liên kết cho và nhận hydrogen.


Để tìm kiếm trên PubChem, "structural query input" có thể là
PubChem Identifier (CID – tên định danh trong PubChem), SMILES, Inchi.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi dùng SAHA là cấu trúc truy vấn. Bởi trong
các nhóm chất ức chế histon deacetylase (HDAC), các acid hydroxamic là
nhóm chất được quan tâm chú ý và tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Do các
acid hydroxamic có cấu tr c đơn giản, dễ tổng hợp và có nhóm -NHOH tạo
được phức bền với Zn+ <sub>ở trung tâm hoạt động của HDAC mang lại có hoạt </sub>


<b>Tìm kiếm đồng dạng </b>


<b>Hợp chất ức chế HDAC2</b>
<b>QSAR </b>


</div>
<span class='text_page_counter'>(40)</span><div class='page_container' data-page=40>

tính ức chế enzym mạnh. Trên thực tế, FDA đã phê duyệt một acid
hydroxamic UHDAC điển hình là vorinostat (suberoylanilide hydroxamic
acid, Zolinza) vào năm 2006 sử dụng trong điều trị u lympho da tế bào
[refractory cutaneous T-cell lymphoma (CTCL)]. Chính vì vậy SAHA được
lựa chọn là cấu trúc truy vấn (chất mẫu), được sử dụng để sàng lọc các hợp
chất có cấu tr c tương tự. Các chất này có cấu tr c tương tự SAHA hy vọng
có tính chất hoặc hoạt tính sinh học giống SAHA.


Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng là kỹ thuật tìm kiếm các hợp chất có cấu
trúc tương tự với hợp chất mẫu (SAHA) trên CSDL (Pubchem) về cấu trúc
của các hợp chất. Kỹ thuật được tiến hành dựa trên nguyên tắc tương tự, theo
đó những phân tử có cấu trúc tương tự nhau thường có đặc tính và hoạt động


sinh học tương tự nhau. Các hợpchất được xếp hạng dựa trên sự tương đồng
với chất mẫu. Độ tương đồng của một chất với chất mẫu có thể phản ánh khả
năng có hoạt tính của chất đó.


Hệ số Tanimoto (Còn được gọi là hệ số Jaccard) là hệ số tương đồng
được sử dụng để biểu diễn sự giống nhau giữa các chất của CSDL được sàng
lọc và chất mẫu rộng rãi nhất trong hóa tin. Hệ số này được tính tốn dựa trên
cơng thức:


Hệ số Tanimoto =




Trong đó: <sub> </sub> là Số lượng các đặc tính xuất hiện trong cấu trúc A
là Số lượng các đặc tính xuất hiện trong cấu trúc B


NC là Số lượng các đặc tính xuất hiện trong cả 2 cấu trúc A và B


</div>
<span class='text_page_counter'>(41)</span><div class='page_container' data-page=41>

mô hình QSAR đã xây dựng được (3.1) để dự đốn hoạt tính cho chúng. Số
liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excell 2007. Kết quả tính tốn
TSPT và dự đốn hoạt tính được nêu trong Phụ lục.


<b>- </b> Từ kết quả sàng lọc này, chọn 10% các hợp chất có IC50 thấp nhất,


được nêu trong bảng 3.2 dưới đây.


<i><b>Bảng 3.2. </b>Kết quả sàng lọc ảo từ cơ sở dữ liệu PubChem.</i>
STT Mã CID


(PubChem)



Cấu trúc IC50


dự đoán
(μM)


1 58624316 0.032781


2 20721667 0.0213922


3 85697302 0.012845


4 44359800 0.0231520


5 42637850 0.0326886


</div>
<span class='text_page_counter'>(42)</span><div class='page_container' data-page=42>

7 14496775 0.0387043


8 0.0395340 0.0395340


9 88254626 0.003744


10 21302179 0.0380004


11 54077290 0.0240224


12 90889464 0.0044032


13 70232351 0.003756



14 4953736 0.0331159


</div>
<span class='text_page_counter'>(43)</span><div class='page_container' data-page=43>

Như vậy so với SAHA, là một chất ức chế HDAC2 mạnh, đã được ứng
dụng trong lâm sàng, các hợp chất sàng lọc được trên CSDL PubChem có
hoạt tính ức chế HDAC2 cao hơn rất nhiều. Các hợp chất này là các
hydroxamics có cấu tr c tương đồng với SAHA > 85%. Do đó các hơp chất
này hồn tồn có thể tổng hợp được và có nhiều tiềm năng phát triển thành
thuốc chống ung thư.


