Tách dòng và thiêt kê vector chuyển gen mang gen mã hoa nhân tô phiên mã gmdreb3 điêu khiển tinh chống chịu của cây đâu tương glycine max (l ) merrill

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

BÀNH THỊ MAI ANH

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ
HĨA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG
CHỊU CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2011
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

TÁCH DÕNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN MÃ
HÓA NHÂN TỐ PHIÊN MÃ GmDREB3 ĐIỀU KHIỂN TÍNH CHỐNG CHỊU
CỦA ĐẬU TƢƠNG [Glycine max (L.) Merrill]

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62.42.70

Học viên: Bành Thị Mai Anh
Người hướng dẫn: PGS.TS. Chu Hoàng Hà

THÁI NGUYÊN - 2011

1


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa có ai cơng bố trong một cơng
trình nào khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ ng̀n gốc.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS.TS. Chu Hồng Hà đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ
bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn
thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn TS. Lê Văn Sơn , TS. Phạm Bích Ngọc, Ths. Lê Thu
Ngọc cùng toàn thể cán bộ phịng Cơng nghệ Tế bào thực vật , Viện Cơng nghệ Sinh học
đã tận tình giúp đỡ cho tơi trong q trình nghiên cứu và hồn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô khoa Sinh-KTNN và khoa Sau đại học, trƣờng Đại học
Sƣ phạm – Đại học Thái Nguyên. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Di
truyền & Sinh học hiện đại đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q
trình học tập và nghiên cứu đề tài.
Tơi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã ln động viên, giúp đỡ tơi trong suốt q
trình học tập và thực hiện thành công luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2011

Học viên

BÀNH THỊ MAI ANH


MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan..............................................................................................................
Lời cảm ơn..................................................................................................................
Mục lục.......................................................................................................................

i

Danh mục chƣ̃ viết tắt.................................................................................................

iv

Danh mục bảng...........................................................................................................

vi

Danh mục hình............................................................................................................

vii

MỞ ĐẦU……………………………………………………………………………

1

I. Đặt vấn đề................................................................................................................

1

II. Mục tiêu nghiên cứu………………………………………………………...........

2

III. Nợi dung nghiên cƣ́u………………………………………………………….....

2

Chƣơng 1. TỞNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………..

3

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƢƠNG……………………………………...

3

1.1.1. Nguồn gốc phân loại cây đậu tƣơng………………………………………….

3

1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng…………………..................................

3

1.1.3. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng......................................................................

5

1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam..............................

6

1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƢƠNG………...........

7

1.3. CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN…………………

11

1.3.1. Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn……………………………...........

11

1.3.2. Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen liên quan đến tính chịu hạn………

12

i


1.3.3. Promoter rd29A…………………………………………………………….....

15

1.4. NHÂN TỐ ĐIỀU KHIỂN PHIÊN MÃ DREB……………………………....

18

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U..............................

24

2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT, THIẾT BỊ...............................................................

24

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.....................................................................

25

2.2.1. Phƣơng pháp sinh học phân tử......................................................................

25

2.2.1.1. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA…………………………..

25

2.2.1.2. Phương pháp tổng hợp cDNA………………………………………………

26

2.2.1.3. Phản ứng PCR ……………………………………......................................

27

2.2.1.4. Phương pháp tách dòng gen………………………………………………..

27

2.2.1.5. Thiết kế cấu trúc pBI101:: rd29A :: DREB3……………………………….

29

2.2.2. Phƣơng pháp tái sinh và chuyển gen thông qua Agrobacterium................

30

2.2.2.1. Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thông qua Agrobacterium.....

30

2.2.2.2. Phương pháp chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua Agrobacterium.......

32

2.2.3. Phƣơng pháp phân tí ch cây chuyển gen.......................................................

33

2.2.3.1. Phương pháp PCR.........................................................................................

33

2.2.3.2. Phương pháp gây hạn nhân tạo.....................................................................

33

2.2.4. Phƣơng pháp tính tốn và xử lý số liệu.........................................................

33

2.2.5. Phƣơng pháp xƣ̉ lý trì nh tƣ̣ gen và amino acid............................................

33

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………...........

34

3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÕNG GEN DREB3……………………………………..

34

ii


3.1.1. Kết quả nhân gen DREB3 tƣ̀ RNA tổng số giống đậu tƣơng Nâu Cao Bằng....

34

3.1.2. Kết quả ghép nối đoạn gen DREB3 vào vector tách dòng …………………...

35

3.1.3. Phân tí ch và xếp nhóm protein DREB3 dƣ̣a vào vùng bảo thủ AP2………….

39

3.2. KẾT QUẢ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN DREB3 ………………..

42

3.2.1. Thiết kế vector ……………………………………………………………….

42

3.2.2.Biến nạp cấu trúc vector pBI

101::rd29A::DREB3

vào vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens………………………………………….......................
3.3. KẾT QUẢ CHUYỂN GEN DREB3 VÀO CÂY THUỐC LÁ THÔNG
QUA AGROBACTERIUM………………………………………………………..
3.3.1. Kết quả chuyển cấu trúc vector pBI ::rd29A::DREB3 vào giống thuốc lá
K326………………………………………………………………………………….

47
48
48

3.3.2. Kết quả phân tí ch và đánh giá các dòng thuốc lá thu đƣợc……………….

50

3.4. KẾT QUẢ CHUYỂN PROMOTER RD29A TRONG CÂY ĐẬU
TƢƠNG……………………………………………………………………………..

52

3.4.1. Kết quả chuyển cấu trúc promoter rd29A vào đậu tƣơng……………………

52

3.4.2. Kết quả phân tích cây đậu tƣơng chuyển gen bằng kỹ thuật PCR……............

55

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ …………………………………………………...........

56

DANH MỤC CÔNG TRÌ NH LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN…………………

57

TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………

58

PHỤ LỤC…………………………………………………………………………..

iii

DANH MỤC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
ABA

Abscisic acid

ABR

ABA/stress responsive

ABRE

ABA responsive element

AP2/EREBP

APETALA2/Ethylene Response Elements Binding Proteins

AP2/ERF

APETALA2/ethylen response factor

AS

Acetosyringone

A. tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

BAP

6-benzyladenine

bar

gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase

bp

Base pair

bZIP

Basic leucine zipper

cDNA

Sợi DNA bổ sung (Complementary DNA)

CCM

Cocultivation medium – môi trƣờng đồng nuôi cấy

Cs

Cộng sƣ̣

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxynucleoside triphosphate

DRE/CRT

Dehydration responsive element/C repeat

DREB

Dehydration responsive element binding

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

E. coli

Escherichia coli

GA3

Gibberellic acid

GM

Germination medium – môi trƣờng nảy mầm hạt

iv


Gus

β –Glucuronidase gene (Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase)

