Bước đầu nghiên cứu nhân giống xoan ta (melia azedarach linn) bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào

LỜI NĨI ĐẦU
Để hồn thành chƣơng trình học tập (2005-2009) và giúp sinh viên làm
quen với công tác nghiên cứu. Đƣợc sự đồng ý của ban chủ nhiệm khoa Lâm
học và bộ môn Giống & CNSH. Tôi tiến hành thực hiện đề tài tốt nghiệp:
“Bước đầu nghiên cứu nhân giống Xoan ta (Melia azedarach Linn)
bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào.”
Bằng tinh thần học hỏi, nghiêm túc trong công việc, đến nay về cơ bản
khóa luận đã hồn thành. Để có đƣợc thành quả nhƣ vậy, tơi xin bày tỏ lòng
cảm ơn đến KS. Kiều Văn Thịnh và ThS. Đồn Thị Mai đã chỉ bảo, hƣớng dẫn
nhiệt tình trong suốt q trình học tập và làm khóa luận .
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong khoa Lâm học, bộ môn
Giống và CNSH- Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã luôn chỉ bảo, giúp đỡ cho tôi
trong q trình học tập .
Tơi xin chân thành cảm ơn các cán bộ viên chức thuộc Trung tâm nghiên
cứu giống cây rừng đã tạo mọi điều kiện và giúp đỡ tơi trong suốt thời gian tơi
thực tập. Giúp tơi hồn thành tốt đợt thực tập tại Trung tâm.
Sau cùng , tơi xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã luôn quan
tâm, động viên trong suốt quá trình học tập và thực hiện.
Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành và lời chúc sức khỏe!
ĐHLN, ngày 15 tháng 5 năm 2009
Sinh viên thực hiện

Đồng Thị Ƣng


ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những thập niên trƣớc đây, việc trồng rừng chủ yếu là nhằm mục
đích phủ xanh thì hiện nay trồng rừng sản xuất lại địi hỏi có năng suất cao. Vì
thế cơng tác giống có vai trị hết sức quan trọng. Tuy nhiên sau khi đã chọn
đƣợc các cây trội hoặc cây ƣu việt, cần xác định đƣợc các phƣơng pháp nhân
giống thích hợp để nhanh chóng cung cấp giống tốt cho sản xuất sản xuất đại

trà.
Nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật (vi nhân
giống) là một công cụ hiệu quả để đáp ứng nhu cầu trên. Bằng phƣơng pháp
này có thể dùng các chồi non, cây mầm, vỏ cây, thậm chí từ bao phấn và chỉ
nhị để tạo thành những cây mới với hệ số nhân giống cao; cây nuôi cấy mơ
thƣờng đƣợc trẻ hóa cao độ, sạch bệnh và mang đầy đủ các đặc tính tốt của cây
lấy vật liệu ban đầu.
Xoan ta (Melia azedarach Linn) là một loài cây trồng rất quen thuộc với
nhân dân ta và có giá trị kinh tế cao, nhƣng trƣớc đây chƣa đƣợc chú ý tới. Đây
là loài cây mọc nhanh, thƣờng đƣợc tái sinh và phục hồi trên đất sau nƣơng rẫy;
cây sinh trƣởng nhanh và thích nghi với nhiều loại đất. Xoan là cây đa tác
dụng: gỗ có thể dùng làm đồ trong xây dựng, lá làm phân xanh, hạt có thể ép
lấy dầu, vỏ có thể làm thuốc…
Trƣớc nhu cầu lớn về gỗ, bao gồm gỗ xây dựng, gỗ nguyên liệu sản xuất
đồ mộc, hàng xuất khẩu ngày càng tăng nhanh; từ trƣớc đến nay nguồn cung
cấp các loại nguyên liệu này chủ yếu là từ rừng tự nhiên hoặc nhập khẩu. Các
nghiên cứu chọn và nhân giống cây rừng gần đây thƣờng chỉ tập trung vào một
số đối tƣợng cây nhập nội, mọc nhanh,… Các nghiên cứu về cây gỗ lớn và cây
bản địa còn thiếu. Mặt khác nhân giống bằng cơng nghệ ni cấy mơ tế bào
ngồi việc đảm bảo về mặt di truyền, còn cung cấp đƣợc số lƣợng lớn cây
giống có chất lƣợng cho trồng rừng. Do đó hƣớng nghiên cứu mở rộng nhân,

1


gây trồng loài Xoan ta là việc làm cần thiết và có ý nghĩa trong việc bổ xung
thêm vào cơ cấu lồi cây trồng rừng kinh tế.
Với mong muốn góp phần vào công tác nghiên cứu nhằm xây dựng một
quy trình chọn tạo và nhân giống hồn chỉnh. Đƣợc sự đồng ý của ban chủ
nhiệm khoa Lâm Học và giáo viên hƣớng dẫn. Tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Bước đầu nghiên cứu nhân giống Xoan ta (Melia azedarach Linn) bằng
công nghệ nuôi cấy mô tế bào.”

2


PHẦN 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào
Nhân giống bằng nuôi cấy mô - tế bào thực vật (vi nhân giống) là
phƣơng pháp sản xuất hàng loạt cây con (bản sao) từ các bộ phận rất nhỏ của
cây (các cơ quan, mô, tế bào) bằng cách nuôi cấy chúng trong môi trƣờng nhân
tạo ở các điều kiện vơ trùng có mơi trƣờng thích hợp và đƣợc kiểm sốt nghiêm
ngặt.
1.1.1. Cơ sở khoa học của ni cấy mơ- tế bào

+

Tính tồn năng của tế bào (Totipotence)
Năm 1902 nhà thực vật học ngƣời Đức Haberlandt lần đầu tiên đƣa ra
quan niệm : “Mỗi tế bào bất kỳ của sinh vật đa bào đều tiềm tàng khả năng phát
sinh để thành một cơ thể hoàn chỉnh”. Sinh học hiện đại ngày nay cũng quan
niệm “Mỗi tế bào riêng rẽ dù đƣợc biệt hóa ở bất kỳ mức độ nào đều chứa đầy
đủ thông tin di truyền (AND) đặc trƣng cho cơ thể thực vật đó và khi gặp điều
kiện thuận lợi thì mỗi tế bào đó phát triển thành cơ thể hồn chỉnh”. Sinh
trƣởng và phát triển của cơ thể thực vật, các tổ chức cơ quan đến các mô gắn
liền với sự sinh trƣởng và phát triển của mỗi tế bào. Do vậy, các đặc tính của tế
bào nhƣ phân hóa, phản phân hóa và đặc tính vốn dĩ rất quan trọng của tế bào
là tính tồn năng của tế bào thực vật chính là cơ sở lý luận vững chắc để xây
dựng nên kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật.
+ Sự phân hóa và phản phân hóa