Trong nghiên cứu này, mơ hình QSAR xây dựng được giúp phát hiện
các hợp chất mới có tiềm năng ức chế HDAC2 chỉ dựa trên thơng tin cấu trúc
phân tử. Mơ hình <i>in silico </i>này có vai trị rất quan trọng trong việc sàng lọc
nhanh và hiệu quả các hợp chất mới ngay cả khi ch ng chưa được tổng hợp
hay phân lập giúp tiết kiệm thời gian, tiền bạc trong quá trình nghiên cứu,
phát triển thuốc chống ung thư.


<b>3.2. Bàn luận </b>


<i><b>3.2.1. Về mơ hình QSAR </b></i>


QSAR hiện nay đang là một kỹ thuật được ứng dụng trong rất nhiều
các lĩnh vực như dược phẩm, y học, hóa học… Kỹ thuật này sử dụng các
TSPT, các kỹ thuật xác suất thống kê và trí tuệ nhân tạo để xây dựng các mơ
hình. Mơ hình xây dựng bằng phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính, lựa
chọn tham số phân tử bằng giải thuật di truyền. Phương pháp này gi p tối ưu
hóa mơ hình nhằm tìm ra mơ hình biểu thị tốt nhất mối quan hệ giữa biến đáp
ứng là các tham số phân tử.


Mơ hình QSAR xây dựng được gồm 6 TSPT 2D. Tham số 2D mơ tả
cấu tr c dưới dạng hình học topo, cho phép xác định chính xác thứ tự, vị trí


của nguyên tố hay mảnh cấu trúc trong phân tử. Mô tả phân tử 2D không cần
tới các thơng tin về cấu trúc 3D của phân tử, có tính ổn định cao hơn do các
hợp chất được mơ tả dưới dạng 3D thường có độ linh động về cấu dạng. Tuy
nhiên, do không kết hợp phương pháp protein docking trong xây dựng mơ
hình QSAR nên không thu được thông tin cấu dạng, không xác định được cơ
chế tương tác giữa các chất và enzyme HDAC2.


</div>
<span class='text_page_counter'>(44)</span><div class='page_container' data-page=44>

mơ hình QSAR; việc giải thích các biến TSPT đơi khi gặp phải khó khăn vì
cơ chế của chúng phức tạp địi hỏi những hiểu biết chuyên sâu về hóa lượng
tử; bên cạnh đó chưa có nhiều tài liệu tham khảo, do đó chưa đủ cơ sở để giải
thích.


<i><b>3.2.2. Về quy trình sàng lọc ảo. </b></i>


Trong nghiên cứu này, tiến hành sàng lọc các hợp chất ức chế HDAC2
từ CSDL PubChem. Quá trình sàng lọc qua 2 bước cơ bản. CSDL PubChem
sau khi sàng lọc bằng phương pháp “Tìm kiếm đồng dạng” với hệ số đồng
dạng Tanimoto ≥ 0.85, dữ liệu đầu vào là cấu trúc dạng SMILE của SAHA.
Kỹ thuật tìm kiếm đồng dạng là kỹ thuật tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc
tương tự với hợp chất mẫu (SAHA) trên CSDL (PubChem) về cấu trúc của
các hợp chất. Kỹ thuật được tiến hành dựa trên nguyên tắc tương tự, theo đó
những phân tử có cấu tr c tương tự nhau thường có đặc tính và hoạt động sinh
học tương tự nhau. Các hợpchất được xếp hạng dựa trên sự tương đồng với
chất mẫu. Độ tương đồng của một chất với chất mẫu có thể phản ánh khả
năng có hoạt tính của chất đó. Kết quả qua phương pháp “tìm kiếm đồng
dạng” là một dãy dẫn chất Hydroxamics có cấu tr c tương đồng với SAHA ≥
0.85. Lựa chọn 120 chất chưa được nghiên cứu về tác dụng ức chế enzym
HDAC2 tiếp tục sàng lọc qua mơ hình QSAR xây dựng được nhằm dự đoán
nồng độ ức chế 50% HDAC2 (IC50). Từ đó tìm được các hợp chất có hoạt tính



ức chế HDAC2 dự đốn mạnh nhất có tiềm năng phát triển thành thuốc chống
ung thư.