IBA

Indole-3-butyric acid

IPTG

Isopropylthio-beta-D-galactoside

Kb

kilo base

LB

Luria Bertani

LEA

Late embryogenesis abundant

MAP kinase

Mitogen-activated protein kinases

MES

2-[N-morpholino] ethanesulfonic acid

MS

Môi trƣờng muối cơ bản theo Murashige và Skoog (1962)

NSL

Nuclear localization signal

OD

Optical density

rd29A

Responsive Dehydration

PCR

Polymerase Chain Reaction – phản ứng chuỗi polymerase

RM

Rooting medium – môi trƣờng ra rễ

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecylsulfat

SIM

Shoot induction medium – môi trƣờng tạo đa chồi

SEM

Shoot elongation medium – môi trƣờng kéo dài chồi

TBE

Tris - Boric acid – EDTA

TAE

Tris - Acetate – EDTA

TE

Tris – EDTA

v/p

vòng/phút

X-gal

5-brom- 4-chloro-3-indolyl-b-D-galactosidase

v


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010…

6

Bảng 2.1. Thành phần dung dịch đệm tách chiết……………………………...

25

Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR…………………………………….

27

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector tách dòng……………….

27

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony – PCR……………………………….

28

Bảng 2.5. Thành phần hoá chất tách plasmid………………………………….

29

Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt bằng enzyme BamHI, SacI......................

29

Bảng 2.7. Môi trƣờng nuôi cấy đậu tƣơng…………………………………….

31

Bảng 2.8. Môi trƣờng nuôi cấy thuốc lá……………………………………….

32

Bảng 3.1. Sƣ̣ sai khác về trì nh tƣ̣ nucleotide và amino acid của 3 trình tự gen
DREB3 thu đƣợc với gen GmDREB3 mã số DQ055133………………………

38

Bảng 3.2. Tỷ lệ sống sót của của các mảnh thuốc lá biến nạp qua các giai
đoạn chọn lọc......................................................................................................

48

Bảng 3.3. Tỷ lệ sống sót của các mô đậu tƣơng qua các giai đoạn chọn lọc.....

53

vi


DANH MỤC HÌ NH
Trang
Hình 1.1. Hệ thống nhân tố phiên mã điều khiển sƣ̣ biểu hiện các gen chƣ́c năng
tham gia phản ƣ́ng chống chị u với điều kiện bất lợi của Arabidopsis ………….....
Hình 1.2. Sơ đồ về sƣ̣ trả lời các tác nhân stress môi trƣờng ……………………..
Hình 3.1. Kết quả nhân gen DREB3 ………………………………………………
Hình 3.2. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến DH5α …….....
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR chọn lọc khuẩn lạc mang gen
DREB3 ………………………………………………………………………….....
Hình 3.4. Điện di sản phẩm cắt kiểm tra plamid bằng enzyme BamHI …………..
Hình 3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotide ………………………………….....
Hình 3.6. Kết quả phân tí ch trì nh tƣ̣ amino acid của protein DREB3 ………….....
Hình 3.7. Kết quả phân tí ch trì nh tƣ̣ amino acid suy diễn các gen họ AP 2/ERF
trên phần mềm Clustal W ……………………………………………………….....
Hình 3.8. Phân tí ch cây phả hệ các gen họ AP2/ERF sƣ̉ dụng phần mềm Cobalt...
Hình 3.9. Mô hì nh mô tả các bƣớc thiết kế vector chuyển gen …………………...
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi DREB3-BamHI/DREB3SacI ………………………………………………………………………………...
Hình 3.11. Kết quả điện di sản phẩm phản ƣ́ng cắt pBI::rd29A::gus bằng BamHI
và SacI ......................................................................................................................
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mời đặc hiệu …….....
Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt kiểm tra plasmid ……………………..
Hình 3.14. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu ………...
Hình 3.15. Các giai đoạn phát triển của mảnh thuốc lá biến nạp …………………
Hình 3.16. Kết quả điện di các sản phẩm PCR các dòng thuốc lá thu đƣợc ……...
Hình 3.17. Kết quả gây hạn
nhân tạo các dòng thuốc lá chuyển
gen………………………………………………………………………………….

Hình 3.18. Các giai đoạn của quá trình chuyển gen ở cây đậu tƣơng ………….....
Hình 3.19. Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi đặc hiệu của promoter
rd29A và cặp mồi nhân gen virC…………………………………………………...

vii

14
17
34
35
36
36
37
39
40
41
42
43
44
45
46
47
49
50
51
54
55


MỞ ĐẦU

I. Đặt vấn đề
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) là cây trồng chính ở Việt Nam chỉ xếp sau
cây lúa và ngô, là nguồn nguyên liệu chế biến thức ăn gia súc và cung cấp nguồn đạm
thực vật cho ngƣời. Đậu tƣơng là cây thực phẩm ngắn ngày có giá trị kinh tế cao , có tác
dụng trong cải tạo đất trồng , dễ canh tác và đặc biệt có khả năng thích nghi với nhiều
vùng sinh thái khác nhau. Vì vậy, cây đậu tƣơng đã đƣợc trờng ở trên 200 quốc gia, với
sản lƣợng trung bình hàng năm khoảng hơn 250 triệu tấn [41]. Từ vị trí là một nƣớc xuất
khẩu đậu tƣơng vào những năm 1980, đến nay Việt Nam đã trở thành một nƣớc nhập
khẩu đậu tƣơng với số lƣợng lớn, riêng năm 2010 là 227,651 tấn [43]. Vì vậy, việc phát
triển diện tí ch và sản lƣợng đậu tƣơng là một chiến lƣợc quan trọng trong chiến lƣợc phát
triển nông nghiệp ở Việt Nam hiện nay.
Các yếu tố bất lợi của môi trƣờng hiện đang là những thách thức lớn cho mục tiêu
duy trì sƣ̣ phát triển bền vƣ̃ng trong sản xuất lƣơng thƣ̣c cho con n gƣời, trong đó hạn và
mặn là hai trong số nhƣ̃ng nhân tố quan trọng nhất kì m hãm sƣ̣ phát triển

sản xuất nông

nghiệp. Những năm gần đây, thế giới cũng nhƣ Việt Nam thƣờng xuyên phải gánh chịu
những biến động lớn; sự gia tăng nhiệt độ trái đất, hạn hán, lũ lụt, xói mịn, thối hóa đất
gây ảnh hƣởng không nhỏ tới năng suất, sản lƣợng, chất lƣợng cây trồng.
Đậu tƣơng là cây chịu hạn kém [3], [10], khi thiếu nƣớc ở các thời kỳ khác đều có
ảnh hƣởng xấu đến năng suất. Nhƣ vậy, việc chọn và tạo đƣợc các giống đậu tƣơng có
khả năng chống chịu hạn là một nhu cầu cần thiết trong sản xuất và đƣợc xem nhƣ định
hƣớng nghiên cứu phát triển cây đậu tƣơng ở Việt Nam.
Cách tiếp cậ n hƣớng nghiên cƣ́u về stress thƣ̣c vật hiện nay đang tập trung vào
phân lập và nghiên cƣ́u đặc tí nh một tập hợp gen liên quan đến tác động bất lợi của môi
trƣờng và mối liên hệ với các stress mặn , hạn và nhiệt độ . Hàng trăm gen đƣợc cảm ƣ́ng
trong các điều kiện bất lợi khác nhau và sản phẩm của các gen cảm ƣ́ng với điều kiện bất
lợi đƣợc chia làm hai nhóm : (1) nhóm các protein giúp thực vật chống lại bất lợi của môi
trƣờng; (2) nhóm các prot ein làm nhiệm vụ điều hòa biểu hiện gen và truyền tí n hiệu