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phơi sinh thành các tế
bào của các mơ chun hóa đảm nhận các chức năng khác nhau của cơ thể.
Cơ thể thực vật trƣởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều
cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau thực
hiện các chức năng cụ thể khác nhau. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều
bắt nguồn từ tế bào phơi sinh.
Q trình phân hóa thành các cơ quan có thể biểu hiện nhƣ sau:
Tế bào phôi  tế bào dãn  tế bào phân hóa chức năng
3


Q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào cũng nhƣ mọi quá trình sống
khác xảy ra theo một chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong bộ gen (AND) của tế
bào. Các gen trong bộ gen của tế bào khơng hoạt động đồng thời mà đƣợc hoạt
hóa và hoạt động từng phần, làm xuất hiện những cơ quan khác nhau. Những
đặc điểm của kiểu hình khác nhau tƣơng ứng với từng giai đoạn trong quá trình
phát triển cá thể.
Tuy nhiên, khi các tế bào nằm trong một khối mô của một cơ quan nào
đó của cơ thể thì chúng thƣờng bị các tế bào ở xung quanh ức chế nên khơng
xuất hiện những tính trạng mới. Nếu các tế bào đƣợc tách riêng rẽ và gặp điều
kiện môi trƣờng thuận lợi thì bộ gen đƣợc hoạt hóa và q trình phân hóa xảy
ra theo một chƣơng trình đã đƣợc định sẵn trong bộ gen đó.
1.1.2. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống In vitro

 Chọn vật liệu gốc ban đầu
Mục tiêu chính của giai đoạn này là tạo đƣợc nguồn mẫu tƣơng đối sạch
để phục vụ cho các bƣớc tiếp theo. Đây đƣợc xem là bƣớc khởi đầu trong q
trình thuần hóa vật liệu để ni cấy. Vật liệu ban đầu đƣợc đƣa ra khỏi nơi
phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với mơi trƣờng mới. Đồng thời giảm bớt
khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ động trong công tác giống.

 Nuôi cấy khởi động
Sau khi có nguồn ngun liệu ni cấy, tiến hành lấy mẫu và xử lý trong
những điều kiện vô trùng. Đặt mẫu cấy vào môi trƣờng nuôi cấy. Kết quả của
giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn mẫu ni cấy, nguồn bệnh trên nó và
mơi trƣờng ni cấy. Thơng thƣờng một số hóa chất nhƣ: HgCl2, Ca(OCl)2,
H2O2,…đƣợc sử dụng để khử trùng mẫu vật nuôi cấy. Tùy thuộc vào từng vật
liệu mà chọn loại hóa chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về
ngun tắc, mơ ni cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa
quả) nhƣng theo Bhatt thì mơ lấy từ các bộ phần non của cây có khả năng nuôi
cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trƣởng thành khác. Vì vậy chồi
đỉnh hay chồi nách thƣờng đƣợc sử dụng để nuôi cấy in-vitro.
4


Yêu cầu đặt ra trong giai đoạn này: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao,
mô nuôi cấy sinh trƣởng ổn định và phân chia khỏe.

 Tạo chồi và nhân nhanh
Đây là giai đoạn rất quan trọng, đảm bảo sản sinh ra lƣợng cây con tối đa
mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây. Nó quyết định sự
thành cơng của tồn bộ q trình nhân giống. Ở giai đoạn này thì các chất điều
hịa sinh trƣởng có ý nghĩa rất lớn. Khi mơi trƣờng đƣợc bổ sung Cytokinin sẽ
có tác dụng kích thích tạo chồi.

 Tạo cây in-vitro hoàn chỉnh.
Tạo rễ là giai đoan quan trọng để có đƣợc cây con hồn chỉnh. Thơng
thƣờng sau 2 - 3 tuần ở các chồi sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hồn chỉnh.
Mơi trƣờng tạo rễ sẽ có hàm lƣợng auxin tăng lên và cytokinin giảm đi để tạo
điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Ngƣời ta thƣờng dùng các chất NAA, IBA,

IAA ở nồng độ 1 - 5mg/lít để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng. Trong một
số trƣờng hợp đặc biệt nếu chồi tạo đƣợc quá nhỏ và ngắn, phải bổ xung 15mg/lít GA3 và một số chất hữu cơ nhƣ nƣớc dừa non,… bổ xung vào môi
trƣờng để đạt tiêu chuẩn cây con chuyển sang khu huấn luyện.

 Huấn luyện và chăm sóc cây con ngồi vườn ươm.
Cây con sẽ đƣợc chuyển dần từ trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo ra điều
kiện tự nhiên. Thông thƣờng cây con tạo ra đƣợc huấn luyện bằng cách tăng
cƣờng độ chiếu sáng và chuyển dần ra điều kiện chiếu sáng ngồi trời. Tránh sự
thay đổi đột ngột làm cây có thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và
đạt những tiêu chuẩn nhất định về chiêu cao, số lá và số rễ thi đƣa ra ngoài giá
thể. Giá thể tiếp nhận cây in-vitro phải đảm bảo tơi xốp, thoáng nƣớc và sạch
bệnh. Cây sinh trƣởng ổn định mới bỏ giàn che và tƣới nhƣ cây ƣơm từ hạt.
1.1.3. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống in- vitro

 Môi trường nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh
dƣỡng cần thiết cho sự tăng trƣởng và phân hóa mơ trong suốt q trình ni
5


cấy in- vitro. Ngày nay có rất nhiều mơi trƣờng dinh duỡng đƣợc tìm ra nhƣ
MS, WPM, B5,…; tùy thuộc vào đối tƣợng và mục đích ni cấy mà lựa chọn
và xác định loại mơi trƣờng thích hợp. Nhìn chung mơi trƣờng ni cấy bao giờ
cũng có những thành phần sau:
− Mơi trường hóa học
Cung cấp đầy đủ các chất dinh dƣỡng và các chất cần thiết cho sự phân
chia, phân hóa tế bào cũng nhƣ cho cây sinh trƣởng bình thƣờng.
+ Nguồn cacbon
Mặc dù tế bào và mơ ni cấy vẫn có khả năng quang hợp cố định CO 2
nhƣng hiệu quả rất thấp. Nhƣ vậy, để nuôi cấy mô tế bào thực vật ngƣời ta phải

bổ xung vào mơi trƣờng ni cấy một nguồn cacbon thích hợp. Nguồn cacbon
thƣờng dùng là đƣờng saccarose, đƣờng maltose, glucose,…với hàm lƣợng
khoảng 20 - 30mg/lít.
Nó giúp mơ tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, làm tế bào
tăng sinh khối, lá chất thẩm thấu chính của mơi trƣờng.
+ Nhóm các nguyên tố đa lƣợng
Là những nguyên tố khoáng nhƣ: N, P, K, S, Mg, Ca và đƣợc sử dụng ở
nồng độ trên 30ppm. Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để
mô và tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình
trao đổi chất của tế bào thực vật và môi trƣờng đƣợc thuận lợi. Việc lựa chọn
thành phần và hàm lƣợng khống cho một đối tƣợng ni cấy là rất khó, địi
hỏi phải có những kiến thức về sinh lý thực vật đối với dinh dƣỡng khống.
+ Nhóm các nguyên tố vi lƣợng
Là những nguyên tố khoáng : Fe, Cu, Mo, Co, Mn, Bo…và đƣợc sử
dụng ở nồng độ dƣới 30ppm . Tuy đƣợc dùng vối nồng độ thấp hơn nhiều so
với các nguyên tố đa lƣợng nhƣng chúng rất cần thiết cho sự phát triển của mô
và tế bào. Sắt là yếu tố hỗ trợ sự phân chia trong tế bào, tham gia tổng hợp
mRNA từ DNA. Do vậy nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn.
Bo có tác dụng làm giảm các chất ức chế auxin (các Auxinoxidase). Trong điều
6


