Tổng hợp và thử tác dụng sinh học của một số dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế enzym histon deacetylase

B GIÁO DC VÀ ÀO TO B Y T

TRNG I HC DC HÀ NI




ÀO TH KIM OANH



TNG HP VÀ TH HOT TÍNH
SINH HC CA MT S DN CHT
ACID HYDROXAMIC HNG C CH
ENZYM HISTON DEACETYLASE



LUN ÁN TIN S DC HC





HÀ NI 2013

B GIÁO DC VÀ ÀO TO B Y T

TRNG I HC DC HÀ NI

ÀO TH KIM OANH



TNG HP VÀ TH HOT TÍNH
SINH HC CA MT S DN CHT
ACID HYDROXAMIC HNG C CH
ENZYM HISTON DEACETYLASE


LUN ÁN TIN S DC HC


CHUYÊN NGÀNH HÓA DC
MÃ S: 62.72.04.03


Ngi hng dn khoa hc: PGS.TS. Nguyn Hi Nam
GS.TS. Sang-Bae Han


HÀ NI 2013


i

LI CAM OAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cu ca riêng tôi.
Các s liu, kt qu đc trình bày trong lun án là trung thc, khách quan và
cha tng đc ai công b trong bt k công trình nào khác.

Tác gi lun án



ào Th Kim Oanh

ii
LI CM N
Trong quá trình nghiên cu và hoàn thành lun án, tôi đã nhn đc s giúp đ
quý báu ca các thy cô giáo, các nhà khoa hc thuc nhiu lnh vc cùng đng
nghip, gia đình và bn bè.
u tiên, tôi xin đc gi li cm n chân thành và s bit n sâu sc ti
PGS.TS. Nguyn Hi Nam, GS.TS. Sang-Bae Han, nhng ngi thy đã tn tình
hng dn và to mi điu kin giúp đ tôi trong sut quá trình nghiên cu c  Vit
Nam và Hàn Quc.
Tôi xin chân thành cm n các đng nghip ti b môn Hóa dc đã ng h,
đng viên tôi trong quá trình nghiên cu.
Trong thi gian thc hin lun án, tôi đã nhn đc s phi hp, giúp đ ca
các cá nhân, đn v trong và ngoài trng. Tôi xin chân thành cm n các anh ch
Phòng thí nghim trung tâm – Trng đi hc Dc Hà Ni, Khoa hóa hc – Trng
đi hc Khoa hc t nhiên – i hc Qu
c gia Hà Ni, Phòng cng hng t - Vin

hóa hc – Vin Khoa hc và Công ngh Vit Nam, Phòng khi ph - Vin hóa hc các
hp cht thiên nhiên - Vin Khoa hc và Công ngh Vit Nam, các bn nghiên cu
sinh ca b môn Dc lý, Khoa Dc, Trng đi hc Quc gia Chungbuk
(Cheongju, Hàn Quc).
Tôi xin chân thành cm n ng y, Ban giám hiu, Phòng đào to sau đi hc,
các b môn và phòng ban chc nng – Trng đi hc Dc Hà N
i đã to điu kin
thun li cho tôi trong thi gian hc tp và hoàn thành lun án này.
Cui cùng, xin gi li cm n sâu sc ti chng và hai con trai, ngi thân, bn
bè đã luôn là nhng ngi đng viên, là đng lc giúp tôi phn đu hoàn thành lun
án.
Mt ln na, xin chân thành cm n tt c nhng s giúp đ quý báu mà mi
ngi đã dành cho tôi.
ào Th Kim Oanh


iii
MC LC
Trang
Danh mc các ký hiu, ch vit tt
Danh mc các bng
Danh mc các hình v, s đ
T VN  1
CHNG 1. TNG QUAN 2
1.1. Histon deacetylase 2
1.1.1. Histon acetyltransferase 4
1.1.2. Histon deacetylase 4
1.1.2.1. Phân loi 5
1.1.2.2. Cu trúc ca HDAC và c ch phn ng deacetyl hóa 7
1.1.3. Mi liên quan gia ung th và s bt thng hot đng ca HAT

hoc HDAC
10
1.2. Các cht c ch HDAC 11
1.2.1. Phân loi 11
1.2.2. C ch tác dng ca các cht c ch HDAC 14
1.2.3. Cu trúc ca các cht c ch HDAC 17
1.3. Tình hình nghiên cu trên th gii v các cht c ch HDAC 18
1.3.1. Các peptid vòng 19
1.3.2. Dn cht benzamid 20
1.3.3. Các acid béo mch ngn 21
1.3.4. Các dn cht ceton 22
1.3.5. Các hydroxamat và dn cht 22
1.3.5.1. Thay đi cu ni 24
1.3.5.2. Thay đi nhóm khóa hot đng 29
1.3.5.3. Thay đi nhóm chc hydroxamic 34
1.4. Các phng pháp to liên kt amid và tng hp acid hydroxamic 39
1.4.1. Các phng pháp to liên kt amid 39
1.4.1.1. Acyl halid 40
1.4.1.2. Acyl azid 41

iv
1.4.1.3. Acylimidazol 41
1.4.1.4. Anhydrid 42
1.4.1.5. Ester 43
1.4.2. Các phng pháp tng hp acid hydroxamic 45
1.4.2.1. Tng hp acid hydroxamic t ester 45
1.4.2.2. Tng hp acid hydroxamic t acid carboxylic 45
CHNG 2. NGUYÊN LIU, THIT B, NI DUNG VÀ PHNG
PHÁP NGHIÊN CU
47

