Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng để phòng trừ bệnh hại cây trồng

LỜI CẢM ƠN
Đƣợc sự đồng ý của Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp, lãnh
đạo Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp và giáo viên hƣớng dẫn tôi tiến
hành nghiên cứu đề tài : “Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi sinh vật
có khả năng đối kháng để phòng trừ bệnh hại cây trồng’’
Sau thời gian làm việc với tinh thần nghiêm túc và tích cực đến nay đề
tài về cơ bản đã hồn thành. Để có đƣợc kết quả này trƣớc hết chúng tôi xin
chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.S Nguyễn Thị Thu Hằng thuộc bộ
môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh – Viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp –
Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt Nam ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn trong suốt
q trình chúng tơi thực hiện đề tài này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm
nghiệp, ban lãnh đạo và cán bộ nhân viên Viện Công nghệ Sinh học Lâm
nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài này.
Mặc dù đã cố gắng để hoàn thành đề tài song do hạn chế về mặt thời
gian, kinh nghiệm bản thân và điều kiện nghiên cứu nên không thể tránh khỏi
những thiếu sót và tồn tại nhất định. Tơi kính mong nhận đƣợc những lời
nhận xét, đóng góp ý kiến của các thầy cô.
Tôi xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày 11 tháng 05 năm 2018
Sinh viên thực hiện

Phạm Thị Ngọc

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC VIẾT TẮT ................................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................... 3
1.1 Tổng quan về vi sinh vật đối kháng ........................................................... 3
1.1.1. Vai trò của vi sinh vật đối kháng ............................................................. 3
1.1.2. Cơ chế tác động của vi sinh vật đối kháng đến các vi sinh vật gây bệnh....... 3
1.1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của vi sinh vật .......... 5
1.1.4. Các vi sinh vật đối kháng đƣợc ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật
gây hại ............................................................................................................... 6
1.2 Vi sinh vật gây bệnh cây trồng thƣờng gặp.............................................. 12
1.2.1 Nấm Fusarium ....................................................................................... 12
1.2.2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae .............................................................. 13
1.2.3 Vi khuẩn Ewinia .................................................................................... 15
1.3.Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng ......................................... 16
1.3.1 Trên thế giới........................................................................................... 16
1.3.2 Việt Nam ................................................................................................ 17
CHƢƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..19
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 19
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 19
2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 19
2.4. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ............................................................... 21
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 22
2.5.1. Thu thập và chuẩn bị mẫu ..................................................................... 22
2.5.2. Phƣơng pháp pha loãng mẫu ................................................................. 22
2.5.3. Phƣơng pháp phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật thuần khiết ....... 22
ii


2.5.4. Phƣơng pháp bảo quản giống ................................................................ 23
2.5.5. Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với vi sinh vật gây

bệnh ................................................................................................................. 24
2.5.6. Xác định đặc điểm hình dạng tế bào của các chủng vi sinh vật đối
kháng đã tuyển chọn........................................................................................ 25
2.5.7. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào ........................................... 26
2.5.8. Xác định hoạt tính catalase ................................................................... 29
2.5.9. Phƣơng pháp xử lí phân tích số liệu...................................................... 29
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 30
3.1. Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng .......... 30
3.2. Xác định hình dạng tế bào của các chủng vi sinh vật đối kháng đã tuyển
chọn ................................................................................................................. 35
3.3. Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi sinh vật đối
kháng đã tuyển chọn........................................................................................ 35
3.4. Xác định hoạt tính catalase ...................................................................... 37
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC VIẾT TẮT
Ký hiệu

Chú thích

BVTV

Bảo vệ thực vật

CMC

Carboxymethyl Cellulose

ĐC

Đối chứng

DNS

Dinitrosalicylic Acid

FAO

Food and Agriculture Organization of the United Nations
(Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc)

IPM

Integrated Pest Management (Quản lý dịch hại tổng hợp)

ISR

Induced systemic resistance (Hiện tƣợng kích kháng hệ thống)

LB

Luria – Bertani

PGA

Potato - Glucose Agar

PGPB

Plant growth promoting bacteria (Vi khuẩn kích thích sinh
trƣởng thực vật)

SAR

Sytemic acquired resistance (Kích kháng hệ thống có điều kiện)

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

VSVĐK

Vi sinh vật đối kháng

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Kí hiệu mẫu đất............................................................................... 19
Bảng 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật ..................................................... 21
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật................ 30
Bảng 3.2. Kết quả xác định hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn đã

phân lập với 3 chủng vi sinh vật kiểm định .................................................... 32
Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái tế bào của các chủng tuyển chọn .................... 35
Bảng 3.4. Kết quả xác định khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào của 3
chủng B1, B5, B6 ............................................................................................ 36

v


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 2.1. Hình dạng tế bào vi sinh vật gây bệnh ............................................ 20
Hình 3.1. Khả năng đối kháng với vi sinh vật kiểm định của các chủng vi
khuẩn, xạ khuẩn phân lập đƣợc....................................................................... 33
Hình 3.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 3 chủng vi khuẩn đối kháng
đã tuyển chọn .................................................................................................. 36
Hình 3.3. Xác định hoạt tính catalase ............................................................. 37

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Nằm trên vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, điều kiện thuận lợi cho
việc phát triển các cây nơng nghiệp, dựa vào ƣu thế đó, Việt Nam đã từng
bƣớc trở thành một trong số các nƣớc sản xuất và xuất khẩu lƣơng thực lớn
trên thế giới. Tuy nhiên, song song với sự thuận lợi cho cây trồng là bệnh hại
phát triển. Hằng năm, các loại nấm, vi khuẩn, virus gây bệnh thực vật nhƣ đạo
ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sƣơng, héo xanh,… chiếm đến trên 83% trong số
các bệnh ở cây trồng, làm thiệt hại hằng trăm tỉ đồng. Bệnh hại do vi sinh vật
(VSV) là vấn đề mà ngƣời nơng dân cịn gặp nhiều khó khăn trong việc quản
lí và phịng trừ. Để khắc phục những thiệt hại đó, ngƣời ta sử dụng nhiều biện