kiện thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhƣng mơ sẹo này lại
có độ xốp cao, mọng nƣớc và hiệu suất tái sinh thấp.
+ Các vitamin
Vitamin là hợp chất hữu cơ có khối lƣơng phân tử tƣơng đối nhỏ, có bản
chất hóa học rất khác nhau, đặc biệt cần thiết cho hoạt động sống bình thƣờng
của sinh vật dị duỡng. Vai trị của vitamin là góp phần tạo các co - enzyme xúc
tác cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào, tăng khả năng sinh trƣởng của mơ
ni cấy. Mặc dù cây in-vitro có thể tự tổng hợp vitamin, nhƣng không đủ cho

nhu cầu (Czocnowoki , 1952). Do đó để cây sinh trƣởng tối ƣu cần bổ sung
thêm các vitamin cần thiết vào môi trƣờng nuôi cấy với lƣợng nhất định tùy
theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các vitamin thuờng đƣợc sử dụng: B1
(thiamin), B2 (riboplavin), B3 (nicotine acid), B6 (piridoxin), vitamin H (biotin),
Myoinositon với nồng độ 0,1 - 1mg/lít.
+ Nhóm chất hữu cơ bổ sung
Đƣợc dùng trong môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp thêm nitơ hữu cơ,
aminoaxit, vitamin và các khống chất,... tác dụng kích thích sinh trƣởng mơ sẹo
và các cơ quan. Các chất thƣờng dùng: nƣớc dừa, khoai tây, chuối, dịch chiết
nấm men, dịch thủy phân casein ...Trong thành phần nƣớc dừa chứa các axit
amin, axit hữu cơ, đƣờng, ARN và ADN, đặc biệt trong đó cịn chứa myoinositol, các hợp chất có hoạt tính auxin, các gluxit của cytokinin quan trọng
trong nuôi cấy mô.
+ Các chất điều hòa sinh trƣởng
Sinh trƣởng và phát triển của cây đƣợc đảm bảo bởi hai cơ chế sinh lý
trái ngƣợc nhau, tác nhân kích thích và tác nhân ức chế. Việc cân bằng giữa các
chất kích thích sinh trƣởng và các chất ức chế sinh trƣởng có ý nghĩa quyết
định trong việc điều hòa sự sinh trƣởng của cây.
Chất điều hòa sinh trƣởng lá các chất có bản chất hóa học khác rất khác
nhau, nhƣng chúng có cùng chức năng điều khiển sinh trƣởng và phát triển của
thực vật trong suốt thời gian sống của chúng.
7


Phytohormon là chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc tổng hợp với hàm
lƣợng rất nhỏ trong các tổ chức mơ để điều tiết q trình sinh trƣởng và phát
triển. Nhằm đảm bảo mối quan hệ hài hòa giữa các cơ quan, bộ phận trong cây.
Ngồi ra nó cịn ảnh hƣởng đến q trình lão hóa mơ và nhiều q trình khác.
Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: auxin, cytokinin, giberillin, ethylen,
abscisic acid. Chúng là những thành phần quan trọng nhất trong môi trƣờng
quyết định đến sự thành công của cả quy trình ni cấy.

Auxin: là một loại phytohormon có khả năng kích thích sự phân chia
mạnh mẽ của tế bào, giúp cây phát triển chiểu ngang và kích thích sự ra rễ ở thực
vật nhƣng lại kìm hãm sự phát triển của chồi phụ. Nhóm này gồm các chất chính
nhƣ: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Napthyl acetic
acid),...
Gibberellin: là phytohormon đƣợc phát hiện sau auxin. Gebberellin chủ
yếu đƣợc tổng hợp trong các phôi đang phát triển, trong các cơ quan còn non.
Trong khoảng 20 loại hormone thuộc nhóm này thì GA3 (Gibberellic Acid 3) là
quan trọng nhất. GA3 kích thích sự nảy mầm của hạt, củ nên đƣợc sử dụng để
phá ngủ nghỉ của củ , hạt và chồi nách. GA3 giúp cây tăng trƣởng nhanh về
sinh khối thơng qua việc kéo dài thân, lóng. Ngồi ra nó cịn kích thích sự ra
hoa, kích thích sự sinh trƣởng kéo dài của cụm hoa và rút ngắn thời gian sinh
trƣởng dinh dƣỡng của cây.
Cytokinin: đƣợc phát hiện sau GA và Auxin. Đây là một loại
phytohormon có tác dụng thúc đẩy sự phân chia tế bào, tạo chồi, rễ phụ; làm
chậm sự lão hóa của lá, tăng cƣờng các chất dinh dƣỡng về phía các bộ phận
đang phát triển (Vũ Văn Vụ, 1983; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989). Các hợp chất
thƣờng sử dụng là: Kinetin (6-Furfuryl aminopurine- C10H9NO5), BAP(6Benzyl amino purine), Zip(Izopentenyl adenin), Zeatin. Trong đó Kinetin và
BAP là chất thƣờng đƣợc sử dụng nhiều. Bên cạnh đó, ngƣời ta cũng chứng
minh đƣợc tỉ lệ về hàm lƣợng auxin/cytokinin đóng vai trị quyết định trong
việc phát sinh hình thái mơ ni cấy. Để tạo rễ thì tỉ lệ này cần lớn hơn một,
8


nếu nhỏ hơn 1 mơ sẽ biệt hóa theo hƣớng tạo chồi. Cịn nếu tỉ lệ
auxin/cytokinin gần bằng 1 thì mẫu ni cây sẽ biệt hóa tạo mơ sẹo. Trong ni
cấy để kích thích sự nhân nhanh, ngƣời ta thƣờng sử dụng Cytokinin với nồng
độ 10-6 - 10-4M.
Ethylen: Là chất có tác dụng kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn
sớm nhƣng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn.