2.1. Nguyên liu 47
2.2. Thit b 48
2.3. Ni dung và phng pháp nghiên cu 49
2.3.1. Ni dung nghiên cu 49
2.3.2. Phng pháp nghiên cu 49
2.3.2.1. Phng pháp tng hp 49
2.3.2.2. Phng pháp kim tra đ tinh khit 51
2.3.2.3 Phng pháp phân tích cu trúc 52
2.3.2.4. Phng pháp th hot tính sinh hc 53
2.3.2.5. Docking 56
CHNG 3. KT QU NGHIÊN CU 57
3.1. Tng hp hóa hc và phân tích d liu ph 57
3.1.1. Các dn cht N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
4
-hydroxysuccinamid và
N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
5
-hydroxyglutaramid
57
3.1.1.1. Kt qu tng hp 57
3.1.1.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 3a-f và 5a-f 63
3.1.2. Các dn cht N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
6
-hydroxyadipamid và

N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
8
-hydroxyoctandiamid
66
3.1.2.1. Kt qu tng hp 66
3.1.2.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 7a-f và 9a-h 73
3.1.3. Tng hp cht N
1
-(thiazol-2-yl)-N
8
-hydroxyoctandiamid (23) 76
3.1.4. Các dn cht N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
4
-(3-(hydroxyamino)-3-
oxopropyl)succinamid và N
1
-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N
5
-(2-(hydroxy
amino)-2-oxoethyl)glutaramid
77

v
3.1.4.1. Kt qu tng hp 77
3.1.4.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 11a-d và 13a-f 82
3.1.5. Các dn cht N

1
-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)-N
4
-
phenylsuccinamid và N
1
-(2-(hydroxyamino)2-oxoethyl)-N
5
-phenyl
glutaramid
85
3.1.5.1. Kt qu tng hp 85
3.1.5.2. Kt qu phân tích ph ca các dn cht 17a-c, f, h và 20a-h 93
3.1.6. Tng hp N
1
-(4-clorophenyl)-N
6
-(3-(hydroxyamino)-3-oxopropyl)
adipamid (26)
97
3.2. Hot tính sinh hc 102
3.2.1. Tác dng c ch HDAC 102
3.2.2. Hot tính kháng t bào ung th in vitro 105
3.2.3. Hot tinh kháng t bào ung th in vivo 107
CHNG 4. BÀN LUN 110
4.1. Tng hp hóa hc 110
4.1.1. Tác nhân acyl hóa là anhydrid acid 110
4.1.2. Tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 111
4.1.3. Tác nhân acyl hóa là ester 117
4.2. Khng đnh cu trúc 118

4.2.1. Ph hng ngoi 118
4.2.2. Ph khi lng 120
4.2.2.1. Phân tích cm pic ion phân t 121
4.2.2.2. C ch phá mnh ca phân t theo cu trúc d kin 122
4.2.3. Ph cng hng t ht nhân 126
4.2.3.1. Ph cng hng t ht nhân ca các acid hydroxamic mang
khung benzothiazol
126
4.2.3.2. Ph cng hng t ht nhân ca các acid hydroxamic mang
vòng phenyl
134
4.2.3.3. Ph cng hng t ht nhân ca acid hydroxamic mang vòng
thiazol
137
4.3. Hot tính sinh hc 138
4.3.1. Các acid hydroxamic mang khung benzothiazol 138
4.3.2. Các acid hydroxamic mch alkyl có liên kt amid 143

vi
4.3.3. Docking 147
4.3.4. Hot tính kháng t bào ung th in vivo 148
KT LUN VÀ KIN NGH 151
DANH MC CÁC CÔNG TRÌNH Ã CÔNG B
TÀI LIU THAM KHO
PH LC

vii
DANH MC CÁC KÝ HIU, CH VIT TT
 (ppm)
 dch chuyn hóa hc (phn triu)

13
C-NMR Ph cng hng t ht nhân carbon 13 (
13
C-Nuclear Magnetic
Resonance)
1
H-NMR Ph cng hng t ht nhân proton (
1
H-Nuclear Magnetic Resonance)
AcOH Acid acetic
ADN Acid desoxyribonucleic
AsPC-1 Dòng t bào ung th ty ngi
BCL2 B-cell lymphoma 2
BSA Albumin huyt thanh bò (bovine serum albumin)
CBFb Core-binding factor subunit beta
CBHA m-carboxycinnamic bishydroxamid acid
CBP Cyclic-AMP response element-binding protein
CDI Carbonyl diimidazol
CTPT Công thc phân t
DCC Dicyclohexyl carbodiimid
DCM Dicloromethan
DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium
DMF Dimethylformamid
DMSO-d
6
Dimethylsulfoxid deutri hóa
EGTA Acid ethylen glycol tetraacetic
ESI Ion hóa phun bi đin t (Electron Spray Ionization)
FBS Huyt thanh bào thai bò (Fetal bovine serum)
FDA Cc qun lý Thc phm và Dc phm M

GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat dehydrogenase
HAT Histon acetyltransferase
HATU N-[(dimethylamino)-1H-1,2,3-triazol[4,5-b]pyridin-1ylmethylen]-N-
methylmethanaminium hexafluorophosphat
HDAC Histon deacetylase
HDIs Các cht c ch HDAC
HDLP Histone deacetylase-like protein
HMBC Ph tng tác đa liên kt d nhân
HOBt 1-hydroxybenzotriazol
HSQC Ph tng tác d nhân lng t đn
IC
50
Nng đ c ch 50%
IR Ph hng ngoi (Infrared Spectrometry)
i Dch chuyn đin tích

viii
J
Hng s tng tác (Hz)
MCF-7 T bào ung th vú ngi
MeOH Methanol
MOZ Monocytic leukemia zinc-finger protein
MS Ph khi lng (Mass Spectrometry)
MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid
NCI-H460 T bào ung th phi ngi
PBS Dung dch mui có b sung đm phosphat (Phosphate buffered saline)
PC-3 T bào ung th tin lit tuyn ngi
PCl
3
Phosphor triclorid