Như vậy từ một CSDL lớn (hơn 31 nghìn chất) qua hệ thống sàng lọc
này đã sàng lọc được một tập hợp nhỏ các hợp chất có tiềm năng ức chế
enzym HDAC2. Phương pháp này giúp ích nhiều cho việc phát hiện các hợp
chất mới có hoạt tính sinh học ngay cả trước khi ch ng được tổng hợp hay
phân lập. Từ đó gi p tiết kiệm rất nhiều thời gian và công sức và tiền bạc cho
các khâu của quá trình nghiên cứu và phát triển một thuốc mới.


</div>
<span class='text_page_counter'>(45)</span><div class='page_container' data-page=45></div>
<span class='text_page_counter'>(46)</span><div class='page_container' data-page=46>

<b>KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ </b>
<b>KẾT LUẬN </b>


Từ những kết quả nghiên cứu đã trình bày trên đây ch ng tôi r t ra các
kết luận sau:


1. Nghiên cứu đã xây dựng thành cơng mơ hình toán học biểu diễn mối quan
hệ định lượng giữa cấu trúc và tác dụng ức chế enzyme HDAC2 có phương
trình:


<i><b>LogIC</b><b>50</b></i> = 2.808 + 0.064×<i><b>ATS8m</b></i> – 230.167×<i><b>JGI10</b></i> –


1.072×<i><b>SM15_AEA(bo)</b></i>– 2.821×<i><b>SM08_AEA(dm)</b></i> +
3.519×<i><b>SM09_AEA(dm)</b></i> – 0.700×<i><b>B06[N-O]</b></i>


2. Nghiên cứu đã đánh giá mơ hình xây dựng được theo các ngun tắc của
OECD với <i>R2</i>=0.89, <i>Q2</i>= 0.81, khả năng dự đoán nội 88,85% và khả năng dự
đoán ngoại 84,64%. Như vậy mơ hình thoả mãn các tiêu chí đánh giá nội và
ngoại về độ chính xác, độ ổn định và khả năng dự đốn tốt. Mơ hình xây dựng
được có thể được ứng dụng để sàng lọc các CSDL lớn nhằm tìm kiếm các hợp


chất ức chế HDAC2.


3. Nghiên cứu đã sàng lọc được 120 hợp chất từ CSDL Pubchem, 14 trong
số đó có hoạt tính mạnh tương đương hoặc hơn SAHA, một thuốc ức chế
HDAC đang lưu hành trên thị trường. Đặc biệt, có 3 hợp chất mạnh hơn
SAHA 60 -70 lần và chưa từng được nghiên cứu tác dụng chống ung thư. Các
hợp chất này có tiềm năng phát triển thành thuốc chống ung thư mới.


<b>KIẾN NGHỊ </b>


Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu của khóa luận trong tìm
kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học ức chế HDAC2 cao, chúng tôi xin
đưa ra các đề xuất sau:


1. Nghiên cứu bằng phương pháp Docking phân tử để tìm hiểu cơ chế ức chế
HDAC2 của 14 hợp chất sàng lọc được.


</div>
<span class='text_page_counter'>(47)</span><div class='page_container' data-page=47>

<b>TÀI LIỆU THAM KHẢO </b>
<b>Tài liệu Tiếng Việt </b>


1. Nguyễn Bá Đức (2001), "Bài giảng UNG TH HỌC"<i>, NXB Y Học</i>.
<b>Tài liệu Tiếng Anh </b>


2. Anand P., Kunnumakkara A. B., Sundaram C., Harikumar K. B,
Tharakan S. T., Lai O. S. and Sung B. B. (2008), "Cancer is a
preventable disease that requires major lifestyle changes", <i>Pharm Res </i>
25(9), 2097 - 2116.


3. Andrea M., Viviana C., Manuela P. and Todeschini R. (2006),
"DRAGON SOFTWARE: an easy approach to molecular descriptor


and calculator", <i>MATCH Commun. Math. Comput. Chem</i>. 56, 237-248.
4. Andrianov V., Gailite V., Lola D., Loza E. and Semenikhina V.