Auxin và ethylen tác dụng tƣơng hỗ. Auxin kích thích sự hình thành
ethylen trong cây. Auxin ở nồng độ thấp có chức năng kích thích con ở nồng độ
cao lại ức chế, sự ức chế sinh trƣởng của auxin chính là sự kích thích tổng hợp
ethylen rồi từ đó ethylen gây ức chế sinh trƣởng phát triển của thực vật.
+ Chất làm đông cứng môi trƣờng
Agar là một loại polysacharid của tảo có khả năng ngậm nƣớc khá cao 612g/lít. Độ thống khí của mơi trƣờng thạch có ảnh hƣởng rõ rệt đến sinh
trƣởng mơ ni cấy.
Ngồi ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trƣờng vì nó ảnh hƣởng trực
tiếp đến khả năng hịa tan các chất khống trong mơi trƣờng, sự ổn định của
môi trƣờng, khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của cây. Độ pH thấp (<4,5) hay
cao (>7,0) đều gây ức chế sinh trƣởng, phát triển của cây mô. Độ pH thƣờng
đƣợc sử dụng trong ni cấy mơ nói chung là từ 5,6 - 5,8.
- Môi trường vật lý:
Sự sinh trƣởng và phát triển của các tế bào, mô đƣợc điều kiển bởi sự kết
hợp giữa điều kiện vật lý trong phòng và điều kiện dinh dƣỡng trong ống
nghiệm. Các yếu tố của mơi trƣờng vật lý đƣợc quan tâm đó là nhiệt độ, ánh
sáng và độ ẩm.
Nhiệt độ: mỗi loài cây có tốc độ sinh trƣởng tối đa ở một nhiệt độ nhất
định, nhƣng thơng thƣờng nhiệt độ phịng ni cấy dao động trong khoảng
251oC. Nhiệt độ ảnh hƣởng đến sinh trƣởng của mẫu ni cấy. Các lồi cây
hay các giai đoạn sinh trƣởng khác nhau của cùng một cây đều đỏi hỏi chế độ

9


khác nhiệt nhau. Do vậy, trong nghiên cứu cần bố trí các khoang ni cấy với
chế độ nhiệt độ khác nhau.
Nhiệt độ thấp còn làm ngừng hoặc làm chậm quá trình sinh trƣởng của
mẫu ni cấy. Đây là cách tốt để bảo quản giống và làm ngân hàng mô.
Ánh sáng đây là yếu tố ảnh hƣởng trực tiếp đến quá trình phát triển và

phát sinh hình thái của các tế bào, mô nuôi cấy. Mức độ tác động của ánh sáng
phụ thuộc vào cƣờng độ chiếu sáng và thành phần ánh sáng cũng nhƣ chu kỳ
chiếu sáng. Thời gian chiếu sáng có vai trị quan trọng trong q trình phát triển
của mơ ni cấy. Thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12h/ngày.
Cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sinh trƣởng của mô sẹo trong khi
cƣờng độ ánh sáng thấp lại khiến mơ sẹo phân hóa theo hƣớng tạo chồi
(Ammirato, 1986). Cƣờng độ ánh sáng thích hợp vào khoảng từ 1000- 7000lux
(Moresin, 1974).
Bên cạnh đó thì chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng khá rõ. Ánh sáng
đỏ làm tăng chiều cao của thân, chồi hơn so với ánh sáng trắng.Nhƣng ánh sáng
trắng lại có ảnh hƣởng tốt tới sinh trƣởng của mơ sẹo hơn. Trong khi đó ánh
sáng xanh thì ức chế sự vƣơn cao của chồi nhƣng lại có ảnh hƣởng tốt tới sự
sinh trựởng của mơ sẹo. Vì vây các phịng thì nghiệm thƣờng sử dụng ánh sáng
của đèn huỳnh quang với cƣờng độ từ 2000-3000lux.
Độ ẩm trong các bình ni cấy thì độ ẩm tƣơng đối ln bằng 100% nên
ta không cần quan tâm nhiều đến vấn đề độ ẩm khi nuôi cấy.

 Vật liệu nuôi cấy
Lựa chọn đƣợc vật liệu ni cấy thích hợp là khâu quyết định đến sự
thành bại của cả quá trình nhân giống invitro. Một nguyên tắc cơ bản trong
nuôi cấy mô tế bào là vật liệu ni cấy càng non thì khả năng ni cấy thành
cơng càng cao. Trong đó tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, tiếp đến là
các tế bào của đỉnh sinh trƣởng: mô phân sinh đầu ngọn, đầu rễ, lá non, tƣợng
tầng, sau đó là các tế bào sinh dục (noãn bào) …

10


Mùa vụ lấy vật liệu cũng cần đƣợc quan tâm. Vì nó ảnh hƣởng đến khả
năng bật, nhiễm của mẫu nuôi cấy.

 Điều kiện vô trùng
Đây là điều kiện luôn đƣợc thiết lập và duy trì trong các phịng ni cấy.
Bởi vì mơi trƣờng dinh dƣỡng dùng trong ni cấy mô tế bào thực vật là nguồn
giàu các chất vô cơ, hữu cơ và cũng là môi trƣờng sinh trƣởng rất tốt cho nấm
và các vi sinh vật khác. Do vậy cần tách chúng khỏi tế bào nuôi cấy và mơi
trƣờng dinh dƣỡng đó. Mặt khác, các vi sinh vật có tốc độ sinh trƣởng nhanh
hơn các tế bào thực vật nhiều lần, nên trong điều kiện vô trùng sẽ khơng có sự
cạnh tranh giữa các vi sinh vật với các tế bào nuôi cấy.
Sự sinh trƣởng của bất kỳ vi sinh vật nào trên bất kỳ môi trƣờng sống
nào cũng làm biến đổi thành phần hóa học của mơi trƣờng đó. Bởi chúng khơng
chỉ sử dụng mơi trƣờng dinh dƣỡng và tế bào thực vật làm thức ăn mà chúng
cịn giải phóng các chất chuyển hóa ra mơi trƣờng, gây ức chế các vi sinh vật
khác, đồng thời ức chế sự sinh trƣởng của các tế bào thực vật đem nuôi cấy.
Một số nguyên nhân lây nhiễm thƣờng gặp:
− Lây nhiễm từ chính các mơ - tế bào đem ni cấy, bình ni cấy.
− Lây nhiễm mơi trƣờng dinh dƣỡng, môi trƣờng xung quanh.
− Lây nhiễm từ các thiết bị sử dụng, từ tay, quần áo ngƣời nuôi cấy.
Do đó việc thực hiện kỹ thuật khử trùng là một trong những nội dung
quan trọng trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào.
1.1.4. Những vấn đề trong nhân giống in-vitro

 Sự nhiễm mẫu
Nhiễm là vấn đề rất đƣợc quan tâm và dễ xảy ra trong nuôi cấy mô thực
vật, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy. Một số nguồn gây nhiễm
mẫu nhƣ mẫu cấy, thao tác trong quá trinh cấy, môi trƣờng, dụng cụ và các
thiết bị (màng lọc của tủ cấy, hệ thống thơng khí trong phòng cấy),…
Để giảm khả năng nhiễm mẫu bằng cách:

11

- Có thể sử dụng một số chất kháng sinh (Amphostericin B, Gentamicin,
Pencillin…) để diệt vi khuẩn và nấm.
- Sử dụng mô phân sinh đỉnh sinh trƣởng để nuôi cấy.