1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




trong quá trì nh đáp ƣ́ng điều kiện bất lợi , nhóm này chính là cá c nhân tớ phiên mã . Gần
đây, dƣ̣a trên nhƣ̃ng thành tƣ̣u của chƣơng trì nh nghiên cƣ́u chƣ́c năng hệ gen

thƣ̣c vật

cùng với sự phát triển các kỹ thuật microarray , proteomic…, các nhà khoa học đã phát
hiện và chƣ́ng minh vai trò quan trọng của các nhóm gen điều khiển (Transcription factor,
Kinase) trong việc tăng cƣờng tí nh chị u hạ n ở th ực vật . Nhóm gen điều khiển mặc dù
không tham gia trƣ̣c tiếp vào phản ƣ́ng đáp ƣ́ng với điều kiện hạn của thƣ̣c vật , nhƣng sƣ̣
biểu hiện của chúng lại có vai trò kí ch hoạt sƣ̣ biểu hiện của rất nhiều gen chƣ́c năng khá c
tham gia vào quá trì nh đáp ƣ́ng hạn, dẫn tới làm tăng cƣờng khả năng chị u hạn ở thƣ̣c vật .
Phát hiện này đã mở ra một hƣớng nghiên cứu mới cho lĩnh vực chọn giống chuyển gen ở
thƣ̣c vật, đó là chỉ chuyển một hay vài gen điều khiển, thay vì vài trăm gen chƣ́c năng vào
cây để tăng cƣờng tí nh chống chị u của cây trồng [8].
Xuất phát từ nhƣ̃ng cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Tách dòng và thiết kế
vector chuyển gen mang gen mã hóa nhân tố phiên

mã GmDREB3 điều khiển tí nh

chống chị u của cây đậu tƣơng [Glycine Max (L.) Merrill]”.
II. Mục tiêu nghiên cứu
- Phân lập đƣợc cDNA của gen DREB3 tƣ̀ cây đậu tƣơng.
- Thiết kế đƣợc vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::GmDREB3.

- Đánh giá hoạt động của cấu trúc rd29A::GmDREB3 trên cây thuốc lá chuyển gen.
- Kiểm tra khả năng hoạt động của promoter rd29A trên cây đậu tƣơng chuyển gen.
III. Nội dung nghiên cƣ́u
- Tách dịng, xác định và phân tích trình tự cDNA của gen DREB3.
- Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc rd29A::GmDREB3.
- Tạo cây thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc rd29A::GmDREB3 và đánh giá khả
năng chịu hạn của cây thuốc lá chuyển gen tạo đƣợc.
- Tạo cây đậu tƣơng chuyển gen mang cấu trúc pBI::rd29A::gus.

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.TỔNG QUAN VỀ CÂY ĐẬU TƢƠNG
1.1.1. Nguồn gốc phân loại cây đậu tƣơng
Đậu tƣơng là một trong những lồi cây trờng đƣợc biết đến từ rất sớm. Các bằng
chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều chỉ ra rằng đậu tƣơng có nguyên sản ở châu Á
và có ng̀n gốc từ Trung Quốc. Đậu tƣơng đƣợc thuần hóa và trờng làm cây thực phẩm ở
Trung Quốc vào khoảng thế kỉ 17 trƣớc công nguyên. Sau đó, nó đƣợc truyền bá sang
Nhật Bản vào khoảng thế kỷ thứ 8, du nhập vào nhiều nƣớc châu Á khác nhƣ Indonesia,
Philippin, Thái Lan, Ấn Độ, Việt Nam,… vài thế kỷ sau đó. Đậu tƣơng đƣợc trờng ở châu
Âu vào thế kỷ 17 và ở Hoa Kỳ thế kỷ 18. Và ngày nay, Hoa Kỳ là quốc gia sản xuất đậu
tƣơng hàng đầu thế giới, chiếm 50% sản lƣợng trên toàn thế giới, tiếp theo là các nƣớc
Trung Quốc, Ấn Độ…[41]
Cây đậu tƣơng thuộc bộ Phaseoleae, họ Đậu Fabaceae, họ phụ cánh bƣớm
Papilionoideae, chi Glycine. Đậu tƣơng có tên khoa học là Glycine Max (L) Merr. Có

nhiều hệ thống phân loại khác nhau, trong đó hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm
hình thái, sự phân bố địa lý và số lƣợng nhiễm sắc thể do Hymowit và Newell (1984) xây
dựng đƣợc công nhận rộng rãi. Theo cách phân loại này thì ngồi chi Glycine cịn có chi
phụ Soja. Chi Glycine đƣợc chia thành 7 lồi hoang dại lâu năm, chi Soja gờm 2 lồi
trong đó có lồi đậu tƣơng trờng Glycine Max (L) Merr [3].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây đậu tƣơng
Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merril) là cây hai lá mầm, thân thảo. Thân cây có
nhiều lơng nhỏ, khi cịn non thân có màu xanh hoặc tím, khi về già chuyển màu nâu nhạt.
Màu sắc của thân cây cho ta biết màu của hoa sau này. Nếu thân có màu xanh, hoa sẽ có
màu trắng, nếu thân có màu tím thì sau hoa sẽ có màu tím đỏ. Chiều cao của thân từ 0,3 –
1m tùy theo giống. Khác với những cây trồng khác thân cây đậu tƣơng phát triển mạnh
nhất lại chính vào lúc cây ra hoa rộ nhất. Đây là lúc mà giai đoạn sinh trƣởng sinh dƣỡng