PCl
5
Phosphor pentaclorid
POCl
3
Phosphor oxyclorid
PVDF Màng polyvinyliden difluorid
rH Dch chuyn hydro
RAR
Receptor acid retinoic
ROS Reactive oxygen species
RPMI Môi trng nuôi cy t bào (Roswell Park Memorial Institute medium)
SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic
SDS-PAGE Gel SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gel
electrophoresis)
Sin 3 Protein c ch phiên mã
SMMHC T bào c (Smooth muscle myosin heavy chain)
SW620 T bào ung th đi tràng ngi
TEA Triethylamin
TSA Trichostatin A
t
o
C Nhit đ nóng chy
WAF1 Cht c ch kinase ph thuc cyclin
ZBG Nhóm gn ion Zn
2+


ix
DANH MC CÁC BNG

TT Tên bng Trang
1 Bng 1.1 Phân loi các cht c ch HDAC 13
2 Bng 1.2 Các cht c ch HDAC đã và đang đc th lâm sàng 19
3 Bng 1.3 Tác dng c ch HDAC2 và đc tính t bào ca dn cht
-alkoxy (AH10)
28
4 Bng 3.1 Kt qu phân tích ph khi ca các cht 3a-f, 5a-f 64
5 Bng 3.2 Kt qu phân tích ph
1
H-NMR ca các cht 3a-f, 5a-f 64
6 Bng 3.3 Kt qu phân tích ph
13
C-NMR ca các cht 5a-f 66
7 Bng 3.4 Kt qu phân tích ph khi ca các cht 7a-f, 9a-h 73
8 Bng 3.5 Kt qu phân tích ph
1
H-NMR ca các cht 7a-f, 9a-h 73
9 Bng 3.6 Kt qu phân tích ph
13
C-NMR ca các cht 7a-f, 9a-h 75
10 Bng 3.7 Kt qu phân tích ph khi ca các cht 11a-d, 13a-f 82
11 Bng 3.8 Kt qu phân tích ph
1
H-NMR ca các cht 11a-d, 13a-f 83
12 Bng 3.9 Kt qu phân tích ph
13
C-NMR ca các cht 11a-d, 13a-f 85
13 Bng 3.10 Kt qu phân tích ph khi ca các cht 17a-c, f, h, 20a-h 93
14 Bng 3.11 Kt qu phân tích ph
1

H-NMR ca các cht 17a-c,f,h,
20a-h
93
15 Bng 3.12 Kt qu phân tích ph
13
C-NMR ca các cht 17a-c,f,h,
20a-h
96
16 Bng 3.13 Tóm tt kt qu tng hp các dn cht trong lun án 98
17 Bng 3.14 Tác dng c ch HDAC ca các dn cht tng hp 102
18 Bng 3.15 Kt qu đnh lng tác dng c ch HDAC2 ca các cht
9a-h, 23
104
19 Bng 3.16 Kt qu th hot tính kháng t bào ung th ngi in vitro 105
20 Bng 3.17 S thay đi kích thc và khi lng ca khi u trên chut
 nhóm th, nhóm trng đi chiu và SAHA
107
21 Bng 3.18 Phn trm thay đi cân nng ca chut trong quá trình thí
nghim
108
22 Bng 4.1 Cng đ cm pic ion phân t ca cht 7a 122

x
TT Tên bng Trang
23 Bng 4.2 D liu các ph cng hng t ht nhân ca cht 9g 132
24 Bng 4.3 D liu ph
1
H-NMR và
13
C-NMR ca cht 23 137

25 Bng 4.4 Tác dng c ch HDAC và đc tính t bào in vitro ca các
cht 7a-f
140
26 Bng 4.5 Tác dng c ch HDAC và đc tính t bào in vitro ca các
cht 9a-h
141
27 Bng 4.6 Nng lng liên kt vi trung tâm hot đng ca HDAC 147
28 Bng 4.7 Kt qu c ch s phát trin khi u in vivo ca cht 9g 
các liu khác nhau vi dòng t bào ung th PC-3
149

xi
DANH MC CÁC HÌNH V, S 
HÌNH V
TT Tên hình Trang
1 Hình 1.1 S đ cu to nucleosom 3
2 Hình 1.2 HAT và HDAC điu hòa quá trình phiên mã 3
3 Hình 1.3 Phân loi HDAC  ngi 7
4 Hình 1.4 Cu trúc HDAC8 8
5 Hình 1.5 Cu trúc v trí hot đng ca HDLP khi liên kt vi phn
acetyl-lysin ca histon (trái) và Trichostatin A (phi)
9
6 Hình 1.6 C ch phn ng deacetyl hóa theo Finnin 9
7 Hình 1.7 iu hòa s phát trin và sng sót ca t bào bi các cht
c ch HDAC
14
8 Hình 1.8 Các cht c ch HDAC thúc đy s cht t bào 16
9 Hình 1.9 Công thc c đin ca HDI và v trí ca HDI trong túi
enzym HDAC
18

