Nghiên cứu sản xuất và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của muối chitosan chloride

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
---------------------

VÕ KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA MUỐI CHITOSAN CHLORIDE

LUẬN VĂN THẠC SỸ

KHÁNH HÒA – 2017


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
---------------------

VÕ KHÁNH LINH

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH
KHÁNG KHUẨN CỦA MUỐI CHITOSAN CHLORIDE
LUẬN VĂN THẠC SỸ
Ngành:

Công nghệ Sinh học

Mã số:

60420201

Quyết định giao đề tài:

551/QĐ-ĐHNT, ngày 21/06/2017

Quyết định thành lập Hội đồng:

800QĐ/ĐHNT

Ngày bảo vệ:
Người hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. TRANG SĨ TRUNG
Người hướng dẫn khoa học 2:
ThS. NGUYỄN CÔNG MINH
Chủ tịch Hội đồng:
PGS. TS. NGÔ ĐĂNG NGHĨA
Khoa Sau Đại học:

KHÁNH HÒA - 2017


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: Nghiên cứu sản xuất và khảo sát hoạt
tính kháng khuẩn của muối chitosan chloride” là cơng trình nghiên cứu của cá nhân
tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ cơng trình khoa học nào khác cho đến thời
điểm này.
Khánh Hòa, ngày 15 tháng 08 năm 2017
Tác giả luận văn

iii

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám hiệu cùng quý thầy
cô trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ tận tình và truyền đạt cho tôi kiến thức trong
những năm học qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Bộ KH&CN đã cung cấp kinh phí cho tơi thực hiện
một phần trong đề tài Nghị Định Thư “Nghiên cứu sản xuất các sản phẩm giá trị gia
tăng từ phế liệu tôm để ứng dụng trong Nông nghiệp” do PGS. TS. Trang Sĩ Trung
làm chủ nhiệm.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy PGS. TS Trang Sĩ Trung là
người đã định hướng và truyền đạt kinh nghiệm cho tôi, cũng chính là giáo viên hướng
dẫn tơi thực hiện đề tài này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy ThS. Nguyễn Cơng Minh, thầy TS. Nguyễn Văn
Hịa đã giúp đỡ và hướng dẫn tơi rất nhiều trong q trình tơi thực hiện đề tài nghiên
cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy cơ và cán bộ quản lý Phịng thí
nghiệm Cơng nghệ và Thiết bị cao, Phịng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Chế biến đã
tạo điều kiện thuận lợi và hỗ trợ cho tơi thực tập tại phịng thí nghiệm.
Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn trong nhóm nghiên cứu “Sản xuất sản phẩm
giá trị gia tăng từ phế liệu tôm” do PGS. TS Trang Sĩ Trung chủ trì.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến ba mẹ và bạn bè đã động viên tôi trong suốt
quá trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, ngày 15 tháng 08 năm 2017
Tác giả luận văn

iv

MỤC LỤC
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................ix
TRÍCH YẾU LUẬN VĂN .............................................................................................xi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1.

Tổng quan về chitosan và dẫn xuất của nó ........................................................ 3

1.1.1.

Cấu tạo và tính chất của chitosan ...................................................................... 3

1.1.1.1. Cấu tạo chitosan ................................................................................................. 3
1.1.1.2. Tính chất lý, hóa, sinh học của chitosan ............................................................ 6
1.1.2.

Muối chitosan .................................................................................................. 10

1.1.2.1. Giới thiệu về muối chitosan ............................................................................. 10
1.1.2.2. Phương pháp sản xuất muối chitosan .............................................................. 11
1.1.2.3. Tình hình nghiên cứu muối chitosan ............................................................... 14
1.2.

Chủng vi khuẩn G- và G+ ................................................................................. 15

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 18
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................... 18

2.2.

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 20

2.2.1.

Bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................................. 20

2.2.2.

Bố trí thí nghiệm chi tiết .................................................................................. 22

2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của kích thước chitosan, nhiệt độ, thời
gian phản ứng giữa chitosan và khí HCl đến độ tan, độ nhớt của chitosan
chloride từ chitosan có DD 70-80%, DD 80-90%, DD >90% ........................ 22
2.2.3.

Các phương pháp phân tích ............................................................................. 25
v


2.2.4.

Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ....................................... 27
3.1.

Ảnh hưởng của kích thước chitosan, thời gian và nhiệt độ phản ứng trong quy
trình tạo chitosan chloride đến độ tan và độ nhớt của chitosan chloride ........ 27

3.1.1.

Ảnh hưởng của kích thước chitosan, thời gian và nhiệt độ phản ứng đến độ tan
và độ nhớt của chitosan chloride tạo thành từ chitosan có DD 70-80% ......... 27

3.1.2.

Ảnh hưởng của kích thước chitosan, thời gian và nhiệt độ phản ứng đến độ tan
và độ nhớt của chitosan chloride tạo thành từ chitosan có DD 80-90% ......... 31

3.1.3.

Ảnh hưởng của kích thước chitosan, thời gian và nhiệt độ phản ứng đến độ tan
và độ nhớt của chitosan chloride tạo thành từ chitosan có DD > 90%............ 33

3.1.4.

So sánh độ tan và độ nhớt của chitosan chloride từ chitosan DD 70 – 80%,
DD 80 – 90% và DD >90% theo các quy trình khác nhau về kích thước
chitosan,thời gian và nhiệt độ phản ứng .......................................................... 36

3.2.