3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




và sinh trƣởng sinh thực cạnh tranh nhau dẫn đến khủng hoảng dinh dƣỡng. Vì vậy, trờng trọt
cần chú ý cung cấp đầy đủ dinh dƣỡng cho cây trƣớc khi chúng bƣớc vào giai đoạn này [3].
Cây đậu tƣơng có ba loại lá: lá mầm, lá đơn, lá kép. Mỗi lá kép thƣờng có 3 lá chét.
Lá kép mọc so le, trên phiến lá có nhiều lơng tơ. Hình dạng của lá thay đổi theo giống,
những giống có lá dài và nhỏ chịu hạn tốt nhƣng cho năng suất thấp. Những giống lá to
thƣờng cho năng suất cao hơn nhƣng cũng chịu hạn kém hơn [3].
Hoa đậu tƣơng đƣợc phát sinh từ nách lá, đầu cành hoặc đầu thân. Hoa đậu tƣơng
mọc thành chùm, mỗi chùm thƣờng có từ 3-5 hoa. Hoa lƣỡng tính nên đậu tƣơng là cây tự
thụ phấn, tỷ lệ giao phấn rất thấp chỉ chiếm 0,5-1%. Thời gian bắt đầu ra hoa sớm hay
muộn, dài hay ngắn phụ thuộc vào từng giống đậu tƣơng. Căn cứ vào phƣơng thức ra hoa
ngƣời ta chia đậu tƣơng ra làm hai nhóm: nhóm ra hoa hữu hạn, hƣớng ra hoa từ trên

xuống dƣới và từ ngoài vào trong và nhóm ra hoa vơ hạn, hƣớng ra hoa từ dƣới lên trên
và từ trong ra ngoài [3].
Quả đậu tƣơng thẳng hoặc hơi cong, dài từ 2-7cm. Mỗi quả thƣờng có 2-3 hạt. Hạt
đậu tƣơng có hình trịn, bầu dục,… giống có hạt màu vàng có giá trị thƣơng phẩm cao.
Khối lƣợng 1000 hạt dao động trung bình từ 100-200g. Hình dạng và màu sắc của rốn hạt
đặc trƣng cho mỗi giống [3].
Bộ rễ đậu tƣơng gồm rễ chính và rễ phụ. Trên rễ có rất nhiều nốt sần, đó là kết quả
của sự cộng sinh giữa vi khuẩn Rhizobium japonicum với rễ. Nốt sần có thể dài 1 cm,
đƣờng kính 5-6 mm, khi mới hình thành nó có màu trắng sữa, khi phát triển tốt nhất nốt
sần có màu hờng. Nốt sần tập trung nhiều ở tầng đất có độ sâu từ 0-20cm, có vai trị quan
trọng trong việc cố định đạm từ nitơ không khí, với lƣợng đạm cung cấp cho cây khoảng
30-60kg/ha [3].
Dựa vào thời gian sinh trƣởng, đậu tƣơng đƣợc chia thành các loại: chín rất sớm:
thu hoạch sau 80-90 ngày, chín sớm thu hoạch sau 90-100 ngày, chín trung bình thu
hoạch sau 100-110 ngày, chín muộn trung bình cho thu hoạch sau 110-120 ngày, chín
muộn cho thu hoạch sau 130-140 ngày, chín rất muộn cho thu hoạch sau 140-150 ngày.

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Thời gian sinh trƣởng của mỗi giống đƣợc đánh giá theo từng vùng và vụ trồng nhất định do
thời gian sinh trƣởng của nó chịu ảnh hƣởng nhiều bởi thời gian chiếu sáng và nhiệt độ [3].
1.1.3. Giá trị kinh tế của cây đậu tƣơng
Đậu tƣơng là cây trồng ngắn ngày có giá trị kinh tế cao, sản phẩm của nó đƣợc
dùng làm thực phẩm cho con ngƣời, thức ăn cho gia súc, nguyên liệu cho công nghiệp,
làm hàng xuất khẩu và là lồi cây cải tạo đất trờng rất tốt.
Giá trị về mặt thực phẩm: hàm lƣợng protein cao cũng nhƣ nhiều hợp chất có giá

trị có trong hạt đậu khiến nó trở thành một trong những loại thực phẩm quan trọng nhất
trên thế giới. Hàm lƣợng protein trong đậu tƣơng cao hơn trong cá, thịt và cao gấp 2 lần
các loại đậu đỗ khác, protein trong hạt đậu chiếm khoảng 35-50% (phụ thuộc vào giống
và điều kiện chăm sóc), dễ tiêu hóa hơn thịt và khơng có thành phần tạo cholesterol. Đậu
tƣơng còn đƣợc xem là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng, lipid đậu tƣơng chứa thành
phần các acid béo không no cao, tổng số chất béo chiếm khoảng 18%. Ngồi ra trong hạt
đậu cịn chứa sắt, canxi, phospho và các thành phần chất xơ tốt cho tiêu hóa. Vitamin
trong đậu tƣơng có nhiều nhóm B, đáng kể là vitamin B1, B2, B6, ngồi ra cịn có vitamin
E, pholic acid. Thành phần có trong đậu tƣơng đƣợc nhắc tới nhiều và giúp ích cho sức
khỏe con ngƣời gờm có phytosterol, lecithin, isoflavon và phytoestogen và những sản
phẩm ức chế phân hủy protein [3].
Giá trị về mặt nơng nghiệp: tồn bộ cây đậu tƣơng cả khi tƣơi và khơ đều có thể
dùng làm thức ăn cho gia súc, sản phẩm phụ cơng nghiệp nhƣ khơ dầu có thành phần dinh
dƣỡng khá cao: N 6,2%; P2O5 0,7%; K2O 2,4% là nguồn thức ăn rất tốt cho gia súc. Một
kilogram hạt đậu tƣơng tƣơng đƣơng với 1,38 đơn vị thức ăn chăn ni. Đậu tƣơng cịn
có vai trị quan trọng trong cải tạo đất trồng. Một hecta đậu tƣơng nếu sinh trƣởng và phát
triển tốt sẽ để lại trong đất 30-60kg N. Thân, lá với hàm lƣợng đạm cao có thể dùng để
bón cho đất thay cho phân hữu cơ. Việc luân canh đậu tƣơng với cây trồng khác có thể
xem là biện pháp cải tạo đất trờng hữu hiệu [3].

5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.1.4. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và ở Việt Nam
Với những giá trị kinh tế to lớn mà cây đậu tƣơng mang lại, nó đƣợc xem là một
trong những loại cây trồng quan trọng bậc nhất trên thế giới, chỉ đứng sau lúa mì, lúa
nƣớc và ngơ.