pháp kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học… trong đó thuốc hóa học đƣợc sử dụng
phổ biến vì thuận tiện và hiệu quả.
Theo Sarazy, Kenmor (2008 - 2011), ở các nƣớc châu Á trồng nhiều lúa,
10 năm qua (2000 - 2010) sử dụng phân bón tăng 100%, sử dụng thuốc
BVTV tăng 200 - 300%. Thuốc BVTV đƣợc bắt đầu đƣợc sử dụng ở miền
Bắc Việt Nam vào những năm 1955 từ đó đến nay tỏ ra là phƣơng tiện quyết
định nhanh chóng dập tắt các dịch sâu bệnh trên diện rộng. Mặt khác, việc sử
dụng thuốc hóa học, thuốc bảo vệ thực vật lâu dài và khơng kiểm sốt để lại
những hậu quả đáng tiếc về môi trƣờng đất, nƣớc… gây ô nhiễm nghiêm
trọng, làm mất cân bằng sinh thái, ảnh hƣởng không nhỏ tới sức khỏe con
ngƣời vật nuôi do lƣợng thuốc tồn dƣ để lại. Theo thống kê cả nƣớc hiện còn
tồn đọng trên 706 tấn thuốc cần tiêu hủy và 19.600 tấn rác bao bì thuốc bảo vệ
thực vật chƣa đƣợc thu gom và xử lý, hàng năm phát sinh mới khoảng 9.000
tấn.
Vì vậy, Hội nghị tƣ vấn khu vực châu Á Thái Bình dƣơng của FAO năm
1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chƣơng trình IPM
(quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lƣợc là sử dụng tác nhân sinh học để
hạn chế sự phát triển của quần thể ký sinh. Một trong hƣớng nghiên cứu theo

1


xu hƣớng này là sử dụng các vi sinh vật có khả năng đối kháng để ức chế các
vi sinh vật gây bệnh.
Huớng ph ng trừ bẹnh sinh học đã và đang đuợc nhiều các nhà khoa học
tren thế giới nghien cứu và cho ra các chế phẩm sinh học có nhiều triển vọng.
Đay là mọt trong những phuong pháp ph ng chống có hiẹu quả khả quan.
Tìm ra các chủng vi sinh vạt có khả nang kháng nấm bẹnh gi p cay trồng phát
triển tốt hon, làm cho tác nhan gay bẹnh khong kháng thuốc, an toàn với moi
truờng sinh thái, phù hợp với xu huớng an toàn nong nghiẹp hiẹn nay là biẹn

pháp phổ biến của cong tác ph ng trừ sinh học. Co chế đối kháng với vi sinh
vạt gay bẹnh là chủng vi sinh vạt có thể tiết ra chất kháng sinh, cạnh tranh về
dinh du ng hoạc tấn cong trực tiếp len to nấm gay bẹnh, hay tiết ra những
chất kích thích sinh truởng gi p cho cay trồng tang khả nang kháng bẹnh. Do
đó, việc phân lập tuyển chọn thƣờng xuyên các chủng vi sinh vật đối kháng
mới có tính độc cao là rất cần thiết. Chúng sẽ là đối tƣợng cho việc tuyển
chọn các chủng VSV vừa có khả năng đối kháng cao vừa cạnh tranh tốt với
các VSV gây bệnh cây trồng để sản xuất chế phẩm sinh học, góp phần nâng
cao năng suất, chất lƣợng nông sản, giảm thiệt hại kinh tế cũng nhƣ bảo vệ
môi trƣờng, cân bằng hệ sinh thái.
Từ những lý do trên, tôi tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một
số chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng để phịng trừ bệnh hại cây
trồng”.

2


CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1 Tổng quan về vi sinh vật đối kháng
Trong tự nhiên nhiều loài vi sinh vật có khả năng ức chế sinh trƣởng và
phát triển của các loài vi sinh vật khác và ch ng thƣờng đƣợc gọi là vi sinh
vật đối kháng. Việc sử dụng hiện tƣợng đối kháng này trong công tác bảo vệ
thực vật đƣợc gọi là biện pháp phòng trừ sinh học. Biện pháp này đƣợc cho là
một phƣơng pháp quản lý bệnh cây trồng trực tiếp, bằng cách sử dụng các
thành phần trong hệ sinh thái để giúp cây trồng chống lại những tác nhân gây
bệnh, nó là chìa khóa để tạo một nền nơng nghiệp bền vững [3, 9, 13].
1.1.1. Vai trò của vi sinh vật đối kháng
Các lồi vi khuẩn đối kháng ln tồn tại trong tự nhiên, đa số trong
ch ng đều có lợi cho con ngƣời. Đối với nông nghiệp những vi khuẩn đối

kháng đều thuộc hệ vi sinh vật sống ở vùng rễ cây trồng và sống hoại sinh
trong đất. Trong quá trình sinh trƣởng chúng tiết ra các chất trao đổi thứ cấp
nhƣ: kháng sinh, enzyme, siderophore, chất điều h a sinh trƣởng, acid v.v...
Những chất này rất có lợi cho sự phát triển của cây trồng nhƣ: kháng bệnh,
tăng khả năng hấp thu dinh dƣ ng của cây trồng, kích thích sinh trƣởng cây,
h a tan dinh dƣ ng trong đất từ dạng khó tiêu thành dễ tiêu để cây trồng hấp
thụ đƣợc v.v... [3, 9, 13].
1.1.2. Cơ chế tác động của vi sinh vật đối kháng đến các vi sinh vật gây
bệnh
VSV đối kháng có khả năng cạnh tranh trực tiếp với các vi sinh vật
khác trong hệ sinh thái về dinh dƣ ng, oxy, không gian sống, sinh kháng sinh,
tạo siderophore vv… để sinh trƣởng.
 Cơ chế tiết kháng sinh ức chế VSV gây bệnh
Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất có tính chống lại các VSV
hại, ch ng có hoạt tính sinh lý cao có tác động chọn lọc và đƣợc các VSV tiết
ra đƣa vào môi trƣờng sống trong mối quan hệ đối kháng với các sinh vật
3


khác, trong đó vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn là những VSV sinh ra nhiều chất
kháng sinh nhất (Lƣơng Đức Phẩm, 2011). CKS có tác dụng ức chế sinh
trƣởng hoặc tiêu diệt một số VSV khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng
độ thấp, có thể can thiệp vào hoạt động sinh lý của một chất khác bằng cách
kết hợp đặc hiệu với thụ thể, kềm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV
khác.
Nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều
chất kháng sinh có cấu tr c hóa học và có tác dụng tƣơng tự nhau. Quá trình
sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài
các gen chịu trách nhiệm tổng hợp chất kháng sinh, c n có cả các gen chịu
trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor [9, 18].