Đề xuất quy trình tạo muối và đánh giá chất lượng của chitosan chloride...... 39

3.3.

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và muối chitosan chloride đối
với hai chủng vi khuẩn Gram – (Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus),
hai chủng vi khuẩn Gram+ (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus) ........... 41

KẾT LUẬN ................................................................................................................... 51
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 52
PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 57

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Diễn giải

Cp

Centipoise

CTS

Chitosan

DD

Độ deacetyl

EMB agar

Môi trường Eosin Methylene Blue agar

LMWC

Chitosan phân tử lượng thấp (Low molecular weight chitosan)

LSB

Môi trường Lauryl Sulphate Broth

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration)

MW

Khối lượng phân tử (Molecular Weight)

NA

Môi trường Nutrient agar

NB

Môi trường Nutrient Broth

TCBS agar

Môi trường Thiosulfate Citrate Bile Salts Sucrose agar

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Các dung môi dùng để hịa tan chitosan ........................................................ 6
Bảng 1. 2. Các thơng số hóa lý của vi hạt muối chitosan .............................................. 13
Bảng 1. 3. Tỷ lệ % các thành phần của thành tế bào vi khuẩn ..................................... 15

Bảng 2.1. Chỉ tiêu chất lượng của chitosan đầu vào ..................................................... 18

Bảng 3. 1. Mối tương quan giữa độ tan và độ nhớt với các biến kích thước chitosan,
thời gian và nhiệt độ phản ứng. ..................................................................................... 27
Bảng 3. 2. Giá trị của độ tan và độ nhớt theo các biến kích thước chitosan, thời gian và
nhiệt độ phản ứng .......................................................................................................... 31
Bảng 3. 3. Giá trị của độ tan và độ nhớt theo các biến kích thước chitosan, thời gian và
nhiệt độ phản ứng .......................................................................................................... 34
Bảng 3. 4. Chỉ tiêu chất lượng của sản phẩm muối chitosan chloride .......................... 41
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của các nồng độ chitosan (%, w/v) đến tỷ lệ chết (%) của 4
chủng vi khuẩn khảo sát ................................................................................................ 42
Bảng 3. 6. Ảnh hưởng của các nồng độ chitosan chloride (%, w/v) đến tỷ lệ chết (%)
của 4 chủng vi khuẩn khảo sát ....................................................................................... 44

viii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cenllulose ........................................ 3
Hình 1.2. Hình dạng và màu sắc của chitosan ................................................................. 6

Hình 1.3. Phức hợp Ag với chitosan ............................................................................... 8
Hình 1. 4. Cấu tạo của chitosan (a), muối chitosan (b) ................................................. 11
Hình 1. 5. Cơ chế tạo muối chitosan ............................................................................. 12
Hình 1. 6. Cơ chế tạo muối chitosan chloride ............................................................... 12
Hình 1. 7. Cơ chế tạo muối methylated N-(4- N,N-dimethylaminocinnamyl) chitosan
chloride .......................................................................................................................... 14

Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng qt .................................................................. 20
Hình 2.2. Hệ thống sản xuất chitosan chloride ở trạng thái rắn .................................... 21
Hình 2. 3. Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và chitosan chloride
....................................................................................................................................... 23

Hình 3. 1. Ảnh hưởng của các điều kiện trong quy trình tạo muối chitosan chloride từ
chitosan nguyên liệu DD 70-80% đến hàm lượng Cl- (%) và pH của muối ................. 30
Hình 3. 2. Ảnh hưởng của các điều kiện trong quy trình tạo muối chitosan chloride từ
chitosan nguyên liệu DD 80-90% đến hàm lượng Cl- (%) và pH của muối ................. 33
Hình 3. 3. Ảnh hưởng của các điều kiện trong quy trình tạo muối chitosan chloride từ
chitosan nguyên liệu DD >90% đến hàm lượng Cl- (%) và pH của muối .................... 36
Hình 3. 4. Ảnh hưởng của các điều kiện tạo chitosan chloride từ 3 loại chitosan DD
70-80%, DD 80-90%, DD >90% đến độ tan của sản phẩm muối ................................. 37
Hình 3. 5. Ảnh hưởng của các điều kiện tạo chitosan chloride từ 3 loại chitosan DD
70-80%, DD 80-90%, DD >90% đến độ nhớt của sản phẩm muối .............................. 38
Hình 3. 6. Quy trình sản xuất muối chitosan chloride từ chitosan DD 70-80%, DD 8090%, DD >90 ................................................................................................................. 40
Hình 3. 7. Chitosan chloride từ chitosan DD 70-80% (a), DD 80-90% (b), DD >90%
(c) ................................................................................................................................... 41

