XÁC ĐỊNH tác NHÂN VI KHUẨN gây BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN cá BỐNG kèo (pseudapocryptes elongatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY
BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO
(Pseudapocryptes elongatus)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

Cần Thơ, 2016
i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NGUYỄN THU DUNG

XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY
BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO
(Pseudapocryptes elongatus)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

Cần Thơ, 2016
ii


LỜI CẢM TẠ
Để hoàn thành các nội dung cơ bản trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố
gắng học hỏi của bản thân, tơi cịn nhận được sự giúp đỡ không nhỏ từ nhiều tổ
chức, cơ quan và cá nhân.
Trước hết tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và chân thành biết ơn tới Ban
Giám hiệu, Ban lãnh đạo Khoa Sau đại học, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, quý
thầy, cô Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập,
nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới cô PGS. TS Đặng
Thị Hoàng Oanh đã trực tiếp, hướng dẫn, tận tình dìu dắt và đóng góp ý kiến q
báu để giúp tơi hồn thành luận văn này.
Xin cảm ơn các cô và các em ở Bộ môn Bệnh học thủy sản đã nhiệt tình
giúp đỡ tơi trong q trình học tập cũng như làm đề tài tại Bộ môn. Cám ơn các
em học viên Cao học và các em sinh viên lớp Bệnh học thủy sản đã hỗ trợ tơi
trong q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin cảm ơn Lãnh đạo Sở Nông nghiệp & PTNT, Trung tâm Khuyến
nông Khuyến ngư Bạc Liêu đã tạo điều kiện cho tôi hồn thành chương trình học
tại Trường Đại học Cần Thơ.
Nhân đây, tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp
những người đã góp ý, chia sẻ chân thành, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời
gian hồn thành khóa học.
Cuối cùng tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và
bạn bè đã tạo mọi điều kiện để tơi vượt qua khó khăn, trở ngại trong suốt q
trình học tập và làm việc.

TÁC GIẢ

i


TÓM TẮT
Bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus) đã gây thiệt
hại rất lớn cho người nuôi. Qua kết quả điều tra phỏng vấn trực tiếp 90 hộ nuôi ở
Bạc Liêu cho thấy, mật độ nuôi cá bống kèo dao động từ 100 – 150 con/m2, trong
suốt thời gian nuôi hầu hết các hộ nuôi không thay nước mà chỉ cấp thêm nước,
xử lý hóa chất và vi sinh nhằm cải thiện môi trường nuôi. Cá tập trung bệnh ở
giai đoạn 02 tháng tuổi với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và
hậu môn với tỉ lệ chết cao và trên diện rộng, ảnh hưởng đến năng suất và lợi
nhuận của người nuôi.
Kết quả phân lập vi khuẩn sau 6 lần thu mẫu đã thu được 252 khuẩn lạc,
tiến hành kiểm tra một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản của vi khuẩn cho thấy vi khuẩn
thu được là vi khuẩn Gram (+), hình trịn, khơng di động, oxidase và catalase âm
tính. Sau khi tiến hành định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep và phương pháp
giải trình tự gen 16S rRNA đã xác định vi khuẩn gây bệnh là Streptococcus
dysgalactiae. Quy trình PCR sử dụng đoạn mồi STRD-DyI/dys-16S-23S-2 được
chuẩn hóa để chẩn đoán nhanh S. dysgalactiae gây bệnh xuất huyết trên cá bống
kèo.
Kết quả xác định liều lượng gây chết LD50 của vi khuẩn là 4,25 x 104
CFU/ml. Vi khuẩn S. dysgalactiae gây bệnh trên cá bống kèo nhạy cao với kháng
sinh florfenicol và doxycycline. Kết quả điều trị trong phịng thí nghiệm cho thấy
khi gây cảm nhiễm cá bống kèo bằng chủng vi khuẩn B1-6T với liều lượng vi
khuẩn 4,25 x 104 CFU/cá, sử dụng 02 loại thuốc kháng sinh florfenicol và
doxycycline ở liều lượng 20 mg thuốc/kg trọng lượng cá, sau 21 ngày theo dõi cả
hai loại kháng sinh trên (ở dạng nguyên liệu và thành phẩm) đều cho tỷ lệ điều trị
đạt cao, tỉ lệ sống của cá đạt từ 65,56 % – 71,11 %, giá trị RPS (%) đạt từ
45,27% – 61,16 %.

ii


ABSTRACT
Hemorrhagic disease has caused huge losses in the cultured mudskipper
(Pseudapocryptes elongates). Result interviewed 90 farmers in Bac Lieu
province showed that the farmers culture mudskipper density from 100-150
fish/m2, almost no change water but they add water in the pond, they use
chemical processing and microbiology for improving farming environment. Fish
concentrate disease stage 02 months old with clinical signs of hemorrhage in the
body, at the fin and anal with a high mortality rate and widespread, affecting the
productivity and profitability of farmers.
Results were obtained sampling 252 colonies after 6 times collecting
bacteria sample, examined some basic biochemical indicators of bacteria showed
that bacterial is Gram (+), cocci, non-motile, oxidase and catalase-negative. After
conducting identification of bacteria by API 20 Strep kit and method of 16S
rRNA gene sequence analysis has identified the bacteria is Streptococcus
dysgalactiae. PCR using primers STRD-DYI/dys-16S-23S-2 is standardized to
provide rapid diagnosis pathogenic S. dysgalactiae in hemorrhage mudskipper.
The results determine the LD50 in lethal doses of bacteria is 4.25 x 104
CFU/ml. S. dysgalactiae bacteria were sensitized with florfenicol and
doxycycline. The results of treatment in the laboratory showed that when the
mudskippers are causing susceptibility by strain B1-6T with dose 4.25 x 104
CFU/fish, use florfenicol and doxycycline in dose 20 mg/kg fish, after 21 days,
the result of the experiment showed that two kinds of antibiotics (materials and
products) are for reaching higher treatment rates, survival rate is from 65.56% 71.11%, the value RPS (%) was from 45.27% - 61.16%.

iii

CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam kết luận án này được hồn thành dựa trên kết quả nghiên cứu
của tơi trong khuôn khổ của đề tài ‟Nghiên cứu bệnh xuất huyết trên cá bống kèo
(Pseudapocryptes lanceolatus) nuôi thương phẩm và đề xuất giải pháp phòng,
trị” (Mã số: B2013- 16-29) do Bộ Giáo dục và Đào tạo tài trợ. Đề tài có quyền sử
dụng kết quả luận án này để phục vụ cho đề tài.