 Cơ chế do siderophore
Siderophore là một loại protein sinh ra trong q trình sinh trƣởng của
VSV, nó có khả năng hấp thụ các ion Fe3+ trong môi trƣờng với ái lực cao nhằm
phục vụ trực tiếp cho sự sinh trƣởng và hô hấp của VSV, làm cho môi trƣờng
xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các lồi VSV khác khơng có đủ sắt cho q trình
sinh trƣởng của mình, do đó ch ng sẽ không sinh trƣởng đƣợc [9, 18].
 Cơ chế tăng cường sức đề kháng của cây (kích kháng)
Tác dụng của VSV kích thích sinh trƣởng thực vật: vi khuẩn (VK) kích
thích sinh trƣởng thực vật (Plant growth - promoting bacteria – PGPB) là
VSV vùng rễ khi tƣơng tác với rễ cây có thể tạo ra tính kháng của cây chống
lại VK, nấm và virus gây bệnh. Hiện tƣợng này đƣợc gọi là tính kích kháng
hệ thống – ISR (Induced Systemic Resistance), cũng giống nhƣ tính kích
kháng có hệ thống có điều kiện – SAR (Systemic Acquired Resistance) (Ryu,
C. M. và cs, 2004).
PGPR (Plant growth promoting rhizobacteria) là các VK sống xung
quanh vùng rễ cây, dễ hình thành khuẩn lạc, nhân lên với số lƣợng lớn và ảnh
hƣởng trực tiếp hoặc gián tiếp gi p ngăn cản những tác nhân gây bệnh thực
vật, có khả năng ức chế các tác nhân gây bệnh thông qua cạnh tranh chất dinh
4


dƣ ng, cạnh tranh sắt thong qua thể mang sắt (siderophores), tạo ra kháng
sinh hoặc tiết enzyme thủy phân tạo hệ thống đề kháng cho cây
(Bhattacharyya P., 2012).
1.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
Trong tự nhiên, sự sinh trƣởng và phát triển của VSV cũng phụ thuộc
vào nhiều yếu tố nhƣ pH, nhiệt độ, ánh sáng, tính đặc hiệu, mật độ…
 Nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố ảnh hƣởng lớn đến sự phát triển của VSV. Mỗi loại
VSV phát triển trong một giới hạn nhiệt độ nhất định, dựa vào khoảng nhiệt

độ phát triển tối ƣu, VSV có thể đƣợc chia làm 3 nhóm: nhóm ƣa ấm có nhiệt
độ tối ƣu giữa 20 - 45oC, nhóm ƣa lạnh có nhiệt độ tối ƣu dƣới 20oC và nhóm
ƣa nóng có nhiệt độ tối ƣu trên 45oC. Ở nhiệt độ qua thấp VSV khơng phát
triển đƣợc nhƣng có thể sống; cịn ở nhiệt độ cao hoặc rất cao thì VSV bị tiêu
diệt do protein bị đông đặc, enzyme bị phá hủy, tổn thƣơng màng nguyên
tƣơng làm thay đổi tính thẩm thấu, phá hủy cân bằng lý hóa trong tế bào do
tăng tốc độ phản ứng sinh vật hóa học, giải phóng acid nucleic…
 Ánh sáng
Ánh sáng thƣờng có tác động đến sự hình thành bào tử sinh sản, tổng
hợp sắc tố, chuyển động hƣớng sáng… Bức xạ ánh sáng có thể tiêu diệt hoặc
ức chế vi sinh vật.
 pH
Độ pH của môi trƣờng có ảnh hƣởng đến hoạt động sống của VSV do làm
thay đổi sự cân bằng về trao đổi chất giữa mơi trƣờng và VSV, có thể giết chết
VSV. Mỗi loại VSV chỉ thích hợp với một giới hạn pH nhất định (từ 5,5 đến 8,5),
đa số là pH trung tính (pH = 7), bởi vì pH nội bào của tế bào sống là trung tính
 Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của mơi trƣờng xung quanh có tác động mạnh đến tế
bào VSV do tính thẩm thấu của màng nguyên tƣơng. Đa số các VSV phát
triển thích hợp khi mơi trƣờng có áp suất thẩm thấu bằng 7 atm (dung dịch
5


NaCl 0,9%). Trong dung dịch nhƣợc trƣơng, áp suất thẩm thấu bên trong tế
bào cao hơn môi trƣờng nên nƣớc bị hút vào tế bào làm tế bào phình to và v .
Trong dung dịch ƣu trƣơng, áp suất thẩm thấu ở môi trƣờng cao nên nƣớc bị
h t ra môi trƣờng làm tế bào bị teo lại.
 Độ ẩm
Hàm lƣợng nƣớc trong môi trƣờng quyết định độ ẩm mà nƣớc là dung
mơi của các chất khống dinh dƣ ng là yếu tố hóa học tham gia vào các q

trình thủy phân các chất. Nhìn chung vi khuẩn đ i hỏi độ ẩm cao, nấm men
đ i hỏi ít nƣớc hơn, c n nấm sợi có thể sống trong điều kiện độ ẩm thấp. Do
đó, nƣớc có thể đƣợc dùng để khống chế sự sinh trƣởng của từng nhóm vi
sinh vật. Mỗi loại vi sinh vật sinh trƣởng trong một giới hạn độ ẩm nhất định.
 Yếu tố sinh vật
Trong quá trình tồn tại của VSV nếu ch ng phải sống trong điều kiện
có VSV khác thì ch ng có thể bị cạnh tranh sinh tồn, bị tiêu diệt hoặc song
song tồn tại.
1.1.4. Các vi sinh vật đối kháng được ứng dụng trong phòng trừ vi sinh vật
gây hại
1.1.4.1.Vi khuẩn Burkholderia cepacia
Năm 1950, William Burkholder, một nhà sinh học thuộc trƣờng Đại
học Cornell Mỹ đã phát hiện và mô tả Burkholderia cepacia nhƣ một tác nhân
gây ức chế bệnh thối củ hành. Đến năm 1992, Pseudomonas cepacia và 6 loài
khác thuộc nhóm II rRNA của chi Pseudomonas đã đƣợc chuyển sang một chi
mới và mang tên của ngƣời đã phát hiện ra Burkholderia cepacia. Trái với chi
Pseudomonas, Burkholderia cepacia bao gồm ít nhất 17 lồi có liên quan chặt
chẽ đến các phân khu β - proteobacteria. Tất cả các loài Burkholderia có bộ
gen rất lớn về kích thƣớc từ 6 - 9 Mb, và tƣơng đối khác nhau, là cơ sở cho
khả năng di truyền là rất lớn và đƣợc xem là nền tảng cơ sở cho sự linh hoạt
của chủng trong sự tồn tại và thích ứng của chủng trong tự nhiên [22].