ix


Hình 3. 8. Các ống nghiệm ni vi khuẩn trong mơi trường có chứa muối chitosan

chloride. Ống 15 tương ứng với nồng độ chitosan chloride từ 0-0.2% (w/v), ống 6 là
ống chứng chỉ có muối chitosan chloride mà khơng có vi khuẩn ................................. 45
Hình 3. 9. Kết quả kháng B.cereus của mẫu (a) dung dịch muối chitosan chloride 0%
(w/v) (mẫu đã được pha loãng 10-6 trước khi trải đĩa), (b) dung dịch muối chitosan
chloride 0,1% (w/v) (mẫu đã được pha lỗng 10-2 trước khi trải đĩa) ........................... 45
Hình 3. 10. Kết quả kháng S. aureus của mẫu (a) dung dịch muối chitosan chloride 0%
(w/v) (mẫu đã được pha loãng 10-2 trước khi trải đĩa), (b) dung dịch muối chitosan
chloride 0,1% (w/v) (mẫu đã được pha loãng 10-2 trước khi trải đĩa) ........................... 46
Hình 3. 11. Kết quả kháng E.coli của mẫu (a) dung dịch muối chitosan chloride 0%
(w/v) (mẫu đã được pha loãng 10-6 trước khi trải đĩa) (b) dung dịch muối chitosan
chloride 0,1% (w/v) ....................................................................................................... 48
Hình 3. 12. Kết quả kháng V.parahaemolyticus của mẫu (a) dung dịch muối chitosan
chloride 0% (w/v), (b) dung dịch muối chitosan chloride 0,1% (w/v) .......................... 48

x


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Việc sản xuất muối chitosan có thể tiến hành ở trạng thái lỏng (hịa tan chitosan
trong mơi trường acid sau đó sấy phun để thành muối) hoặc trạng thái rắn (cho
chitosan tiếp xúc với acid), tuy nhiên nghiên cứu sản xuất chitosan chloride ở trạng
thái rắn chưa được công bố nhiều và chất lượng của chitosan chloride sản xuất ở trạng
thái rắn phụ thuộc vào loại chitosan, kích thước chitosan, thời gian phản ứng, nhiệt độ
phản ứng… chính vì những lý do trên việc nghiên cứu quy trình sản xuất chitosan
chloride ở trạng thái rắn để tạo ra chitosan chloride có độ tan tốt và hạn chế q trình
cắt mạch chitosan là điều cần thiết.
Chitosan chloride có hoạt tính tương tự với chitosan hịa tan trong mơi trường acid
tương ứng tuy nhiên hoạt tính kháng khuẩn của chitosan chloride trên các đối tượng vi
khuẩn là khác nhau.
Mục tiêu của đề tài là tìm ra quy trình sản xuất muối chitosan chloride ở trạng thái

rắn có các thơng số độ tan tốt và độ nhớt cao. Từ đó cũng khảo sát hoạt tính kháng
khuẩn của chitosan và muối chitosan chloride đối với các 2 chủng vi khuẩn Gram ̶ là
Escherichia coli và Vibrio parahaemolyticus, 2 chủng vi khuẩn Gram + là Bacillus
cereus và Staphylococcus aureus.
Nghiên cứu này tiếp cận theo hướng sản xuất muối chitosan ở trạng thái rắn bằng
cách cho chitosan (dạng rắn) tiếp xúc trực tiếp với khí HCl, sau phản ứng sản phẩm
được rửa để loại acid thừa và thu nhận muối chitosan.
Hệ thống tạo muối chitosan chloride là một ống hình trụ có thể tích 4 lít. Trong ống
hình trụ có thiết kế các khay (S=6cm2) để chứa chitosan, khoảng cách giữa các tầng
khay là 10 cm. Hệ thống phản ứng được nối với bình chứa HCl đậm đặc và bình
NaOH 10%, bình HCl được gắn với máy bơm.
Kết quả bước đầu cho thấy muối chitosan chloride có thể được sản xuất ở trạng thái
rắn. Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến độ tan và độ nhớt của muối chitosan
chloride. Đối với từng loại chitosan có độ deacetyl khác nhau thì quy trình tạo muối
chitosan chloride cũng khác nhau. Muối chitosan chloride được tạo ra có độ tan tốt, độ
nhớt cao, màu sắc đẹp, dạng bột mịn. Chitosan chloride tạo ra từ chitosan DD 70-80%
(điều kiện phản ứng: kích thước: 120 mesh size, thời gian: 3h, nhiệt độ: 4ºC) có độ tan
95,05%, độ nhớt là 35,25 mPa.s. Chitosan chloride tạo ra từ chitosan DD 80-90%
xi


(điều kiện phản ứng: kích thước: 80 mesh size, thời gian: 5h, nhiệt độ: 4ºC) có độ tan
95%, độ nhớt là 50,77 mPa.s. Chitosan chloride tạo ra từ chitosan DD > 90% (điều
kiện phản ứng: kích thước: 80 mesh size, thời gian: 3h, nhiệt độ: 4ºC) có độ tan 99%,
độ nhớt là 61,67 mPa.s.
Các kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của muối chitosan chloride cho thấy
muối chitosan vẫn giữ hoạt tính kháng khuẩn tương tự như chitosan ban đầu. Giá trị
MIC của chitosan nguyên liệu và muối chitosan chloride đối với 2 chủng vi khuẩn
Gram+ B.cereus, S. aureus, đều là 0,2% (w/v). Giá trị MIC của chitosan nguyên liệu
và muối chitosan chloride đối với 2 chủng vi khuẩn Gram–

V.parahaemolyticus đều là 0,15% (w/v).

