NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT: KỸ THUẬT VÀ ỨNG DỤNG.TS.VŨ BÍCH NGỌC

10/1/17

TS.VũBíchNgọ

1


SINH HỌC CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Đặcđiểmsinhhọccủa
tếbào
Cácyếutốảnhhưởng
đếnsựthànhcơngcủa
nicấytếbào
10/1/17

TS.VũBíchNgọc-


ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Tínhcơhọcyếu(dễvỡ)

10/1/17

Tăngtrưởng,phânchiachậm(20-40giờ)
Hiệusuấtsinhchấtcóhoạtcnhsinhhọcthấp

TS.VũBíchNgọc-

Chukìtếbào
G2 check point
•  DNA replicated
•  cell big
•  environment suitable

G2
Gap2

M
Mitosis

Metaphase check point
•  chromosome align on spindle

G1
Gap1

G0
S
Synthesis

G1 check point
•  cell big
•  environment suitable

4


Chukìtếbào

• 

Interphase:

–  Nhìnchungkéodàitừ12-14giờtrongmơđộngvậtcóvú
–  TếbàođangtổnghợpRNA,tạoproteinvàpháttriểnvềkíchthước

•  Gap0(G0):tếbàothốtrakhỏichukìtếbàovàkhơngphânchia
•  Gap1(G1):tếbàogiatăngkíchthước,tổnghợpRNAvàprotein,có1G1
Checkpoint
•  SPhase:sựnhânđơiDNAxảyra
•  Gap2(G2):tếbàosẽcếptụcpháttriểnvàsảnxuấtcácproteinmới.Có1G2
Checkpoint

• 

MitosishayMPhase:
– 
– 
– 
– 

Sựpháttriểnvàtổnghợpprotein
Tếbàochiathành2tếbàogiốngnhau.
Mitosisthườngxảyratừ1-2giờ
CóCheckpointtronggiữakìcủaMitosis(MetaphaseCheckpoint)đểđảmbảo
tếbàohồnthànhxongsựphânchia.

5

Chukìtếbào
•  Làđiểmquantrọngquyết
địnhsựphânchiacủatê
sbaof
•  Khitếbàovượtquađiểm
này,đivàophaseS,qtrình
phânchiakhơngthểđảo
ngược.


Chukìtếbào
•  Đảmbảotếbàophânchia
thuậnlợi
•  Nếutếbàobịlỗihoặctổn
thương,G”checkpointsẽ
dừnglạiđểsửachữa
•  Nếutổnthươngkhơngthể
đảongược,tếbàođivào
qtrìnhapoptosisàđảm
bảoDNAhưhỏngtếbào
khơngtruyềnchothếhệ
saquantrọngtrongngăn
ngừaungthư


Chukìtếbào


SỰTĂNGSINHINVITRO

•  SựTĂNGSINHcủatếbàotrongnicấyphụthuộc:
–  Trạngtháitựnhiêncủatếbào:
Vaitrịcủabộgen–GiớihạnHayflick
Vaitrịcủasựbiểuhiệngen

• 
• 

–  Mơitrườngnicấy
• 
• 
• 
• 
• 

Cơchấttếbàobám
Thànhsinhlívàsinhhốcủamơitrườngni
Thànhphầncủaphasekhí
Nhiệtđộni
Tươngtáctếbào-tếbàovàtếbào-chấtnền

9


ThờigiannhânđơicủarBMMSCkhơngthayđổi
trongsuốtqtrìnhnitrongkhiởhASC,rASC,
hBMMSCthờigiannàytănggấp2


IzadpanahR,TryggC,PatelB,etal.BiologicProperŠesofMesenchymalStemCellsDerived

FromBoneMarrowandAdiposeTissue.Journalofcellularbiochemistry.2006;99(5):1285


Thayđổikiểugenvàkiểuhình
Dunghợp,biếnnạp,tảinạp…àtế
bàothayđổikiểugenvàkiểuhình

•  Ởmỗitếbàophânchia,
sựtựlàmmớivàbiệthố
đượcquyếtđịnhbởi
tươngtáccủayếutốbên
trongvàcnhiệuhướng
dẫnhoặccnhiệuchọnlọc
bênngồi


Thayđổikiểugenvàkiểuhình
•  MSCcủacáclồicókhảnăngbiệthốthành
tếbàomỡnhưnhauởpass5(6-8ngày)
•  rASCvàhBMMSCthờigiantạogiọtmỡdài
hơnởpass10;khơngcókhảnăngtạomỡsau
pass15
•  rBMMSCvàhASC:ítthayđổikhảnăngbiệt
hố,thờigianhìnhthànhgiọtmỡkhơngkhác
nhauchođếnpass20


Thayđổikiểugenvàkiểuhình
•  hASCvàrBMMSCbiệthốthànhdịngtếbào
tạoxươngtrongsuốtqtrìnhnicấy