6


Burkholderia cepacia là nhóm vi sinh vật đƣợc phân bố khắp mọi nơi
và tìm thấy phổ biến trên rễ cây, vùng rễ trong đất, các mơi trƣờng ẩm ƣớt và
có khả năng sống sót trong mơi trƣờng nghèo dinh dƣ ng.
Burkholderia cepacia đã đƣợc chứng minh là vi khuẩn hữu ích nhƣ là
thuốc đối kháng của sâu hại cây trồng và gia tăng năng suất của một số cây

trồng, nhƣ l a trồng ở các nơi có mức pH thấp có tính axit, đất kém phì nhiêu
[20, 21].
Hơn nữa, các nhà khoa học cũng đang khai thác các tính chất chuyển
hóa đa dạng của Burkholderia cepacia để phát triển nó nhƣ một tác nhân để
sử dụng trong việc xử lý sinh học góp phần giải quyết vấn đề ơ nhiễm môi
trƣờng do các hợp chất bảo vệ thực vật đƣợc sử dụng trong nông nghiệp, hiện
nay ch ng đang đƣợc đề suất để sử dụng thay thế cho thuốc trừ sâu và thuốc
diệt cỏ có nguồn gốc hóa học có hại với môi trƣờng, một số các hợp chất đã
đƣợc xác định là pyrolnitrin có tác dụng ức chế tác động lên chuỗi vận chuyền
điện tử và việc sản xuất ammoniac dễ bay hơi cũng đã đƣợc phát hiện để kiểm
soát mầm bệnh trong đất.
1.1.4.2. Xạ khuẩn
Xạ khuẩn (Actinomycetes) là nhóm VSV đơn bào, phân bố rộng rãi
trong tự nhiên: trong đất, nƣớc, ao hồ, một phần trong bùn và các chất hữu cơ
khác. Xạ khuẩn giống nấm ở chỗ tạo thành hệ sợi, nhƣng lại có cơ thể đơn
bào, khơng có nhân thực giống vi khuẩn. Những loại xạ khuẩn tham gia vào
quá trình phân giải sơ cấp và mùn hóa chất hữu cơ trong đất trung tính, hơi
kiềm hoặc rác ủ đều có khả năng xâm nhập vào cơ chất không tan nhƣ
lignocelluloza [4].
Xạ khuẩn là loại vi khuẩn Gram dƣơng có tỉ lệ G + C cao (>55%) trong
DNA [2], toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính:
thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập.
Đa số xạ khuẩn sống tự do, hoại sinh và phân bố rộng rãi trong tự nhiên
và xác thực vật, thƣờng sống ở nhiệt độ 25 - 37oC và pH trung tính, tham gia
7


vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất nhƣ cellulose, tinh
bột v.v... góp phần khép kín v ng tuần hồn vật chất trong tự nhiên. Đặc tính
này c n đƣợc ứng dụng trong q trình chế biến phân hủy rác v.v... Nhiều xạ

khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh. Đặc điểm này đƣợc sử dụng trong
nghiên cứu sản xuất các chất kháng sinh dùng trong y học, nông nghiệp và
bảo quản thực phẩm.
Từ lâu các nhà khoa học đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng xạ khuẩn
có khả năng ức chế nấm bệnh thực vật. Theo Kamada (1974), khi điều tra
VSV đối kháng trong đất ở Nhật Bản cho thấy nơi nào có nhiều xạ khuẩn thì
ở đó các lồi Fusarium biến mất nhanh. Thơng thƣờng một lồi xạ khuẩn đối
kháng có thể ức chế nhiều loài nấm gây bệnh và đƣợc sử dụng nhƣ tác nhân
chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học. Tuy nhiên khi sử dụng các chủng có
hoạt phổ rộng phải ch ý tránh xạ khuẩn ức chế luôn cả khu hệ sinh vật có lợi
trong vùng rễ. Khơng phải tất cả xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm in vitro đều
thể hiện trong đất (khoảng 4% – 5%) nhƣng ch ng có vai tr quan trọng trong
việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là
quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ
nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh. Xạ khuẩn ngoài việc chống
nấm bằng cách tiết chất đối kháng c n sinh enzyme tác động lên hệ VSV nhƣ
enzym chitinase tác động lên thành tế bào nấm mốc, các enzyme phân giải
hợp chất hữu cơ khó tan nhƣ cellulase gi p phân giải cellulose tạo thành phân
bón hữu cơ cho cây trồng. Dùng để sản xuất nhiều enzym nhƣ protease,
amylase, cellulase, chitinase… một số axit amin và axit hữu cơ. Ngoài ra,
nhiều loài xạ khuẩn c n sinh ra các chất kích thích sinh trƣởng đối với thực
vật cũng nhƣ các lồi VSV có lợi cho đất. Một số chủng xạ khuẩn vừa kháng
đƣợc các nấm gây bệnh vừa giết đƣợc tuyến trùng hại cây trồng và tham gia
tích cực vào các q trình chuyển hố nhiều hợp chất trong đất, nƣớc (Lƣơng
Đức Phẩm, 2011).