Cần Thơ, ngày tháng năm 2016
Tác giả

Nguyễn Thu Dung

iv


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm tạ ............................................................................................................... i
Tóm tắt ................................................................................................................... ii
Abstract ................................................................................................................. iii
Cam kết kết quả .................................................................................................... iv
Chƣơng I: Giới thiệu ........................................................................................... 1
1.1 Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
1.2 Phạm vi nghiên cứu ......................................................................................... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu........................................................................................ 2
1.4 Giới hạn nghiên cứu......................................................................................... 3
1.5 Ý nghĩa nghiên cứu .......................................................................................... 3
1.6 Điểm mới của luận án ...................................................................................... 3
Chƣơng II: Tổng quan tài liệu ............................................................................ 4

2.1 Phân loại cá bống kèo ...................................................................................... 4
2.2 Tình hình ni cá bống kèo trên thế giới và trong nước ................................. 4
2.2.1 Tình hình ni cá bống kèo trên thế giới ...................................................... 4
2.2.2 Tình hình ni cá bống kèo trong nước ........................................................ 5
2.3 Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo...................................................... 5
2.4 Bệnh xuất huyết ở cá........................................................................................ 6
2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý ........................................................................................... 6
2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học ................................................................................. 6
2.4.3 Đặc điểm huyết học ...................................................................................... 7
2.5 Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá ......................................... 8
2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio............................................................................... 8
2.5.2 Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas ................................................................. 10
2.5.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus................................................................. 11
2.5.4 Bệnh do vi khuẩn Flexibacter ..................................................................... 12
2.5.5 Bệnh do vi khuẩn Aeromonas..................................................................... 13
2.5.6 Bệnh do vi khuẩn Edwardsiella ................................................................. 15
2.6 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn Streptococcus trên cá nước lợ, mặn ........... 16
2.6.1 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus iniae........................................................ 17
2.6.2 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus agalactiae ............................................... 18
2.6.3 Bệnh do vi khuẩn Streptococcus dysgalactiae ........................................... 19
2.6.4 Cơ chế gây bệnh.......................................................................................... 20
2.6.5 Phương thức lây truyền bệnh trong mơi trường ni ................................. 20
2.6.6 Phương thức chẩn đốn .............................................................................. 21
2.7 Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá ... 21
v


2.8 Chẩn đoán bệnh xuất huyết ở cá .................................................................... 22
2.9 Phịng và trị bệnh xuất huyết ở cá.................................................................. 23
2.9.1 Hóa chất ...................................................................................................... 23

2.9.2 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 23
2.9.3 Vắc xin ........................................................................................................ 25
Chƣơng III: Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................ 27
3.1 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 27
3.1.1 Dụng cụ ....................................................................................................... 27
3.1.2 Hóa chất ...................................................................................................... 27
3.1.3 Môi trường .................................................................................................. 27
3.1.4 Thuốc kháng sinh ........................................................................................ 28
3.1.5 Địa điểm và thời gian thực hiện .................................................................. 28
3.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 28
3.2.1 Điều tra phỏng vấn...................................................................................... 28
3.2.2 Phương pháp thu mẫu cá............................................................................. 29
3.2.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng ........................................................... 29
3.2.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn ........................................................ 29
3.2.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ................................. 32
3.2.6 Phương pháp mô bệnh học ......................................................................... 33
3.2.7 Phương pháp huyết học .............................................................................. 33
3.2.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết ........................................ 34
3.2.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ .................................................................. 37
3.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................. 38
3.3 Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................. 41
Chƣơng IV: Kết quả và thảo luận .................................................................... 42
4.1 Khảo sát tình hình ni cá bống kèo ............................................................. 42
4.1.1 Kỹ thuật nuôi cá bống kèo .......................................................................... 42
4.1.2 Tình hình bệnh trên cá bống kèo ni thương phẩm .................................. 49
4.2 Kết quả kiểm tra ký sinh trùng trên cá bống kèo ........................................... 50
4.3 Phân lập và định danh vi khuẩn trên cá bống kèo bệnh xuất huyết .............. 51
4.3.1 Kết quả phân lập vi khuẩn .......................................................................... 51
4.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa vi khuẩn gây bệnh
trên cá bống kèo .......................................................................................... 52

4.3.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep .................................... 53
4.3.4 Kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự ..................... 53
4.4 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo................... 55
4.4.1 Xác định đặc điểm bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ................ 55
4.4.2 Đặc điểm mô bệnh học bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ......................... 58
4.4.3 Đặc điểm huyết học trên cá bống kèo bệnh ................................................ 63
vi


4.5 Phát triển quy trình chẩn đốn bệnh xuất huyết ở cá bống kèo
bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................................. 69
4.5.1 Kết quả chiết tách DNA trực tiếp từ mô thận cá ........................................ 69
4.5.2 Kết quả chiết tách DNA vi khuẩn ............................................................... 69
4.5.3 Kết quả khảo sát cặp mồi cho qui trình PCR phát hiện
Streptococcus dysgalactiae ......................................................................... 69
4.5.4 Kiểm tra tính đặc hiệu và độ nhạy của qui trình PCR
phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 70
4.5.5 Kiểm tra khả năng ứng dụng của qui trình PCR
phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae .............................................................. 71
4.6 Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo
ở qui mơ phịng thí nghiệm ........................................................................... 72
4.6.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo ....... 72
4.6.2 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ................................................................... 77
4.6.3 Kết quả thí nghiệm xác định giá trị LD50 ................................................... 80
4.6.4 Kết quả thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mơ phịng thí nghiệm .................... 82
Chƣơng 5: Kết luận và đề xuất ......................................................................... 86
5.1 Kết luận .......................................................................................................... 86
5.1.1 Kết quả điều tra ........................................................................................... 86
5.1.2 Kết quả nghiên cứu ..................................................................................... 86