Do có khả năng thích nghi với nhiều điều kiện khí hậu khác nhau nên đậu tƣơng
đƣợc trồng rộng rãi khắp năm châu lục , tập trung nhiều nhất ở châu Mỹ tiếp đến là châu
Á. Diện tích gieo trồng cũng nhƣ sản lƣợng đậu tƣơng liên tục tăng trong những năm qua.
Bình qn hàng năm trên thế giới có khoảng 91 triệu ha đậu tƣơng đƣợc gieo trồng với
năng suất bình quân khá cao 22-23 tấn/ha. Mỹ là nƣớc có diện tích gieo trờng cũng nhƣ
sản lƣợng đậu tƣơng lớn nhất thế giới, tiếp theo là Brazil, Achentina, Trung Quốc [41].
Ở Việt Nam, đậu tƣơng đƣợc gieo trồng từ rất sớm, nó đƣợc trờng trƣớc cây đậu
xanh và đậu đen. Tuy nhiên với các phƣơng pháp canh tác truyền thống, bộ giống năng
suất thấp, sản xuất nhỏ lẻ, giá thành cao, lãi suất thấp, giá thành đậu tƣơng trong nƣớc
khơng có khả năng cạnh tranh với đậu tƣơng nhập khẩu là nguyên nhân khiến cho nông
dân không mặn mà với cây đậu tƣơng . Vì vậy, diện tích và sản lƣợng đậu tƣơng của nƣớc
ta phát triển chậm [43].
Bảng 1.1. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam từ năm 2003 đến 2010 [42]
Năm
Chỉ tiêu

2003

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

Diện tích (1000 ha)

165,6 183,8 204,1 185,6 187,4 192,1 146,2 197,8

Năng suất (tạ/ha)

13,3

Sản lƣợng (1000 tấn)

219,7 245,9 292,7 258,1 275,2 267,6 213,6 296,9

13,3

14,3

13,9

14,7

14,0

14,6

15,0

(Nguồn: Tổng cục thống kê, 2011)
Về diện tích , đậu tƣơng đƣợc gieo trồng trên diện tí ch chỉ chiếm

1 tỉ lệ rất thấp

khoảng 1,5-1,6 %, xét về tốc độ thì diện tích gieo trồng vẫn tăng qua các năm. Năm 1980,
diện tích trờng đậu tƣơng là 48,8 nghìn ha, nhƣ vậy tính đến năm 2010, diện tích đã tăng

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




lên gấp 4,05 lần. Về năng suất: năng suất bình quân của đậu tƣơng ở nƣớc ta là rất thấp,
chỉ bằng 50% - 70% năng suất đậu tƣơng của thế giới [42].
Với sản lƣợng đậu tƣơng chƣa đủ phục vụ nhu cầu , hàng năm Việt Nam vẫn phải
nhập khẩu một lƣợng lớn đậu tƣơng tƣ̀ nƣớc ngoài . Lƣợng đậu tƣơng nhập khẩu này , ¾
dành cho sản xuất thức ăn chăn ni, ¼ còn lại sản x́t sản phẩm phục vụ con ngƣời[42].
Nhƣ vậy, việc phát triển diện tí ch và sản lƣợng đậu tƣơng là

rất cần thiết và yêu

cầu đặt ra là phải chọn tạo ra giống đậu tƣơng có năng suất cao hơn thơng qua các biện
pháp truyền thống và đặc biệt là việc áp dụng công nghệ gen.
1.2. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN CÂY ĐẬU TƢƠNG
Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc do môi trƣờng gây
nên làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của cây . Những cây có khả năng duy trì
sự phát triển và cho năng suất ổn định trong điều kiện hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng
của thực vật có thể làm giảm mức độ tổn thƣơng do thiếu nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn.
Có hai loại hạn cơ bản: hạn thật (gồm hạn đất, hạn không khí, hạn toàn diện), và
hạn sinh lí. Hạn đất là do lƣợng nƣớc trong đất giảm làm hệ rễ của cây không thể lấy

nƣớc từ đất vào tế bào, dẫn đến cây có hiện tƣợng bị héo lâu dài. Hạn khơng khí thƣờng
có đặc trƣng là nhiệt độ cao (39 - 420C) và độ ẩm thấp hơn 62%. Hạn không khí thƣờng
gây nên hiện tƣợng héo tạm thời, vì rễ cây khơng hút đủ nƣớc mà q trình thốt hơi nƣớc
quá nhanh do nhiệt độ môi trƣờng cao. Hạn sinh lí khác với hai loại hạn trên ở chỗ môi
trƣờng vẫn đầy đủ nƣớc nhƣng do mất cân bằng áp suất thẩm thấu giữa môi trƣờng tế bào
và môi trƣờng bên ngồi nên rễ cây khơng có khả năng hút nƣớc [10].
Hạn hán là một trong những áp lực môi trƣờng nghiêm trọng và ảnh hƣởng đến
hầu nhƣ tất cả các chức năng thực vật. Cơ chế chống chịu hạn ở thực vật rất phức tạp liên
quan đến các đặc điểm hình thái giải phẫu, sinh lí, hố sinh, và liên quan đến các gen chịu
hạn. Hạn thƣờng làm giảm 40% năng suất đậu tƣơng và tác động đến tất cả các giai đoạn
sinh trƣởng và phát triển , tƣ̀ nảy mầm đến ra hoa , tạo hạt cũng nhƣ chất lƣợng hạt đƣợc
tạo thành [23], [29].

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Tác động của hạn đến hệ rễ : Đậu tƣơng thƣờng xuyên chịu đựng s ự thiếu nƣớc
lớn. Thƣ̣c vật nói chung , đậu tƣơng nói riêng có thể thí ch ƣ́ng bằng cách phát triển rễ
chính dài hơn, hệ thống lông rễ lớn có thể tì m nƣớc ở các lớp đất phí a dƣới ẩm hơn và hút
dinh dƣỡng nhƣ phospho. Một trong các yếu tố chí nh ảnh hƣởng đến độ sâu của hệ rễ đậu
tƣơng là tỉ lệ kéo dài rễ. Rễ cái là dạng rễ đầu của đậu tƣơng, xác định kiểu hình của rễ cái
dƣới điều kiện không stress có thể cho phép xác đị nh khả năng đâm sâu của rễ . Kaspar và
cs đã lấy ra 105 kiểu hì nh khác nhau của đậu tƣơng tƣ̀ các nhóm có tí nh trƣởng thành
khác nhau. Độ dài của rễ cái trong mỗi nhóm trƣởng thành biến thiên vào khoảng 1,3 cm
d-1. Các kết quả trên cho t hấy nhóm các giống có tỉ lệ kéo dài rễ nhanh hơn thƣờng có thể
hút nƣớc trong đất ở sâu 120 cm dƣới bề mặt . Dƣới điều kiện hạn , số lƣợng rễ mới /một
đơn vị chiều dài rễ cái tăng lên đáng kể , nhƣng không tăng chiều dài h ay đƣờng kí nh rễ

cái. Bởi vì , sƣ̣ sinh trƣởng rễ và sƣ̣ phân phối nƣớc là quyết đị nh để duy trì chƣ́c năng
trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau , đặc tí nh mềm dẻo của rễ là yếu tố qút đị nh
khả năng tìm đƣợc các ng̀ n nƣớc . Stress nƣớc hƣớng tới sƣ̣ gia tăng phân chia khối
lƣợng hợp chất sinh học đến rễ , gia tăng tỉ lệ rễ : thân. Các cây không đƣợc tƣới nƣớc cho
thấy sƣ̣ gia tăng kí ch thƣớc rễ khi so sánh với cây đƣợc tƣới nƣớc , xuất hiện tƣơng quan
đặc trƣng giƣ̃a sƣ́c chị u đƣ̣ng hạn với các đặc điểm đa dạng của rễ nhƣ khối lƣợng khơ