8


1.1.4.3.Vi khuẩn Bacillus

Vi khuẩn thuộc chi Bacillus có 4 lồi khác nhau, phần lớn là vô hại,
một số gây bệnh là làm hỏng thức ăn, thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong đấu
tranh sinh học và ph ng trừ các loại sâu bệnh hại cây trồng [2].
Bacillus là trực khuẩn, thƣờng xếp thành chuỗi, kích thƣớc từ 0,5 – 2,5
x 1,2 - 10μm, hầu hết có khả năng di động.
Các VK thuộc chi Bacillus phần lớn sống hoại sinh và có khả năng
sống ở những điều kiện khắc nghiệt nhƣ sa mạc, suối nƣớc nóng, vùng cực
hay trong cả những nơi có giá trị nhiệt độ, pH và nống độ muối mà ít lồi có
khả năng sống sót đƣợc [15].
Bacillus là nhóm vi khuẩn phân bố rộng từ trong đất, côn trùng cũng
nhƣ là sống trên cơ thể con ngƣời. Các vi khuẩn thuộc chi Bacillus có nhiều
đặc tính sinh học nhƣ khả năng sinh kháng sinh, enzyme, vitamin cũng nhƣ
nhiều sản phẩm trao đổi khác. Ngoài ra, khả năng chống chịu lớn đối với
nhiệt độ cao và các chất tẩy rửa, các bào tử của Bacillus đƣợc dùng để kiểm
tra các kĩ thuật khử trùng hơi nóng và trong các chất tẩy rửa hóa học [1, 25].
Các lồi thuộc chi Bacillus đều có khả năng sinh chất kháng sinh, là sản
phẩm chuyển hóa thứ cấp trong pha sinh trƣởng muộn hay pha cân bằng sớm
của quá trình phát triển khi ni cấy. Có hơn 169 chất trao đổi thứ cấp đã
đƣợc thơng báo, điển hình nhƣ B.subtillis có 68 chất kháng sinh đƣợc biết đến
và B.brevis có 23 chất kháng sinh nhƣ Bacilysocin, TasA, Sublancin,
Subtilin,... Chất kháng sinh do vi khuẩn Bacillus sinh ra hầu hết có khả năng
hoạt động chống lại các vi khuẩn Gram (+). Các chủng vi khuẩn
B.thuringiensis, B.subtilis, B.larvae, B.lentimorbus đƣợc sử dụng rộng rãi
trong việc sản xuất thuốc trừ sâu sinh học cũng nhƣ phân bón hữu cơ vi sinh,
ph ng trừ VSV gây hại nhƣ nấm Fusarium, Rhizotonia solani,..., ngồi ra cịn
đƣợc ứng dụng nhiều trong công tác bảo quản nông sản sau thu hoạch. Việc
sử dụng các chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus để ph ng trừ sâu bệnh hại là

9

một hƣớng triển vọng và hiệu quả, thân thiện với mơi trƣờng trong đấu tranh
sinh học.
1.1.4.4.Vi khuẩn Pseudomonas
Đặc điểm hình thái chung cho Pseudomonas là vi khuẩn Gram âm, tế
bào hình que, di động nhờ roi ở đầu và khơng có bào tử. Các đặc điểm sinh lý
dị dƣ ng, không lên men, linh hoạt về dinh dƣ ng, không quang hợp hoặc cố
định nitrogen. Về đặc điểm sinh hóa, một số d ng VK này có đặc điểm nhƣ:
khuẩn lạc có màu trắng, tr n, viền nhẵn, có khả năng di động. Một số
Pseudomonas có thể chuyển hóa các chất ơ nhiễm hóa học mơi trƣờng, nhƣ
Pseudomonas resinovorans có thể làm suy giảm cacbazol [27].
Vi khuẩn Pseudomonas là VK có sự biến dƣ ng dễ thay đổi và linh
động, có thể xuất hiện ở mọi mơi trƣờng khác nhau nhƣ đất, nƣớc, trên đất và
trong l ng đất. Trong số những lồi Pseudomonas, có những lồi tiêu biểu có
thể sử dụng trong các nghiên cứu khoa học, đặc biệt là cơng nghệ sinh học [8,
27].
Một số chủng Pseudomonas có ảnh hƣởng quan trọng trong sự sinh
trƣởng và phát triển thực vật, tổng hợp kích tố tăng trƣởng thực vật nhƣ:
auxin, cytokinin, kích thích sự phát triển của bộ rễ cây làm gia tăng khả năng
hấp thu chất dinh dƣ ng trong đất ở một số loài nhƣ: Pseudomonas putida,
Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas syringae. Pseudomonas kích thích
sinh trƣởng của cây trồng bởi vì ch ng x c tiến cây trồng sinh ra các chất kích
thích sinh trƣởng nhƣ auxin, xitokinyl, gibberellin và tính 23 kháng tập thể
của cây, gi p cây kháng lại tốt hơn sự tấn công của mầm bệnh. Cơ chế tác
động của vi khuẩn đối kháng Pseudomonas nhƣ sau:
+ Có khả năng sản sinh ra cyanide, tăng tính chống chịu của cây, sản
sinh ra chất kích thích sinh trƣởng và có khả năng phân giải độc tố do vi sinh
vật gây bệnh tiết ra.
+ Có khả năng hấp thụ các ion Fe3+ trong môi trƣờng với ái lực cao
nhằm phục vụ trực tiếp cho sự sinh trƣởng và hô hấp của vsv, làm cho môi

10


trƣờng xung quanh nghèo sắt, dẫn đến các loại vi sinh vật khác khơng có đủ
ion Fe3+ cho q trình sinh trƣởng của mình, do đó ch ng sẽ khơng sinh
trƣởng đƣợc. Cạnh tranh dinh dƣ ng với các vi sinh vật gây bệnh, ví dụ nhƣ
tiết ra các hợp chất siderophore tạo điều kiện thuận lợi cho việc cạnh tranh Fe.
Có khả năng ph ng chống lại nhiều loại vi sinh vật gây bệnh hại cây,
nghĩa là có khả năng chống lại những loại vi sinh vật gây bệnh mà những vi
sinh vật đó thƣờng làm giảm sự sinh trƣởng và phát triển của cây trồng [27].
1.1.4.5.Nấm Trichoderma
Trichoderma sp phân bố phổ biến trong đất, nơi có nhiều dinh dƣ ng, là
nấm hoại sinh có khả năng ký sinh và đối kháng với nhiều loại nấm hại gây
bệnh cây trồng. Trichoderma sp sinh trƣởng và phát triển mạnh ở vùng rễ,
thuộc nhóm nấm Deuteromycetes (Nhóm nấm bất tồn - Fungi imperfecti),
khơng có giai đoạn sinh sản hữu tính, sinh sản vơ tính bằng những đính bào tử
Conidia (bào tử nguyên phân).
Trichoderma có khả năng khống chế, cạnh tranh và tiêu diệt nhiều loại
nấm gây bệnh thối rễ, chết rạp cây con, xì mủ… trên cây trồng nhƣ Pythium,
Rhizoctonia, Fusarium, Phytophthora, Sclerotium…bằng cách tiết ra một
enzym làm tan vách tế bào các lồi nấm hại, sau đó xâm nhập và hấp thu các
chất dinh dƣ ng làm nấm hại bị chết. Ngoài tác dụng diệt nấm, nhiều nghiên
cứu cho thấy một số chủng Trichoderma c n gi p th c đẩy “cơ chế tự ph ng
vệ” của cây chống lại các tác nhân gây bệnh khác.
Một số giống Trichoderma giúp cây phát triển hệ rễ, rễ mọc nhiều và sâu
hơn (sâu 1 m dƣới mặt đất) nhờ đó gi p cây tăng cƣờng tính chịu hạn và
chống đổ ngã… Ngồi ra, nghiên cứu gần đây cho thấy trên rễ cây bắp
có nấm Trichoderma giống T.22 cần ít hơn tới 40% đạm so với cây khơng có
nấm Trichoderma.
Trichoderma sp thể hiện tính kháng “bẩm sinh” với phần lớn hố chất