5.2 Đề xuất ........................................................................................................... 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 88
1. Tài liệu tiếng Anh ............................................................................................ 88
2. Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 100
PHỤ LỤC.......................................................................................................... 106
Phụ lục A: Phiếu điều tra ao ni ...................................................................... 106
Phụ lục B: Hóa chất và phương pháp phân tích mẫu......................................... 108
Phụ lục B.1: Phương pháp xác định khả năng tan huyết của vi khuẩn.............. 108
Phụ lục B.2: Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ............. 108
Phụ lục B.3: Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu của
thuốc kháng sinh .......................................................................... 109
Phụ lục C: Số liệu nghiên cứu ........................................................................... 112
Phụ lục C.1: Kết quả điều tra ............................................................................. 112
Phụ lục C.2: Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn ......................................... 121
Phụ lục C.3: Định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep ................................... 141
Phụ lục C.4: Kết quả giải mã gen và định danh vi khuẩn.................................. 142
Phụ lục C.5: Kết quả quan sát mẫu mô cá bống kèo ......................................... 154
Phụ lục C.6: Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................... 157
vii


Phụ lục C.7: Kết quả thí nghiệm LD50 ............................................................... 158
Phụ lục C.8: Kết quả thí nghiệm điều trị ........................................................... 160

viii


DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số loài vi khuẩn Vibrio ............................. 9

Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số lồi Pseudomonas .............................. 10
Bảng 2.3 Đặc điểm sinh hóa của một số lồi Streptococcus ............................... 12
Bảng 2.4 Đặc điểm sinh hóa của một số lồi Flexibacter ................................... 13
Bảng 2.5 Đặc điểm sinh hóa của một số lồi Aeromonas ................................... 14
Bảng 2.6 Đặc điểm sinh hóa của E. tarda và E. ictaluri ..................................... 15
Bảng 3.1 Thuốc thử và cách đọc kết quả phản ứng test API 20 Strep ................ 32
Bảng 3.2 Đường kính vơ trùng của một số kháng sinh ....................................... 38
Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người ni cá bống kèo ........................................... 42
Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo ................................................................... 43
Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao ........................................................................... 45
Bảng 4.4 Mật độ thả giống .................................................................................. 46
Bảng 4.5 Tỷ lệ cá chết ......................................................................................... 50
Bảng 4.6 Cường độ và tỷ lệ nhiễm ký sinh trùng trên cá bống kèo ................... 51
Bảng 4.7 Số lượng vi khuẩn phân lập từ các cơ quan qua các đợt thu mẫu ........ 52
Bảng 4.8 Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá
bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI..... 54
Bảng 4.9 Mật độ hồng cầu ở cá bống kèo khỏe và cá bệnh xuất huyết ............... 65
Bảng 4.10 Số lượng bạch cầu trên cá bống kèo................................................... 67
Bảng 4.11 Kết quả so sánh các loại bạch cầu ở cá bống kèo .............................. 67
Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ .......................................................... 74
Bảng 4.13 Kết quả MIC của 4 dòng vi khuẩn S. dysgalactiae
trên 3 loại kháng sinh FFC, DO và AML ........................................... 77
Bảng 4.14 Tỉ lệ chết của 4 chủng vi khuẩn S. dysgalactiae
ở thí nghiệm cảm nhiễm ..................................................................... 77
Bảng 4.15 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn phân lập
từ cá bống kèo gây cảm nhiễm ........................................................... 79
Bảng 4.16 Kết quả xác định tỉ lệ gây chết của hai chủng B1-6T và B2-5G........ 81
Bảng 4.17 Tỷ lệ sống (%) của cá ở thí nghiệm điều trị ....................................... 84

ix

DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cá bống kèo ............................................................................................ 4
Hình 4.1 Tần suất cho ăn ..................................................................................... 47
Hình 4.2 Tình hình sử dụng kháng sinh trong nuôi cá bống kèo ở Bạc Liêu ...... 48
Hình 4.3 Cá bống kèo bị bệnh ............................................................................. 49
Hình 4.4 Tỷ lệ xuất hiện bệnh trong ao ni cá bống kèo thương phẩm ............ 49
Hình 4.5 Hình dạng vi khuẩn Gram (+) hình liên cầu (100X) ............................ 52
Hình 4.6 Kết quả kiểm tra tan huyết và khả năng phát triển
trong mơi trường TSB (+6,5%NaCl) ...................................................... 53
Hình 4.7 Kết quả test API 20Strep 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G ........... 53
Hình 4.8 Dấu hiệu bệnh lý bên ngồi của cá bống kèo bệnh xuất huyết............. 56
Hình 4.9 Dấu hiệu bệnh lý bên trong của cá bống kèo bệnh xuất huyết ............. 56
Hình 4.10 Mẫu thận cá bống kèo phết kính (Wright & Giemsa, 100X) ............. 58
Hình 4.11 Mơ mang cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ..................... 59
Hình 4.12 Mơ thận cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ....................... 61
Hình 4.13 Mơ gan cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (H&E, 40X) ........................ 63
Hình 4.14 Hình dạng tế bào máu ở cá bống kèo (100X) ..................................... 64
Hình 4.15 Máu cá bống kèo bị bệnh xuất huyết (100X) ..................................... 64
Hình 4.16 Các loại bạch cầu (100X) ................................................................... 66
Hình 4.17 Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện Streptococcus dysgalactiae
bằng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 .......................................... 69
Hình 4.18 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra tính đặc hiệu của qui trình .. 70
Hình 4.19 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra độ nhạy của qui trình .......... 71
Hình 4.20 Kết quả PCR 10 chủng vi khuẩn......................................................... 71
Hình 4.21 Kết quả PCR từ mẫu thận cá bống kèo bệnh xuất huyết .................... 72
Hình 4.22 Kết quả tách ròng và nhuộm gram các chủng vi khuẩn sử dụng trong
thí nghiệm kháng sinh đồ ................................................................... 73