10 Hình 1.10 HDIs có cu trúc peptid vòng 20
11 Hình 1.11 HDIs là các benzamid 21
12 Hình 1.12 HDIs là các acid béo mch ngn 21
13 Hình 1.13 HDIs là các dn cht ceton 22
14 Hình 1.14 HDIs có cu trúc hydroxamat 23
15 Hình 1.15 Các dn cht N-hydroxy-2-propenamid 24
16 Hình 1.16 a) Các acid biphenyl-4-yl-acrylohydroxamic (AH2); b)
Các dn cht vi cu ni có hai liên kt đôi (AH3) và
dng kh hóa ca AH3 (AH4)
25
17 Hình 1.17 Mt s dn cht có liên quan ca AH2b 25
18 Hình 1.18 Các dn cht amid ngc ca SAHA 26
19 Hình 1.19 Các aryloxyalkanoic N-hydroxyamid (AH9) 26
20 Hình 1.20 Cu trúc ca amamistatin A, B 27
21 Hình 1.21
Các dn cht

-alkoxy ca SAHA
27
22 Hình 1.22 Cu trúc ca dn cht p-methoxybenzyl ether (AH10) 28

xii
TT Tên hình Trang
23 Hình 1.23
Mt s dn cht

-alkyl ca SAHA
29
24 Hình 1.24 Các acid phenylthiazol hydroxamic tng t SAHA 29
25 Hình 1.25 Mt s acid phenylthiazol hydroxamic 30

26 Hình 1.26 Các dn cht acid biphenyl-hydroxamic 30
27 Hình 1.27 Các acid isoxazol-hydroxamic 31
28 Hình 1.28 ADS100380 32
29 Hình 1.29 Các đnh hng ti u hóa cu trúc ca ADS102550 32
30 Hình 1.30 Các arylthiophen hydroxamat 33
31 Hình 1.31 Các acid pyridin-thiophen-hydroxamic 33
32 Hình 1.32 Các dn cht biphenyl sulfamid 34
33 Hình 1.33 Mt s dn cht sulfamid khác 34
34 Hình 1.34 Các dn cht sulfamid không mang cu ni amid 35
35 Hình 1.35 Mt s dn cht trithiocarbonat 35
36 Hình 1.36 Mt s trithiocarbonat khác và cht tng t 36
37 Hình 1.37 Các dn cht thiol 36
38 Hình 1.38 T disulfid đn KD5170 37
39 Hình 1.39 S thy phân và to chelat vi Zn
2+
ca KD5170 37
40 Hình 1.40 a) Tng hp amid thông qua to ester hot hóa; b) Mt s
alcol hay dùng
44
41 Hình 3.1 Công thc cu to ca 23 77
42 Hình 3.2 Công thc cu to ca 26 98
43 Hình 3.3 Hình nh khi u ca nhóm th, nhóm trng đi chiu và
SAHA
108
44 Hình 4.1 Phn ng th ái nhân acyl 110
45 Hình 4.2 Mt s hydroxylamin có gn nhóm bo v 115
46 Hình 4.3 Công thc cu to chung ca 51 cht tng hp đc 118
47 Hình 4.4 Ph hng ngoi ca cht 5e 120
48 Hình 4.5 Ph khi lng ca cht 7a 121
49 Hình 4.6 Ph khi lng ca cht 20f 124

50 Hình 4.7 Ph
1
H-NMR dãn rng ca cht 5a 127

xiii
TT Tên hình Trang
51 Hình 4.8 Ph
1
H-NMR dãn rng ca cht 9f 128
52 Hình 4.9 a) Ph
1
H-NMR; b) Ph
13
C-NMR ca cht 9g 130
53 Hình 4.10 Ph tng tác đn lng t d nhân – HSQC ca cht 9g 130
54 Hình 4.11 Ph tng tác đa liên kt d nhân - HMBC ca cht 9g 132
55 Hình 4.12 Ph
1
H-NMR dãn rng ca cht 20f 135
56 Hình 4.13 nh hng ca t trng flo lên carbon và hng s tng
tác (J)
136
57 Hình 4.14 Ph
13
C-NMR dãn rng ca cht 20b 136
58 Hình 4.15 Cu trúc ca TSA và SAHA 138
59 Hình 4.16 Công thc cu to ca các acid hydroxamic 3a-f 139
60 Hình 4.17 Các acid hydroxamic 5a-f, 7a-f 139
61 Hình 4.18 Kt qu phân tích Western blot ca các cht 7a-f 139
62 Hình 4.19 Cu trúc các acid hydroxamic 9a-h 140

63 Hình 4.20 Kt qu phân tích Western blot ca các cht 9a-f 141
64 Hình 4.21 Tng hp các aryltriazolylhydroxamat 27a-d 142
65 Hình 4.22 Cu trúc ca các acid hydroxamic 11a-d và 13a-f 143
66 Hình 4.23 Cu trúc ca các acid hydroxamic 17a-c, f, h và 20a-h 144
67 Hình 4.24 Kt qu phân tích Western blot ca mt s cht đi din
dãy 13 và 20
144
68 Hình 4.25 Cu trúc không gian ca SAHA, 17a và 20a 145
69 Hình 4.26
Cu trúc các acid

-lactam-hydroxamic
146
70 Hình 4.27 Cu trúc chung ca các dn cht homo-oxa-SAHA 146
71 Hình 4.28 Docking ca cht 9g (màu cam), 9h (màu tím hng) và
SAHA (màu xanh lá) vi HDAC8
148
72 Hình 4.29 S thay đi kích thc khi u trung bình ca nhóm th so
vi SAHA
149
73 Hình 4.30 S thay đi cân nng ca chut trong quá trình thí nghim 150



xiv
S 
TT Tên s đ Trang
1 S đ 1.1 Phn ng to liên kt amid trc tip 39
2 S đ 1.2 Phn ng to liên kt amid thông qua acid hot hóa 40
3 S đ 1.3 a) Phn ng to acyl clorid; b) Tng hp amid 40