(2009), "Novel amide derivatives as inhibitors of histone deacetylase:
design, synthesis and SAR", <i>Eur J Med Chem</i>. 44.


5. Bae H. and Nam S. W. (2014), "HDAC2 (histone deacetylase 2)", <i>Atlas </i>
<i>Genet Cytogenet Oncol Haematol </i>18, 594-597.


6. Bernstein B. E. and Tong J. K. (2000), "Genomewide studies of histone
deacetylase function in yeast", <i>Proc Natl Acad Sci U S A</i>. 97(25),
13708-13.


7. Bertrand P. (2010), "Inside HDAC with HDAC inhibitors", <i>Eur J Med </i>
<i>Chem.</i> 45(6), 2095-116.


8. Chun P. (2011), "Synthesis and Importance of Bulky Aromatic Cap of
Novel SAHA Analogs for HDAC Inhibition and Anticancer Activity",
<i>Bulletin of the Korean Chemical Society</i>. 32(6), 1891-1896.


9. Chueh A. C. (2015), "Mechanisms of Histone Deacetylase
Inhibitor-Regulated Gene Expression in Cancer Cells<i>",</i> <i>Antioxid Redox Signal</i>.
23(1), 66-84.


</div>
<span class='text_page_counter'>(48)</span><div class='page_container' data-page=48>

11. Dallavalle S., Cincinelli R., Vesci L. and Barbarino M. (2009),
"Design, synthesis, and evaluation of biphenyl-4-yl-acrylohydroxamic
acid derivatives as histone deacetylase (HDAC) inhibitors", <i>Eur J Med </i>
<i>Chem</i>, 1-13.


12. de Martel C., Ferlay J., Franceschi S., Vignat J., Bray F. and Forman D.


M. (2012), "Global burden of cancers attributable to infections in 2008:
a review and synthetic analysis.", <i>The Lancet Oncology</i>. 13(6), 607 -
615.


13. de Ruijter A. J., van Gennip A. H., Caron H. N. and Kemp S. (2003),
"Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical
HDAC family", <i>Biochem J</i>. 370(Pt 3), 737-49.


14. Do T. M. Dung (2015), "Novel 3-substituted-2-oxoindoline-based
N-hydroxypropenamides as Histone Deacetylase Inhibitors and Antitumor
Agents", <i>Medicinal Chemistry</i>. 11(8), 725-735.


15. Do Thi Mai Dung, Phan Thi Phuong Dung, Dao Thi Kim Oanh, Tran
Khac Vu, Hyunggu Hahn, Byung Woo Han, Minji Pyo, Young Guk
Kim, Sang-Bae Han and Nam, N.H. (2015), "Exploration of novel
5'(7')-substituted-2'-oxospiro[1,3]dioxolane-2,3'-indoline-based
N-hydroxypropenamides as histone deacetylase inhibitors and antitumor
agents", <i>Arabian Journal of Chemistry. </i>


16. Dokmanovic M. (2005), "Prospects: histone deacetylase inhibitors", <i>J </i>
<i>Cell Biochem</i>. 96(2), 293-304.


17. Edwardand C. (2000), "Histone deacetylase transcriptional control and
cancer", <i>Journal of cenlular Physyology</i>. 184(1), 1-16.


18. Eric V. (2006), "Histone Deacetylases Transcriptional Regulation and
Other Cellular Functions".


</div>
<span class='text_page_counter'>(49)</span><div class='page_container' data-page=49>

20. John J. I. and Shoichet B. K. (2005), "ZINC – A Free Database of
Commercially Available Cosmpounds for Virtual Screening", <i>J Chem </i>


<i>Inf Model</i>. 45(1).


21. Johnstone R. W.(2002), "Histone-deacetylase inhibitors: novel drugs
for the treatment of cancer", <i>Nat Rev Drug Discov</i>. 1(4), 287-299.


22. Kamb A., Wee S. and Lengauer C. (2007), "Why is cancer drug
discovery so difficult?", <i>Nat Rev Drug Discov.</i> 6(2), 115-120.


23. Kim S., Thiessen P. A., Bolton E. E., Chen J., Fu G., Gindulyte A., Han
L., He J., He S., Shoemaker B. A., Wang J., Yu B., and Zhang J.
(2016), "PubChem Substance and Compound databases", <i>Nucleic Acids </i>
<i>Res</i>. 44.