Hình 4.23 Kết quả kháng sinh đồ với vi khuẩn S. dysgalactiae .......................... 73
Hình 4.24 Kết quả thí nghiệm cảm nhiễm ........................................................... 78
Hình 4.25 Kết quả PCR 4 chủng vi khuẩn........................................................... 80
Hình 4.26 Kết quả thí nghiệm LD50 của vi khuẩn B1-6T và B2-5G ................... 81
Hình 4.27 Dấu hiệu bệnh lý của cá trong thí nghiệm điều trị.............................. 82
Hình 4.28 Kết quả định danh chủng vi khuẩn tái phân lập
từ thí nghiệm điều trị .......................................................................... 83
Hình 4.29 Tỷ lệ sống của cá ở thí nghiệm điều trị............................................... 84

x


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long

Sở NN&PTNT

Sở Nông nghiệp và phát triển nông thôn

NCBI

National Center for Biotechnology Information

TSA

Tryptic Soy Agar

TSB

Tryptic Soy Broth

NB

Nutrient Broth

NA

Nutrient Agar

TCBS

Thiosulphate Citrate Bile Salt Agar

BHIA

Brain Heart Infusion Agar

MHA

Mueller Hinton Agar

TH-CR

Todd Hewitt – Congo Red

LD50

Lethal Dose 50

RPS

Relative Percent Survival

O/F

Oxidation – Fermentation

PCR

Polymerase Chain Reaction

dNTPs

Deoxynucleoside Triphosphates

EDTA

Ethylendiamin Tetraacetic Acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

DNA

Deoxyribonucleic Acid

GCS

Group C Streptococci

GLS

Group L Streptococci

GCSD

Group C Streptococcus dysgalactiae

MIC

Minimum Inhibitory Concentration

N

Neomycin

FFC

Florfenicol

CIP

Cirprofloxacin

GM

Gentamicin

DO

Doxycycline

CZ

Cefazolin

AMP

Ampicillin

AML

Amoxicillin
xi


SXT

Trimethoprim + sulfamethoxazole

TE

Tetracycline

NOR

Norfloxacin

ENR

Enrofloxacin

RBC

Red Blood Cell

NT

Nghiệm thức

BC

Bạch cầu

xii


Chƣơng I: GIỚI THIỆU
Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) là một loài cá bản địa với
nguồn giống tự nhiên phong phú và là nguồn thực phẩm được nhiều người ưa
chuộng. Hiện nay, cá bống kèo là lồi thủy đặc sản có giá trị kinh tế cao, được
tiêu thụ rộng rãi trong nước và có giá trị xuất khẩu. Tuy nhiên, trong những
năm gần đây, nghề nuôi cá bống kèo gặp trở ngại lớn do bệnh xuất hiện và lây
lan trên diện rộng làm ảnh hưởng đến sản lượng nuôi trồng và thu nhập của
người dân.
Cá bống kèo được nuôi tập trung ở một số tỉnh vùng Đồng Bằng Sông
Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc Liêu và Sóc Trăng, trong đó Bạc Liêu

là tỉnh có diện tích ni khá lớn, diện tích ni đạt 405 ha vào năm 2011 (Sở
Nơng nghiệp & PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2012). Tuy nhiên từ năm 2007 đến nay
cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên
thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và chết trên diện rộng. Xuất huyết
là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác nhân gây ra như virus, vi khuẩn và do môi
trường.
Tác nhân gây xuất huyết được mô tả nhiều nhất là do vi khuẩn. Điển
hình như tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi (Oreochromis spp.) ở
một số tỉnh miền Bắc Việt Nam được Phạm Hồng Quân và ctv., 2013 xác định
là do vi khuẩn Streptococcus agalactiae gây ra. Vi khuẩn này cũng gây bệnh
xuất huyết ở cá điêu hồng (Oreochromis spp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh và
Nguyễn Thanh Phương, 2012). Bệnh xuất huyết còn do tác nhân là vi khuẩn S.
iniae, theo kết quả nghiên cứu của Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng (2011)
thì tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm (Latex calcarifer) là vi khuẩn S.
iniae, vi khuẩn này còn là tác nhân gây bệnh trên cá bơn Nhật Bản
(Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999).
Ngoài ra, bệnh xuất huyết trên cá còn do vi khuẩn S. dysgalactiae, vi khuẩn
này gây hội chứng xuất huyết, bơi xoắn, mất phương hướng ở cá đối (Liza
alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer schrenckii)
(Yang và Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) và cá bớp (Rachycentron
canadum) (Abdelsalam et al., 2009).
Tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá còn được tìm thấy do nhiều lồi vi
khuẩn khác như Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Loan và ctv.,
2009), Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus gây bệnh trên cá mú giống
và cá mú thịt, (Leong tak Seng, 1994; Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn
Thị Thanh Thùy và ctv., 2009 được trích dẫn bởi Võ Văn Nha, 2012).
1


Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết ở

động vật thủy sản chỉ có hiệu quả khi tác nhân và nguyên nhân gây bệnh được
xác định chính xác. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu chính thức nào về bệnh
xuất huyết ở cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin cho các đơn vị quản lý, các
nhà chun mơn khuyến cáo người ni phịng, trị bệnh một cách hiệu quả. Vì
thế, đề tài “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống
kèo (Pseudapocryptes elongatus)” sẽ góp phần vào việc kiểm sốt dịch bệnh
ở cá bống kèo nói riêng và ở thủy sản ni trong vùng nói chung ngày càng
hiệu quả hơn.
1.1. Mục tiêu nghiên cứu
Mục tiêu trƣớc mắt: Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất
huyết trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu. Xác định đặc điểm bệnh học
của tác nhân gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phịng và trị bệnh
hiệu quả.
Mục tiêu lâu dài: Cung cấp thông tin làm cơ sở cho các giải pháp phòng
trị bệnh ở cá bống kèo hướng đến nghề nuôi cá bống kèo bền vững.
1.2 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu tập trung vào phân lập, định danh,
xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh trên cá bống kèo nuôi. Đồng thời phát
triển qui trình chẩn đốn bệnh và thử nghiệm phịng trị bệnh xuất huyết ở cá
bống kèo ở qui mơ phịng thí nghiệm.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Luận án tập trung nghiên cứu các nội dung sau:
1. Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo
nuôi thương phẩm.
1.1 Điều tra, khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo nuôi.
1.2 Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống
kèo.
2. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo.
2.1 Xác định đặc điểm bệnh học.
2.2 Xác định đặc điểm mô học.
2.3 Xác định đặc điểm huyết học.