 Tính bất định về mặt di truyền
Kỹ thuật nhân giống vơ tính áp dụng với mục đích tạo quần thể cây trồng
đồng nhất với số lƣợng lớn nhƣng phƣơng pháp cũng tạo ra những biến dị soma
qua nuôi cấy mô sẹo,…Tần số biến dị thì hồn tồn khác nhau và không lặp lại
(Creissen và Karp, 1985; Fish và Karp, 1986). Nuôi cấy mô sẹo cho biến dị
nhiều hơn nuôi cấy chồi đỉnh. Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy
thƣờng là biến dị vể chất lƣợng, số lƣợng và năng suất nhƣng biến dị này
không di truyền,…Những nhân tố gây ra biến dị:
- Kiểu di truyền của mơ ni cấy: các lồi cây khác nhau có tỷ lệ đột
biến khac nhau
- Số lần cấy chuyền: số lần cấy chuyền càng nhiều càng cho độ biến dị
cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và
Phillíp, 1988). Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn
làm giảm sự biến dị.

 Sản sinh chất độc từ mẫu nuôi cấy
Thƣờng chúng ta hay thấy hiện tƣợng hóa nâu hay hóa đen mẫu làm sinh
trƣởng của mẫu bị ngăn chặn , hổng mẫu. Hiện tƣợng này là do mẫu ni cấy
có chứa các hợp chất Tanin hay Hydroxyphenol, có nhiều trong mô già hơn mô
non. Để khắc phục hiên tƣợng này ngƣời ta thƣờng hay áp dụng phƣơng pháp:
− Than hoạt tính đƣợc đƣa vào mơi trƣờng giúp cản q trình hóa nâu
hay đen với nồng độ thƣờng dùng 0.1-0.3%.
− Polyvinylpyrolidone (PVP), một chất thuộc loại polyamide hấp thụ
phenol qua vòng hydrogen ngăn chặn sự hóa nâu ở nhiều lồi cây trồng khác

nhau.
− Nuôi cấy mẫu trong môi trƣờng lỏng, oxy thấp, khơng có ánh sáng
trong 1 - 2 tuần
12


− Cho các chất khử q trình oxy hóa vào mơi trƣờng ngăn chặn q
trình oxy hóa phenol, chất khử thƣờng đƣợc dùng nhƣ ascorbic acid, citric acid,
L- cystein hydrochloride…
− Sử dụng mẫu ni cấy rất non có ít tanin, phenol…

 Hiện tượng thủy tinh hóa
Trong ni cấy mơ cũng thƣờng gặp hiện tƣợng này. Khi chuyển ra khỏi
bình ni cấy, cây con dễ bị mất nƣớc và tỷ lệ sống sót thấp. Dạng này thƣờng
thấy khi ni cấy trên môi trƣờng lỏng hay môi trƣờng bán rắn, đặc biệt là khi
sự trao đổi khí thấp, q trình thốt hơi nƣớc tập trung trong cây.
Để hạn chế quá trình thủy tinh hóa có thể sử dụng một số phƣơng pháp :
− Làm giảm ảnh hƣởng của hàm lƣợng nƣớc trong môi trƣờng nuôi cấy
bằng cách tăng nồng độ đƣờng và tạo điều kiện môi trƣờng nuôi cấy (nhiệt độ,
ánh sáng, trao đổi khí) thích hợp.
− Giảm C2H2 trong bình ni cấy thơng qua tạo mơi trƣờng ni cấy
(thơng gió tốt, tăng cƣờng ánh sáng, giảm nhiệt độ phịng cấy) thích hợp.
− Giảm nồng độ chất chứa N trong môi trƣờng nuôi cấy.
− Xử lý Acid Abxixic (ABA) hoặc các chất ức chế sinh trƣởng.
1.2. Các nghiên cứu về Xoan ta
1.2.1. Đặc điểm nhận biết
Họ Xoan (Meliaceae) là một họ thực vật có hoa với chủ yếu là cây thân
gỗ và cây bụi. Lá kép lơng chim 1 lần, có khi 2 - 3 lần hoặc là lá đơn, khơng có
lá kèm, hoa thƣờng lƣỡng tính,...
Họ Xoan gồm khoảng 47 chi, 800 loài phân bố vùng nhiệt đới và á nhiệt

đới Xoan ta có tên khoa học là Melia azedarach Linn, thuộc họ Xoan
(Meliaceae), bộ Bồ Hòn (Sapindales), nghành Ngọc Lan (Magnoliophyta).
Xoan ta là cây gỗ lớn, cao từ 15 - 20m, đƣờng kính 30 - 70cm. Thân
thẳng, tán lá thƣa, vỏ mầu xám nâu, có những đƣờng bì khổng chạy dọc màu
vàng da cam, cành non có lơng. Lá kép lông chim 2 - 3 lần mọc cách, lá chét
ngắn có khía răng, lá có mùi hắc.
13


Hoa đều, lƣỡng tính, màu tím nhạt, nở rộ vào tháng 3 - 4. Quả hạch, cỡ
hịn bi, vỏ có màu vàng nhạt khi chín, treo trên cây suốt mùa đơng và dần dần
trở thành trắng.
1.2.2. Đặc tính sinh học và sinh thái
học
Cây mọc nhanh, 5 tuổi có thể
cao 10m, đƣờng kính 20cm hoặc hơn.
Rụng lá vào mùa đơng, ra hoa tháng 3
- 5, quả chín tháng 10 - 12 hoặc 1 năm
sau.
Batcher (2000) phân tích dựa
trên nền tảng của sự mô tả chung nhất,
Xoan ta cần nhiều ánh sáng mặt trời,
khơng ƣa bóng râm, nó chịu đƣợc nhiệt
độ và khô hạn (Time Life Plant
Encyclopedia Virtual Garden 1999, in
Batcher 2000). Quả Xoan có chứa chất
độc với con ngƣời và các lồi động vật
có vú khác. Xoan có hệ rễ nơng, chỉ Hình 1.1: Cây Xoan trƣởng thành
mọc sâu khoảng 70cm trong lòng đất.
(Toky and Bisht 1993, in Batcher 2000).

Xoan ta sinh trƣởng và phát triển mạnh trên nhiều vùng đất khác nhau từ
đất chua đến đất kiềm hoặc hơi mặn, trồng sau khoảng 5-6 năm là có thể thu
hoạch và nếu trồng lấy gỗ lớn thì kéo dài từ 8 - 10 năm. Đặc biệt cây Xoan có
khả năng tái sinh (mọc lại từ gốc cũ đã thu hoạch cây) từ 3 - 4 lần. Có thể mọc
thành đám thuần loài hoặc hỗn giao cùng với các cây ƣa sáng khác đƣợc phục
hồi sau lƣơng rẫy.