24. Lai M.J. (2012), "Synthesis and Biological Evaluation of
1-Arylsulfonyl-5-(N-hydroxyacrylamide)indoles as Potent Histone
Deacetylase Inhibitors with Antitumor Activity in Vivo", <i>Medicinal </i>
<i>Chemistry</i>. 55(8), 3777–3791.


25. Lee Y. H., Seo D., Choi K. J., Andersen J. B., Won M. A., Kitade M.,
Gomez-Quiroz L. E., Judge A. D., Marquardt J. U., Raggi C,. Conner
E. A., MacLachlan I. and Factor V. M. (2014), "Antitumor effects in
hepatocarcinoma of isoform-selective inhibition of HDAC2", <i>Cancer </i>
<i>Res</i>. 74(17), 4752-61.


26. Marson C. M., Mahadevan T., Dines J., Sengmany S., Morrell J. M.,
Alao J. P., Joel S. P. and Vigushin D. M. (2007), "Structure-activity
relationships of aryloxyalkanoic acid hydroxyamides as potent
inhibitors of histone deacetylase", <i>Bioorg Med Chem Lett</i>. 17(1),
136-41.



</div>
<span class='text_page_counter'>(50)</span><div class='page_container' data-page=50>

28. Organisation for Economic Co-operation and Developme (2007),
"Guidance Document on the Validation of (Q)SAR Models ",
<i>Environment directorate joint meeting of the chemicals committee and </i>
<i>the working party on chemicals, pesticides and biotechnology. </i>


29. Pawan K. and Sasazuki T. (2008), "HDAC2 deficiency sensitizes colon
cancer cells to TNFα-induced apoptosis through inhibition of NF-κB
activity", <i>Experimental Cell Research</i>. 314(7), 1507–1518.


30. Pingyuan W., Zhiqing L. and Chen H. (2009), "Sulfamides as novel
histone deacetylase inhibitors", <i>Bioorganic and Medicinal Chemistry </i>
<i>Letters</i>. 17, 1123-1128.


31. Roperoand Santiago (2007), "The role of histone deacetylases
(HDACs) in human cancer", <i>Molecular Oncology</i>. 1, 19-25.


32. Roth S. Y. (2001), "Histone acetyltransferase", <i>Annu.Rev.Biochem. </i>
(120, 81-120e).


33. Stefan B., "Short Manual to the Chemical Drawing Program
ChemDraw®", <i>IfC Department of Chemistry. </i>


34. Sento E. and Glozak M. A. (2007), "Histone deacetylases and cancer",
<i>Oncogene</i>. 26, 5420-5432.


35. The Chemicals Committee and Working Party on Chemicals.(2004),
"OECD Principles for the Validation, for Regulatory Purposes, of
(Quantitative) Structure-Activity Relationship Models".


36. Thaler F. (2013), "Synthesis and biological characterization of


spiro[2H-(1,3)-benzoxazine-2,40-piperidine] based histone deacetylase
inhibitors", <i>European journal of medicinal chemistry</i>. 64, 273-84.


37. Todeschini R. and Consonni V. (2000), "Handbook of Molecular
Descriptors 1st", <i>Federal Republic of Germany</i>. 11.


38. Tran T.L. Huong. (2015), "Novel 2-oxoindoline-based hydroxamic
acids: Synthesis, cytotoxicity and inhibition of histone deacetylation",
<i>Tetrahedron Letters Tetrahedron Letters</i>. 56(16), 6425–6429.


</div>
<span class='text_page_counter'>(51)</span><div class='page_container' data-page=51>

40. WHO (2014), "World Cancer Report".


41. Yoshida M., Kijima M., Akita M. and T, B. (1990), "Potent and
specific inhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and
in vitro by trichostatin A", <i>J Biol Chem</i>. 265(28), 17174-9.


42. Zhang L., Fang H. and W X. (2010), "Strategies in developing
promising histone deacetylase inhibitors", <i>Medicinal Research </i>
<i>Reviews</i>. 30(4), 585-602.