3. Phát triển qui trình chẩn đốn bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng
phương pháp sinh học phân tử.
4. Phương pháp điều trị bệnh xuất huyết ở cá bống kèo ở qui mơ phịng
thí nghiệm.
4.1 Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của
thuốc kháng sinh lên vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.
2


4.2 Bố trí thí nghiệm điều trị bệnh ở qui mơ phịng thí nghiệm.
1.4 Giới hạn nghiên cứu
Nghiên cứu tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi
thương phẩm tại tỉnh Bạc Liêu.
1.5 Ý nghĩa nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu nhằm đáp ứng cho quá trình đa dạng vật ni thủy
sản và góp phần gia tăng sản lượng động vật thủy sản. Thông tin từ kết quả
khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo và qui trình phịng trị bệnh sẽ góp
phần hạn chế thiệt hại trong q trình ni cá bống kèo mang lại hiệu quả về
năng suất và kinh tế, tăng thu nhập cho người nuôi.
1.6. Điểm mới của luận án
Lần đầu tiên xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá bống
kèo là vi khuẩn Streptococcus dysagalactiae và các thời điểm bệnh thường
xuất hiện ở cá bống kèo nuôi trong ao.
Hồn chỉnh qui trình phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae để ứng dụng
chẩn đoán sớm, nhanh và đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo
bằng phương pháp PCR.
Đề xuất một số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo.

3

Chƣơng II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Phân loại cá bống kèo
Hiện nay cá bống kèo được gọi phổ biến là Pseudapocryptes elongatus.
Tên tiếng Việt là cá bống kèo hay cá bống kèo vẩy nhỏ. Tên tiếng Anh là
Lanceolate goby. Theo Cuveir (1816), cá bống kèo được phân loại:
Bộ: Perciformes
Họ: Gobiidae
Giống: Pseudapocryptes
Lồi: Pseudapoccryptes lanceolatus (Bloch & Schneider, 1801)
Pseudapocryptes elongatus (Cuveir, 1816)

Hình 2.1: Cá bống kèo

2.2. Tình hình ni cá bống kèo trên thế giới và trong nƣớc
2.2.1. Tình hình ni cá bống kèo trên thế giới
Cá bống kèo là loài cá phân bố rộng ở những vùng cửa sông hay trong hệ
sinh thái rừng ngập mặn và bãi bùn ở Ấn Độ, Banglades, Campuchia, Nhật
Bản, Trung Quốc, Việt Nam…(Abid et al., 2014). Đây cũng là một trong
những đối tượng được quan tâm phát triển nghề nuôi trên thế giới do cá dễ
ni và có giá trị dinh dưỡng cao, có 34 giống cá bống thuộc họ Gobiiidae
được tập trung nuôi ở các nước như Banglades, Trung Quốc, Đài Loan, Thái
Lan, Philippines và Việt Nam (Polgar và Lim, 2011).
Theo Hong và Zhang (2004) thì Trung Quốc đã sinh sản nhân tạo thành
cơng một lồi cá bống có tên khoa học là Boleophthalmus pectinirostris và đã
phát triển nuôi đối tượng này với mật độ ni từ 4,5 – 7,5 con/m2, năng suất
trung bình đạt từ 750 đến 975 kg/ha. Diện tích ni lồi cá này ở Trung Quốc
đạt khoảng 13.000 ha ở (Hong et al., 2007). Đây cũng là lồi cá bống được
ni phổ biến ở Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan (Takeshi, 2008).
Một loài cá bống khác là cá bống kèo Pseudapocryptes elongates cũng

được phát triển mạnh ở một số nước Châu Á, điển hình như Đài Loan và Việt
4


Nam, đây là lồi cá được ni ở dạng mơ hình ni thâm canh và bán thâm
canh (Dinh et al., 2007) với năng suất ni đạt bình qn 0,8 tấn/ha ở mật độ
thấp và 6,4 tấn/ha ở mật độ nuôi cao (Trương Hồng Minh và Nguyễn Thanh
Phương, 2011)
2.2.2 Tình hình nuôi cá bống kèo trong nƣớc
Cá bống kèo là một trong những đối tượng thủy sản được các tỉnh vùng
ven biển ĐBSCL quan tâm phát triển nuôi trong những năm gần đây. Cá bống
kèo (Pseudapoccryptes elongatus) là loài cá bản địa, đây là một đối tượng ni
cịn khá mới, diện tích ni đối tượng này khơng đáng kể, ở những năm đầu
2000 diện tích ni dối tượng này chỉ vài ha, tuy nhiên vào những năm 2011,
2012 diện tích ni đối tượng này đã tăng 105 ha ở Cà Mau (Sở Nông nghiệp
& PTNT tỉnh Cà Mau, 2013) và 445 ha ở tỉnh Bạc Liêu (Sở Nông nghiệp &
PTNT tỉnh Bạc Liêu, 2013), diện tích ni cá bống kèo ở tỉnh Bạc Liêu tập
trung ở 03 huyện trọng điểm đó là thành phố Bạc Liêu, huyện Hịa Bình và
huyện Đơng Hải.
Theo Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu (2013) thì cá bống
kèo được ni ở quy mơ thâm canh với diện tích ao ni từ 3.000 m2 đến
5.000 m2. Mật độ thả giống cao, trung bình thả ni 100 con/m2, thời gian
nuôi từ 4 – 6 tháng cá đạt trung bình từ 40 – 50 con/kg, năng suất ước đạt từ
10 – 15 tấn/ha, một số hộ nuôi có thể đạt năng suất 20 tấn/ha, lợi nhuận bình
qn từ 100 triệu – 150 triệu đồng/ha. Cơng trình phục vụ cho q trình ni
đối tượng này khá đơn giản, người ni ít tốn cơng chăm sóc, chủ yếu tập
trung chủ yếu ở giai đoạn cải tạo ao và xử lý nước đầu vụ ni cịn trong suốt
thời gian ni, người ni khơng có hoạt động thay nước trong ao, chỉ cung
cấp thêm nước khi cần thiết và cho cá ăn liên tục trong ngày. Chính những
hoạt động này đã góp phần làm cho mơi trường ao ni ngày càng xấu đi do

các chất cặn bã tích tụ dưới đáy ao và cũng là nguyên nhân gây ra bệnh trên cá
ảnh hưởng đến năng suất nuôi cũng như lợi nhuận của người sản xuất.
2.3. Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo
Do tốc độ phát triển của nghề nuôi cá bống kèo phát triển nhanh chóng,
cá được ni dưới hình thức cơng nghiệp – bán cơng nghiệp với mật độ nuôi
cao, lên đến 100 con/m2 (Trung tâm Khuyến nông – khuyến ngư Bạc Liêu,
2013), nhưng kỹ thuật nuôi đối tượng này vẫn chưa hoàn chỉnh, người dân
chưa được trang bị đầy đủ kiến thức về phương pháp quản lý, chăm sóc cũng
như phịng và trị bệnh về cá ni. Cá bống kèo được nuôi trong điều kiện ao
nuôi không thay nước, lượng thức ăn được cung cấp liên tục trong ngày tạo ra
một lượng thức ăn dư thừa tích tụ dưới đáy ao, nhưng trong quản lý môi
5