14


1.2.3. Phân bố
Theo Batcher (2000) Xoan ta mọc dọc theo các con đƣờng và đôi khi
mọc lan sang các vùng khác. Nó xuất hiện ở những vùng đồng cỏ vùng cao,
những vùng rừng và khu vực ven sông ở miền Đông Nam nƣớc Mỹ. (Randall
and Rice, unpublished, in Batcher 2000) và Tây Nam Châu phi (Everett et al.
1989, Henderson and Musil 1984, in Batcher, 2000).
Ở Texas, xuất hiện ở những đồng cỏ vùng rừng và vùng cao ven sông
(Randall and Rice, unpublished, in Batcher 2000). Ở Hawai, nó mọc tự nhiên ở
nơi khô, đặc biệt là ở khe sâu và các đồng cỏ cao tới 610m. (Wagner et al.
1999).
Ở Fiji, Nó đƣợc trồng rải rác hoặc phân bố ở các vùng đất thấp. (Smith
1985, in PIER 2003). Xoan cũng mọc tự nhiên ở vùng Nam Queensland tới Bắc
New South Wales của Úc.
Riêng ở Việt Nam dọc theo từ Bắc vào Nam hầu nhƣ tỉnh nào cũng có sự
phân bố của cây Xoan.
1.2.4. Giá trị
Gỗ Xoan thuộc gỗ nhóm V, có lõi màu hồng hay nâu nhạt, dác xám
trắng; gỗ nhẹ mềm tỷ trọng 0,565. Gỗ Xoan nhẹ, nhƣng khá bền, ít bị mục,
mọt, mềm rất dễ bào nhẵn, cƣa xẻ và chạm trổ, nhƣng có nhƣợc điểm là dễ nứt,
dễ bị mối phá hoại. Nếu đƣợc ngâm nƣớc 5 - 6 tháng thì trở nên rất bền, khó bị

mối mọt, thƣờng đƣợc dùng trong xây dựng nhà cửa, đóng đồ gia dụng …
Lá Xoan làm tăng độ pH của đất và cung cấp nitơ cho đất, nó làm thay đổi một
cách đáng kể thành phần hóa học đất (Noble et al. 1996, in Batcher 2000). Lá
Xoan cũng làm giảm lƣợng Nhôm trong đất (Noble et al. 1996, in Batcher
2000). Lá Xoan khi mục nát tăng cƣờng một lƣợng Nitơ cho đất do đó nó có
tác dụng tƣơng đƣơng với các cây họ đậu có khả năng cố định đạm trong đất
(Singh et al. 1996, in Batcher 2000).
Lá, vỏ, quả, rễ đều có thể làm thuốc sát trùng. Hạt ép dầu làm sơn, xà
bơng, hoặc thắp đèn. Ta có thể trồng Xoan để che bóng và phịng hộ
15


1.2.5. Các nghiên cứu về chọn giống và nuôi cấy mô - tế bào
Nuôi cấy mô tế bào thực vật ngày nay có ý nghĩa cực kỳ quan trọng
trong phát triển công nghệ sinh học và các ứng dụng thƣơng mại của công nghệ
sinh học. Thật vậy, khi tiến hành kỹ thuật chuyển gen tạo ra các giống cây
trồng mới cũng nhƣ khi tìm cách nhân nhanh các giống mới đó, chúng ta đều
cần đến kỹ thuật ni cấy mơ tế bào thực vật.
Nuôi cấy mô ở nƣớc ta đã đƣợc áp dụng rộng rãi trong công tác nhân
giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dịng vơ tính Bạch đàn lai và Keo
lai có năng suât cao.
Nghiên cứu nhân giống in-vitro cho giống Bạch đàn lai giữa Bạch đàn
liễu và Bạch đàn trắng đã đƣợc Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự thực hiện thành
công tử năm 1993
Năm 1995, Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự cũng có nghiên cứu nhân
nhanh Keo lai băng phƣơng pháp nuôi cấy mô
Nguyễn Văn Uyển, Lê Tấn Đức, Nguyễn Hữu Hổ đã nghiên cứu hệ
thống tái sinh in-vitro cây Hông (Paulownia fortunei) và ảnh hƣởng của tác
nhân chọn lọc để tạo cây chuyển gen.
Riêng đối với cây Xoan ta thì đây là lồi cây đang rất đƣợc quan tâm với

những cơng trình nghiên cứu đã đƣợc công bố:
Nghiên cứu tạo giống Xoan ta (Meli azaedarach L.) biến đổi gen có sức
sinh trƣởng nhanh, chất lƣợng gỗ tốt (do ThS. Hồ Văn Giảng - Trƣờng ĐH
Lâm Nghiệp, 2007)
Nghiên cứu tuyển chọn, nhân giống Xoan Ta và Tếch có năng suất cao
nhằm đáp ứng yêu cầu trồng rừng gỗ lớn (do Ths. Đoàn Thị Mai - Viện KHLN
Việt Nam, 2006)
Phát sinh phôi soma và tái sinh từ phơi mầm cịn non của cây Xoan ta
trên tạp trí của nhóm tác giả Silvia. V, Ana. G, Hebe. R, Luis. M, (2002).

16


PHẦN 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu:
Xác định đƣợc kỹ thuật nhân giống Xoan ta (Melia azedarach) bằng nuôi
cấy mô tế bào; cụ thể : xác định chế độ khử trùng, môi trƣờng nhân chồi và mơi
trƣờng ra rễ thích hợp.
2.2. Nội dung
2.2.1. Ảnh hƣởng của chế độ khử trùng đến kết quả tạo mẫu sạch.
- Loại hóa chất và nồng độ hóa chất
- Thời vụ lấy mẫu để khử trùng
2.2.2. Ảnh hƣởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân chồi của Xoan ta.
2.2.3. Ảnh hƣởng của IBA và NAA đến khả năng ra rễ của Xoan ta trong in
- vitro.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Vật liệu và môi trƣờng nuôi cấy.
- Vật liệu nuôi cấy
Lấy chồi từ cây ghép 4 tháng tuổi tại vƣờn ƣơm Trung tâm nghiên cứu
giống cây rừng (dòng PT3 - Phú Thọ và dịng BV2 - Ba Vì).

- Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản là mơi trƣờng dinh dƣỡng khống MS
(Murashige và Skoog), đƣợc bổ sung 30g/l đƣờng và 7g/l agar. Bên cạnh đó là
các chất điều hòa sinh trƣởng: BAP (6-Benzyl amino purine); Kinetin (6Furfuryl aminopurine- C10H9NO5); IBA (Indol-3-butyric acid); NAA (Napthyl
acetic acid), ...với các nồng độ sử dụng khác nhau.
2.3.2. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm:
Địa điểm: Phịng ni cấy mô của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
Viện khoa học Lâm Nghiệp, Đông Ngạc – Từ Liêm – Hà Nội
Điều kiện thí nghiệm: Duy trì trong điều kiện nhân tạo
− Số giờ chiếu sáng trong ngay từ 14 - 16h/ngày. Cƣờng độ ánh sáng vào
khoảng 2000 - 3000Lux. Nhiệt độ phịng ni cấy: 25  2oC.
17


− Các dụng cụ sử dụng đƣợc hấp trong nồi tuyệt trùng có áp suất từ 1,2 1,5 atm ở nhiệt độ 120 - 130oC trong thời gian từ 20 - 40 phút.
− pH của môi trƣờng nuôi cấy 5,6 - 5,8.
2.3.3. Phƣơng pháp luận
− Các nhân tố là chỉ tiêu nghiêm cứu phải đƣợc chia thành các cơng
thức thí nghiệm và có cơng thức đối chứng.
− Các nhân tố không phải là chỉ tiêu nghiên cứu phải đƣợc đồng nhất
giữa các cơng thức thí nghiêm.
− Số mẫu của mỗi cơng thức thí nghiệm phải đủ lớn (n ≥ 30).
2.3.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm 1. Xác định loại hóa chất, nồng độ hóa chất khử trùng thích
hợp cho hai dòng Xoan ta (PT3 và BV2).
Sử dụng 2 loại hóa chất ở những nồng độ khác nhau: HgCl2 0,05% và
0,1% ; Ca(ClO)2 5% và 10%. Các mẫu đƣợc lặp lại 3 lần , mỗi lần quan sát trên
45 mẫu.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm:
Hóa chất

HgCl2 0,05%

HgCl2 0,1%

Ca(ClO)2 5% Ca(ClO)2 10%

Thời gian

5’

5’

5’

10’ 15’

10’ 15’

10’ 15’

5’

10’ 15’

Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của thời vụ lấy mẫu đến khả năng bật chồi
Xoan.
Mẫu vật đƣợc lấy vào các khoảng thời gian khác nhau trong năm từ
tháng 1 đến tháng 12.
Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của BAP và Kinetin đến khả năng nhân

nhanh và kéo dài chồi của Xoan .
Môi trƣờng nhân chồi đƣợc xác định dựa trên môi trƣờng cơ bản MS
đƣợc cải tiến về thành phần, tỷ lệ cũng nhƣ các chất đa lƣợng và vi lƣợng có bổ
sung thêm các axit amin, vitamin cùng một số chất kích thích sinh trƣởng .

18


Môi trƣờng nhân chồi đƣợc bổ xung các chất điều hịa sinh trƣởng thuộc
nhóm Cytokinin.
Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của IBA và NAA đến khả năng ra rễ của
Xoan ta trong phịng thí nghiệm (in-vitro).
Nghiên cứu ra rễ của Xoan đƣợc thực hiện ở giai đoạn khi các chồi có
chiều cao từ 2,5 - 3 cm đƣợc tách ra cấy vào mơi trƣờng MS bổ sung một số
chất kích thích sinh trƣởng ở nồng độ khác nhau (MT*).
2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu:
Tổng số mẫu nhiễm
− Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =

x 100
Tổng số mẫu ban đầu
Tổng số mẫu nảy chồi

− Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) =

x 100
Tổng số mẫu cấy vào
Tổng chiều dài chồi

− Chiều dài trung bình của chồi (cm) =

x 100
Tổng số chồi đo đếm

Tổng số chồi mới hình thành
− Hệ số nhân chồi (lần)

− Tỷ lệ ra rễ (%) =

=
Tổng số chồi ban đầu
Tổng số chồi ra rễ
x 100
Tổng số chồi nuôi cấy
Tổng chiều dài rễ

− Chiều dài rễ trung bình (cm) =
Tổng số rễ đo đếm
Số liệu thu đƣợc ghi chép trong bảng biểu và xử lý trên máy tính bằng
phần mềm thống kê Excel .
 Cơng thức tính tốn
− Số mẫu trung bình :

1n
X   Xi
n i 1
19


−Sai tiêu chuẩn :

− Phƣơng sai mẫu :
− Hệ số biến động:

S

( f i xi )
Qx
& Q x   f i xi 
n 1
n
 Qx 

S  (S )  
 n 1 


2

V (%) 

2

2

2

S
 100%
X

 Kiểm tra ảnh hưởng của các cơng thức thí nghiệm tới tỷ lệ mẫu



nhiễm, tỷ lệ mẫu bật chồi bằng tiêu chuẩn

2
0.5

− Đặt giả thiết:
H0: Các mẫu về chất thuần nhất với nhau.
H1: Các mẫu về chất không thuần nhất với nhau.
− Tính



2
n

theo cơng thức:

Với a mẫu quan sát (a > 2)



2
n

=

TS

T T
q

− Tra bảng

v

2
2

q
T
q
i


 T i TS 







2
0.5

với k bậc tự do, k= (a – 1)(b – 1)

−Kết luận:


Giả thuyết H0 đƣợc chấp nhận khi:



Giả thuyết H1 đƣợc chấp nhận khi:

 

2
n

2
0.5

2

2

n

0.5

Kiểm tra ảnh hưởng các cơng thức thí nghiệm đến tỷ lệ mẫu nhiễm,
tỷ lệ mẫu bật chồi, tỷ lệ ra rễ, chiều dài rễ và chiều dài chồi.
Kiểm tra dựa trên việc phân tích phƣơng sai 1 nhân tố:
B1.Tính các đặc trƣng mẫu.

B2. Kiểm tra ảnh hƣởng của công thức môi trƣờng A
− Đặt giả thiết:
H0: 1 = 2 = … =  Nhân tố A tác động đồng đều tới kết quả thí nghiệm.
20


H1 Có ít nhất 1 số trung bình tổng thể khác với các số trung bình tổng thể
cịn lại. Nghĩa là nhân tố A tác động khác nhau tới kết quả thí nghiệm.
− Việc kiểm tra giả thiết căn cứ vào FA và F05 tra bảng với bậc tự do K1 =
a – 1 và K2 = n – a nếu:
FA < F05 Thì giả thiết Ho đƣợc chấp nhận.
FA > F05 Thì giả thiết Ho bị bác bỏ.
B3.Tìm cơng thức ảnh hƣởng trội nhất.
Trong trƣờng hợp giả thuyết Ho bị bác bỏ, tiến hành so sánh 2 số trung
bình lớn thứ nhất và thứ hai theo tiêu chuẩn t Student:
− Đặt giả thiết:
H0: 1

=

2 Đƣợc chấp nhận khi /t/  t05 tra bảng với K = n – a bậc tự do.