,

kích thƣớc tồn bộ hệ rễ , khới lƣợng và số lƣợng rễ phụ [23]. Phân tích proteomic của rễ
cây đậu tƣơng xƣ̉ lý hạn, phát hiện 35 protein đƣợc tạo ra và có nhiều thay đởi quan trọng
ở vùng rễ bị stress mất nƣớc khi so sánh với điều kiện bình thƣờng . Sớ lƣợng của mợt sớ
protein gia tăng , nhƣ là ferritin, trong khu vƣ̣c kéo dài của rễ bị xƣ̉ lý stress , có vai trị
quan trọng bảo vệ tế bào chống lại các dạng oxy hoạt hoá . Thông tin tƣ̀ proteomic đã cho
thấy mối quan hệ gần gũi giƣ̃a sinh tổng hợp phenylpropanoid và sinh trƣởng của rễ trong
điều kiện thế nƣớc thấp , nhƣ sƣ̣ gia tăng lớn của lƣợng isoflavon và các bƣ́c vách
phenolic, bao gồm lignin lần lƣợt ở vùng chóp rễ và vùng cơ bản [29].
Tác động của hạn đến khả năng cố định đạm : Nitơ liên kết trong cây họ đậu rất
nhạy cảm với đất khô . Trong điều kiện hạn , cây đậu tƣơng không chỉ bị mất cân bằng
lƣợng CO 2 tích lũy và làm giảm sự phát triển diện tích lá

, mà lƣợng nitơ liên kết cũng

8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




không còn đƣợc giƣ̃ vƣ̃ng . Đất khô làm giảm của hàm lƣợng nitơ cho quá trình

tạo ra

protein, làm giảm năng suất cây trồng và chất lƣợng hạt giống . Một vài yếu tố liên quan
đến ức chế nitơ liên kết trong điều kiện hạn bao gồm

: hạn chế lƣợng oxy đi vào ; giảm

dòng cacbon đến nốt sần ; giảm hoạt động tổ ng hợp đƣờng trong nốt sần ; đồng thời tăng
tích lũy urê và các amino acid tự do [23], [29]. Hoạt động của nitrogenase cho thấy giảm
70% trong 4 ngày đầu gây hạn , trong khi quang hợp chỉ giảm

5%, điều này cho thấy

stress nƣớc tạo một tác động đến hoạt động của nitrogenase , mà khơng phụ thuộc tỉ lệ
quang hợp. Nó cũng cho thấy sự thiếu nƣớc tác động đến hoạt động của nốt sần thông qua
sƣ̣ gia tăng khả năng chị u đƣ̣ng sƣ̣ khuếch tán oxy đến bacteriod . Khả năng chống lại sự
khuếch tán oxy đƣợc tăng cƣờng ; giảm hô hấp nitrogenase liên kết và hoạt động các
enzyme; tích lũy các chất nền hơ hấp và lipid bị oxy hóa ; điều tiết ngƣợc các gen chớng
lại oxy hóa; cùng với hoạt độ ng tập trung hô hấp của bacteriod bị làm suy yếu trong điều
kiện hạn, và sự hƣ hại oxy hóa xảy ra trong nốt sần trƣớc khi đến tác động nào tới sinh
tổng hợp đƣờng hay leghemoglobin . Đất khô thƣờng điều khiển sự tích lũy của urê trong
lá cây đậu tƣơng và đƣợc biết tới nhƣ một nhân tố hạn chế sự tạo nốt sần [29].
Tác động của hạn đến hình thái lá : Lông tơ lá thƣờng là một đặc điểm phổ biến
của thự c vật chị u hạn , cũng nhƣ mộ t vài loại câ y trồng , trong đó có đậu tƣơng . Thông
thƣờng, độ dày lông tơ lá gia tăng hệ số phản xạ tƣ̀ lá , dẫn đến giảm nhiệt độ của lá trong
điều kiện chiếu sáng cao. Độ dày lông tơ lá là đặc điểm thích ứng quan trọng cho cây đậu
tƣơng dƣới điều kiện hạn . Lông tơ dày đặc đƣợc tăng cƣờng sƣ́c sinh trƣởng , rễ dày đặc
hơn và mở rộng xuống sâu hơn . Sƣ̣ gia tăng độ dày lông tơ lá có thể làm tăng lớp ranh
giới chống lại stress lên hơn 50%, giảm nhiệt độ của lá , hạn chế thoát hơi nƣớc và tăng

cƣờng quá trì nh quang hợp . Hơn nƣ̃a, sƣ̣ gia tăng độ dày lông tơ có thể làm giảm đi đáng
kể phạm vi ảnh hƣởng bệnh khảm virus của đậu tƣơng [29].
Tác đ ộng của hạn đến đặc điểm sinh lý của t hân: Một trong nhƣ̃ng đặc điểm
sinh lý liên quan đến thân có thể tác động đến khả năng chị u hạn là

sƣ̣ suy giảm lƣợng

nƣớc sƣ̉ dụng trong toàn bộ cơ thể thƣ̣c vật khi đất bị thiếu nƣớc . Khi sƣ̣ mất nƣớc ở đất
gia tăng, thƣ̣c vật phải chịu đựng một thời kỳ chuyển tiếp từ trạng thái bão hòa nƣớc , khi

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




mà lƣợng nƣớc toàn bộ cơ thể thực vật sử dụng không phụ thuộc vào lƣợng nƣớc trong
đất; sang trạng thái thƣ́ hai khi mà nƣớc sƣ̉ dụng liên quan tr ực tiếp tới lƣợng nƣớc dùng
đƣợc trong đất . Việc chuyển trạng thái này đƣợc kết hợp với sƣ̣ giảm chỉ số dẫn truyền
trung bì nh ở khí khổng, và có thể xảy ra phụ thuộc lƣợng nƣớc trong đất khác nhau, trong
nhiều loài khá c nhau. Tính dẫn truyền của khí khổng tác động quan trọng đến sự thay đổi
sƣ̣ trao đổi khí của lá và thoát hơi nƣớc . Các tác động của hạn đến sinh trƣởng của lá , sƣ̣
dẫn truyền của khí khổng và mối quan hệ với lƣợng n ƣớc trong cây đã đƣợc nghiên cứu
trong cây đậu tƣơng . Nó cho thấy rằng hạn làm giảm tƣơng đối tỉ lệ mở rộng của lá