trường ao ni người dân ít sử dụng các loại vi sinh cải thiện điều kiện sống
của cá nuôi, kết hợp những yếu tố trên đã làm cho chất lượng môi trường nuôi
ngày càng bị ô nhiễm ảnh hưởng đến sức khỏe của cá, tạo điều kiện cho mầm
bệnh bộc phát.
Mơ hình ni cá bống kèo thương phẩm là mơ hình ni mới, diện tích
ni của mơ hình nhỏ so với tổng diện tích ni thủy sản của các tỉnh Cà Mau,
Bạc Liêu và Sóc Trăng, nên khơng có số liệu thống kê diện tích cá bị thiệt hại
và tỷ lệ thiệt hại chính thức từ các cơ quan chức năng, nhưng những năm
2007, 2008 và 2009 là năm mà nghề nuôi cá bống kèo của tỉnh Bạc Liêu và
các tỉnh lân cận như Sóc Trăng và Cà Mau gặp rất nhiều khó khăn do phát sinh
dịch bệnh, cá bị chết hàng loạt có những ao tỷ lệ chết lên đến 90%, cá biệt có
những ao tỷ lệ cá chết “trắng”, mỗi ngày người nuôi vớt từ 200 – 300 con cá
bống kèo chết trong một ao với dấu hiệu thường thấy là xuất huyết, chướng
bụng, nổ mắt và lở loét ().
2.4 Bệnh xuất huyết ở cá
2.4.1 Dấu hiệu bệnh lý

Cá bệnh xuất huyết có dấu hiệu bệnh lý như xuất huyết từng mảng đỏ
trên cơ thể, xuất huyết khắp trên da cá, tập trung nhiều ở gốc vây và đuôi, hậu
môn bị viêm hoặc xuất huyết. Hoại tử đuôi, vây, xuất hiện các vết thương trên
lưng, mắt lồi, mờ đục và phù ra. Bụng sưng to, xoang bụng chứa dịch, nội tạng
hoại tử, thận và tỳ tạng sưng to (Từ Thanh Dung và ctv., 2005).
Kết quả nghiên cứu trên cá điêu hồng bị bệnh xuất huyết cho thấy, cá
bệnh có dấu hiệu bệnh lý như bơi lờ đờ, hoạt động chậm chạp, kém linh hoạt,
bơi lội mất phương hướng, mắt lồi và đục, trên thân có những đốm xuất huyết
ở vây ngực và vây bụng, mang tái nhạt, bụng trương to, xoang bụng có chứa
dịch màu vàng, nội tạng bị xuất huyết, mềm nhũn (Đặng Thị Hoàng Oanh và
Nguyễn Thanh Phương, 2012). Kết quả tương tự khi nghiên cứu trên một số
loài cá bị bệnh xuất huyết như cá tầm (Wunging và Aihua Li, 2009), cá đối
(Qi et al., 2013) và cá rô phi (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013).
2.4.2 Đặc điểm mô bệnh học
Kết quả nghiên cứu của Trương Đình Hồi và ctv. (2012) trên cá rơ phi
(Oreochromis niloticus) bị bệnh xuất huyết cho thấy, mang cá xuất huyết, phù
nề và tăng sinh biểu mô. Mô não bị sung huyết, viêm và thối hóa ở nhu mơ
não. Mơ thận cá xuất hiện nhiều vùng bị sung huyết, tụ huyết và thối hóa,
ống thận bị hoại tử và mất cấu trúc. Mô gan cá xuất hiện nhiều tế bào đại thực
bào, đảo tụy tăng sinh, xuất hiện nhiều vùng sung huyết, tụ máu, thối hóa và
6


giảm số lượng tế bào gan. Ở mô ruột của cá bị sung huyết, xuất huyết, thối
hóa nội mạc.
Tương tự khi nghiên cứu trên cá điêu hồng (Oreochromis spp.) bị bệnh
xuất huyết cho thấy có những biến đổi về mơ học như bị xuất huyết, có chất
dịch tế bào trên da. Gan, tụy và thận sưng to có hiện tượng sung huyết, xuất
huyết (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Những biến
đổi ở mô mang cá bệnh xuất huyết như các sợi mang bị dính lại, phình to hoặc

mất cấu trúc mang cản trở hơ hấp nếu tình trạng bệnh nặng sẽ gây chết cá
(Đặng Thụy Mai Thy và Đặng Thị Hồng Oanh, 2011; Trương Đình Hồi và
ctv., 2014).
Kết quả nghiên cứu của Đặng Thụy Mai Thy và ctv. (2012) cho thấy mô
thận cá rô (Anabas testudineus) bệnh xuất huyết bị sung huyết, xuất huyết gây
hoại tử, ống thận bị xơ hóa, quản cầu thận bị biến đổi cấu trúc ảnh hưởng đến
chức năng hoạt động của thận.
Ở cá bệnh xuất huyết, khi quan sát mô gan kết quả cho thấy gan cá bị
sung huyết, xuất huyết gây hoại tử. Mô gan bị nhiễm khuẩn, sự xuất hiện của
các không bào lipid to bất thường, tế bào lympho và tế bào hồng cầu hiện diện
nhiều dẫn đến vùng mơ bị xơ hóa nhẹ nếu nặng sẽ hình thành u nang hoặc vơi
hóa cuối cùng gây hoại tử (John và Patricia, 2007).
2.4.3 Đặc điểm huyết học
Tế bào hồng cầu có dạng hình oval hay elip và nhân hình trịn ở giữa. Số
lượng hồng cầu ở cá nước mặn dao động từ 0,9 - 4 triệu tế bào hồng cầu/ml.
Số lượng tế bào hồng cầu trong cơ thể cá bị ảnh hưởng do nhiều nguyên nhân
như tập tính sống của từng lồi, cá sống ở tầng mặt sẽ có số lượng hồng cầu
thấp hơn so với các loài cá sống ở tầng giữa và tầng đáy; ở cá đực có số lượng
hồng cầu cao hơn con cái, ngoài ra số lượng hồng cầu còn phụ thuộc vào chất
lượng thức ăn và nhất là khi cơ thể cá bị nhiễm bệnh sẽ làm thay đổi đáng kể
số lượng hồng cầu trong cơ thể cá (Phạm Tân Tiến, 2010).
Bạch cầu là thành phần cơ bản của hệ thống miễn dịch, với chức năng
bảo vệ giúp cơ thể chống lại các tác nhân ảnh hưởng của các yếu tố bên trong
và bên ngoài mơi trường sống. Q trình tạo bạch cầu trong cơ thể được đáp
ứng cho việc bảo vệ cơ thể trong suốt thời kỳ cơ thể gặp tình trạng sốc hoặc
nhiễm bệnh. Bạch cầu là những tế bào máu có nhân, kích thước khác nhau tùy
thuộc vào từng loại bạch cầu. Các loại bạch cầu thường được tìm thấy gồm tế
bào lympho, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Mostafa et
al., 2000).
7

