Giới thiệu về nuôi cấy tế bào động vật doc

Giới thiệu về nuôi cấy tế
bào động vật
Phạm văn Phúc
PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc
Bộ môn Động vật-Sinh lí Động vật
Experimental Methods 2006 2
Mục tiêu
• Sau khi học bài này, sinh viên có thể:
– Thế nào là nuôi cấy mô và các kiểu nuôi cấy mô
– Ứng dụng của nuôi cấy mô
– Thuận lợi và bất lợi của mỗi kiểu nuôi cấy mô
– Một số khái niệm cơ bản
Experimental Methods 2006 3
Nuôi cấy mô là gì?
• Nuôi cấy In vitro (duy trì và/hay tăng sinh)
các tế bào, mô và các cơ quan
• Các kiểu nuôi cấy mô
– Nuôi cấy cơ quan
– Nuôi cấy mô
– Nuôi cấy tế bào
Experimental Methods 2006 4
Nuôi cấy cơ quan
• Nuôi cấy phôi hay cơ quan tách khỏi cơ thể
• Thuận lợi
– Chức năng sinh lí bình thường được duy trì
– Tế bào giữ trạng thái biệt hóa hoàn toàn
• Bất lợi
– Không thể nuôi cấy quy mô lớn
– Phát triển chậm
– Fresh explantation is required for every
experiment.

Experimental Methods 2006 5
Nuôi cấy mô
• Các mảnh của mô được phát triển trong môi
trường nuôi cấy
• Thuận lợi
– Một số chức năng bình thường được duy trì
– Có thể nuôi cấy quy mô lớn (nhưng khó tiến hành)
• Bất lợi
– Tổ chức ban đầu của mô mất
Experimental Methods 2006 6
Nuôi cấy tế bào
• Mô được tách thành tế bào đơn, hầu hết
là bằng enzyme, thành huyền phù tế bào
được nuôi cấy in vitro như monolayer hay
nuôi cấy huyền phù
• Thuận lợi
– Phát triển một dòng tế bào qua nhiều thế hệ
– Có thể nuôi cấy quy mô lớn
• Bất lợi
– Tế bào mất một số đặc tính đã biệt hóa trong
mô
EMP04 7
Experimental Methods 2006 8
Tại sao cần nuôi cấy mô?
• Nghiên cứu
– Vượt qua các vấn đề trong nghiên cứu như:
• Các tác động của các mô xung quanh
• Các biến đổi mà do các điều kiện của động vật
– Giảm các động vật sử dụng
• Sản xuất các sản phẩm thương mại

– vaccine, antibody, hormone
– Tế bào sử dụng cho cấy ghép
Experimental Methods 2006 9
Advantages of Cell culture
• Advantages:
– Absolute control of physical environment
– Homogeneity of sample
– Less compound needed than in animal models
• Disadvantages:
– Hard to maintain
– Only grow small amount of tissue at high cost
– Dedifferentiation
– Instability, aneuploidy
10
Các kiểu nuôi cấy tế bào
1. Nuôi cấy sơ cấp (Primary Culture)
– Thu nhận trực tiếp từ các mô và nuôi cấy theo kiểu
như
• Sự phát triển ra của các mô trong nuôi cấy
• Tách thành tế bào đơn (bằng enzyme hay cơ học)
– Thuận lợi:
• Thường giữ được nhiều các đặc tính đã được biệt hóa
của tế bào in vivo.
– Bất lợi:
• Ban đầu hỗn tạp nhưng sau đó trở nên nổi trội ở các
fibroblast
• Các nuôi cấy sơ cấp thường tốn công sức
• Có thể duy trì in vitro trong thời gian giới hạn
11
2. Nuôi cấy thứ cấp

– Cấy chuyền (or passage, or transfer) từ nuôi cấy sơ
cấp
• Cấy chuyền = quá trình thu nhận và tái nuôi cấy
tế bào sau khi chúng gia tăng số lượng bản sao
trong nuôi cấy
– Thường chứa kiểu êế bào đơn
– Có thể tăng sinh liên tục trong nhiều thế hệ
– Có hai kiểu dòng tế bào khi nuôi cấy:
• Dòng tế bào
• Dòng tế bào liên tục
Các kiểu nuôi cấy tế bào
Experimental Methods 2006 12
1) Dòng tế bào
• Có đời sống hạn định, lão hóa sau một số âần
cấy chuyền nhất định (chừng 30 lần phần chia)
• Thường là lưỡng bội và duy trì một số mức độ
biệt hóa
• Cần thiết để thiết lập một hệ thống ngân hàng
Master và ngân hàng làm việc để duy trì những
dòng này trong thời gian dài
Các kiểu nuôi cấy tế bào
Experimental Methods 2006 13
2) Dòng tế bào liên tục
• Có thể tăng sinh không hạn định
• Chúng thường là những tế bào chuyển dạng:
– Tế bào từ khối u.
– Nhiễm với các viral oncogenes
– Xử lí hóa chất (chemical treatments).
• Bất lợi của những dòng này là giữ lại rất ít các
đặc tính in vivo.