nơng nghiệp bao gồm cả thuốc trừ bệnh, dù rằng một số giống thể hiện tính
kháng có khác nhau.
11


1.2 Vi sinh vật gây bệnh cây trồng thƣờng gặp
1.2.1 Nấm Fusarium
Fusarium là một chi lớn của nấm nito, một phần của nhóm thƣờng
đƣợc gọi là hyphomycetes, phân bố rộng rãi trên toàn thế giới. Ch ng phân bố
trên tất cả các vùng địa lý từ sa mạc đến các vùng nhiệt đới, từ các vùng đồng
cỏ đến các vùng đất trống, do có khả năng thay đổi hình thái, sinh lý trong
q trình phát triển để thích nghi với mơi trƣờng sống nhờ đó dẫn đến sự gia
tăng số lồi để thích ứng với các vùng sinh thái khác nhau. Nấm Fusarium
chủ yếu tồn tại trong đất dƣới dạng hoại sinh hoặc ký sinh vật chủ, phổ ký chủ
của ch ng khá rộng bao gồm cả động vật và thực vật.
Các độc tố chính đƣợc sản xuất bởi các loài Fusarium là fumonisins và
trichothecenes thƣờng nhiễm vào l a mạch nếu có mƣa vào cuối mùa, đó là
tác động kinh tế đối với ngành chế tạo bia. Tổng thiệt hại ở Hoa Kỳ đối với
l a mạch và l a mì trong giai đoạn 1991 - 1996 ƣớc tính khoảng 3 tỉ USD [5].
Một số chủng nấm Fusarium gây bệnh thối thân, rễ, gây rụng lá trên
thực vật. Bệnh do nấm Fusarium gây ra thƣờng ít xuất hiện sớm mà gây hại
mạnh nhất ở cuối giai đoạn sinh trƣởng của cây. Biểu hiện rõ ràng là những lá
gốc chuyển từ màu xanh sang màu vàng sau đó đến các lá phía trên. Mặc dù
lá bị vàng nhƣng các lá gốc chƣa rụng ngay mà về sau khi phần thân sát mặt
đất khơ tóp lại và có màu vàng nhạt, ranh giới giữa mô bệnh và mô khỏe là
không rõ ràng, phần gốc tiếp giáp với rễ có màu nâu xám nham nhở khác với
vết thƣơng do trầy xƣớc. Cây bị bệnh lá héo từ dƣới lên trên, phần thân dƣới
cùng và rễ bị thối dần nên có thể nhổ cây một cách dễ dàng. Nguyên nhân là
do sợi nấm mọc lấn át, thít chặt các bó mạch dẫn làm cho ban đầu cây bị héo
sau đó phần thân và rễ bị thối dần.

Nấm Fusarium moniliorme gây nên bệnh l a von với các triệu chứng
nhƣ: cây phát triển cao vọt, cong queo, lá bệnh chuyển màu xanh nhạt sau đó
chuyển màu vàng gạch cƣa, cứng gi n rồi chết nhanh chóng, dóng thân cây

12


phát triển cao vọt và mọc ra nhiều rễ phụ ở đốt và có lớp phấn trắng phớt
hồng bao quanh, hạt bị bệnh thƣờng lửng, lép, màu xám... [11].
Nấm Fusarium verticillioides là nguyên nhân gây bệnh mốc hồng trên
ngô biểu hiện một số triệu chứng: gây vết đốm nhỏ màu nâu trên thân cây, sau
đó phát triển rộng tạo ra thành vết thối xung quanh thân làm phần này bị thối
mục. Khi có gió lớn phần này dễ bị gãy, ngồi ra có thể gây thối đen trên rễ
và gây hiện tƣợng cây bị héo vàng [11].
Nấm Fusarium oxysprorum là nguyên nhân gây bệnh héo, thối nõn,
thân, rễ và mầm cây trên nhiều lý chủ khác nhau nhƣ thuốc lá, cà chua, khoai
lang, khoai tây, cây hoa huệ... (Hình 1.1A). Nấm Fusarium oxysprorum có
dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào tử hình trăng khuyết, một
đầu thắt lại hình bàn chân. Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa bào hình cầu hoặc
hình bầu dục.Một số lồi Fusarium oxysprorum có bào tử nhỏ, bào tử hậu và
quả thể hoặc khơng có bào tử hậu. Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển là
25 - 30oC, phát triển trong 4 - 5 ngày ở độ ẩm 90 - 95%. Nhiệt độ tối ƣu cho
gây bệnh là 30oC hoặc cao hơn. Tuy nhiên nhiễm trùng qua hạt giống có thể
xảy ra ở nhiệt độ thấp tới 14oC.
1.2.2 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae
 Bệnh bạc lá ở cây lúa
Bệnh bạc lá ở cây lúa (Hình 1.1B) lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở
Fukouka - Nhật Bản vào năm 1884. Ban đầu, các nhà khoa học tƣởng lầm
nguyên nhân gây nên triệu chứng bệnh là do acid đất (Bokura, 1911). Sau đó,
các nhà khoa học đã cơng nhận ngun nhân của nó là do vi khuẩn gây nên và

theo Ishiyama, (1922) loài vi khuẩn đó thuộc loại vi khuẩn Bacillus oryzae.
Vi khuẩn này sau đó đƣợc Tagami, Mizukami (1962), Wakimoto (1969) đặt
tên là Pseudomonas oryzae, về sau Dowson đặt tên là Xanthomonas oryzae.
Bệnh bạc lá ở cây l a trở nên phổ biến ở tất cả các vùng trồng l a khác
nhau trên thế giới vào cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỉ XX, đặc biệt
trên các nƣớc trồng l a ở châu Á nhƣ: Ấn Độ (1990), Philipin (1957), Indonexia
13