, sƣ̣

dẫn truyền của khí khổng và sƣ́c căng của lá , trong khi đó nó tăng cƣờng lƣợng abscisis
acid trong lá và mạch xylem. Sƣ̣ giảm tí nh dẫn của khí khổng xảy ra đồng thời với sƣ̣ gia
tăng abscisis acid trong xylem và xảy ra trƣớc bất cƣ́ sƣ̣ thay đổi quan trọng nào về sƣ́c

căng của lá , nó chỉ ra rằng các dấu hiệu hóa học

(abscisis acid - nguồn gốc tƣ̀ rễ ) điều

khiển hoạt động khí khổng ở trạng thái mất nƣớc vƣ̀a phải [9], [29].
Tác động của hạn đến áp suất thẩm thấu : Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm
thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nƣớc của tế bào rễ cây đối với
đất. Trong điều kiện hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu đƣợc các phân
tử nƣớc hiếm hoi có trong đất nhờ vậy thực vật có thể vƣợt qua tình trạng hạn cục bộ. Khi
tế bào mất nƣớc, các chất hoà tan sẽ đƣợc tích luỹ nhằm chống lại việc giảm mất nƣớc,
tăng khả năng giữ nƣớc của nguyên sinh chất và chúng có thể thay vị trí nƣớc nơi xảy ra
các phản ứng sinh hoá, tƣơng tác với lipid hoặc protein trong màng ngăn chặn sự phá huỷ
của màng và các phức protein. Các chất hồ tan có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao
bao gồm các ion K +, proline, acid hữu cơ , các loại đƣờng . Khi bắt đầu mất nƣớc , hàm
lƣợng proline và abscisic acid tăng , tăng tổng hợp protein, nhƣng nếu hạn kéo dài sẽ xảy
ra hiện tƣợng thuỷ phân protein. Q trình thuỷ phân các hydratcacbon dự trữ cũng là
ng̀n cung cấp chất tan cho quá trình điều chỉnh áp suất thẩm thấu [23], [29].
Abscisic acid (ABA) đƣợc tạo ra dƣới stress mất nƣớc và đóng vai trị quan trọng
trong việc chống chịu đối với hạn hán. Trong trƣờng hợp có mặt ABA q trình đóng mở
lỗ khí đƣợc điều chỉnh làm hạn chế sự thoát hơi nƣớc. Hầu hết gen cảm ứng stress hạn

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




cũng đƣợc gây ra bởi tác động ABA (Shinozaki và Yamaguchi-Shinozaki năm 1997,
2000). Tuy nhiên, trong các thể đột biến Arabidopsis aba (thiếu ABA) hoặc abi (không
nhạy cảm với ABA) có một số gen khác đã đƣợc gây ra bởi hạn hán, muối và lạnh. Điều

này cho thấy một số gen lại không yêu cầu ABA cho biểu hiện của chúng dƣới các điều
kiện mặn, hạn hán và lạnh [25].
1.3. CÁC NHÓM GEN LIÊN QUAN ĐẾN TÍ NH CHỊ U HẠN
1.3.1. Các nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn
Hạn, mặn và lạnh làm giảm tì nh trạng nƣớc trong tế bào thƣ̣c vật và gây tởn
thƣơng cho cây, có thể dẫn đến chết cây . Ở mức độ phân tử , điều kiện hạ n sẽ làm cho
thƣ̣c vật gia tăng mƣ́c độ biểu hiện và tí ch lũy của các gen /protein chống chị u stress. Một
số gen đƣợc tăng hoạt động và một số khác bị giảm hoạt động trong cây bị stress hạn. Sự
điều chỉnh này xảy ra ở các mức riêng biệt, từ thời điểm phát hiện stress đến việc sản xuất
các protein hoạt tính sinh học (Shinozaki và Yamaguchi-Shinozaki, 2007). Các cơ chế
bảo vệ tham gia vào quá trình này là khá giống nhau trong giới thực vật. Do đó, nghiên
cứu sử dụng cây mơ hình, nhƣ A.thaliana và thuốc lá (Nicotiana tabacum), có thể giúp
xác định những gen có chức năng quan trọng trong cơ chế bảo vệ trong các loài thực vật
khác. Các gen mã hóaprotein tham gia vào phản ƣ́ng của thƣ̣c vật với các tác nhân stress đƣợc
phân thành hainhóm dựa vào chức năng của các sản phẩm mà chúng mã hóa
[8], [19], [25].
(1) Nhóm protein chức năng tham gia trực tiếp đáp ứng điều kiện hạn , bảo vệ các
đại phân tƣ̉ và màng (protein LEA, osmotin, protein chống đơng , chaperonin và protein
liên kết mRNA…) và duy trì nƣớc tự do qua màng (protein kênh vận chuyển nƣớc và các
kênh xuyên màng…), các enzyme xúc tác các quá trình sinh tổng hợp các chất thẩm thấu
(proline, betain và đƣờng..) và các enzyme khƣ̉ độc cho phép các hoạt động sinh lý trong
tế bào hay sƣ̣ chuyển hóa sinh học duy trì mƣ́c bì nh thƣờng

(glutathinone S-transferase,

epoxide hydrolase hòa tan, catalase, superoxide và ascorbic peroxidase…) [16], [25]. Khả
năng chống chị u với hạn hay mặn có thể đƣợc tăng cƣờng bằng cách chuyển gen mã hóa
protein LEA, protein trong tởng hợp hoặc tởng hợp betain…[25].

11

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




(2) Nhóm protein điều khiển sự biểu hiện của các gen chức năng liên quan đến tính
chịu hạn , các nhân tố phiên mã bám vào trì nh tƣ̣ DNA đặc hiệu trên vùng khởi động
(promoter) của các gen chức năng tham gia vào tính chịu hạn và hoạt hóa sự biểu hiện của
các gen này và kết quả là tăng cƣờng tính chịu hạn của thực v ật. Các nghiên cứu về gen
đã chƣ́ng minh vùng khởi động của nhiều gen chƣ́c năng chƣ́a một hoặc nhiều trì nh tƣ̣
DNA đặc hiệu là điểm bám của một nhân tố phiên mã

. Điều này chƣ́ng tỏ một nhân tố

phiên mã có thể hoạt hóa biể u hiện của nhiều gen chƣ́c năng . Các nghiên cứu biểu hiện
gen đã chƣ́ng minh nhiều nhân tố phiên mã biểu hiện mạnh trong điều kiện hạn , chƣ́ng tỏ
nhóm protein này đóng vai trò quan trọng trong cơ chế điều hòa và biểu hiện của các gen
tăng cƣờng tí nh kháng hạn ở thƣ̣c vật [8]. Sản phẩm gen thuộc nhóm hai bao gồm các yếu
tố phiên mã (bZIP, MYC, MYB và DREB… ); protein kinase (MAP kinase và CDP
kinase, protein kinase thụ quan, protein kinase ribosome và protein kinase liên quan phiên
mã…); proteinase (photphoeterase và phospholipase C…) [25], [30].
1.3.2. Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen liên quan đến tính chịu hạn
Quá trình từ DNA đến protein trải qua quá

trình rất quan trọng là phiên mã. Các

nhân tố phiên mã bám và trì nh tƣ̣ DNA đặc hiệu trên vùng khởi động của các gen đí ch và
điều hòa biểu hiện của các gen này.
Nhóm gen mã hóa các nhân tố phiên mã chiếm khoảng