Từ khóa: chitosan, muối chitosan, kháng khuẩn.

xii

E.coli,


MỞ ĐẦU
Chitosan là sản phẩm deacetyl hóa của chitin, là một polymer chứa các đơn vị
là D-glucosamine và N-acetyl-Glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4glycoside (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010). Chitosan có khả năng biểu hiện hoạt tính
sinh học nhờ có ba nhóm chức năng N-acetyl, nhóm amino, nhóm hydroxyl
(Mahmoud và Seid, 2016b). Tuy nhiên chitosan chỉ hịa tan trong một số loại dung
mơi acid yếu (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010), do đó đã làm hạn chế khả năng ứng
dụng của chitosan. Để khắc phục những hạn chế trên, nhiều tác giả đã tập trung nghiên
cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nước để cải thiện khả năng ứng dụng của chitosan.
Chitosan hòa tan trong nước có thể tồn tại dưới dạng chitosan oligosaccharide
(COS) hoặc dạng muối chitosan. Chitosan hòa tan trong nước thường có ưu điểm là dễ
sử dụng và hoạt tính sinh học đặc biệt là hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa
khơng bị biến đổi nhiều so với chitosan ban đầu hơn nữa dung dịch muối chitosan có
tính chất tương tự như khi hịa tan chitosan trong dung mơi acid tương ứng, một số loai
muối chitosan đã được nghiên cứu như chitosan sulphate, chitosan chlorate, chitosan
acetate, chitosan lactate, chitosan propionate, chitosan ascosbate. Mặt khác, muối
chitosan (đặc biệt chitosan chloride) có thể tồn tại ở dạng rắn và có khả năng hịa tan
tốt trong nước vì vậy tăng khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực: nông nghiệp, dược
phẩm, mỹ phẩm, xử lý môi trường,…(Kumar, 2000)
Hiện nay các nghiên cứu về sản xuất chitosan chloride ở trạng thái rắn còn hạn chế.
Chính vì vậy đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của
muối chitosan chloride”, được thực hiện. Kết quả của đề tài sẽ dẫn liệu khoa học cho

những nghiên cứu ứng dụng của chitosan và muối chitosan.
Mục tiêu nghiên cứu
Nghiên cứu quy trình tạo muối chitosan chloride ở trạng thái rắn và khảo sát hoạt
tính kháng khuẩn trên một số chủng vi khuẩn G- và G+ của chitosan chloride.
Tính mới của đề tài
Hiện nay, ở Việt Nam các nghiên cứu về các dẫn xuất của chitosan như muối
chitosan còn rất hạn chế, đặc biệt tạo muối chitosan chloride ở trạng thái rắn chưa có
tác giả nào công bố. Với những dữ liệu ban đầu về quy trình sản xuất muối chitosan
1


chloride sẽ góp phần mở rộng những nghiên cứu về dẫn xuất của chitosan cũng như
ứng dụng của nó trong các lĩnh vực khác nhau.
Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan chloride ở trạng thái rắn từ các
loại chitosan có độ deacetyl khác nhau.

-

Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của muối chitosan chloride đối với các chủng
vi khuẩn Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus (Gram ̶ ), Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus (Gram +).

2


CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về chitosan và dẫn xuất của nó

1.1.1. Cấu tạo và tính chất của chitosan
1.1.1.1.

Cấu tạo chitosan

Chitosan là dẫn xuất của chitin thu nhận thông qua quá trình deacetyl chitin.
Chitosan cũng là một polymer sinh học, khơng độc hại, có nhiều tính chất hóa lý và
sinh học. Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là
nhóm –OH ở vị trí C2 của mỗi đơn vị D-glucose của cellulose được thay bằng nhóm –
NHCOCH3 ở chitin, nhóm –NH2 ở chitosan. Chitosan được cấu tạo từ các đơn vị Dglucosamin và N-acetyl-D-glucosamin (Elson, 2011). Đơn vị cấu tạo chủ yếu trong
phân tử chitosan là D-glucosamin, liên kết với nhau bởi các liên kết β-1,4 glycoside.
Mạch phân tử chitosan vẫn tồn tại các nhóm acetyl đan xen do sự deacetyl hóa chưa
hồn tồn. So sánh cấu tạo của chitin, chitosan và cellulose được trình bày trong Hình
1.1.

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của chitin, chitosan và cenllulose (Elson, 2011)
Tên danh pháp của chitosan: poly β – (1,4) – 2 – amino – 2 – deoxi – D –
glucopyranose hoặc poly – (1,4) – D – glucosamine
Công thức phân tử: (C6H11O4N)n
Phân tử lượng: Mchitosan = (161,07)n
Độ deacetyl (DD)
3


Độ deacetyl là một thông số quan trọng của chitosan. Độ deacetyl là tỷ số giữa số
nhóm –NH2 so với tổng số nhóm –NH2 và nhóm –NHCOCH3 trong phân tử chitin hoặc
chitosan. Tỷ lệ này ảnh hưởng đến khả năng hịa tan của chitin, chitosan và các tính