(1950), Trung Quốc (1957). Ở Việt Nam, bệnh đƣợc phát hiện từ sau hồ bình
lập lại (1945) trên các giống l a địa phƣơng cao cây. Sau đó, do phong trào thâm
canh l a lên cao đã làm cho bệnh bạc lá l a phát triển mạnh trên diện rộng, phức
tạp và khó ph ng trừ, thƣờng xuyên gây hại nặng ở vụ mùa. Bệnh đã phát triển
nhiều thành dịch lớn ở một số tỉnh đồng bằng sông Hồng trong v ng từ năm
1968 – 1975 [10]. Trong những năm gần đây, ở miền Bắc, thiệt hại do bệnh bạc
lá l a có xu hƣớng tăng trở lại và gây hại ở cả vụ xuân.
 Vi khuẩn Xanthomonas oryzae
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae có dạng hình gậy ngắn, hai đầu hơi tr n,
có một lơng roi ở một đầu, kích thƣớc 1 - 2 x 0,8 - 1μm. Trên môi trƣờng
nhân tạo, khuẩn lạc của vi khuẩn có dạng hình tr n, có màu vàng sáp, rìa
nhẵn, bề mặt ƣớt, háo khí, nhuộm gram âm.
Vi khuẩn này khơng có khả năng phân giải nitrat, khơng có dịch hóa
gelatin, khơng tạo NH3, idol nhƣng tạo H2S, tạo khí nhƣng khơng tạo acid
trong mơi trƣờng có đƣờng.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trƣởng từ 26 - 30oC, nhiệt độ tối
thiểu 0 - 5oC, tối đa 40oC. Nhiệt độ làm vi khuẩn chết là 53 oC.
Xanthomonas oryzae có khả năng sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 –
8,5 thích hợp nhất là ở pH khoảng 6,8 – 7,2; tồn tại khơng lâu trong đất và chỉ có
thể tồn tại 15 - 38 ngày trong môi trƣờng nƣớc; tuy nhiên c n tùy thuộc vào loại
đất, tồn tại 7 - 8 tháng trong hạt giống nhƣng chỉ 3 - 4 tháng trong rơm [12].

Vi khuẩn xâm nhập có tính chất thụ động, có thể xâm nhiễm qua thủy
khổng, lỗ khí ở trên n t mép lá. Khi đã tiếp x c với bề mặt có màng nƣớc, vi
khuẩn dễ dàng di động và xâm nhập vào bên trong các lỗ khí, qua vết thƣơng
mà sinh sản nhân lên ở mặt số lƣợng, theo các bó mạch dẫn mà lan rộng đi
[10]. Trong điều kiện mƣa ẩm thích hợp thuận lợi cho sự phát triển của vi
khuẩn, trên bề mặt vết bệnh tiết ra những giọt vi khuẩn. Thông qua sự va
chạm giữa các lá l a, nhờ gió lan truyền bệnh sang các lá khác để tiến hành
xâm nhiễm lặp lại nhiều lân trong thời ký sinh trƣởng của cây.
14


1.2.3 Vi khuẩn Ewinia
Bệnh thối nhũn thân, rễ, lá (Hình 1.1C) xuất hiện phổ biến trên cây
ngô, cây lúa, phong lan, khoai tây… do vi khuẩn Erwinia gây ra. Hiện nay
chƣa có cách ph ng trị bệnh hiệu quả. Chính vì vậy, thiệt hại do vi khuẩn
Erwinia sp trên cây trồng là rất lớn đặc biệt vào mùa xuân.
Trên thế giới, bệnh do Erwinia gây ra rất lớn, hiện diện khá phổ biến ở
Brazil, Mỹ, Ấn Độ, Ai Cập, Úc, Israel… Đây là bệnh hại trên cây ngô trồng ở
vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, đặc biệt gây hại nghiêm trọng trong điều kiện
nhiệt độ và độ ẩm cao. Ở Việt Nam, hằng năm, Erwinia gây thiệt hại lớn trên
các vƣờn lan tại thành phố Đà Lạt và các ruộng ngô, thanh long của đồng
bằng song Cửu Long.
Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua những vết thƣơng tạo nên vết thối ƣớt
với mùi hơi khó chịu. Ban đầu vết thối nhỏ có màu vàng nâu, bệnh nặng vết
thối lan nhanh trong lá và gây rụng lá. Thời tiết khí hậu nóng ẩm gi p bệnh
phát triển mạnh mẽ hơn [12].
Bệnh thƣờng xảy ra vào những ngày mƣa dầm. Vi khuẩn Erwinia phát
triển thuận lợi trong phạm vi nhiệt độ từ 27 - 32oC, tuy nhiên có thể chết trong
điều kiện khơ và dƣới ánh nắng trực tiếp.

Hình 1.1. Các bệnh cây trồng thường gặp
A: Bệnh héo rũ vàng trên cây cà chua
B: Bệnh bạc lá ở cây l a
C: Bệnh thối nhũn trên cây phong lan
15