Experimental Methods 2006 14
Chuyển dạng (Transformation)
Và Chuyển nhiễm (Transfection)
• Chuyển dạng
– Cảm ứng thay đổi kiểu hình ban đầu thông qua ưự thay
đổi DNA và sự biểu hiện gen
• Tốc độ phát triển
• Kiểu phát triển (loss of contact inhibition)
• Hình thành sản phẩm chuyên biệt
• Kéo dài tuổi thọ
• Mất khả năng bám dính
• Chuyển nhiễm
– Đưa DNA vào trong tế bào (like viral DNA)
Experimental Methods 2006 15
Khởi sự một nuôi cấy
Mô
Nuôi cấy tế bào sơ cấp
Dòng tế bào Dòng tế bào liên tục
Phân tách
Cấy chuyền
Hạn định số lượng Không hạn định số lượng
Bảo quản Bảo quản
Experimental Methods 2006 16
Hình dạng tế bào khi nuôi
• Hình dạng tế bào khi nuôi cấy ở 2 dạng chính:
– Phát triển huyền phù (như một tế bào đơn hay các cụm nhỏ tế bào)
• Dòng tế bào thu từ máu (leukaemia, lymphoma)
– Phát triển dạng monolayer bám dính vào dụng cụ nuôi.
• Tế bào thu từ các mô rắn (lungs, kidney), endothelial, epithelial, neuronal,
fibroblasts

Hela-Epithelial
MRC5-Fibroblast
SHSY5Y-Neuronal
BAE1-Endothelial
Experimental Methods 2006 17
Special types of Cell culture
Cells in the culture can be grown to
adopt
in vivo
characteristic
• Histotypic culture
– Single cell lineage
• Organotypic culture
– Multiple cell lineages
Experimental Methods 2006 18
Sinh học của tế bào nuôi cấy
• Sự phát triển và tăng trưởng của tế bào trong
nuôi cấy phụ thuộc:
– Trạng thái tự nhiên của tế bào
– Môi trường nuôi cấy
• Cơ chất tế bào bám
• Thành sinh lí và sinh lí của môi trường nuôi
• Thành phần của phase khí
• Nhiệt độ nuôi
• Tương tác tế bào-tế bào và tế bào-chất nền
Experimental Methods 2006 19
Chu kì tế bào
M
Mitosis
G1

Gap1
G2
Gap2
G0
S
Synthesis
G1 check point
• cell big
• environment suitable
G2 check point
• DNA replicated
• cell big
• environment suitable
Metaphase check point
• chromosome align on spindle
Experimental Methods 2006 20
Chu kì tế bào
• Interphase:
– Nhìn chung kéo dài từ 12-14 giờ trong mô động vật có vú
– Tế bào đang tổng hợp RNA,tạo protein và phát triển về kích
thước
• Gap 0 (G0): tế bào thoát ra khỏi chu kì tế bào và không phân chia
• Gap 1 (G1): tế bào gia tăng kích thước, tổng hợp RNA và protein, có
1 G1 Checkpoint
• S Phase: sự nhân đôi DNA xảy ra
• Gap 2 (G2): tế bào sẽ tiếp tục phát triển và sản xuất các protein mới.
Có 1 G2 Checkpoint
• Mitosis hay M Phase:
– Sự phát triển và tổng hợp protein ngừng
– Tế bào chia thành 2 tế bào giống nhau.

– Mitosis thường xảy ra từ 1-2 giờ
– Có Checkpoint trong giữa kì của Mitosis (Metaphase
Checkpoint) để đảm bảo tế bào hoàn thành xong sự phân chia.
Experimental Methods 2006 21
Các nhân tố ảnh hưởng đến sự
tăng sinh tế bào
• Kích thích sự tăng sinh
– Mật độ thấp (leaves the cell with free
edge)
– Các tín hiệu từ môi trường: các nhân tố
phát triển
• Ức chế sự tăng sinh
– Giới hạn mật độ: mật độ tế bào cao
– Kìm hãm tiếp xúc: tương tác tế bào
– Các tín hiệu từ môi trường: p53 gene
product
Experimental Methods 2006 22
Nhân tố ảnh hưởng đến sự
biệt hóa
• Sự biệt hóa tế bào là quan trọng cho các
chức năng tế bào bình thường
• Nhân tố kích thích sự biệt hóa tế bào:
– Mật độ tế bào cao
– Tương tác tế bào-tế bào và tương tác tế bào-chất
nền
– Chất cảm ứng: hydrocortisone, retinoid, matrix
Experimental Methods 2006 23
Các nhân tố ảnh hưởng đến
tính bám dính
• Sự bám dính tế bào là cần thêết cho sự

tăng sinh và biệt hóa (signaling through
cytoskeleton)
• Các phân tử bám dính tế bào:
– Tương tác tế bào-tế bào: CAMs, cadherins
– Tương tác tế bào-chất nền: integrin,
transmembrame proteoglycan
• Phức hợp nối chặt (Tight junctional
complex) trong tế bào biểu mô cho sự
tương tác tế bào-tế bào.
Experimental Methods 2006 24
Các nhân tố ảnh hưởng đến
sự bám dính
• Sự phân tách bằng enzyme tiêu hủy các
phân tử bám dính và chất nền ngoại bào
• Hầu hết tế bào từ mô rắn phát triển dạng
monolayer
• Bề mặt bao phủ với Matrix kích thích sự
tăng sinh và biệt hóa`
Experimental Methods 2006 25
Các yếu tố ảnh hưởng đến sự
thành công của nuôi cấy tế bào
• Tế bào thích hợp
• Điều kiện thích hợp
– Phase rắn
• Cơ chất hay phase mà tế bào phát triển eg. glass, plastic, collagen,
agar
– Phase lỏnt
• Các đặc tính sinh lí và lí hóa của thành phần môi trường nuôi
– Phase khí
– Nhiệt độ

– Độ vô trùng của môi trường