chất của dung dịch chitosan. Ngồi ra, độ deacetyl cịn là thơng số cơ bản để phân biệt
chitin và chitosan. Nếu độ deacetyl nhỏ hơn 50% thì gọi là chitin, cịn lớn hơn 50% thì
là chitosan. Độ deacetyl của chitosan nằm trong khoảng 56% đến 99%, trung bình là
80%, tùy thuộc vào từng loại giáp xác và phương pháp sản xuất (No và Meyers, 1997).
Độ deacetyl có thể được xác định bằng nhiều kỹ thuật khác nhau như: phân tích
nguyên tố, chuẩn độ điện thế tuyến tính, chuẩn độ thế năng, chuẩn độ Hydro bromua
(HBr), kiểm ninhydrin, quang phổ hồng ngoại (IR), phổ UV, phương pháp sắc kí lỏng
và rắn…(Elson, 2011, Renata và cộng sự, 2012), nhưng phương pháp thường dùng
phương pháp quang phổ IR, vì ưu điểm tương đối nhanh và dễ thực hiện, khơng địi
hỏi độ tinh khiết của mẫu thử nghiệm và sự hịa tan của mẫu trong dung mơi. Bên cạnh
đó, phương pháp IR sử dụng đường chuẩn để tính tốn nên loại dụng cụ, điều kiện
chuẩn bị mẫu, người thực hiện có thể làm thay đổi đường chuẩn và việc phân tích mẫu
(Lê Nghiêm Anh Tuấn, 2012), do đó dẫn đến sự thay đổi giá trị độ deacetyl, một trong
các cơng thức đã được hình thành bởi các nhà nghiên cứu:
DD = 100 – [(A1655/A3450) x 100/1,33] (Julian và George, 1985)
DD = 100 – [(A1655/A3450) x 115) (Alasdair và cộng sự, 1992)
DD = 97,67 – [26,486 x (A1655/A3450)] (Shobhan và Lawrence, 1997)
DD = 118,883 – [40,1647 x (A1655/A3450)] (Sandeep, 2001)
Trong đó: A1655 là cường độ hấp phụ tại đỉnh 1655
A3450 là cường độ hấp phụ tại đỉnh 3450
Khối lượng phân tử
Phân tử lượng của chitosan (Mw) là thông số quan trọng ảnh đến tính chất của
chitosan như tính tan, khả năng tạo màng, tạo gel, hấp phụ màu, khả năng ức chế vi
sinh vật và chống oxy hóa…(Jolanta và cộng sự, 2011, Trang Sĩ Trung và cộng sự,
2010). Mw chitosan thường < 1.200.000 Dalton. Mw của chitosan phụ thuộc vào
4


nguồn chitin và phương pháp sản xuất (Li và cộng sự, 1992). Chitosan phân tử lượng
cao có khả năng tạo màng tốt. Chitosan phân tử lượng thấp thì thường có hoạt tính

sinh học cao hơn, được ứng dụng nhiều trong công nghệ thức phẩm, y học, nông
nghiệp, công nghệ sinh học. Khối lượng phân tử của chitosan có thể được xác định
bằng các phương pháp sắc kí lỏng HPLC, phương pháp tán xạ ánh sáng, phương pháp
sắc kí gel thấm qua, phương pháp đo độ nhớt …(Majeti, 2000). Trong đó, phương
pháp đọ độ nhớt là phương pháp thường được dùng để xác định phân tử lượng của
chitin, chitosan vì ưu điểm đơn giản và nhanh chóng.
Theo phương pháp này, khối lương phân tử M quan hệ với độ nhớt nội [η] theo
phương trình Mark – Houwink: [η] = KMα. Trong đó hằng số K và α phụ thuộc vào
dung mơi hòa tan và trạng thái của polymer trong dung dịch.
Độ nhớt, độ tan
Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào khối lượng phân tử, độ deacetyl, pH, nhiệt
độ (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010). Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì độ nhớt
càng cao. Chitosan có phân tử lượng cao, lớn hơn 1 triệu dalton thì thường có độ nhớt
3000 – 4000 cps, còn chitosan phân tử lượng thấp thì có độ nhớt trong khoảng 32 –
200 cps.
Chitosan chỉ có khả năng hịa tan trong các dung dịch acid yếu (acid hữu cơ như
acid acetic, acid formic, acid lactic…) hoặc acid lỗng có pH < 6 (acid vơ cơ như HCl
1%), nhưng khơng hịa tan trong các acid mạnh, đậm đặc như H2SO4, H3PO4. Khi pH
> 7,0 tính hịa tan của chitosan rất kém (Sandeep, 2001). Độ tan của chitosan khơng
những phụ thuộc vào loại dung mơi mà cịn phụ thuộc vào nồng độ của dung môi
(Bảng 1.1.). Nhờ đặc tính này mà chitosan có giá trị ứng dụng cao hơn chitin.

5


Bảng 1. 1. Các dung mơi dùng để hịa tan chitosan (Trang Sĩ Trung và cộng sự,
2010)

1.1.1.2.

Dung môi

Nồng độ thường sử dụng (%)

Acid acetic

1-2

Acid formic

1-2

Acid lactic

1-2

Acid propionic

1-2

Acid HCl

0,25-0,5

Acid citric

5-10

Acid glutamic

1-3%

Acid ascorbic

1-2%

Tính chất lý, hóa, sinh học của chitosan

Ở trạng thái tự nhiên chitosan là chất không mùi, rắn, xốp, nhẹ, có dạng vảy và
có màu trắng đục.

Hình 1.2. Hình dạng và màu sắc của chitosan
Do mỗi đơn phân của chitosan có 3 loại nhóm chức: – NH2, –NHCOCH3, – OH,
nghĩa là chùng vừa là amin, vừa là amide, vừa là alcohol, nên phản ứng hóa học có thể
xảy ra ở vị trí nhóm chức để tạo ra các dẫn xuất khác nhau của chitosan.
Các phản ứng của nhóm – NH2:
-

Phản ứng tạo dẫn xuất N – acyl hóa chitosan

Chit-NH2

+

R-CO-O-CO-R  Chit-NH-CO-R + R-COOH
6


-

Phản ứng tạo dẫn xuất N – glycochitosan

Chit-NH2 +
-

Phản ứng tạo dẫn xuất N – carbonxylmethyl chitosan

Chit-NH2 +
-

OHC-COOH  Chit-N=CH-COOH + H2O

Cl-CH2COOH  Chit-NH-CH2COOH

+

HCl

Phản ứng tạo dẫn xuất acroleylen chitosan

Các phản ứng của nhóm –NHCOCH3:
-

Phản ứng tạo dẫn xuất O, N – carboxylmethyl chitosan

-

Phản ứng cắt đứt liên kết β – (1, 4) glycoside

Các phản ứng của nhóm – OH:

-

Phản ứng tạo dẫn xuất O – acyl chitosan

-

Phản ứng tạo dẫn xuất O – tosyl chitosan

Khả năng tạo phức với các ion kim loại của chitosan
Trong phân tử chitosan có chứa các nhóm chức có phân tử oxy, nito cịn cặp
electron chưa sử dụng, vậy nên chúng có khả năng tạo phức với hầu hết các kim loại
nặng và các kim loại chuyển tiếp như Ni2+, Cu2+, Zn2+, Ag+,…(Khalid, 2012, Lê
Nghiêm Anh Tuấn, 2012). Bản chất của các cation là rất quan trọng trong cơ chế
tương tác tạo thành phức chất, ái lực của chitosan đối với các cation được hấp thụ trên
màng thể hiện tính chọn lọc theo thứ tự sau:
Cu2+ >> Hg2+ > Zn2+ > Cd2+ > Ni2+ > Co2+ ~ Ca2+
Hai dạng phức chất của chitosan và đồng là [Cu(-NH2)]2+, 2OH-, H2O và [Cu(NH2)2]2+, 2OH-. Dạng phức chất thứ nhất được hình thành tại giá trị pH trong khoảng
5-5,8, trong khi dạng hai được hình thành ở pH trên 5,8. Hàm lượng đồng tối đa phù
hợp là [Cu]/[-NH2]= 0.5mol/mol. Phức chất của chitosan với Fe3+ được tạo thành bằng
cách trộn bột chitosan trong 1.5 M sắt clorua (FeCl3), Chất rắn sau phản ứng được rửa
sạch, sấy khô và phân tích. Thu được một phức chất chitosan – Fe (III) có khả năng tan
trong nước, và xác định được trong cấu tạo phân tử có một Fe3+ kết hợp với hai
chitosan, ba phân tử nước và một ion Cl-, phức chất có cơng thức tổng qt là
7


[Fe(H2O)3(Glu)2Cl]Cl2. H2O, trong đó Glu đại diện cho glucosamin. Ngồi ra, chitosan
cịn có thể hình thành phức tĩnh điện trong điều kiện acid như: chất hoạt động bề mặt
và phức polyelectrolyte (Rinaudo, 2006).

Hình 1.3. Phức hợp Ag với chitosan (Khalid, 2012)
Khả năng kháng khuẩn
Chitosan có khả năng ức chế nhiều chủng vi sinh vật: vi khuẩn gram âm, vi
khuẩn gram dương và vi nấm. Khả năng ức chế vi sinh vật của chitosan phụ thuộc vào
độ deacetyl, phân tử lượng. Do sự tương tác giữa các phân tử chitosan mang điện tích
dương và màng tế bào mang điện tích âm dẫn đến biến tính màng tế bào và rị rỉ các
thành phần trong tế bào.
So với chitin, chitosan có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt hơn vì chitosan
tích điện dương ở vị trị carbon thứ 2 ở pH nhỏ hơn 6. Chitosan có độ deacetyl cao trên
85% thì có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm tốt. Chitosan có phân tử lượng trên
9000 Da thì có khả năng ức chế vi sinh vật cao. Chitosan được hòa tan trong dung môi
hữu cơ như acid acetic, acid lactic và được sử dụng để xử lý kháng khuẩn, kháng nấm.
Hong Kyoon No (2002) đã nghiên cứu ảnh hưởng của sáu loại khối lượng phân
tử khác nhau của chitosan, chitosan oligomer đến khả năng kháng khuẩn trên bảy loại
vi khuẩn gram dương và bốn loại vi khuẩn gram âm. Hoạt tính kháng khuẩn của
chitosan mạnh hơn ở vi khuẩn gram âm hơn là vi khuẩn gram dương. Chỉ số MIC của
chitosan biến động trong khoảng 0,05-0,1% tùy thuộc vào khối lượng phân tử và loại
vi khuẩn. Hong Kyoon No cũng khẳng định rằng hoạt tính kháng khuẩn của chitosan
thể hiện tốt hơn ở mơi trường pH thấp (Hong và cộng sự, 2002).
Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan và các dẫn xuất của nó đã nhận được sự quan
tâm đáng kể trong những năm gần đây. Cơ chế kháng khuẩn của chitosan có thể được
giải thích như sau: (Nguyễn Anh Dũng và cộng sự, 2014)
8


+ Chitosan là một polycationic, chúng tương tác với thành phần polyanion vách tế
bào (lipopolysaccharides và glycoprotein) của vi sinh vật, kết quả là sự rò rỉ
thành phần nội bào do thay đổi tính thấm của màng sinh chất (barrier); ngăn cản
chất dinh dưỡng đi vào tế bào; ngăn cản sự nhập bào (đặc biệt là chitosan có
khối lượng phân tử thấp LMWC ).

+ Chitosan có khả năng gắn kết gây đông tụ, kết tủa tế bào vi khuẩn (coagulation)
và dẫn đến giết chết tế bào.
Khả năng tạo màng
Chitosan có khả năng tạo màng. Tính chất cơ học của màng chitosan tương đối
tốt, màng dai, khó xé rách, độ bền tương đương với một số chất dẻo được dùng làm
các loại bao bì truyền thống. Khả năng này phụ thuộc vào phân tử lượng và độ
deacetyl. Chitosan có độ deacetyl cao tạo màng có ứng suất kéo và độ giãn dài giới
hạn cao hơn so với màng được tạo bởi chitosan có độ deacetyl thấp. Ngồi ra, tính chất
của màng chitosan phụ thuốc rất nhiều vào dung môi sử dụng hòa tan chitosan để tạo
màng, độ rắn (crystallinity) của màng chitosan cũng phụ thuộc vào dung môi sử dụng
(Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010). Khi hòa tan chitosan vào acid hữu cơ thu được
dung dịch muối của chitosan, sau đó làm khơ và xử lý nhiệt sẽ thu được màng
chitosan. Màng này sẽ tan chậm trong nước và các dung mơi hữu cơ. Màng chitosan
có thể được làm cho không tan bằng cách xử lý với formaldehyde, acyl chloride,
anhydride,…
Màng chitosan được sử dụng trong bảo quản thực phẩm như rau quả, thịt cá
nhằm hạn chế các tác nhân gây hư hỏng. Theo nghiên cứu của Nguyễn Đức Tuân và
cộng sự (2010), ứng dụng màng chitosan trong bảo quản quả bưởi Đoan Hùng, với
nồng độ chitosan là 1,5% thì có thể bảo quản quả bưởi Đoan Hùng trong vòng 90 ngày
vẫn cho chất lượng tốt (Nguyễn Đức Tuân và cộng sự, 2010). Ngồi ra cịn có rất
nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng màng chitosan có khả năng kéo dài thời gian bảo quản,
giảm sự thối hỏng và hao hụt khối lượng tự nhiên, giảm sự hô hấp và sản sinh ethylene
của quả nho, dâu tây, măng cụt, chanh,…(Nguyễn Thị Bích Thủy và cộng sự, 2008,
Sritananan và cộng sự, 2005).
Khả năng chống oxy hóa
9


Chitosan có khả năng loại bỏ các gốc tự do nhờ chứa các nhóm – OH và – NH2
vẫn cịn các electron tự do. Các nhóm này có thể tương tác với ion kim loại do sự hấp

phụ, trao đổi ion và trung hòa các gốc tự do (Zouhour và cộng sự, 2011). Chitosan
giúp nâng cao hoạt tính superoxide dismutases, hỗ trợ hoạt động của các enzyme
chống oxy hóa quan trọng trong cơ thể như enzyme catalase, glutathione
peroxidase…Từ đó cho thấy rằng chitosan có khả năng điều hịa hoạt động của các
enzyme chống oxy hóa và giảm peroxy lipid (Trung và Bao, 2015).
Khả năng chống oxy hóa của chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl, khối lượng
phân tử, độ nhớt của chitosan, nồng độ chitosan, pH và loại dẫn xuất (Tomida và cộng
sự, 2009).
Có nhiều các phương pháp dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa như:
phương pháp quang phổ, phương pháp khử gốc tự do DPPH, phương pháp xác định
tổng năng lực khử, phương pháp xác định hoạt tính bằng mơ hình phản ứng Feton,
phương pháp xác định khả năng bẫy các gốc tự do,… (Huỳnh Nguyễn Duy Bảo và
cộng sự, 2014, Rajalakshmi và cộng sự, 2013).
Khả năng phân hủy sinh học
Chitosan là một polymer sinh học, nên chúng dễ bị phân hủy bởi các vi sinh vật
trong đất và trong nước. Do đó chitosan cũng như các loại polymer khác như chitin,
cellulose và các dẫn xuất của chúng được xem là polymer thân thiện với mơi trường.
Có nhiều nghiên cứu trên thế giới chỉ ra chitosan có tính phân hủy sinh học bằng
các thử nghiệm trên nhiều tác nhân và điều kiện khác nhau (Nguyen và cộng sự, 2012,
Savitri và cộng sự, 2014, Wang, 2009). Theo Kean và Thanou (2010), tính phân hủy
sinh học của chitosan được nghiên cứu ở cả điều kiện in vitro và in vivo. Lysozyme có
khả năng làm giảm hoạt tính của chitosan như làm giảm 66% độ nhớt sau 4h, pH 5,5.
Sự phân hủy này phụ thuộc vào độ deacetyl, khi độ deacetyl tăng thì tính phân hủy
càng nhanh. Cũng như ở điều kiện in vivo, khi tiêm vào thỏ, sau đó xét nghiệm máu thì
thu được chitosan oligosaccharides với liều lượng rất thấp (Kean và Thanou, 2010).
1.1.2. Muối chitosan
1.1.2.1.

Giới thiệu về muối chitosan
10

Chitosan chỉ thể hiện hoạt tính sinh học khi được hịa tan trong mơi trường acid
lỗng (pH<6), do đó giới hạn một số ứng dụng tiềm năng của vật liệu này. Để giải
quyết vấn đề này, một số nhà nghiên cứu đã phát triển các dẫn xuất chitosan biến tính,
trong đó cải thiện khả năng hịa tan trong dung dịch với một phạm vi pH rộng. Nhiều
phương pháp biến tính để đưa các nhóm ưa nước vào chitosan, phổ biến nhất trong số
đó là gắn nhóm amin tứ cấp cacboxymethyl (Warayuth và cộng sự, 2009)và phản ứng
ghép với polyettylen glycol.
Chitosan có khả năng được tạo thành muối với cả acid vô cơ và hữu cơ như acid
clohydric, acid formic, acid glutamic, acid lactic, acid citric và acid ascorbic (Orienti
và cộng sự, 2002).
Muối chitosan là một dẫn xuất tan được trong nước của chitosan, thường có dạng
bột mịn, màu trắng hay vàng nhạt (Dang và cộng sự, 2010). Muối chitosan có tính chất
tương tự như khi hịa tan chitosan trong dung dịch acid tương ứng (Yan và cộng sự,
2007a). Do vậy muối chitosan vẫn giữ được các tính chất lý hóa, sinh học như một
chitosan bình thường.
Độ tan của muối chitosan phụ thuộc vào độ deacetyl (có liên quan đến giá trị pKa
của chitosan) và pH (Lisbeth Ilium, 1998).

Hình 1. 4. Cấu tạo của chitosan (a), muối chitosan (b) (Qing và cộng sự, 2014)
1.1.2.2.

Phương pháp sản xuất muối chitosan
11


a. Cơ chế tạo muối chitosan
Chitosan là một bazo, dễ tạo muối với các acid, gốc NH2 tại vị trí C2 của chitosan
khi tác dụng với acid sẽ hình thành liên kết tĩnh điện, biến đổi gốc NH2 tại vị trí C2

thành gốc muối, các nhóm amin trong chuỗi chitosan được proton hóa (NH3 +OCOR)
bằng các acid, các muối này khi tan trong nước thì tích điện dương. Từ đó hình thành
khả năng tan trong nước của chitosan.
Tính tan của các muối chitosan phụ thuộc vào bản chất của các anion có liên
quan, đặc biệt là tính chất điện ly của các gốc muối.

Hình 1. 5. Cơ chế tạo muối chitosan

Khi chitosan tác dụng với acid HCl loãng, gốc amin – NH2 bị proton hóa thành
gốc muối – NH3Cl.

Hình 1. 6. Cơ chế tạo muối chitosan chloride
Trong quá trình phản ứng, sẽ xảy ra hiện tượng acid HCl cắt mạch chitosan.
Nhiệt độ càng tăng, sự phá vỡ các chuỗi mạch của chitosan xảy ra càng mạnh mẽ,
12


khiến độ nhớt cũng như khối lượng phân tử của chitosan giảm dần và gia tăng về độ
tan.
Theo Anayancy, ở nhiệt độ thấp (5oC), cấu trúc của chitosan được giữ nguyên tới
90%, dẫn đến các giới hạn về khả năng phá hủy mạch chitosan. Ở nhiệt độ phòng, khi
cho chitosan liên kết với acid, độ rắn chắc của mạch chitosan thấp, dẫn đến quá trình
cắt mạch và làm giảm khối lượng phân tử (Anayancy và cộng sự, 2010).
b. Các phương pháp sản xuất muối chitosan
Phản ứng tạo muối chitosan có thể diễn ra ở trạng thái rắn hoặc trạng thái
lỏng. Ở trạng thái lỏng, chitosan thường được hòa tan trong mơi trường acid tương
ứng sau đó thực hiện các phương pháp tách nước (sấy phun, đông khô) để tạo thành
chitosan dạng bột. Theo Janusz và Zofia, 2005 có thể sản xuất muối chitosan bằng
phương pháp sấy phun sau khi pha chitosan có độ deacetyl 71%, M w = 500kDa
trong dung dịch acid ascobic (1,7% w/w) và acid acetic (0,6% w/w). Nồng độ dung

dịch chitosan là 1,7% (w/w) Glutaraldehyde hoặc triphotphate được thêm vào dung
dịch muối chitosan trước khi sấy phun để thu được sản phẩm muối chitosan có kích
thước hạt khác nhau (Bảng 1.4.) (Janusz và Zofia, 2005).

Bảng 1. 2. Các thơng số hóa lý của vi hạt muối chitosan (Janusz và Zofia, 2005)
Ðộ ẩm

Mật độ

Ðường kính

Cầu thể

(%)

(g/cm3)

(µm)

(dmin/dmax)

Chitosan acetate

10,2

1,1

3 - 16

0,8 - 0,9

Chitosan ascorbate

3,4

1,4

2-4

0,9

11,1

1,2

1-4

0,9

3,33

1,6

Mẫu

Chitosan acetate +
glutaraldehyde
Chitosan ascorbate +
triphotphate

3 – 5; 16 30

0,5

Ngoài phương pháp sấy phun, Yan Li và cộng sự (2007) cũng đã sản xuất được
muối chitosan sau khi ngâm chitosan trong ethanol 95%, hỗn hợp trên được loại
ethanol và cho tiếp xúc với acid acetic đậm đặc trong thời gian 2 h, sản phẩm sau được
13