4 S đ 1.4 Vai trò xúc tác ca pyridin 41
5 S đ 1.5 Tng hp amid thông qua to acyl azid 41
6 S đ 1.6 Tng hp amid s dng tác nhân hot hóa CDI 42
7 S đ 1.7 Tng hp amid s dng tác nhân hot hóa DCC 43
8 S đ 1.8 Tng hp amid s dng tác nhân hot hóa ethyl
cloroformat
43
9 S đ 1.9 Tng hp amid s dng tác nhân BOP 44
10 S đ 1.10 Tng hp mt s dn cht amid ngc ca SAHA 45
11 S đ 1.11 Tng hp acid biaryl hydroxamic 46
12 S đ 1.12 Tng hp các acid phenylthiazol hydroxamic 46
13 S đ 3.1 Tng hp các dn cht 3a-f, 5a-f 57
14 S đ 3.2 Tng hp N
1
-(6-nitrobenzo[d]thiazol-2-yl)-N
5
-
hydroxyglutaramid (5f)
63
15 S đ 3.3 Tng hp các dn cht 7a-f và 9a-h 66
16 S đ 3.4 Tng hp N
1
-(thiazol-2-yl)-N
8
-hydroxyoctandiamid (23) 76
17 S đ 3.5 Tng hp các dn cht 11a-d và 13a-f 77
18 S đ 3.6 Tng hp các dn cht 17a-c, f, h và 20a-h 86
19 S đ 3.7 Tng hp N
1
-(4-clorophenyl)-N

6
-(3-(hydroxyamino)-3-
oxopropyl)adipamid (26)
97
20 S đ 4.1 Tng hp các cht trung gian 2a-f, 4a-f, 15a-c, 15f, 15h,
18a-h
110
21 S đ 4.2 Tng hp các acid hydroxamic 3a-f và 5a-f 111
22 S đ 4.3 Tng hp acid hydroxamic 3a-f bng tác nhân hot hóa
DCC
112
23 S đ 4.4 Vai trò ca HOBt trong quá trình to ester hot hóa 113


xv
TT Tên s đ Trang
24 S đ 4.5 Tng hp 3a-f s dng tác nhân hot hóa isobutyl
cloroformat
113
25 S đ 4.6 Tng hp 3a-f s dng tác nhân hot hóa CDI 114
26 S đ 4.7 Tng hp acid hydroxamic 5f 115
27 S đ 4.8 Tng hp các ester trung gian ca các dãy cht 7, 9, 11,
13, 17 và 20, cht 22
116
28 S đ 4.9 Tng hp ester trung gian 25 116
29 S đ 4.10 Tng hp các aryltriazolylhydroxamat 117
30 S đ 4.11
Tng hp mt s dn cht

-alkoxy ca SAHA

117
31 S đ 4.12 C ch phn ng tng hp các acid hydroxamic dãy 7, 9,
11, 13, 17 và 20, cht 23, 26 t ester
117
32 S đ 4.13 S đ phá mnh ca cht 7a 123
33 S đ 4.14 S đ phá mnh ca cht 20f 125


1
T VN 
Nhng tin b trong các ngành khoa hc c bn nh di truyn hc, sinh hc
phân t, sinh hc t bào và đc bit là s ra đi ca bn đ gen ngi đã giúp cho các
nhà khoa hc có nhng hiu bit sâu sc v khi u  cp đ phân t cng nh các quá
trình quyt đnh s phát trin ca khi u. Do đó, hàng lot các protein đóng vai trò
quan trng trong ung th đng thi c
ng là đích mà các thuc điu tr ung th hng
ti đã đc phát hin nh các protein kinase ph thuc cyclin, protein gây ung th
Bcl-2, p53, các farnesyltransferase, histon deacetylase (HDAC), telomerase,
STAT…[27]. Nh vy, vic nghiên cu và phát trin thuc điu tr ung th theo
phng pháp mi hin nay, phng pháp thit k công thc da trên đích tác dng
phân t, ngày càng đt đc nhiu thành tu đáng k.
Mt trong nhng đích tác dng phân t
 đang đc chú ý hin nay là các histon
deacetylase (HDAC). Nghiên cu v các HDAC đã xác đnh hot đng bt thng ca
HDAC có liên quan đn nhiu bnh ung th. Vì vy, các cht c ch HDAC đang tr
thành các tác nhân chng ung th đy trin vng. Acid suberoylanilid hydroxamic
(Zolinza
®
, 2006) và depsipeptid (Romidepsin
®

, 2009) là hai cht c ch HDAC đã
đc Cc qun lý thc phm và dc phm M (US-FDA) phê duyt trong điu tr u
lympho da t bào T [21]. Bên cnh đó, mt s cht c ch HDAC khác cng đang
đc nghiên cu và tri qua các pha th lâm sàng nh NVL-LAQ824, MS-275, CI-
994, PXD-101 [21,33,65]. Các cht c ch HDAC đc chia thành 5 nhóm da theo
cu trúc hóa hc, trong đó các dn cht acid hydroxamic đc các nhà khoa hc trên
th gii tp trung nghiên cu nhi
u nht do cu trúc đn gin d tng hp, hot tính c
ch HDAC mnh.
Hi nhp vi xu hng nghiên cu ca th gii và tìm kim cht c ch HDAC
có hot tính kháng t bào ung th tt, lun án “Tng hp và th hot tính sinh hc
ca mt s dn cht acid hydroxamic hng c ch enzym histon deacetylase”
đc thc hin vi 2 mc tiêu:
1. Thi
t k và tng hp đc khong 40 - 50 dn cht acid hydroxamic mi
hng c ch HDAC.
2. Th tác dng c ch HDAC và tác dng kháng t bào ung th ca các cht
tng hp đc.