•  rASCvàhBMMSCmấtkhảnăngbiệthố
thànhdịngtếbàotạoxươngsaupass10




Thayđổikiểugenvàkiểuhình
•  Chiềudàitelomeregiảmtheotuổi
•  Hoạtcnhcủatelomerasecaonhấtởcácpass
đầuŠên
•  mứcđộhoạtđộngcủatelomerasekhácnhau
giữacáclồivàcácnguồnthu:giảmnhiều
nhấtởrASCvàhBMMSC


Yếutốphiênmã
•  chịutráchnhiệmđiềuhồđặccnhsinhhọccủa
tếbào
–  POUđượcmãhốbởiOct-4
–  Oct-2,Sox-2vàRex1điềuhồchặtchẽtrongq
trìnhpháttriểnphơi
à DuytrìcnhđaŠềmnăngcủatếbào

•  Cácyếutốkhác(bổsungtừngồi):địnhhướng
sựbiệthốcủatếbào(BMP-6,TGF-β3,
dexamethasone,ascorbate2-phosphate,proline,
pyruvate,insulin,transferrin,selenousacid,5azacysŠdine)


Tínhchấtcầngiáđỡ

-TBbámvàogiáđỡđểcóthểsốngsót,phânchia
-Ngoạitrừ:hồngcầu,TBungthư,1sốdịngTBliêntục


10/1/17

TS.VũBíchNgọc-


SỰBÁMDÍNHINVITRO
•  Sựbámdínhtếbàolàcầnthiếtchosựtăngsinhvà
biệthóa
•  Cácphântửbámdínhtếbào:
–  Tươngtáctếbào-tếbào:CAMs,cadherins
–  Tươngtáctếbào-chấtnền:integrin,transmembrame
proteoglycan

•  Phứchợpnốichặt(TightjuncŠonalcomplex)trong
tếbàobiểumơchosựtươngtáctếbào-tếbào.

19


Cácnhântốảnhhưởngđếnsự
bámdính
•  SựphântáchbằngenzymeŠêuhủycácphân
tửbámdínhvàchấtnềnngoạibào
•  Hầuhếttếbàotừmơrắnpháttriểndạng
monolayer

•  BềmặtbaophủvớiMatrixkíchthíchsựtăng
sinhvàbiệthóa`

ExperimentalMethods2006

20


KÌMHÃMTIẾPXÚC
-ĐIỀUHỒSỰTĂNGSINH
•  KìmhãmŠếpxúc
•  Kíchthíchsựtăngsinh

–  Mậtđộthấp
–  Cáccnhiệutừmơitrường:cácnhântốtăng
trưởng

•  Ứcchếsựtăngsinh

–  Giớihạnmậtđộ:mậtđộtếbàocao
–  KìmhãmŠếpxúc:tươngtáctếbào
–  Cáccnhiệutừmơitrường:p53geneproduct
21


Cácyếutốảnhhưởngđếnsựthành
cơngcủanicấytếbào
•  Tếbàothíchhợp
•  Điềukiệnthíchhợp
–  Phaserắn

•  Cơchấthayphasemàtếbàopháttriểneg.glass,plasŠc,collagen,agar

–  Phaselỏng
•  Cácđặccnhsinhlívàlíhóacủathànhphầnmơitrườngni

–  Phasekhí
–  Nhiệtđộ
–  Độvơtrùngcủamơitrường

ExperimentalMethods2006

22


Pharắn
•  Tếbàocầnbámdínhvàomộtgiáthểđể
sinhtrưởngvàdichuyển
•  Dụngcụphổbiếnnâấtlàpolystyrene
plasŠc
•  Nhữngcơchấtkhácnhưglass,filterwells
•  Bềmặtcótêểđượcxửlívới:
–  PhủvớicơchấtnềnnhưCollagen,poly-llysine,matrigel
–  Lớpfeeder:monolayerofsupporŠngcells,
perhapspromotecellgrowthand
differenŠaŠonbycellcontactandsubstance
secreted
•  Neuronsonglialcellfeederlayers

ExperimentalMethods2006

23


Phaselỏng
•  Thànhphầncủamơitrường
–  Muốivơcơ
•  Cânbằngápsuấtthẩmthấu
•  Điềuhịađiệnthếmàng:sodium,potassiumvà
calciumions.
•  Cầnthiếtchosựbámdínhnhưenzymecofactor.
–  Carbohydrate
•  Hầuhếtchứa4-20mMglucose
•  Nguồnnănglượng:glycolysis
ExperimentalMethods2006

24


Phaselỏng
–  ProteinsandPepcdes
•  Đượcsửdụngđểthaythếhiệndiệntronghuyết
thanheg.transferrin,fibronecŠn
–  Aminoacids
•  Quantrọngchosựtăngsinhvàbiệthóa
•  glutaminecóthểđivàochutrìnhKreb’scycle
–  Fa€yAcidsandLipid
•  Quantrọngtrongmơitrườngserumfreemedia
e.g.cholesterolandsteroidscầnthiếtchocáctế
bàođặcbiệt.
ExperimentalMethods2006

25