8-10% trong hệ gen mỡi

lồi và đó ng vai trò quan trọng trong mọi hoạt đợng sống nhƣ quá trì nh sinh trƣởng phát
triển và chống chị u với bất lợi môi trƣờng. Ở đậu tƣơng, hơn 2000 yếu tố phiên mã tƣ̀ cá c
mô và cơ quan chí nh đã đƣợ c xác đị nh khoảng trên 180 yếu tố phiên mã ở rễ liên quan
tính chịu hạn [29]; hệ gen của Arabidopsis có khoảng 5,9% mã hóa cho trên 1500 ́u tớ
phiên mã [10], [34].
Các yếu tố phiên mã liên quan đến phản ứng lại stress của thực vật đƣợc chia thành
các nhóm nhƣ là: AP2/ERF, NAC, MYB, MYC, Cys2His2 và WRKY [31]. Đặc điểm đặc
trƣng của các protein điều khiển (nhân tố phiên mã ) là có hai vùng hoạt động : vùng hoạt
hóa các protein chức năng và vùng gắn với các trật tự DNA đặc hiệu

trên promoter của

gen [9]. Các nhân tố phiên mã điều khiển các gen chịu hạn phân loại dựa vào trật tự DNA

12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




đặc hiệu mà chúng liên kết. Vùng khởi động (promoter) của hầu hết các gen liên quan đến
tính chịu hạn thƣờng chứa mộ t hoặc nhiều trật tƣ̣ DNA đặc hiệu phổ biến là ABRE (yếu
tố đáp ƣ́ng ABA ) và DRE /CRT (yếu tố đáp ƣ́ng hạn /đoạn lặp C ), NAC, MYB… với
chƣ́c năng tƣơng ƣ́ng là điểm bám của các protein điều khiển quá trì nh phiên mã biểu hiện
phụ thuộc và không phụ thuộc vào ABA [8], [19].
Nhóm nhân tố phiên mã không phụ thuộc ABA
NAC: các nhân tố phiên mã họ NAC chứa trình tự đồng nhất gọi là vùng hoạt động
NAC ở đầu N . Đây là một họ gen đặc trƣng ở thƣ̣c vậ t, có vai trị quan trọng trong việc

xác định mô phân sinh đỉnh chồi, biệt hóa các cơ quan rễ , hoa trong sinh trƣởng phát triển
thƣ̣c vật, phản ứng lại điều kiện bị tổn thƣơng và tác nhân gây hại tấn cơng

[9]. Hệ gen

Arabidopsis có ít nhất 100 gen họ NAC, và hệ gen lúa có 75 gen đã đƣợc phân lập nhƣng
chỉ một số ít gen trong số này đƣợc nghiên cứu chức năng [34], ở đậu tƣơng cũng có hơn
100 gen NAC đƣợc tì m thấy trong hệ gen

[30]. Phần lớn protein củ a các gen trong họ

NAC có chƣ́a một vùng liên kết DNA ở tận cùng đầu N có độ bảo thủ cao, một trì nh tƣ̣ tí n
hiệu đị nh vị nhân và một vùng tận cùng đầu C biến đổi.
Nhóm nhân tố DREB: trình tự đặc hiệu của nhóm nhân tố DREB1/CRT có trình tự
lõi là A /GCCGAC lần đầu tiên đƣợc phát hiện nằm trong vùng điều khiển gen

rd29 ở

Arabidopsis và sau này đƣợc phát hiện trên rất nhiều vùng điều khiển gen của các gen
biểu hiện trong điều kiện hạn và l ạnh khác. Các gen điều khiển quá trình phiên mã thuộc
nhóm AP 2 (APETALA2)/ethylene – responsive element-binding factor (ERF) bám vào
trình tự DRE và đƣợc đặt tên là : DREB1/CBF và DREB2 [19]. AP2/ERF là một họ lớn
bao gồm các yếu t ố phiên mã quan trọng . Các protein AP 2 của Arabidopsis đƣợc chia
thành 5 nhóm dựa vào sự giống nhau trong vùng gắn DNA của chúng : họ AP2 (14 gen),
họ RAV (liên quan tới ABI3/VP1) (6 gen), họ DREB (55 gen; nhóm A), họ ERF (65 gen,
nhóm B), và các gen khác (4 gen), một gen rất đặc biệt AL079349 [14], [15], [16], [18]. Ở
đậu tƣơng cũng có 5 nhóm gen tƣơng tự , hiện nay có hơn 380 gen AP2/ERF đƣợc phát
hiện ở hệ gen đậu tƣơng [30]. Các protein họ AP 2 chƣ́a đƣ̣ng hai vùng AP2/ERF, và các
gen trong họ này tham gia điều tiết các quá trì nh phát triển

. Họ protein RAV chứa một

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




vùng AP2/ERF và một vùng B3, cái mà khác với các chức năng sinh học và liên quan đến
các loại khác của quá trình ph iên mã . Trong thƣ̣c tế , các thành viên họ RAV liên quan
phản ứng lại ethylene , brassinosteroid, và các stress môi trƣờng và sinh học . Đối lập với
các thành viên họ AP 2 và RAV, các protein họ DREB/CBF và ERF chỉ chƣ́a mợt vùng
AP2/ERF. Hệ gen Arabidopsis mã hóa 145 protein liên quan DREB/CBF. Các gen của họ
DREB/CBF giƣ̃ vai trò quyết đị nh trong sƣ̣ chống lại stress vô sinh ở thƣ̣c vật bằng cách
nhận ra nhân tố phản ƣ́ng lại sƣ̣ mất nƣớc và lạnh

(DRE/CRT) với mô hì nh trung tâm

A/GCCGAC. Họ ERF liên quan chính đến phản ứng lại stress sinh học nhƣ khi phát sinh
bệnh bằng cách nhận ra nhân tố hoạt động

cis AGCCGCC hay gọi là hộp GCC . Nhiều

thành viên họ ERF cũng gắn với các nhân tố DRE/CRT [39].

Hình 1.1. Hệ thống nhân tố phiên mã điều khiển sƣ̣ biểu hiện các gen chƣ́c năng tham
gia phản ƣ́ng chống chị u với điều kiện bất lợi của Arabidopsis [8]
Các nhân tố phiên mã phụ thuộc ABA
Nhóm nhân tố ABRE

/ABF: trật tƣ̣ DNA đặc hiệu ABRE có trì nh tƣ̣ lõi

ACGTGGC, lần đầu tiên đƣợc phát hiện nằm trên vùng điều khiển gen Em ở lúa mỳ, gen
rab16 ở lúa. Hai nhóm protein điều khiển quá trì nh phiên mã ABRE /ABF bám vào trật tƣ̣

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên