Đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC

NGUYỄN THỊ THÙY

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ
TRÊN MƠ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG
SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU
ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA
(HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC
Khóa: QH.2015.Y

Hà Nội – 2020


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
KHOA Y DƯỢC
Người thực hiện:
NGUYỄN THỊ THÙY

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CẢI THIỆN TRÍ NHỚ
TRÊN MƠ HÌNH GÂY SA SÚT TRÍ NHỚ BẰNG
SCOPOLAMIN CỦA CAO CHIẾT GIÀU
ALCALOID TỪ CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA
(HUPERZIA SERRATA (THUNB.) TREVIS.)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
(NGÀNH DƯỢC HỌC)
Khóa: QH.2015.Y
Người hướng dẫn:

1. ThS. Đặng Kim Thu
2. ThS. Bùi Sơn Nhật

Hà Nội – 2020


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tơi xin được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới hai giảng
viên hướng dẫn là ThS. Đặng Kim Thu và Th.S Bùi Sơn Nhật - giảng viên Bộ môn
Dược lý và Dược lâm sàng, Khoa Y – Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã đưa ra
những lời khun hữu ích, ln lắng nghe, động viên và dẫn dắt tôi từng bước chân
trên con đường thực hiện đề tài.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS. TS. Bùi Thanh Tùng và các
thầy cô thuộc bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia
Hà Nội đã chia sẻ những bài học kinh nghiệm quý báu, nhiệt tình giúp đỡ và động
viên tơi.
Tơi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới DS. Nguyễn Thị Thu Hồi – Học viên
cao học khóa 22, đại học Dược Hà Nội đã cùng ở bên và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian làm đề tài.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các thầy cô của
Khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã nhiệt tình chỉ bảo, quan tâm và truyền
dạy cho tơi những kiến thức q báu trong suốt 5 năm học tập tại khoa cũng như tạo
mọi điều kiện tốt nhất cho tôi được thực hiện trọn vẹn đề tài này.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân và bạn bè đã
động viên và sát cánh bên tôi vượt qua những khó khăn trong qng thời gian cịn
ngồi trên ghế nhà trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2020
Sinh viên

Nguyễn Thị Thùy


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
A

Độ hấp thụ (Absorbance)

A

Amyloid beta

ACh

Acetylcholin

AChE

Enzym Acetylcholinesterase

ACTI

Acetylthiocholin iodid

APP

Protein tiền thân amyloid (Amyloid Precursor Protein)

DL-30

Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cân nặng

DL-60

Cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 60 mg/kg cân nặng

FDA

Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug
Administration)

HFD

Chế độ ăn giàu chất béo (High fat diet)

Hup A

Huperzin A

IC50

Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50%)

IU

Đơn vị quốc tế (International Unit)

MDA

Malondialdehyd

NMDA

Thụ thể N-methyl-D-aspartat

LD50

Liều dùng gây chết 50% số động vật thử nghiệm

OBX

Chuột mất vùng khứu giác (Olfactory bulbectomized)

SAM

Chuột tăng tốc lão hóa

SAMP

Chuột tăng tốc lão hóa nhạy cảm

SE

Sai số chuẩn (Standard errror)

UV-Vis

Quang phổ tử ngoại khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.2.1. Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa .................................... 8
Bảng 2.4.1. Thành phần của hỗn hợp phản ứng ..................................................... 28
Bảng 3.1.1. Kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym AChE in vitro của cao chiết
giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất chuẩn donepezil. .............................. 29
Bảng 3.1.2. Giá trị IC50 của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa và chất
chuẩn quercetin ..................................................................................................... 30


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.2.1. Cấu trúc hóa học của Hup A ................................................................. 8
Hình 2.1.1. Cây Thạch tùng răng cưa Huperzia serrata (Thunb.) Trevis ............... 17
Hình 2.1.2. Phương pháp chiết alcaloid bằng dung môi hữu cơ trong mơi trường kiềm
.............................................................................................................................. 18
Hình 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu ................................................................. 20
Hình 2.4.1. Phản ứng giữa các chất trong hỗn hợp phản ứng Ellman ..................... 21
Hình 2.4.2. Sơ đồ triển khai mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin in vivo .. 24
Hình 3.2.1. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến tỷ lệ
chuyển tiếp giữa các cánh ...................................................................................... 31
Hình 3.2.2. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến thời
gian tìm thấy bến đỗ ở bài tập có bến đỗ ................................................................ 32
Hình 3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa tới thời
gian lưu tại góc phần tư có bến đỗ ở bài tập khơng có bến đỗ ................................ 34
Hình 3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt
độ AChE trên thể đồng nhất não chuột .................................................................. 35
Hình 3.2.5. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm
lượng malondialdehyd (MDA) trong mô não ......................................................... 36

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
Chương 1 - TỔNG QUAN ..................................................................................... 3
1.1.

Tổng quan về bệnh ................................................................................... 3

1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ ................................................................ 3
1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh .................................................. 4
1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ ......................................................... 6
1.2.

Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa .................................................. 7

1.2.1. Đặc điểm thực vật ...................................................................................... 7
1.2.2. Phân bố ...................................................................................................... 7
1.2.3. Thành phần hóa học ................................................................................... 7
1.2.4. Tác dụng dược lý ....................................................................................... 9
1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng răng
cưa...... .................................................................................................................. 9
1.3.

Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ .................... 11

1.3.1. Các mơ hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm................. 11

1.3.2. Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo . 13
1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE .............................. 14
1.3.4. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa ........................... 15
Chương 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................... 17
2.1.

Đối tượng nghiên cứu ............................................................................. 17

2.1.1. Dược liệu nghiên cứu ............................................................................... 17
2.1.2. Mẫu nghiên cứu ....................................................................................... 17
2.2.

Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 18

2.2.1. Động vật thí nghiệm................................................................................. 18
1.2.2. Hóa chất, dung môi .................................................................................. 18


1.2.3. Thiết bị, dụng cụ ...................................................................................... 19
2.3.

Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 19

2.4.

Phương pháp nghiên cứu ....................................................................... 20

2.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE và chống oxy hóa in vitro . 20
2.4.2. Phương pháp đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid
từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin. ........... 23

2.5.

Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 28

Chương 3 – KẾT QUẢ ........................................................................................ 29
3.1.
Kết quả đánh giá tác dụng ức chế AChE và khả năng dọn gốc tự do in
vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa .................................. 29
3.1.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro ........................... 29
3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH in vitro .......................... 30
3.2.

Kết quả đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid

từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin ...... 31
3.2.1. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê
lộ Y..........................................................................................................................31
3.2.2. Kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ in vivo thơng qua thử nghiệm mê
lộ nước Morris..................................................................................................... 32
3.2.3. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hoạt độ
AChE trong não .................................................................................................. 34
3.2.4. Ảnh hưởng của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa đến hàm lượng
malondialdehyd (MDA) trong mô não ................................................................. 36
Chương 4 – BÀN LUẬN...................................................................................... 38
4.1.
Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AchE và chống oxy hóa in
vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa .................................. 38
4.1.1. Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym AChE in vitro ...................... 38
4.1.2. Về kết quả đánh giá khả năng dọn gốc tự do in vitro ................................ 39
4.2.

Về kết quả đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút
trí nhớ bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa . 40
4.2.1. Về kết quả của thử nghiệm hành vi .......................................................... 40
4.2.2. Về kết quả định lượng các marker sinh học .............................................. 42


Chương 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


MỞ ĐẦU
Xã hội ngày càng phát triển, những áp lực của cuộc sống cũng ngày càng tăng
cao. Con người bị ảnh hưởng bởi môi trường và xuất hiện những vấn đề về sức khỏe.
Ngồi những nhóm bệnh phổ biến như bệnh tim mạch và ung thư, sa sút trí nhớ cũng
là một bệnh lý mà nhiều người mắc phải.
Sa sút trí nhớ là một nhóm các rối loạn đặc trưng bởi sự suy giảm trí nhớ và
nhận thức, có ảnh hưởng đến các hoạt động sống hàng ngày và hoạt động xã hội của
người bệnh. Trên thế giới, số lượng người mắc sa sút trí nhớ ngày càng tăng cao với
khoảng 50 triệu người mắc và có gần 10 triệu ca mắc mới mỗi năm [47]. Sa sút trí
nhớ là căn bệnh có tác động rất lớn đến nền kinh tế. Chi phí dành cho chăm sóc và
điều trị cho bệnh nhân sa sút trí nhớ hàng năm trên thế giới ước tính khoảng 800 tỷ
USD (tương đương 1% GDP toàn cầu) và sẽ đạt tới 2000 tỷ USD vào năm 2030 [47].
Sa sút trí nhớ là bệnh lý phổ biến thường gặp ở người cao tuổi. Bệnh diễn biến
từ từ tăng dần, suy giảm dần khả năng nhận thức, trí tuệ, dẫn đến mất dần khả năng
sinh hoạt độc lập và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm trùng, tiết niệu.
Mặc dù sa sút trí nhớ có tác động rất lớn đến sức khỏe người cao tuổi và đang có xu
hướng ngày càng gia tăng nhưng việc điều trị lại gặp nhiều khó khăn do hiểu biết về
bệnh còn hạn chế và việc lựa chọn thuốc điều trị bị giới hạn. Những thuốc dùng điều
trị sa sút trí nhớ gồm 2 nhóm thuốc ức chế cholinesterase và thuốc đối kháng thụ thể

N-methyl-D-aspartat (NMDA). Các thuốc kể trên cho thấy tác dụng kiểm sốt triệu
chứng tốt nhưng khơng làm thay đổi diễn tiến bệnh. Ngoài ra, giá thành tương đối
cao và các tác dụng phụ không mong muốn là nhược điểm của các thuốc này. Do đó,
việc tiếp tục nghiên cứu tìm ra loại thuốc hiệu quả và an tồn hơn trong điều trị sa
sút trí nhớ và Alzheimer là rất cần thiết.
Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.) là một dược liệu đã
được dùng để điều trị bệnh sa sút trí nhớ tại Trung Quốc. Trong dược liệu, Huperzin
A (Hup A) là hợp chất alcaloid nổi bật có tác dụng cải thiện trí nhớ [50,61]. Tuy
nhiên, ở nước ta mới chỉ có một số nghiên cứu dược lý về cao chiết cồn của Thạch
tùng răng cưa trong khi chưa có nghiên cứu nào thực hiện trên đối tượng nghiên cứu
là cao chiết alcaloid. Vì vậy, nghiên cứu này được tiến hành nhằm mục đích đánh
giá tác dụng cải thiện trí nhớ của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa theo
2 mục tiêu sau:

1


1. Đánh giá được tác dụng ức chế enzym AChE và khả năng dọn gốc tự do
DPPH in vitro của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.
2. Đánh giá được tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí nhớ
bằng scopolamin của cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa.

2


Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về bệnh

1.1.1. Khái niệm về bệnh sa sút trí nhớ
Bệnh sa sút trí nhớ được định nghĩa bởi Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm
1992 như sau: Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh của não, có tính chất mạn tính
và tiến triển, có sự xáo trộn nhiều chức năng của não liên quan đến trí nhớ, suy nghĩ,
định hướng, học tập, ngơn ngữ và phán đốn. Song, ý thức khơng bị suy giảm. Sự
suy giảm trong kiểm soát cảm xúc, hành vi xã hội hoặc động lực thường đi kèm, đôi
khi xuất hiện trước sự suy giảm chức năng nhận thức. Hội chứng xảy ra trong bệnh
Alzheimer, bệnh mạch máu não và trong các điều kiện nguyên phát hoặc thứ phát
khác ảnh hưởng đến não [66].
Sa sút trí nhớ là một hội chứng bệnh lý phổ biến ở người cao tuổi. Mặc dù
bệnh chủ yếu ảnh hưởng đến người già nhưng khơng phải là một phần bình thường
của q trình lão hóa. Đa số các bệnh nhân rối loạn chức năng nhận thức đều do tổn
thương không hồi phục các neuron thần kinh hai bên bán cầu (đặc biệt ở vùng vỏ
não phối hợp) và/hoặc các cấu trúc dưới vỏ. Bệnh diễn biến từ từ tăng dần, suy giảm
dần khả năng nhận thức, trí tuệ, cuối cùng mất hết khả năng sinh hoạt độc lập, phải
lệ thuộc hoàn toàn vào người khác và thường tử vong do mắc phải các bệnh nhiễm
trùng, tiết niệu [1].
Theo báo cáo của hiệp hội Alzhiemer năm 2018, trên thế giới có khoảng 50
triệu người mắc sa sút trí nhớ (chiếm khoảng 5% tổng số người trên 60 tuổi của thế
giới). Ước tính cứ mỗi 3 giây sẽ có thêm 1 người mắc sa sút trí nhớ và số người mắc
bệnh dự kiến tăng lên đến 152 triệu người vào năm 2050 [47]. Trong đó, số ca mắc
mới ở châu Á chiếm gần 50% số ca trên thế giới và tập trung chủ yếu ở các nước thu
thập thấp – trung bình. Nguy cơ mắc sa sút trí nhớ tăng theo tuổi. Tỷ lệ mắc sa sút
trí nhớ của một người tăng gấp đơi sau mỗi 6,3 năm [49].
Việt Nam có xu hướng già hóa dân số nhanh. Số người cao tuổi (trên 65 tuổi)
chiếm hơn 10% tổng dân số [10]. Tuy nhiên, số người mắc sa sút trí nhớ trong nước
chưa được đánh giá trên nghiên cứu quy mô lớn. Một số nghiên cứu được thực hiện
với quy mô nhỏ tại địa phương từ năm 2009 – 2015 ước tính tỷ lệ mắc sa sút trí nhớ
chiếm khoảng 4,5 – 5% tổng số người cao tuổi (trên 60 tuổi) [4,9,12].

3


1.1.2. Các thể sa sút trí nhớ và cơ chế bệnh sinh
Sa sút trí nhớ bao gồm nhiều thể bệnh khác nhau. Sa sút trí nhớ trong bệnh
Alzheimer và trong bệnh mạch máu là hai thể bệnh thường gặp nhất:
1.1.2.1. Sa sút trí nhớ trong bệnh Alzheimer
Bệnh Alzheimer là một bệnh thối hóa não ngun phát. Sự tích lũy của các
mảng bám amyloid  (A) ở ngoại bào và một dạng bất thường của protein tau ở
trong tế bào thần kinh là hai trong nhiều thay đổi ở não của bệnh nhân mắc Alzheimer.
Nguyên nhân gây bệnh và cơ chế bệnh sinh chưa được làm sáng tỏ do sự phức tạp
của các yếu tố gây bệnh. Nhiều giả thuyết được hình thành để giải thích về ngun
nhân gây bệnh cũng như cơ chế bệnh sinh, ví dụ như giả thuyết về amyloid  (A),
protein Tau, cholinergic,...
 Giả thuyết về cholinergic
Trong não, các tế bào thần kinh hệ cholinergic có mặt nhiều ở vùng vỏ não
và đồi hải mãi, chịu trách nghiệm về trí nhớ và học tập. Acetylcholin là chất dẫn
truyền thần kinh quan trọng của hệ cholinergic, có vai trị hoạt hóa thụ thể nicotinic
và muscarinic. Giả thuyết cholinergic là giả thuyết được đưa ra bởi hai nhà khoa học
Davies và Maloney vào năm 1976 [22]. Giả thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh
Alzheimer có thể do giảm số lượng acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và
muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền thần kinh. Giả thuyết là cơ sở cho việc
nghiên cứu phát triển thuốc hướng tăng cường hoạt động của chất dẫn truyền thần
kinh acetylcholin.
 Giả thuyết về amyloid  (A ) và protein tau
Hardy John và cộng sự đã đưa ra giả thuyết về A để giải thích cho cơ chế
bệnh Alzheimer năm 1991 [31]. Những A là kết quả của quá trình biến đổi bất
thường của APP – một protein xuyên màng chưa rõ chức năng cụ thể. APP là protein
nằm trong màng, được phân cắt bởi 3 loại enzym -, - và -secretase. Một trong
những sản phẩm của quá trình phân cắt APP là một loại protein không tan tự kết tụ

(A 40 và A 42 ) từ đoạn cắt --. Dưới tác động của Apolipoprotein E (APOE) protein vận chuyển giúp phân bố cholesterol trong mô não, những peptid này kết tụ
với nhau hình thành các mảng amyloid. Những mảng amyloid gây suy giảm trí nhớ
và nhận thức nhờ can thiệp vào sự giao tiếp của các nơ-ron tại synap. Các A kích

4


thích q trình phosphoryl hóa protein tau và phát triển các đám rối tơ thần kinh
NFT.
Protein Tau là thành phần quan trọng của tế bào thần kinh có vai trị cố định
và ổn định cấu trúc của vi ống ở sợi trục. Trong Alzheimer, protein tau bị phosphoryl
hóa, tách ra và tích lũy thành các đám rối tơ thần kinh NFT, ngăn sự di chuyển của
dưỡng chất và các phân tử thiết yếu bên trong tế bào, gây chết tế bào thần kinh. Sự
tích lũy A góp phần khởi động q trình phosphoryl hóa protein tau. Ngược lại,
một nghiên cứu khác cho thấy protein tau độc có thể tăng cường sản xuất A [33].
Sự hiện diện của A và tau độc kích hoạt các tế bào miễn dịch ở não (tế bào thần
kinh đệm). Các tế bào này có nhiệm vụ loại bỏ các protein độc, song cũng làm chết
tế bào thần kinh. Viêm mạn tính được cho là xảy ra khi các tế bào thần kinh đệm
khơng cịn đảm nhận được nhiệm vụ của chúng. Khi viêm xảy ra, các yếu tố miễn
dịch được kích hoạt kéo theo sự hình thành các gốc tự do phá hủy màng tế bào. Teo
não là kết quả do chết các tế bào thần kinh. Ngoài ra, A và tau độc cũng làm giảm
khả năng sử dụng glucose ở não gây suy yếu các chức năng bình thường [15].
 Giả thuyết về Glutamat
Glutamat là chất dẫn truyền thần kinh kích thích nhanh ở não đóng vai trị
quan trọng trong học tập, trí nhớ và vận động. Glutamat hoạt hóa ba loại thụ thể
chính là Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoazolepropionic acid (AMPA), Nmethyl-D-aspartat (NMDA) và thụ thể hướng chuyển hóa. Trong đó, thụ thể NMDA
cho phép ion Na+ và Ca2+ đi vào tế bào. Quá trình exitotoxicity xảy ra khi kích thích
quá mức các thụ thể NMDA bởi glutamat hoặc các acid amin có cấu trúc tương tự,
làm nồng độ các ion Ca2+ trong tế bào tăng cao, gây tổn thương và chết tế bào [24].
1.1.2.2.

Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu

Sa sút trí nhớ trong bệnh mạch máu là thể bệnh phổ biến đứng thứ hai sau
bệnh Alzheimer, chiếm 10 – 20% các trường hợp mắc bệnh. Sa sút trí nhớ do nguyên
nhân mạch máu làm giảm lượng máu tới não, gây tổn thương tế bào thần kinh và ít
hồi phục. Biểu hiện của bệnh thường đột ngột, nhanh (nếu bị tai biến mạch máu mới)
hoặc tiến triển theo từng nấc (trong trường hợp tái phát tai biến nhiều lần) [57].
1.1.2.3.

Các thể sa sút trí nhớ khác

Sa sút trí nhớ cịn do các ngun nhân hiếm gặp khác gây ra, có thể kể đến
như sa sút trí nhớ thể Lewy, sa sút trí nhớ thể thái dương, sa sút trí nhớ trong bệnh
Parkinson, Huntington, Creutzfeldt-Jakob (CJD), sa sút trí nhớ trong bệnh suy giảm

5


miễn dịch ở người (ví dụ HIV), các bệnh chuyển hóa và nội tiết (ví dụ suy giáp, lupus
ban đỏ hệ thống, tăng calci huyết, thiếu vitamin B12) [66].
1.1.3. Các thuốc điều trị bệnh sa sút trí nhớ
Hiện nay chưa có thuốc nào có thể làm chậm hoặc dừng quá trình diễn tiến
của bệnh sa sút trí nhớ. Tổ chức FDA đã chấp nhận 6 thuốc trong điều trị sa sút trí
nhớ bao gồm: tacrin, rivastigmin, galantamin, donepezil, memantin và memantin
phối hợp donepezil [15].
1.1.3.1.

Nhóm thuốc ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE)

Giả thuyết cholinergic được lấy làm trung tâm để phát triển các thuốc. Giả
thuyết cho rằng nguyên nhân gây bệnh Alzheimer có thể do giảm số lượng
acetylcholin và suy yếu thụ thể nicotinic và muscarinic dẫn đến suy giảm dẫn truyền
thần kinh [17]. Nhóm thuốc có tác dụng ức chế AChE có phục hồi, tăng thời gian
tồn tại các chất dẫn truyền thần kinh Acetylcholin từ đó cải thiện trí nhớ và nhận
thức.
Nhóm ức chế AChE gồm 4 thuốc đã được tổ chức FDA cấp phép sử dụng
(Tacrin, Donepezil, Rivastigmin và Galantamin). Tacrin ức chế không cạnh tranh
với enzym acetylcholinesterase nhưng gây độc cho gan nên hiện nay hiếm khi được
sử dụng [64]. Các thuốc thế hệ sau (Donepezil, Rivastigmin và Galantamin) được sử
dụng để thay thế cho Tacrin. Ngoài khả năng ức chế AChE, Rivastigmin có thể ức
chế cả BuChE, trong khi galantamin có tác dụng trong việc điều biến các thụ thể
nicotinic. Cả hai được sử dụng để điều trị Alzheimer mức độ nhẹ - trung bình.
Donepezil chỉ ức chế chọn lọc AChE nên ít có độc tính ngoại biên hơn, được sử dụng
để điều trị trong cả trường hợp nặng. Các tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa
(mệt mỏi, buồn nơn và tiêu chảy), hệ thần kinh (lo lắng, khó chịu) và hệ tim mạch
(nhịp tim chậm) [41].
1.1.3.2.

Nhóm thuốc ức chế thụ thể NMDA

Thuốc duy nhất trong nhóm này được tổ chức FDA phê duyệt là Memantin.
Memantin là chất ức chế thụ thể NMDA không cạnh tranh, có tác dụng bảo vệ thần
kinh, ngăn cản việc mất tế bào thần kinh. Memantin dung nạp tốt hơn vào cơ thể
[40]. Tác dụng phụ thường gặp trên hệ tiêu hóa (buồn nơn, tiêu chảy hoặc táo bón)
và hệ thần kinh (lú lẫn và hưng phấn) [41]. Memantin phối hợp donepezil cho thấy
sự cải thiện lớn về chức năng nhận thức và ghi nhớ ở bệnh nhân sa sút trí nhớ [20].

6

Ngồi ra, người ta cịn sử dụng các chất chống oxy hóa như vitamin E, vitamin
C, các dược liệu (bạch quả, đinh lăng,...), thuốc giảm đau không steroid để hỗ trợ
điều trị sa sút trí nhớ.
1.2.

Tổng quan về cây Thạch tùng răng cưa

1.2.1. Đặc điểm thực vật
Thạch tùng răng cưa có tên khoa học là Huperzia serrata (Thunb.) Trevis.
hay cịn được biết đến là Lycopodium serratum thuộc họ Thông đất (Lycopodiaceae).
Tên khác là Thạch tùng răng hoặc Chân sói.
Mơ tả
Cây thân thảo, thường mọc thành đám nhỏ trên đất hay trên gốc cây có nhiều
rêu trong rừng rậm thường xanh, trên đất ẩm có tầng dày và nhiều mùn, ở độ cao 300
– 1800m.
Thân đứng cao 15 – 40 cm, đơn hay lưỡng thân 1 – 2 lần, đường kính khoảng
2 mm, hình trụ. Lá hình bầu dục – mũi mác, dài 15mm, rộng 3mm, tương đối mỏng,
gân giữa rõ, mép có răng. Túi bao tử ở nách nhánh lá giống lá thường; túi bào tử
hình thận, màu vàng tươi [5,8,11].
1.2.2. Phân bố
Cây thường tìm thấy ở những nước nhiệt đới châu Á, Trung Quốc, Úc và vùng
Trung Mỹ. Ở nước ta, Thạch tùng răng cưa phân bố rải rác ở các tỉnh vùng trung du
và vùng núi cao ở Tây Bắc, miền Trung và Tây Nguyên [5,8,11].
1.2.3. Thành phần hóa học
Thạch tùng răng cưa có thành phần chính là alcaloid thuộc Lycopodium
alcaloid, được phân thành 4 nhóm theo cấu trúc bao gồm Lycodin alcaloid,
Lycopodin alcaloid, Fawcettimin alcaloid và dạng hỗn hợp [35]. Các hợp chất
alcaloid của Thạch tùng răng cưa được liệt kê trong bảng 1.2.1.
Trong đó, Huperzin A (Hup A) được coi là thành phẩn hóa học nổi bật được

phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Theo tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự (2015),
hàm lượng Hup A trong lá Thạch tùng răng cưa ở Đà Lạt vào mùa thu và mùa xuân
lần lượt là 75,4 và 92,5 (g.g-1 mẫu khô) [13]. Theo tác giả Takuya Ohba và cộng sự

7


(2015), Hup A là alcaloid chính trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa
với hàm lượng đạt 0,5  0,003% [45].

Hình 1.2.1 Cấu trúc hóa học của Hup A
Ngồi ra, Thạch tùng răng cưa cịn chứa saponin, glycosid, flavonoid, tanin,
đường khử, acid amin, polysaccharid, steroid và carotenoid [5].
Bảng 1.2.1 Các hợp chất alcaloid của Thạch tùng răng cưa
Các alcaloid
Phân nhóm

Tên hợp chất
Clavolonin, serratidin, 4α-hydroxyserratidin, 4α,6αdihydroxyserratidin, 6α-hydroxyserratidin, lycoposerramin K,
Huperzin E,2-chlorohuperzin E, noxid huperzin E, Huperzin F,
N-oxid huperzin F, Huperzin G, 12-hydroxyhuperzin, Huperzin

Nhóm
lycopodin

O, 12-deoxyhuperzin O, Lycodolin, 12-epilycodolin N-oxid,
4α,6α-dihydroxylycopodin, 6α-hydroxylycopodin, 7hydroxylycopodin, lycoposseramin G, lycoposseramin L,
lycoposseramin M, lycoposseramin N, Serratezomin C,
Lucidiolin, lycoposerramin F lycoposerramin H lycoposerramin
I, lycoposerramin J, lycoposerramin O.

Huperzin A, NN-Dimethylhuperzin A, 6α-Hydroxyhuperzin A,
6β-Hydroxyhuperzin A, 6β-Hydeoxyhuperzin A, Phlegmariurin

Nhóm
lycodin

Nhóm
fawcettimin

M, Huperzin U, Huperzin C, Huperzin D, Huperzinin, Isofordin,
Huperzin B, N-Methylhuperzin B, De-N-methyl-βobscurin.
Huperzin P, Huperzin Q, N‐oxyhuperzin Q, Lycoflexin,
lycothunin, 11α-hydroxyfawcettidin, 2α,11αdihydroxyfawcettidin, 8α,11α-dihydroxyfawcettidin, macleanin,
11α-hydroxyphlegmariurin B, 7-hyroperoxyphlegmariurin B,

8


Neohuperzinin, Serratanidin, Serratezomin B, Serratinin,
Serratin, 8-deoxyserratinin, 8-deoxy-13-dehydroserratinin,
Huperserratinin.
Nhóm các
alcaloid
khác

Huperzin J, Huperzin K, Huperzin L, Huperzin V, Huperzinin B,
Phlegmariurin N, Serratanin A, Serratanin B

1.2.4. Tác dụng dược lý
Thạch tùng răng cưa được biết đến là một dược liệu quý để chữa bệnh sa sút

trí nhớ. Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, cao chiết của Thạch tùng răng cưa có tác dụng
ức chế chọn lọc enzym AChE và cải thiện trí nhớ trên động vật thử nghiệm [3,6,45].
Trong cây, Hup A là thành phần hóa học có tác dụng dược lý nổi trội, có khả năng
ức chế AChE, bảo vệ tế bào thần kinh và ty thể thơng qua thay đổi chuyển hóa của
APP và giảm stress oxy hóa đồng thời ức chế biểu hiện của yếu tố gây viêm [26,62].
Cao chiết của Thạch tùng răng cưa cịn cho thấy có tác dụng tiềm năng chống
khối u trên các tế bào ung thư bạch cầu HL-60 [30] và ức chế sự di căn của tế bào u
thần kinh đệm C6 (glicoma) [46].
Các tác dụng khác của loài cây này như kháng khuẩn [39] và chữa lành vết
thương [18] cũng đã được chứng minh. Bên cạnh đó, tác dụng chống nhược cơ, giải
độc organophosphat cũng được ghi nhận ở Hup A [28,38].
1.2.5. Các nghiên cứu hiện nay về tác dụng cải thiện trí nhớ của Thạch tùng
răng cưa
1.2.5.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Ở Nhật Bản, tác giả Takuya Ohba và cộng sự đã xác định hàm lượng Hup A
trong cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa là 0,5  0,003%. Cao chiết giàu
alcaloid từ Thạch tùng răng cưa có tác dụng ức chế chọn lọc AChE với IC50 là 5,96
µg/ml và không ức chế BuChE ở cùng dải nồng độ ức chế AChE. Nghiên cứu cũng
chỉ ra rằng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng cưa liều 30 mg/kg cho thấy tác
dụng cải thiện trí nhớ ở chuột nhắt trắng thông qua các thử nghiệm hành vi (thử
nghiệm mê lộ chữ Y và mê lộ nước Morris) [45].
Hup A là hợp chất được phân lập từ cao chiết của Thạch tùng răng cưa lần
đầu tiên vào năm 1986 bởi tác giả Liu JS và cộng sự [37]. Năm 1996, Cheng Dong
Hang và cộng sự cho thấy Hup A là một chất ức chế chọn lọc AChE theo cơ chế đảo

9


ngược với IC50 là 82 nM và tỷ lệ ức chế BuChE/AChE là 884,57. Đồng thời, dùng
Hup A liều 0,1 – 0,4 mg/kg giúp cải thiện trí nhớ của chuột gây sa sút trí nhớ bằng

scopolamin [21]. Năm 2011, trong thử nghiệm lâm sàng pha 2, Hup A liều 400 g
thấy tác dụng cải thiện trí nhớ ở bệnh nhân mắc sa sút trí nhớ mức độ nhẹ đến trung
bình [50].
1.2.5.2. Các tác dụng lý được báo cáo tại Việt Nam
Năm 2013, tác giả Nguyễn Ngọc Chương và cộng sự báo cáo kết quả đánh
giá tác dụng của cao chiết cồn từ Thạch tùng răng cưa trên mơ hình gây sa sút trí nhớ
ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin. Kết quả cho thấy cao chiết cồn từ Thạch tùng
răng cưa liều 0,533 g/kg có tác dụng tăng cường trí nhớ trên chuột gây sa sút trí nhớ
bằng scopolamin và LD50 của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa là 5,33g/kg [3].
Năm 2016, tác giả Nguyễn Thị Kim Thu và cộng sự đã chứng minh cao chiết
cồn và các phân đoạn của cao chiết cồn từ lá và thân của Thạch tùng răng cưa thu
hái tại Sapa, Lào Cai có tác dụng ức chế AChE in vitro. Phân đoạn dịch chiết EtOAc
cho thấy hoạt tính ức chế AChE mạnh nhất với IC50 = 89,96 ± 3,42 µg/ml [6].
Cũng năm 2016, tác giả Vũ Thị Ngọc và cộng sự đã đánh giá sự có mặt của
Hup A trong mẫu cây Thạch tùng răng cưa thu hái tại Đà Lạt, Lâm Đồng vào mùa
Xuân và mùa Thu bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Kết quả cho thấy, hàm lượng Hup A trong 2 mẫu lần lượt là 0,0925 mg/g mẫu khô
(mẫu mùa Thu) và 0,0171 mg/g mẫu khô (mẫu mùa Xuân). Hàm lượng Hup A được
nhận định có sự thay đổi giữa các thời điểm trong năm, với hàm lượng cao nhất vào
giữa mùa thu và thấp nhất vào đầu mùa xuân [13].
Tại Việt Nam có rất ít tài liệu nghiên cứu về Thạch tùng răng cưa và chưa có
nghiên cứu trên đối tượng cao chiết giàu alcaloid từ lồi cây này. Vì vậy, trong
nghiên cứu này, nhóm nghiên cứu sử dụng cao chiết giàu alcaloid từ Thạch tùng răng
cưa của Việt Nam để đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ trên mơ hình gây sa sút trí
nhớ ở chuột nhắt trắng bằng scopolamin.

10


1.3.

Một số mơ hình nghiên cứu tác dụng tăng cường trí nhớ

1.3.1. Các mơ hình động gây sa sút trí nhớ trên động vật thử nghiệm
1.3.1.1. Mơ hình gây sa sút trí nhớ tự phát
 Mơ hình lão hóa tự nhiên
Suy giảm trí nhớ là đặc trưng đầu tiên và phổ biến của tuổi già. Vì vậy, những
động vật già có tiềm năng được dùng như những mơ hình tự phát gây suy giảm trí
nhớ. Chuột là động vật thường được sử dụng trong các nghiên cứu do chi phí thấp,
sẵn có, dễ thao tác và hành vi đặc trưng. Do không gây xâm lấn và không chịu tác
động của chất hóa học thần kinh nên những mơ hình này được coi là cơng cụ hữu
ích để phản ánh sinh lý bệnh tự nhiên của bệnh Alzheimer.
 Mơ hình tăng tốc độ lão hóa
Chuột tăng tốc độ lão hóa (SAM) là một mơ hình lão hóa cấp tốc được hình
thành thơng qua việc lựa chọn kiểu hình từ chủng chuột AKP/J, bao gồm 9 chủng
tăng tốc độ lão hóa nhạy cảm (SAMP) và 3 chủng tăng tốc độ lão hóa đề kháng
(SAMR). Trong đó, chủng SAMP8 là mơ hình gây sa sút trí nhớ đáng tin cậy cho
thấy sự suy giảm khả năng học tập và trí nhớ liên quan đến lão hóa [59].
1.3.1.2. Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng tác nhân hóa học
 Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin
Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng scopolamin là một trong những mơ hình động
vật được sử dụng nhiều nhất do quy trình đơn giản và khả năng sống sót cao.
Scopolamin là một chất đối vận muscarinic có cấu trúc tương tự chất dẫn truyền thần
kinh acetylcholin. Do có ái lực cao, scopolamin gắn với các thụ thể muscarinic và
ngăn không cho acetylcholin gắn vào. Kết quả, nồng độ những chất dẫn truyền thần
kinh acetylcholin tự do tăng quá mức gây tổn thương các dây thần kinh dẫn đến suy
giảm khả năng học tập và trí nhớ [65].
 Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng streptozotocin
Streptozotocin gây tổn hại tế bào thần kinh thông qua stress oxy hóa, tăng tích
lũy các A trong não, kích thích sự phosphoryl hóa protein tau. Chuột tiêm

streptozotocin liều 3 mg/kg, 2 lần trong 48 giờ được báo cáo gây ra suy giảm trí nhớ
giống bệnh Alzheimer [52]. Hạn chế của mơ hình này là tỷ lệ tử vong cao, yêu cầu
số lượng động vật thử nghiệm lớn.

11


 Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng Trimethyltin (TMT) clorid
TMT là một chất độc thần kinh mạnh, gây chết các tế bào thần kinh ở vùng
đồi thị của động vật. TMT gây mất tế bào thần kinh, suy giảm trí nhớ, co giật ở chuột
nhờ gây được stress oxy hóa, kích thích các yếu tố tiền viêm [16]. Tuy nhiên, hiệu
quả của TMT có khác biệt giữa các lồi và tùy từng nhóm sản xuất [43].
Ngồi ra, các tác nhân như L-methiomin, Colchicin, acid Okadaic,
Benzodiazepin, các kim loại nặng (Fe, Cu, Cr, Co,...) cũng được sử dụng để gây sa
sút trí nhớ trên động vật thí nghiệm [43].
1.3.1.3. Mơ hình gây tổn thương não
Mơ hình gây sa sút trí nhớ trên chuột mất vùng khứu giác cũng là một trong
những mơ hình được sử dụng nhiều để gây sa sút trí nhớ ở động vật thí nghiệm.
Chuột được tiến hành phá hủy vùng khứu giác và cầm máu bằng miếng bọt cầm máu
gelatin. Các nghiên cứu chỉ ra rằng chức năng học tập và ghi nhớ đã suy giảm đáng
kể sau khi cắt bỏ vùng khứu giác của chuột, làm giảm sự tăng sinh tế bào trong đồi
hải mã và cholin acetyltransferase (ChAT) ở võ não và đồi hải mã [32,42].
1.3.1.4. Mơ hình sử dụng động vật chuyển gen
Động vật được biến đổi gen để biểu hiện các protein tiền chất amyloid (APP)
tạo thành các đám rối A và gây sa sút trí nhớ. Các mơ hình thường sử dụng như
chuột Tg2576, chuột APP23, JNLP3, ApoE… Ngoài ra cịn có các mơ hình chuyển
gen khác bằng cách gây đột biến trong presenilin, đột biến -symelein, mơ hình
chuột biểu hiện quá mức eyelooxygenase-2, đột biến yếu tố chống tăng trưởng thần
kinh (NGF)... [55]
1.3.1.5. Mơ hình gây sa sút trí nhớ do não thiếu oxy

Tình trạng thiếu oxy (hypoxia), tăng natri máu và thiếu máu cục bộ được báo
cáo làm giảm lượng máu cung cấp cho não và gây giảm trí nhớ ở lồi gặm nhấm. Có
thể gây thiếu oxy bằng cách cho chuột phơi nhiễm với khí CO2 tinh khiết, CO.
NaNO2 cũng được dùng để gây suy giảm khả năng học tâp và ghi nhớ nhờ làm giảm
khả năng mang oxy. Ngồi ra, người ta sử dụng mơ hình gây sa sút trí nhớ do thiếu
máu não cục bộ bằng cách thắt động mạch cảnh đồng thời chích máu đuôi chuột gây
hạ huyết áp [55].

12


1.3.1.6. Mơ hình gây sa sút trí nhớ bằng chế ăn giàu chất béo (HFD)
Trong mơ hình này, chuột được cho ăn chế độ ăn giàu chất béo (30-60% chất
béo) trong 2-4 tháng. HFD làm tăng nồng độ cholesterol trong não. Vì cholesterol
ảnh hưởng đến việc thanh thải và lắng đọng A nên việc tăng nồng độ cholesterol
trong não thúc đẩy sự lắng đọng của peptit này và hình thành mảng bám A ở ngoài
tế bào thần kinh. HFD gây ra sự lắng đọng của peptid A, tăng các phản ứng viêm,
giảm tế bào thần kinh và tăng tốc độ suy giảm nhận thức thơng qua căng thẳng oxy
hóa và đẩy nhanh q trình apoptosis thần kinh [51]. Mơ hình có một hạn chế là q
trình xây dựng mơ hình tốn nhiều thời gian.
1.3.2. Một số thử nghiệm hành vi đánh giá tác dụng tăng cường trí nhớ in vivo
 Thử nghiệm nhận diện đồ vật (ORT)
Test nhận diện đồ vật ORT được thực hiện theo phương pháp của Yamada và
cộng sự (2011) để đánh giá khả năng cải thiện trí nhớ ngắn hạn khơng liên quan đến
vị trí khơng gian của chuột [67]. Chuột có xu hướng khám phá vật thể lạ lâu hơn để
thu thập thông tin mới của mơi trường, qua đó đảm bảo sự an tồn cho bản thân động
vật. Đánh giá thời gian chuột khám phá vật thể lạ so với thời gian khám phá vật thể
cũ cho biết khả năng nhớ của chuột. Chuột được coi là cải thiện trí nhớ nếu thời gian
khám phá vật thể mới của chuột lâu hơn so với thời gian khảm phá vật thể cũ.
 Thử nghiệm mê lộ chữ Y

Thử nghiệm mê lộ chữ Y được thực hiện nhằm đánh giá trí nhớ khơng gian
ngắn hạn của chuột. Thử nghiệm này được tiến hành dựa vào hành vi thích khám
phá của động vật gặm nhấm. Hành vi này giúp chúng thu thập thông tin về môi
trường mới, từ đó đảm bảo an tồn cho bản thân. Trong thử nghiệm mê lộ chữ Y,
chuột có xu hướng tìm đến cánh mà chúng chưa khám phá (hay có xu hướng khám
phá lần lượng ba cánh tay liên tiếp). Chuột có trí nhớ tốt sẽ di chuyển thay đổi ln
phiên giữa các cánh và ngược lại [36].
 Thử nghiệm mê lộ nước Morris (Morris Water Maze – MWM)
Test mê lộ nước Morris để đánh giá khả năng học tập và trí nhớ khơng gian
của chuột, dựa vào bản năng sinh tồn và khả năng nhớ vị trí khơng gian của chuột,
khi cho vào nước chuột sẽ bơi để tìm bến đỗ và nhớ vị trí của bến đỗ ở các lần tiếp
theo. Thử nghiệm dựa vào bản năng sinh tồn của động vật sống trên cạn: khi chuột

13


bị đưa vào môi trường nước, chúng sẽ cố gắng bơi để tìm cách trốn thốt nhằm đảm
bảo an tồn cho bản thân. Đánh giá kết quả dựa trên các thơng số: thời gian tìm thấy
bến đỗ, qng đường tìm thấy bến đỗ, vận tốc bơi trung bình, thời gian lưu lại góc
có bến đỗ [60].
 Thử nghiệm né tránh thụ động
Test né tránh thụ động được sử dụng để đánh giá trí nhớ dài hạn của động vật
thử nghiệm, dựa trên sự mâu thuẫn giữa bản năng sợ hãi vùng khơng gian mở, có
ánh sáng của các lồi gặm nhấm với phản xạ trốn tránh có điều kiện vùng khơng gian
nguy hiểm đã được nhận diện trước đó. Dựa trên đặc điểm sinh học này, người ta
thiết kế buồng tối (khu vực ưa thích của chuột) trở thành vị trí nguy hiểm (bị điện
giật), trong khi buồng sáng lại là vị trí an tồn (khơng bị điện giật) [34]. Trong thử
nghiệm, chuột được đưa vào buồng sáng, nếu chuột đi vào buồng tối sẽ bị điện giật.
Sau một số lần tập luyện, chuột sẽ hạn chế vào buồng tối. Đánh giá kết quả dựa trên
thông số thời gian từ khi cho chuột vào buồng sáng đến khi chuột sang buồng tối.

Ngồi ra, cịn có một số thử nghiệm hành vi khác như thử nghiệm sợ hãi có điều
kiện, thử nghiệm vận động tự nhiên, bài tập tìm thức ăn trong mê lộ, mê lộ hình chữ
thập, vận động trong rotarod…
1.3.3. Một số phương pháp đánh giá tác dụng ức chế AChE
Acetylcholin là một chất dẫn truyền thần kinh thuộc hệ cholinergic, được tổng
hợp từ Ac-coenzym A và cholin dưới tác dụng của acetyltransferase. Sau khi được
giải phóng, acetylcholin tồn tại ở mơ trong vài giây, sau đó bị AChE ở mô liên kết
tại chỗ phân giải thành ion acetat và cholin. AChE giữ vai trị quan trọng trong kiểm
sốt biểu hiện của chất dẫn truyền thần kinh acetylcholin.
 Phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman
Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE dựa trên nguyên tắc: cơ chất ATCI
bị thủy phân nhờ sự xúc tác của cholinesterase tạo thiocholin. Thiocholin phản ứng
với thuốc thử DTNB giải phóng ra hợp chất 5-thio-2-nitrobenzoic màu vàng. Hợp
chất này có độ hấp thụ quang cực đại tại bước sóng 412 nm. Lượng hợp chất này
được tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ của AChE. Phương pháp sử dụng thuốc thử
Ellman được áp dụng phổ biến trong đánh giá hoạt độ của enzym do có ưu điểm là
hợp chất được tạo thành có độ bền cao, độ nhạy và đơn giản của phương pháp [25].

14


 Phương pháp sử dụng thuốc thử muối Fast Blue B
Phương pháp đánh giá hoạt tính của AChE sử dụng thuốc thử muối Fast Blue
B được công bố sau phương pháp sử dụng thuốc thử Ellman nhưng ít được sử dụng
hơn. Nguyên tắc của phương pháp: cơ chất -naphthyl acetat bị thủy phân bởi enzym
esterase giải phóng chất -naphthol. Chất này phản ứng với thuốc thử muối Fast
Blue B tạo thành sản phẩm mà diazo. Hợp chất này được xác định bằng cách đo độ
hấp thụ của dung dịch ở bước sóng 600 nm [29].
1.3.4. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa
1.3.4.1. Một số phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro

 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH
Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do DPPH là phương pháp được
sử dụng nhiều nhất để đánh giá tác dụng chống oxy hóa của một hợp chất hoặc hồn
hợp các chất. Nguyên tắc của phản ứng là dựa vào phản ứng giữ các gốc tự do DPPH
với chất chống oxy hóa tạo thành sản phẩm có màu vàng khơng hấp thụ ánh sáng tử
ngoại tại bước sóng 517 nm. Phương pháp có nhiều ưu điểm như đơn giản, ít tốn
kém, độ nhạy cao và phạm vi ứng dụng lớn [14].
 Phương pháp đánh giá khả năng dọn gốc tự do ABTS+
Khả năng dọn gốc tự do được xác định bằng phương pháp khử màu ABTS+
(2,2-azino-bis(2-ethylbenz-thiazolin-6-sulfonic acid)). ABTS+ phản ứng với chất
chống oxy hóa tạo thành sản phẩm khơng màu, làm dung dịch mất màu xanh. Độ
hấp thụ quang được đo ở bước sóng 750 nm và được tính tốn dựa vào đường chuẩn
của chất chuẩn Trolox [48].
Ngồi ra, còn nhiều phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro
khác được áp dụng trên thế giới như phương pháp dọn gốc tự do HO, nitric oxid,
peroxynitrit, superoxid,...
1.3.4.2. Phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa in vivo
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều phương pháp được đưa ra để đánh giá khả
năng chống oxy hóa trong mơ hình thực nghiệm như phương pháp đánh giá khả năng
làm giảm sắt trong huyết tương, phương pháp đánh giá khả năng làm giảm
glutathion,... Trong đó, phương pháp định lượng hàm lượng peroxid hóa lipid màng
tế bào được sử dụng nhiều nhất do đơn giản và tiết kiệm chi phí. Khả năng ức chế
q trình peroxy hóa lipid của các chất được đánh giá thông qua việc xác định hàm

15


lượng malonyldialdehyde (MDA) - sản phẩm của quá trình oxy hóa lipid màng tế
bào.
 Định lượng MDA theo phương pháp của Wojciech Wasowicz

Phương pháp định lượng MDA theo Wojciech Wasowicz dựa trên phản ứng
của malondialdehyd (MDA) với acid thiobarbituric (TBA) trong môi trường acid,
tạo ra hợp chất trimethin màu hồng có cực đại hấp thụ tại 532nm. Do đó, có thể định
lượng MDA thông qua mật độ quang của phức hợp tạo thành .Sử dụng 1,1,3,3tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn [63].
 Định lượng MDA theo phương pháp của Gérard-Monnier
Phương pháp định lượng MDA theo Gérard-Monnier dựa trên phản ứng của
malonaldehyd (MDA) với 2 phân tử 1-methyl-2-phenylindol ở 450C. Sản phẩm tạo
thành có cực đại hấp thụ ở bước sóng 586 nm [27]. Do đó, có thể định lượng MDA
thông qua đo độ hấp thụ quang của phức hợp tạo thành. Sử dụng 1,1,3,3tetramethoxypropan (TMP) để xây dựng đường chuẩn.

16