Bạch cầu đơn nhân là tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống miễn dịch
không đặc hiệu với vai trò thực bào, tiêu diệt kháng nguyên và đặc biệt là khả
năng trình diện kháng nguyên và để thực hiện bước khởi đầu của quá trình đáp
ứng miễn dịch đặc hiệu. Bạch cầu trung tính có khả năng thực bào các vật có
kích thước nhỏ như vi khuẩn và có khả năng di chuyển xuyên qua các mao
mạch có chuyển động định hướng đến những nơi bị viêm nhiễm, những nơi bị
viêm có bạch cầu tập trung nhiều nhất (Phạm Tân Tiến, 2010). Sự gia tăng về
tỉ lệ và số lượng bạch cầu trung tính cho thấy hoạt động của hệ bạch huyết gia
tăng để tiêu diệt các vi sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể (Ellis, 1988).
Các tế bào lympho là những tế bào có khả năng miễn dịch. Các bạch cầu
không hạt sản xuất ra các kháng thể β-globulin và nhất là γ-globulin, đây là
kháng thể chống vi trùng rất mạnh. Tế bào lympho có thể sinh ra mọi loại
kháng thể để chống lại mọi kẻ thù (Phạm Tân Tiến, 2010).
Chức năng chính của tiểu cầu là giải phóng chất thromboplastin để gây
đơng máu, đặc biệt trong tình trạng viêm nhiễm. Tiểu cầu cịn có đặc tính kết
dính nhờ vậy mà góp phần đóng miệng các vết thương. Ngồi ra tiểu cầu cịn
tham gia vào q trình đáp ứng miễn dịch (Houston, 1990; Chinabut và ctv.,
1991).
Các chỉ tiêu huyết học ở cá bị bệnh xuất huyết có những thay đổi đáng kể
như số lượng tế bào hồng cầu giảm do bị vi khuẩn phá hủy, số lượng tế bào
bạch cầu tăng đáng kể (Martins et al., 2008), số lượng bạch cầu trung tính ở cá
bệnh tăng cao (Pathiratne và Rajapakshe, 1998) và sự hiện diện của tiểu cầu và
sự gia tăng của tế bào lympho nhằm tăng cường cơ chế phòng vệ của cá bị
nhiễm bệnh (Martins et al., 2008).
2.5. Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá
2.5.1 Bệnh do vi khuẩn Vibrio
Theo Austin (2010), Vibrio thuộc họ Vibrionaceae, là vi khuẩn Gram (-),
có dạng hình que, chuyển động nhờ tiên mao, phản ứng oxydase và catalase

dương tính, có khả năng oxy hóa và lên men trong mơi trường O/F. Kích
thước tế bào 0,3 - 0,5 x 1,4 - 2,6µm. Hầu hết Vibrio spp. phân bố trong mơi
trường nước mặn, thích hợp ở 20 - 40‰, có lồi cịn có thể phát triển ở độ
mặn 70‰, nên Vibrio luôn là mối đe dọa cho nghề ni động vật thủy sản.
Vi khuẩn Vibrio có thể phân lập bằng phương pháp vi sinh vật học trên
môi trường nuôi cấy chọn lọc TCBS, ở môi trường này, vi khuẩn Vibrio phát
triển rất nhanh, sau 15-18 giờ, ở nhiệt độ 30-35oC các khuẩn lạc của Virio đã
lớn và phân biệt rõ ràng trên môi trường nuôi cấy (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004).
8


Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của một số lồi vi khuẩn Vibrio (Inglis et al.,
1994)
Đặc điểm sinh hóa
Phát triển ở nhiệt độ 4oC
Phát triển ở nhiệt độ 37oC
Phát triển ở 0%NaCl
Phát triển ở 3%NaCl
Phát triển ở 7%NaCl
Nhạy cảm 0/129 (10µg)
Phát triển trên TCBS
Β- galactosidase
Arginine dihydrolase
Lysine decarboxylase
Orinithine decarboxylase
Phản ứng citrate
Sinh H2S
Phản ứng urease
Indole
Voges – Proskauer

Thủy phân gelatin
Axit hóa glucose
Axit hóa mannitol
Axit hóa inositol
Axit hóa sorbitol
Axit hóa sucrose
Axit hóa arabinose

1
+
+
S
Y
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+

2
+
S
+
+

+
+
-

3
+
+
S
O
+
D
-

4
+
+
+
S
Y
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-

5
+
+
S
G
+
+
+
+
+
-

6
+
+
+
R
Y
+
+
D
+
+
+
+
+
+
-

Ghi chú: 1. V. anguillarum; 2. V. ordalii; 3. V. salmonicida; 4. V.cholerae; 5. V. vulnificus;