2
Chng 1. TNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE
Các nghiên cu v ung th đã xác đnh cn nguyên ca bnh không ch do c
ch di truyn hc mà còn do c ch di truyn biu hin gen. C ch di truyn biu hin
gen liên quan đn nhng thay đi trong quá trình biu hin gen mà không nh hng
đn cu trúc chui ADN. C ch di truyn biu hin gen gm các bin đi v ADN và
histon nh s methyl hóa, acetyl hóa [25,55,71,90]. Nhng bin đi này dn
đn các
bt thng ca quá trình biu hin gen th hin  s phát trin, s bit hóa và s cht
t bào theo chng trình, kt qu là tng kh nng bin đi ca t bào.

Cho đn nay, các nghiên cu đã chng minh cu trúc ca nhim sc th là yu
t quan trng trong điu hòa quá trình biu hin gen [11,22,63,71]. Cu trúc ca nhim
sc th là mt ph
c hp cu to bi ADN, các histon và các protein không phi histon
[22,40]. Histon là các protein c bn giàu acid amin nh lysin, arginin, đc chia
thành 5 nhóm chính (H1, H2A, H2B, H3, H4). Tng cp ca H2A, H2B và H3, H4
cùng nhau to nên lõi protein octomer hình đa. Lõi protein này đc qun quanh bi
146 cp ADN to nên nucleosom (hình 1.1) [11,22,63,71,77]. Các nucleosom ni vi
nhau nh phn amino tn ca các histon. Bn cp histon lõi có 2 phn quan trng:
phn đuôi C nm bên trong lõi ca nucleosom và phn đu N vi acid amin kt thúc là
lysin nm bên ngoài nucleosom [63]. Cu trúc này chu nh hng chính bi s
 bin
đi phn đu N ca histon. Phn đu N ca histon, đc bit H3, H4 là ni din ra rt
nhiu quá trình bin đi khác nhau trong phiên mã nh acetyl hóa/deacetyl hóa lysin,
methyl hóa lysin và arginin, phosphoryl hóa serin và ubiquinin, sumoyl hóa lysin
[22,40,71].
C ch ca phn ln các bin đi trên đu cha sáng t. So vi s methyl hóa
và phosphoryl hóa, dng nh s acetyl hóa phn lõi histon là quá trình bin đi đã
đc nghiên cu và hiu bit tng tn hn. Histon có th t
n ti  mt trong hai dng
đi lp nhau là acetyl hóa hoc deacetyl hóa. Các enzym đóng vai trò trong s chuyn
đi này là histon acetyltransferase (HAT) và histon deacetylase (HDAC)
[11,22,40,63,71]. Khi xy ra s acetyl hóa histon, nhim sc th s đc tháo xon và
hot hóa quá trình phiên mã, trong khi đó deacetyl hóa phn đu N ca histon s làm
gim quá trình phiên mã thông qua s đóng xon nhim sc th. Nói chung, khi tng
acetyl histon dn đn thúc đy quá trình phiên mã và ngc li khi s acetyl hóa histon
gim làm ngn cn quá trình phiên mã (hình 1.2) [63,71].


3

Hình 1.1.
S đ cu to nucleosom [71]


Hình 1.2.
HAT và HDAC điu hòa quá trình phiên mã [71]
* Chú thích: HAT: histon acetyltransferase; HDAC: histon deacetylase; Ac: acetyl.



4
1.1.1. Histon acetyltransferase (HAT)
Histon acetyltransferase (HAT) xúc tác chuyn nhóm acetyl t acetyl coenzym
A đn liên kt vi nhóm -amino ca lysin  phn đu N ca histon. S chuyn đi
này xy ra nhiu hn trên histon H3, H4. V trí acetyl hóa quan trng là Lys
9
và Lys
14

trên histon H3; Lys
5
, Lys
8
, Lys
12
và Lys
16
trên histon H4 [71,77]. S acetyl hóa histon
làm tháo xon nhim sc th bng cách trung hòa đin tích dng ca phn đu N ca

histon, do vy làm gim ái lc ca histon vi phn tích đin âm trên ADN [70]. Chính
vì vy, vic tng acetyl hóa histon làm ni lng cu trúc nhim sc th và hot hóa
gen.
Các histon acetyltransferase đc chia thành 5 nhóm bao gm khong 20
isoenzym [15,22,40,70]. C s ca vic phân nhóm này là da trên s tng t nhau
ca cu trúc chui c
bn và thng có c cht đc hiu. Nhóm HAT đu tiên là các
GNAT (Gcn5-related N-acetyltransferase), bao gm các protein liên quan đn s bt
đu phiên mã, nh là Gcn5 và PCAF (p300/cyclic-AMP-response-element binding
protein-associated factor). Nhóm th hai là các MYST, đc đt tên theo protein gn
Zn trong bnh bch cu đn nhân to (MOZ-monocytic leukemia zinc-finger protein),
YBF2/SAS3, SAS2 và HIV-1 TAT-interactive protein 60 (TIP60). Nhóm th ba là 2
enzym liên quan cht ch đn protein p300 và CBP (cyclic-AMP response element-
binding protein), chúng hot đng nh cht đng hot hóa mt s phc hp ca nhân
t sao chép mã. Hai nhóm HAT khác là các cht đng hot hóa receptor nhân nh
phc hp TFIID (general transcription factor IID) (cu trúc d
i phân t là TAFII250)
và ACTR (amplified in breast cancer), SRC1 (avian sarcoma viral oncogene
homologue 1) [20]. Không ch acetyl hóa đuôi histon, các HAT còn có th acetyl hóa
các cht đng hot hóa, cht đng c ch sao chép mã nh E2F, p53, GATA1 [40,76].
Nh vy, các HAT đóng vai trò quan trng trong hot hóa cng nh c ch gen. Các
HAT không gn kt trc tip vi ADN mà to thành phc hp vi các HAT khác cng
nh vi các nhân t sao chép mã.