</div>
<span class='text_page_counter'>(52)</span><div class='page_container' data-page=52>

<b>PHỤ LỤC </b>


<b>Bảng . Sàng lọc CSDL Pubchem các hợp chất giống SAHA (</b><i>Tanimoto</i> similarity index ≥ 0.85), tính tốn tham số
phân tử và dự đốn hoạt tính bằng mơ hình (3.1)


<b>ST</b>
<b>T </b>


<b>Cấu trúc </b>



<b>(</b>
<b>.nih.gov/compound/) </b>


<b>Mã CID </b> <b>ATS</b>
<b>8m </b>


<b>JGI10 SM15_ </b>
<b>AEA </b>
<b>(bo) </b>


<b>SM08_ </b>
<b>AEA </b>
<b>(dm) </b>


<b>SM09_ </b>
<b>AEA </b>
<b>(dm) </b>


<b>B06 </b>
<b>[N-O] </b>


<b>IC50dự đoán </b>


<b>(μM) </b>


1


<b>10039224 </b> 2.865 0.003 1 -1 -1.282 0 0.4347064


2



<b>58833044 </b> 2.94 0.006 1 -1 -1 0 0.6070787


3 s <b>87072389 </b> 2.784 0.006 1 -1.179 -1.385 0 0.1895215


4


</div>
<span class='text_page_counter'>(53)</span><div class='page_container' data-page=53>

5


<b>46205431 </b> 2.882 0.007 1 -1.167 -1.333 0 0.1758513


6


<b>53302622 </b> 2.992 0.008 1 -1 -1.3 0 0.0824400


7


<b>9838671 </b> 2.887 0.007 1.049 -1.171 -1.373 0 0.1394253


8


<b>59507279 </b> 2.887 0.005 1.049 -1.172 -1.414 0 0.2265910


9


<b>88576450 </b> 2.865 0.007 1 -1 -1.178 0 0.1833417


10


</div>
<span class='text_page_counter'>(54)</span><div class='page_container' data-page=54>

11



<b>24861500 </b> 4.074 0.004 1.532 0.347 0.111 0 1.0217461


12


<b>58624316 </b> 2.683 0.008 1 -1.193 -1.62 0


0.032781


13


<b>10516731 </b> 2.865 0.005 1 -1 -1.173 0 0.3659117


14


<b>85697273 </b> 2.98 0.006 1.066 -1.169 -1.368 0 0.2061343


15


<b>85697290 </b> 2.98 0.006 1.061 -1.164 -1.229 0 0.3832203


16


</div>
<span class='text_page_counter'>(55)</span><div class='page_container' data-page=55>

17


<b>23075284 </b>


2.98 0.008 1.063 -1.166 -1.321 0


0.1298851



18


<b>20721667 </b> 2.924 0.006 1.049 -1 -1.171 1 0.0213922


19


<b>44456995 </b> 2.877 0.006 1 -1.172 -1.414 0 0.1726303


20


<b>85697255 </b> 2.871 0.005 1.049 -1.172 -1.414 0 0.2240354


21


<b>85697257 </b> 3.065 0.006 1.043 -1 -1 0 0.6242240


22


</div>
<span class='text_page_counter'>(56)</span><div class='page_container' data-page=56>

23


<b>85697302 </b> 2.463 0.008 0.325 -1.766 -1.946 1


0.012845


24


<b>23399147 </b>


3.065 0.009 1.064 -1.141 -1.185 0



0.1661152


25


<b>14496776 </b> 2.378 0.007 0.608 -1.774 -1.94 0 0.1443687


26


<b>57426850 </b> 2.199 0.007 0.181 -1.939 -2 0 0.3368304


27


<b>70379132 </b> 2.348 0.007 0.349 -1.779 -1.948 0 0.2003737


28


</div>
<span class='text_page_counter'>(57)</span><div class='page_container' data-page=57>

29


<b>44359673 </b> 2.94 0.006 1 -1 -1 0 0.6070787


30


<b>44431491 </b> 2.932 0.008 1 -1 -1.3 0 0.0790071


31


<b>59835569 </b> 2.952 0.006 1 -1 -1.349 0 0.1250892


32



<b>56951447 </b> 4.01 0.01 1.584 -1 -1 0 0.1492143


33


<b>23557326 </b> 2.865 0.006 1 -1.163 -1.358 0 0.2132279


34


</div>
<span class='text_page_counter'>(58)</span><div class='page_container' data-page=58>