6. V. alginolyticus. G: màu xanh; Y: màu vàng; D: có phản ứng; O: khơng biết

Cá khi bị nhiễm khuẩn Vibrio spp. thường có những dấu hiệu điển hình
như xuất huyết trên các vây và mắt lồi, mờ đục giác mạc. Cá lờ đờ biếng ăn,
mang có màu nhợt nhạt do thiếu máu nặng (Toranzo et al., 2005).
Trong họ Vibrionaceae, các loài vi khuẩn gây ra bệnh nghiêm trọng nhất
trên cá biển là V. anguillarum, V. ordalii, V. salmonicida. Vi khuẩn V.
anguillarum phân bố rộng rãi trong mơi trường, chúng gây nhiễm trùng huyết
điển hình là bệnh xuất huyết ở các loài cá nước ấm và lạnh có kinh tế quan
trọng, bao gồm cá hồi Thái Bình Dương và Đại Tây Dương (Oncorhynchus
spp. và Salmo salar), cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss), cá bơn
(Scophthalmus maximus), cá chẽm (Dicentrarchus labrax), cá tráp (Sparus
aurata), cá vược (Morone saxatilis), cá tuyết (Gadus morhua), cá chình Nhật
Bản và Châu Âu (Anguilla japonica và Anguilla anguilla), và cá Ayu
(Plecoglossus altivelis) (Toranzo và Barja, 1993; Actis et al., 1999). Vibrio đã
gây thiệt hại trên mơ hình ni tơm cơng nghiệp ở Philippin, Ấn Độ và
Indonesia (Austin, 2010).
9


2.5.2. Bệnh do vi khuẩn Pseudomonas
Vi khuẩn Pseudomonas thuộc họ Pseudomonadeceae, Gram (-), có dạng
hình que, khơng sinh bào tử, kích thước tế bào khoảng 0,5 – 1,0 x 1,5 – 5,0
µm, chuyển động nhờ tiên mao. Pseudomonas phát triển trong mơi trường đơn
giản và hiếu khí. Đa số lồi Pseudomonas có phản ứng oxy hóa, một số ít
khơng có phản ứng oxy hóa và khơng lên men trong mơi trường O/F. Giới hạn
nhiệt độ phát triển rộng từ 4 – 43oC. Chúng phân bố rộng khắp trong môi
trường, đất và nước, chúng có thể gây bệnh cho người, động vật và thực vật.
Pseudomonas thường gây bệnh xuất huyết trên cá, nhưng gây bệnh chủ yếu ở
cá nước ngọt. Tác nhân gây bệnh ở cá gồm một số loài: P. fluorescens, P.

chlororaphis, P. anguilliseptica, P. dermoalba, P. putida. (Inglis et al., 1994).
Bảng 2.2 Đặc điểm sinh hóa của một số loài Pseudomonas (Buller, 2004)
Chỉ tiêu
Gram
Di động
Phát triển ở 37oC
Oxidase
Catalase
Lysine decarboxylase
Arginine dihydrolase
Indole
Voges - Proskauer
Thủy phân aesculin
Thủy phân gelatin
O/F
Arabinose
Glucose
Inositol
Lactose
Mannitol
Sorbitol
Sucrose
Trehalose

P.
anguilliseptica
+
+
+
+

+

P.
chlororaphis
+
+
+
v
+
v
+
O
+
+
+
+
+

P.
fluorescens
+
+
+
+
+
O
+
+
v
+

v
v
v

P.
putida
+
+
+
+
O
+
+
+
+
-

Ghi chú: (+) phản ứng dương; (-) phản ứng âm.v: phản ứng xảy ra chậm.

Trong số các loài Pseudomonas được phát hiện từ cá bệnh gồm: P.
chlororaphis, P. anguilliseptica, P. fluorescens, P. putida, và P.
plecoglossicida, trong đó vi khuẩn P. anguilliseptica được coi là tác nhân gây
bệnh nguy hiểm nhất cho cá nuôi (Toranzo và Barja, 1993; Austin và Austin,
1999). P. anguilliseptica gây tỉ lệ chết cao trong các ao nuôi lươn ở Nhật Bản
(Wakabayashi và Egusa, 1972). Sau đó là những trại lươn ở Châu Âu, Đài
Loan, Scotland và Đan Mạch (Stewart et al., 1983). Vi khuẩn này cũng được
phân lập từ các loài cá khác như cá tráp đen và cá Ayu ở Nhật Bản (Nakai et
10

al., 1985), cá hồi ở Phần Lan (Wiklund và Bylund, 1990), cá bơn và cá tráp
đen (Lo'pez - Romalde et al., 2009).
Theo Nguyễn Văn Hảo và Nguyễn Ngọc Du (2009), P. anguilliseptica
được xem là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất. Bệnh xảy ra ở nhiệt độ thấp
(dưới 16oC) vào những tháng mùa đông với biểu hiện là chướng bụng, có
những đốm xuất huyết ở da và nội quan. Ở cá mú, thân bị lở loét, xuất huyết
da, vây và đuôi, mắt lồi và đục. Bệnh nhiễm trùng máu xuất huyết do
Pseudomonas spp. gây ra và tác động lên cá ở mọi giai đoạn, tỷ lệ cá chết từ
20 – 60%.
2.5.3. Bệnh do vi khuẩn Streptococcus
Vi khuẩn Streptococcus là vi khuẩn hình cầu hoặc liên cầu, Gram (+),
khơng có khả năng di động trong môi trường lỏng, phản ứng oxidase và
catalase âm tính, khơng có khả năng lên men glucose trong cả hai điều kiện
hiếu khí và kỵ khí, mọc trên môi trường thạch máu (Barrow và Feltham,
1993). Streptococcus sinh trưởng tốt trên mơi trường Tryptic soy agar (TSA)
có thêm 0,5% Glucose, môi trường BHIA (Brain heart infusion agar), môi
trường THBA (Todd hewitt broth agar), môi trường thạch máu ngựa (Horse
blood agar). Nuôi cấy ở 20 – 30oC, sau 24 - 48 giờ hình thành khuẩn lạc nhỏ
đường kính 0,5 – 1,0 mm; màu hơi vàng, hình trịn, hơi lồi. Các tế bào vi
khuẩn Streptococcus thường ghép với nhau thành từng chuỗi dài, nên được gọi
là liên cầu khuẩn (Buller, 2004; Salvador et al., 2005).
Dấu hiệu chung khi cá bị nhiễm vi khuẩn Streptococcus là màu sắc đen
tối, bơi lội khơng bình thường, mắt cá bị phù mắt hoặc lồi mắt và đục, xuất
huyết trên thân (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Các
vết xuất huyết lan rộng thành lở loét, cá bị bệnh vận động khó khăn, khơng
định hướng, cá bệnh có hình thức bơi xoắn, thận và lá lách tăng lên về thể tích
do phù nề. Sự thương tổn nội quan là lý do gây chết cá (Bùi Quang Tề và cvt.,
2004).

11