1.1.2. Histon deacetylase (HDAC)
Histon deacetylase có tác dng ngc vi HAT, nó xúc tác vic loi b nhóm
acetyl ca lysin  phn đ
u N ca histon, dn đn nhim sc th b đóng xon và c
ch quá trình phiên mã [22,40,43,63,71,81]. HDAC đc bo tn trong quá trình tin
hóa và biu hin trong các t chc ca các sinh vt t đn bào nguyên thy cho đn

loài ngi.

5
Tng t nh HAT, các HDAC không gn kt trc tip vi chui ADN mà to
phc hp vi các cht đng c ch phiên mã khác. Các HDAC khác nhau to các phc
hp khác nhau. Hot tính ca HDAC đc điu hòa bi s bin đi
sau phiên mã. Các
HDAC không ch deacetyl hóa histon, mà còn deacetyl hóa các protein không histon
nh p53, Ku70, pRB và E2F-1 [16,59,81].
1.1.2.1. Phân loi
HDAC1  ngi là histon deacetylase đu tiên đc xác đnh bng cách s
dng cht c ch HDAC trapoxin vào nm 1996 [80]. Cho đ
n nay, 18 HDAC khác
nhau  ngi đã đc xác đnh và chia thành 4 nhóm (hình 1.3) [11,22,33,34,40,56,71,
89]. Các HDAC khác nhau  tính tng đng chui, c cht đc hiu và cofactor ph
thuc [33,34,89].
* Nhóm I
(HDAC1, 2, 3, 8) (hình 1.3): tng đng vi Rdp3  t bào nm men
S.cerevisiae, có chc nng c ch phiên mã, ch hot đng khi nm trong phc hp
protein [2,16]. HDAC nhóm I có  nm men, đng vt có vú và thc vt.  đng vt
có vú, các HDAC này đc chia thành 2 phân nhóm là HDAC1/2 và HDAC3.
Cu trúc ca HDAC1 và 2 khá tng đng (82%). Vùng xúc tác nm  đu N
to nên phn chính ca protein. Khi đc to ra bng k thut tái t hp, HDAC1 và 2
không có hot tính chng t
các cofactor là cn thit cho hot đng ca HDAC.
HDAC1, 2 hot đng khi nm trong phc hp nh phc hp SIN3, NuRD/NRD/Mi2
và CoREST. Phosphoryl hóa serin trên HDAC1, 2 điu hòa hot đng ca chúng và
to nên phc hp vi các cofactor khác [29,71].
HDAC3 đc tìm thy trong phc hp vi N-CoR (nuclear receptor copressor)
và phc hp vi SMRT (silencing mediator for retinoic acid and thyroid hormon

receptors). HDAC3 có cùng cu trúc vùng ging nh các HDAC nhóm I. Khong 68%
vùng các acid amin ca HDAC3 đng nht vi HDAC1, 2. Phn đuôi C không đo
ngc ca HDAC3 cn thit cho c
 hot tính deacetyl hóa và c ch phiên mã [71].
HDAC8 không đc xp vào phân nhóm nào vì nó ch yu có  đng vt có
xng sng. HDAC8 có 37% tng đng vùng các acid amin vi HDAC3. Hot đng
ca HDAC8 gim khi phosphoryl hóa bi protein kinase A, trong khi đó HDAC1, 2 li
hot đng bi s phosphoryl hóa [30]. HDAC8 là HDAC đu tiên  đng vt có vú
xác đnh đc cu trúc 3 chiu [74].
* Nhóm II
gm HDAC4, 5, 7, 9 (nhóm IIa) và HDAC6,10 (nhóm IIb) tng đng vi
HDA1 trong t bào nm men (hình 1.3). HDAC nhóm II có kích thc phân t ln
(855-1122 aa) và khác bit so vi HDAC nhóm I do có đu N tham gia vào quá trình
c ch phiên mã. Nhóm này cha tín hiu đnh v ngoài nhân NES nên có th di
chuyn t nhân ra bào tng và ngc li.

6
Hn 70% vùng các acid amin ca HDAC4, 5 tng đng vi nhau, còn
HDAC7 ch tng đng khong 57 - 58% vi HDAC4, 5. C 3 HDAC này đu có
vùng xúc tác nm  đuôi C ca protein. Trong khi đó, HDAC9 li có vùng xúc tác 
đu N, ging nh các HDAC nhóm I. Các HDAC nhóm IIa có đu N tng tác đc
hiu vi yu t phiên mã MEF2 (myogenic transcription factor 2). Yu t này đóng vai
trò quan trng trong s bit hóa c. Do vy, các HDAC này khi kt hp vi MEF2 gây
c ch chc nng phiên mã c
a MEF2, h qu là t bào c không bit hóa đc. Các
HDAC này có th b sung cho nhau đ kim soát s điu hòa bit hóa ca quá trình
biu hin gen trong các giai đon khác nhau ca s bit hóa trong t bào c [71].
HDAC6 và 10 có vùng acid amin tng đng khong 37%. im khác bit ca
HDAC6 và 10 so vi các HDAC khác là chúng có 2 vùng xúc tác, tuy nhiên HDAC10
có 1 vùng xúc tác b bt hot. Mt đc đim riêng ch có  HDAC6 là s có mt ca