1.3.Tình hình nghiên cứu về vi sinh vật đối kháng
1.3.1 Trên thế giới
Vi sinh vật đối kháng với một số bệnh cây trồng đã đƣợc các nhà khoa
học trên thế giới nghiên cứu và ứng dụng từ những năm đầu của thế kỷ XX.
Cho tới nay có khoảng 30 nƣớc đã có những nghiên cứu sử dụng vi sinh vật
đối kháng để trừ bệnh hại cây trồng (Nga, Mỹ, Đức, Hunggari, Ấn Độ, Thái
Lan, Philippin…) cho khoảng hơn 150 loài vi sinh vật gây bệnh trên hơn 40
loại cây trồng.
Theo Elad và cs (1982) [16], dùng chế phẩm Trichoderma sp. Có tác
dụng ph ng trừ bệnh hại cây trồng, làm giảm tỷ lệ cây bị bệnh rõ rệt, chế
phẩm nấm đối kháng nấm Trichoderma sp. Có thể gi p cây khỏe hơn, tăng
sức đề kháng với vi sinh vật gây bệnh, tác dụng kích thích sinh trƣởng đối với
cây. Theo Dutta và Das (1999), đã thử nghiệm khả năng ph ng trừ sinh học
của nấm Trichoderma harzianum bằng cách cho một số lƣợng lớn bào tử nấm
này nuôi trồng trong mơi trƣờng rắn vào đất để kiểm sốt nấm Rhizoctonia
solani trên cây đậu tƣơng. Trichoderma harzianum khi bón vào đất với tỷ lệ
1:10 theo thể tích đã ngăn chặn đƣợc bệnh ở thân và rễ do nấm Rhizoctonia
solani gây hại đồng ruộng.
Kết quả nghiên cứu của Ganesan và Gnanamanickam (1987) [17], sử
dụng các chủng vi khuẩn bản địa Pseudomonas fluorescens đánh giá khả năng
của ch ng trong hạn chế bệnh héo rũ gốc mốc trắng lạc do Sclerotium rolfsii
cho thấy vi khuẩn Pseudomonas fluorescens có khả năng ức chế sinh trƣởng
của sợi nấm Sclerotium rolfsii ở điều kiện in vitro, giảm khả năng nảy mầm

của hạch nấm và giảm tỷ lệ bệnh ở trong điều kiện nhà kính.
Theo kết quả công bố của Kishore và cs (1995) [19], 393 chủng vi
khuẩn nội sinh (endophyte) Pseudomonas đƣợc sử dụng xử lý hạt giống lạc
và tƣới vào đất để đánh giá khả năng ph ng trừ bệnh thối trắng hại lạc
Sclerotium rolfsii. Trong đó, 12 chủng có khả năng giảm tỉ lệ bệnh cây chết.
Và sử dụng 12 chủng này nghiên cứu ở điều kiện in vitro cho thấy ch ng có
16


khả năng làm giảm sự sinh trƣởng của sợi nấm Sclerotium rolfsii và hoạt chất
của ch ng tiết ra có khả năng ức chế enzyme phân huỷ vách tế bào của nấm
Sclerotium rolfsii.
Kết quả nghiên cứu của Anand và Kulothungan (2010) [14], cho thấy
các chủng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens đƣợc phân lập từ rễ cây lạc
khỏe và đánh giá khả năng đối kháng của ch ng với nấm gây bệnh héo rũ gốc
mốc đen Aspergillus niger. Kết quả ở điều kiện in vitro cho thấy 5 trong số 60
chủng Pseudomonas fluorescens có khả năng đối kháng và có khả năng tạo ra
các enzyme thuỷ phân nhƣ protease, lipase và các hợp chất thứ cấp nhƣ
xianhydric acid, salicylic acid. Bên cạnh đó các chủng vi khuẩn Pseudomonas
fluorescens có khả năng làm giảm tỷ lệ bệnh c n 8,27% trong khi đó đối
chứng là 18,77% và năng suất quả khô đạt 1800,48 kg ha và đối chứng đạt
1557,14 kg/ha [26].
1.3.2 Việt Nam
Viện Bảo vệ Thực vật đã tiến hành phân lập các chủng Trichoderma từ
các nguồn khác nhau và xác định khả năng ức chế của Trichoderma đối với
một số nấm gây bệnh, tìm phƣơng pháp ni cấy để tạo chế phẩm. Các chủng
nấm Trichoderma thu thập đƣợc có hiệu quả ức chế từ 67,7 – 85,5% đối với
các nấm gây bệnh nhƣ Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium sp,
Aspergillus sp.
Dƣơng Minh và cs (2006) [7], đã tuyển chọn đƣợc các chủng nấm đối

kháng Trichoderma spp. Có hiệu quả ph ng, trị tốt các bệnh do Phytophthora
palmivora gây hại trên cây sầu riêng tại đồng bằng sông Cửu Long. Khả năng
tiết enzyme thủy phân của các chủng Trichoderma đƣợc phân lập tại Việt
Nam cũng đã đƣợc nghiên cứu.
Nguyễn Lân Dũng và cs (1998) đã tiến hành tối ƣu điều kiện nuôi
cấy vi khuẩn Bacillus thuringiensis ứng dụng trong diệt trừ sâu bệnh hại.
Đinh Minh Hiệp và cs (2007) [6], đã tiến hành khảo sát hoạt tính các
enzyme chitinase, β - glucanase, cellulose, pectinase, amylase và protease của
17


92 chủng Trichoderma phân lập tại Việt Nam. Kết quả cho thấy, ngoại trừ
enzyme protease, có sự chênh lệch khác biệt về hoạt tính các enzyme này giữa
các chủng Trichoderma khảo sát. Ngoài ra, kết quả nghiên cứu c n chọn ra
đƣợc 26 92 chủng Trichoderma có khả năng sinh tổng hợp các enzyme
chitinase, β- glucanase, cellulose, pectinase và amylase cao.

18


CHƢƠNG 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng
một số chủng vi sinh vật gây bệnh ở thực vật.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng từ các mẫu đất thu
thập đƣợc.
- Tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng đối kháng với một số vi
sinh vật gây bệnh (vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây bệnh bạc lá ở cây l a,

nấm Fusarium oxysprorum gây bệnh héo vàng trên cây cà chua, vi khuẩn
Erwinia carotovora bệnh thối nhũn trên phong lan.
- Xác định một số đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi sinh vật
đối kháng tuyển chọn phục vụ cho nghiên cứu định danh lồi sau này.
+ Đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào của các chủng vi sinh
vật tuyển chọn
+ Khả năng sinh tổng hợp enzyme ngoại bào (amylase, cellulase,
protease)
+ Xác định hoạt tính catalase
+ Xác định khả năng lên men các loại đƣờng
2.3. Vật liệu nghiên cứu
Các mẫu đất lấy từ núi Luốt thuộc trƣờng Đại học Lâm nghiệp Việt
Nam và ruộng lúa ở thị trấn Xuân Mai, đƣợc kí hiệu theo bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kí hiệu mẫu đất
Kí hiệu

Địa điểm lấy mẫu

STT

mẫu đất

1

Sƣờn phía Đông núi Luốt

2

Ruộng lúa ở thị trấn Xuân Mai, Chƣơng Mỹ, Hà RL

SN

Nội
19