35


<b>44359800 </b> 2.875 0.01 1 -1 -1.414 0 0.0231520


36


<b>85905437 </b> 2.995 0.004 1 -1 -1 0 1.2314345


37


<b>85697276 </b> 3.065 0.007 1.075 -1 -1.171 0 0.1961748


38


<b>42637850 </b> 2.679 0.008 1 -1.193 -1.62 0 0.0326886


39


<b>24284701 </b>


2.88 0.006 1 -1 -1.353 0



0.1167208


40


</div>
<span class='text_page_counter'>(59)</span><div class='page_container' data-page=59>

41


<b>14496778 </b> 2.69 0.003 0.879 -1.38 -1.63 0 0.4118330


42


<b>564390 </b> 2.222 0.007 0.181 -1.939 -2 0 0.3423673


43


<b>68394755 </b> 2.563 0.003 0.794 -1.597 -1.816 0 0.4245148


44


<b>54753628 </b> 2.763 0.008 1 -1 -1.41 0


0.042486


45


<b>71459490 </b> 2.982 0.006 1 -1 -1.325 0 0.1425234


46


</div>
<span class='text_page_counter'>(60)</span><div class='page_container' data-page=60>

47



<b>56668788 </b> 3.001 0.005 1 -1 -1 0 0.8854045


48


<b>44431497 </b> 3.06 0.006 1.03 -1 -1 0 0.6335470


49 <b>52950298 </b>


3.763 0.006 1.733 0.958 0.606 0 0.2773072


50


<b>71712264 </b> 3.267 0.005 1.414 -0.283 -0.586 0 0.2389080


51


<b>89108892 </b> 2.964 0.006 1 -1 -1.349 0 0.1261578


52


</div>
<span class='text_page_counter'>(61)</span><div class='page_container' data-page=61>

53


<b>11232029 </b> 3.01 0.006 1.049 -1 -1 0 0.5952860


54


<b>71376590 </b> 2.94 0.006 1 -1 -1.171 0 0.2788060


55



<b>88272608 </b> 2.955 0.006 1 -1 -1.349 0 0.1253555


56


<b>44359788 </b> 2.795 0.007 0.81 -1.38 -1.598 0 0.1486498


57


<b>85697281 </b> 3.065 0.006 1.074 -1 -1.17 0 0.2756449


58


</div>
<span class='text_page_counter'>(62)</span><div class='page_container' data-page=62>

59


<b>9543542 </b> 3.111 0.005 1.354 -1 -1 0 0.5804522


60


<b>54789249 </b> 2.845 0.006 1 -1 -1.39 0 0.0962167


61


<b>54789247 </b> 2.935 0.007 1 -1 -1 0 0.4331006


62


<b>68232694 </b> 2.796 0.009 1 -1.185 -1.34 0 0.0881255


63



<b>14496779 </b> 2.779 0.004 1 -1.277 -1.414 0 0.4732568


64


</div>
<span class='text_page_counter'>(63)</span><div class='page_container' data-page=63>

65


<b>17607862 </b> 2.387 0.009 0.242 -1.776 -1.944 0 0.1236229


66


<b>24710930 </b> 2.496 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0 0.4932942


67


<b>71354457 </b> 2.935 0.005 1 -1 -1.133 0 0.4612942


68


<b>23428 </b> 2.469 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0 0.4839423


69


<b>5196616 </b> 2.578 0.003 0.794 -1.597 -1.816 0 0.4290529


70


<b>207164 </b> 2.754 0.004 1 -1 -1.414 0 0.1577748


71



</div>
<span class='text_page_counter'>(64)</span><div class='page_container' data-page=64>

72


<b>42637654 </b> 2.189 0.007 0.181 -1.939 -2 0 0.3344511


73


<b>57426849 </b> 2.017 0.012 -0.126 -2 0 0 977.4688919


74


<b>46205758 </b> 3.164 0.007 1.049 -1 -1 1 0.0395340


75


<b>54753629 </b> 3.016 0.005 1 -1 -1 0 0.8948695


76


<b>16739374 </b> 3.149 0.007 1.21 -1 -1 0 0.3746286


77


</div>
<span class='text_page_counter'>(65)</span><div class='page_container' data-page=65>

78


<b>44431496 </b> 3.069 0.006 1.03 -1 -1 0 0.6376020


79


<b>56658395 </b> 3.239 0.004 1.242 -0.84 -1 0 0.5570702



80


<b>59567106 </b> 2.904 0.008 0.821 -1.324 -1.389 0 0.2355086


81


<b>102191201 </b>


2.882 0.007 1 -1.329 -1.414 0


0.2288591


82


<b>88254626 </b> 2.964 0.007 1 -1 -1.502 1


</div>
<span class='text_page_counter'>(66)</span><div class='page_container' data-page=66>

83


<b>44415994 </b> 2.883 0.003 1 -1 -1.282 0 0.4402888


84


<b>4119737 </b>


2.514 0.007 0.884 -1.656 -1.801 0 0.127857


85


<b>54508233 </b> 3.075 0.004 1.262 -1 -1 0 0.9000322



86


<b>91172933 </b> 2.772 0.006 1 -1.172 -1.414 0 0.1602474


87


<b>81275 </b> 3.209 0.005 1.414 -0.235 -0.503 0 0.2773776


88


</div>
<span class='text_page_counter'>(67)</span><div class='page_container' data-page=67>

89


<b>4351049 </b> 3.221 0.006 1.028 -0.75 -0.77 0 0.7647220


90


<b>15560754 </b> 3.093 0.006 1.388 -0.596 -1 0 0.0808510


91


<b>21302179 </b> 2.789 0.007 1 -1 -1.512 0 0.0380004


92


<b>54077290 </b> 3.022 0.006 1 -1 -1.176 1 0.0240224


93


<b>58660950 </b> 3.004 0.006 1.155 -1 -1 0 0.5103040



94


</div>
<span class='text_page_counter'>(68)</span><div class='page_container' data-page=68>

95


<b>3597078 </b> 2.914 0.006 1 -1 -1 0 0.5959920


96


<b>3382807 </b> 3.052 0.004 1.01 -1 -1 0 1.2642211


97


<b>17202535 </b> 3.064 0.006 1.024 -1 -1 0 0.6407555


98


<b>17204914 </b> 2.985 0.005 1 -1 -1 0 0.8754187


99


<b>36656244 </b> 2.803 0.011 0.731 -1.414 -1.55 0 0.0623897


100


<b>70232351 </b>


</div>
<span class='text_page_counter'>(69)</span><div class='page_container' data-page=69>

101 <b>101030013 </b>


3.638 0.005 1.597 0.244 0.103 0 0.7060332



102


<b>43125168 </b> 2.6 0.006 0.54 -1.536 -1.804 0 0.1906166


103


<b>59838335 </b> 2.677 0.008 1 -1.193 -1.62 0 0.0326423


104


<b>4518322 </b> 3.296 0.003 1.414 -0.147 -0.481 0 0.4512904


105


<b>3833468 </b> 3.19 0.004 1.307 -0.537 -0.75 0 0.4694463


106


<b>71344197 </b> 3.346 0.003 1.45 0.02 -0.298 0 0.5326504


107


</div>
<span class='text_page_counter'>(70)</span><div class='page_container' data-page=70>

108


<b>65450231 </b> 2.697 0.005 0.804 -1.338 -1.61 0 0.2192940


109


<b>71402929 </b> 3.282 0.003 1.414 -0.147 -0.481 0 0.4468337



110


<b>89974472 </b> 2.689 0.008 0.726 -1.549 -1.806 0 0.0834179


111


<b>89556224 </b> 2.444 0.004 0.525 -1.791 -1.949 0 0.4754412


112


<b>203897 </b> 2.677 0.003 1 -1.313 -1.652 0 0.2395842


113


<b>94794 </b> 2.849 0.004 1 -1 -1.139 0 0.5898757


114


</div>
<span class='text_page_counter'>(71)</span><div class='page_container' data-page=71>

115


<b>4195216 </b> 2.925 0.003 1 -1 -1 0 1.6367313


116


<b>20721653 </b> 1.982 0 -0.131 -2 0 0 52941.67496


10


117



<b>4953736 </b> 2.655 0.009 0.706 -1.251 -1.681 0 0.0331159


118


<b>1718311 </b> 2.746 0.006 0.709 -1.249 -1.406 0 0.3323904


119


<b>13311491 </b> 2.692 0.003 1 -1.478 -1.69 0 0.3877590


120


</div>
<span class='text_page_counter'>(72)</span><div class='page_container' data-page=72></div>

<!--links-->

×