HUB (HDAC6-, USP3- và Brap2-related zinc finger motif) 
đuôi C. c đim này là
du hiu cho s ubiquitin hóa và cho thy HDAC này thiên v s thoái hóa. Nghiên
cu in vitro và in vivo đã xác đnh HDAC6 liên quan cht ch đn các bnh thoái hóa
mô thn kinh nh bnh Parkinson, bnh Hutington. HDAC6 ch yu có  bào tng,
tuy nhiên nó còn đc tìm thy  nhân trong phc hp vi HDAC11. HDAC10 có mt
vùng xúc tác  đu N và vùng xúc tác b bt hot  đuôi C. HDAC 10 có kh nng
tng tác v
i HDAC1, 2, 3, 4, 5, 7, nhng không tng tác vi HDAC6 và vn th
hin hot tính deacetyl hóa khi không to phc. HDAC6, 10 kháng li trapoxin và
butyrat natri tt hn các HDAC nhóm I, IIa. [21,45,71].
* Nhóm III
: (silent information regulator genes - Sirtuins), gm SIRT1-7 tng t
Sir2  t bào nm men. HDAC nhóm III này không liên quan đn các nhóm khác,
chúng có  trong nhân (SIRT1,6,7), bào tng (SIRT2) hoc ty th (SIRT3,4,5).
HDAC nhóm III ít đc nghiên cu  ngi, nhng đã đc xác đnh có c ch hot
đng ph thuc vào cofactor NAD
+
, khác vi HDAC nhóm I, II, IV (HDAC kinh đin)
ph thuc Zn
2+
và b c ch bi các cht to phc chelat vi Zn
2+
[45,71,89].
* Nhóm IV
: HDAC 11 (ch có  ngi). Nghiên cu h thng loài thy rng HDAC11
liên quan gn hn vi HDAC3, 8, nên có th gi đnh HDAC11 liên quan mt thit vi
HDAC nhóm I hn là nhóm II. HDAC 11 có vùng xúc tác  đu N và có th b c ch
bi trapoxin (dn cht ca TSA). HDAC11 cha đc tìm thy trong các phc hp
HDAC đã bit đ có th xác đnh chc nng sinh hc [45,71,89].

7

Hình 1.3.
Phân loi HDAC  ngi [21]
* Chú thích: Hình ch nht màu xanh dng là vùng xúc tác đc bo tn ca HDAC; N:
nhân; C: bào tng; Mit: ty th; Ac: acetyl hóa; P: phosphoryl hóa; S: sumoyl hóa; Ub:
ubiquitin hóa. N.D: cha xác đnh.
HDAC không ch điu hòa các protein histon mà rt nhiu protein không histon
cng b nh hng bi hot tính ca các HDAC. Thut ng các cht c ch HDAC đ
ch các cht có kh nng c ch HDAC nhóm I, II và IV [45,89].

1.1.2.2. Cu trúc ca HDAC và c ch phn ng deacetyl hóa
Vic xác đnh cu trúc ca HDAC rt cn thit đ xác đnh c ch tác dng ca
HDAC, đng thi da vào cu trúc HDAC đ thit k công thc cho các cht c ch
HDAC. Phng pháp kt tinh to tinh th và chp tia X đc áp dng đ tìm ra cu
trúc tinh th ca các HDAC khác nhau, đc bit là trung tâm hot đng ca nó.
HDAC8 là HDAC đu tiên  đng vt có vú xác đnh đc cu trúc 3 chiu [74].

8

Hình 1.4.
Cu trúc HDAC8 ( ion Zn
2+
biu th là hình tròn màu xanh lá) [86]
Các HDAC đu có trung tâm hot đng gm 2 phn chính: ion Zn
2+
, kênh
enzym dng túi hình ng. Bao quanh ion Zn
2+

là 2 cp acid amin Histidin-Aspartic
(HDLP là His131-Asp166 và His132-Asp173, HDAC 8 là His142-Asp176 và His143-
Asp183), mt phân t Tyrosin đóng vai trò cho proton (HDLP là Tyr297, HDAC8 là
Tyr306) và 2 acid aspartic (HDLP là Asp258 và Asp168, HDAC8 là Asp178 và
Asp267), mt phân t Histidin (HDLP là His170, HDAC8 là His180) [11].
- Ion Zn
2+
là coenzym ca HDAC, nm  đáy kênh enzym. Trong phân t HDAC,
ion Zn
2+
có th to 5 liên kt phi trí: 4 liên kt vi nguyên t oxy, nit ca các acid
amin, 1 liên kt phi trí vi nguyên t oxy ca nhóm acetyl ca phân t acetyl-lysin 
phn đu N ca histon, t đó xúc tác tách loi nhóm acetyl. Khi có mt các cht c ch
HDAC nh các acid hydroxamic, ion Zn
2+
to 2 liên kt phi trí vi 2 nguyên t oxy
ca nhóm hydroxamic (hình 1.5) [11].
- Kênh enzym có dng túi hình ng hp, to nhiu liên kt Van der Waals vi c
cht (lysin tn ca histon/phn cu ni ca các cht c ch HDAC). Túi đc cu to
t các acid amin thân lipid: Phenylalanin, Tyrosin, Prolin, Histidin. áy túi còn có 1
vài phân t nc làm nhim v vn chuyn nhóm acetyl trong phn ng deactyl hóa và
tham gia to liên kt hydro khi không có mt nhóm -OH ca Tyrosin. Cu trúc túi rt
linh đng, có th
bin đi đ phù hp vi chiu dài ca các c cht khác nhau. B rng
ca túi đc gii hn bi 2 vòng thm đc tìm thy trên cùng mt v trí  nhiu
HDAC khác nhau. Trên ming túi có 1 vành nh đc to nên t 1 vài vòng xon
protein (phn vành s tng tác vi nhóm nhn din b mt ca HDAC) [11].