Vì vậy sai dị giữa 2 số trung bình mẫu là khơng rõ rệt nên có thể lấy cơng thức
thí nghiệm ứng với số trung bình mẫu thứ nhất hoặc thứ hai làm công thức tốt
nhất.
H1: 1 ≠ 2 Giả thiết H0 bị bác bỏ khi /t/  t05 tra bảng với K = n – a với
bậc tự do.
Do đó: Sai dị giữa 2 số trung bình mẫu là rõ rệt vì vậy lấy cơng thức thí
nghiệm ứng với số trung bình mẫu thứ nhất là cơng thức tốt nhất.
− t đƣợc tính theo cơng thức:

t=

X

max 1

S ,,



X

max 2

1
1

ni
nj

Trong đó S’’ Là sai tiêu chuẩn ngẫu nhiên

21


PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Ảnh hƣởng của chế độ khử trùng đến kết quả tạo mẫu sạch
Để một quy trình nhân giống in-vitro thành cơng thì khâu vào mẫu là rất
quan trọng. Mẫu cấy cần đƣợc khử trùng để tạo mẫu sạch đƣa vào nuôi cấy.
Hiện nay, phƣơng pháp hóa học đƣợc sử dụng phổ biến để vơ trùng mẫu

cấy. Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn hay đƣợc sử dụng trong nuôi cấy
mô - tế bào thực vật nhƣ: NaClO, Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2, AgNO3, các chất
kháng sinh…
Để các hóa chất diệt khuẩn có thể xâm nhập và bám dính tốt hơn trên bề
mặt mẫu cấy, một số hóa chất có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt thƣờng
đƣợc bổ sung thêm vào các dung dịch khử trùng nhƣ : tween 20, tween
80,…hoặc sử lý bằng cồn 70o phối hợp với các hóa chất diệt khuẩn. Tùy loài
cây mà ta lựa chọn loại hóa chất ở nồng độ và thời gian phù hợp.
Nhìn chung một loại hóa chất đƣợc lựa chọn cho quá trình vơ trùng mẫu
cấy phải đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật cao, khơng hoặc có
mức độ độc tính thấp đối với mẫu cấy.
Từ kết quả khảo sát ảnh hƣởng của hai loại hóa chất HgCl2 và Ca(OCl)2
ở các nồng độ, thời gian khác nhau đến tỷ lệ mẫu bật chồi, tỷ lệ mẫu nhiễm ở
giai đoạn tái sinh cây in - vitro. Kết quả cho thấy khi khử trùng cho cả hai dòng
Xoan ta đều cho kết quả khử trùng phù thích hợp nhất khi sử dụng HgCl2 0,1%
trong 15 phút.
Trong số các hóa chất diệt vi sinh vật thƣờng dùng thì HgCl2 là loại hóa
chất có thể gây độc tính cao đối với mô thực vật. Tuy nhiên ở đây ta lại thấy dù
dùng HgCl2 ở 0,1% và trong thời gian dài (15 phút) mà không gây tổn thƣơng
nhiều đến mẫu cấy, vừa cho tỷ lệ mẫu nhiễm thấp lại cho tỷ lệ mẫu bật chồi
cao. Đây thực sự là hóa chất khử trùng thích hợp nhất cho Xoan ta. Dƣới đây là
là bảng kết quả thu đƣợc.

22


Bảng 3.1: Kết quả thí nghiệm khử trùng hai dịng Xoan ta
Thời
Dịng Hóa chất

gian

0,1%

HgCl2
0,05%

Tỷ lệ mẫu nhiễm (%)

Tỷ lệ mẫu bất chồi (%)

mẫu/lặp

TB

Sd

V%

TB

Sd

V%

5

45

74,07

3,15

4,25

5,19

1,28

24,74

10

45

50,37

3,39

6,74

6,67

2,22

33,33

15

45

42,96

4,63

10,77

16,30

2,57

15,75

5

45

85,93

3,39

3,95

4,44

2,22

50,00

10

45

62,22

4,44

7,14

8,15

1,28

15,75

15

45

58,52

3,39

5,80

6,67

2,22

33,33

5

45

94,81

5,59

5,90

0,74

1,28

173,21

10

45

81,48

3,39

4,17

2,96

1,28

43,30

15

45

68,15

2,57

3,77

5,19

1,28

24,74

5

45

97,04

3,39

3,50

0,74

1,28

173,21

10

45

90,37

3,39

3,76

3,70

1,28

34,64

15

45

87,41

2,57

2,94

3,70

1,28

34,64

5

45

82,22

2,22

2,70

3,70

1,28

34,64

10

45

54,07

3,39

6,28

8,89

2,22

25,00

15

45

51,11

2,22

4,35

15,56

2,22

14,29

5

45

90,37

3,39

3,76

5,93

2,57

43,30

10

45

74,07

2,57

3,46

8,89

2,22

25,00

15

45

65,19

5,59

8,58

8,15

2,57

31,49

5

45

94,81

3,39

3,58

0,74

1,28

173,21

10

45

88,89

8,01

9,01

2,96

2,57

86,60

15

45

76,30

4,63

6,06

5,19

3,39

65,47

5

45

97,78

3,85

3,94

0,00

0,00

0,00

10

45

94,81

5,13

5,41

1,48

1,28

86,60

15

45

87,41

6,79

7,77

1,48

1,28

86,60

(phút)
HgCl2

Số

PT3
Ca(OCl)2
10%

Ca(OCl)2
5%

HgCl2
0,1%

HgCl2
0,05%
BV2
Ca(OCl)2
10%

Ca(OCl)2
5%

23


Từ bảng số liệu thu đƣợc cho thấy khi sử dụng hóa chất khử trùng là
HgCl2 0,1% trong thời gian 15 phút cho tỷ lệ mẫu bật chồi trung bình, sạch
bệnh (nấm, khuẩn) cao nhất (16,30%, ở dòng PT3 và 15,56% ở dịng BV2), có
tỷ lệ mẫu nhiễm trung bình thấp nhất (42,96% ở dòng Xoan PT3 và 51,11% ở
dòng BV2).
Trong khi đó với Ca(OCl)2 5%, ở 5 phút lại cho tỷ lệ mẫu nhiễm trung bình rất
cao, tỷ lệ mẫu bật chồi trung bình lại thấp ở cả hai dòng Xoan ta. Ở dòng PT3
cho tỷ lệ mẫu nhiễm trung bình rất cao (97,04%) và tỷ lệ mẫu bất chồi trung
bình lại rất thấp (0,74%). Dịng BV2 cũng cho kết quả tƣơng tự, tỷ lệ mẫu
nhiễm 97,78% và không bật đƣợc chồi. Tuy hóa chất HgCl2 0,1% ở 10 phút
cũng cho tỷ lệ mẫu nhiễm trung bình thấp (50,37% ở dịng PT3 và 54,07% ở
dịng BV2) nhƣng lại có tỷ lệ mẫu bật chồi trung bình khơng cao (6,67% ở
dịng PT3 và 8,89% ở dịng BV2). Những thí nghiệm cịn lại đều cho tỷ lệ mẫu
nhiễm trung bình cao mà tỷ lệ mẫu bất chồi trung bình lại thấp.

HgCl2 0,1% (10 phút)

HgCl2 0,1% (15phút)

Hình 3.1: Cụm chồi Xoan tạo thành sau 30 ngày khử trùng
Kết quả cũng cho thấy dịng Xoan PT3 có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp và tỷ lệ
mẫu bật chồi cao hơn dòng Xoan BV2 khi khử trùng cùng loại hóa chất, nồng
độ, thời gian. Cùng cho kết quả khử trùng vào mẫu thích hợp nhất là HgCl 2.
24