Phân lập, tuyển chọn các chủng baciluus subtilis có khả năng sinh tổng hợp poly gamma glutamic acid(khóa luận công nghệ sinh học lâm nghiệp)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP
----------o0o----------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Baciluus
subtilis CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP POLY
GAMMA GLUTAMIC ACID
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ

: 7420201

Giáo viên hướng dẫn

: TS. Vũ Kim Dung

Sinh viên thực hiện

: Nguyễn Thị Hải Yến

Lớp

: K61 – CNSH

Khóa học

: 2016 - 2020

Hà Nội, 2020

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hồn thành đề tài khóa luận, em xin chân thành cảm ơn các
thầy cô ban giám hiệu Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, đặc biệt là ban lãnh đạo
Viện cùng các thầy cô Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện
và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Th.S Đào Văn
Minh – cán bộ phịng Cơng nghệ sinh học nông nghiệp – Viện Nghiên cứu
Phát triển Vùng, ngƣời đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình giúp đỡ em trong suốt
thời gian thực tập và nghiên cứu, giúp cho em có thêm kiến thức chun mơn,
xây dựng nền tảng vững chắc phục vụ cho việc học tập và nghiên cứu.
Em xin chân thành cảm ơn TS Vũ Kim Dung – chủ nhiệm bộ mơn Vi
sinh – Hóa sinh viện Cơng nghệ sinh học Lâm nghiệp đã tận tình giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân đến gia đình, bạn bè, những ngƣời ln
ở bên động viên, khích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, làm việc
và hoàn thành đề tài.
Với sự cố gắng thực hiện đề tài một cách nghiêm túc nhƣng sự thiếu sót
và hạn chế của bản thân, vẫn gặp phải những điều mà em chƣa làm đƣợc. Rất
mong nhận đƣợc sự đóng góp và đƣa ra ý kiến của quý thầy giáo, cơ giáo để
luận văn đƣợc hồn thiện hơn.
Xin chân thành cảm ơn!

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii

DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH ẢNH ................................................................................ v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................... 2
1.1. Tổng quan về Polygammar Glutamic Acid ............................................... 2
1.1.1. Giới thiệu về PGA ................................................................................... 2
1.1.2. Tính chất PGA......................................................................................... 3
1.1.3. Phân loại PGA ......................................................................................... 4
1.1.4. Ứng dụng PGA ........................................................................................ 5
1.2. Các nguồn thu nhận PGA........................................................................... 8
1.2.1. Bacillus subtilis ....................................................................................... 9
1.2.2. Bacillus licheniformis ........................................................................... 10
1.2.3. Bacillus anthracis .................................................................................. 10
1.3. Cơ chế sinh tổng hợp PGA ...................................................................... 10
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp PGA ........................ 13
1.4.1. Ảnh hƣởng của các yếu tố dinh dƣỡng ................................................. 13
1.4.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố ngoại cảnh .................................................. 14
1.5. Thu hồi PGA ............................................................................................ 15
1.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam ..................................... 15
CHƢƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
......................................................................................................................... 18
2.1. Mục tiêu nghiên cứu................................................................................. 18
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 18
2.3. Vật liệu ..................................................................................................... 18
2.3.1. Nguồn phân lập ..................................................................................... 18
2.3.2. Hóa chất................................................................................................. 18
2.3.3. Mơi trƣờng ni cấy .............................................................................. 18
ii

2.3.4. Thiết bị .................................................................................................. 19
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 19
2.4.1. Phƣơng pháp phân lập tuyển chọn chủng có khả năng sinh PGA ........ 19
2.4.2. Phƣơng pháp giữ giống vi sinh vật. ...................................................... 21
2.4.3. Phƣơng pháp định tên bằng sinh hóa và sinh học phân tử.................... 21
2.4.4. Phƣơng pháp khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng sinh tổng hợp
PGA ................................................................................................................. 25
2.4.5. Phƣơng pháp thu hồi PGA .................................................................... 27
2.4.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng PGA ............................................... 27
2.5. Phƣơng pháp xác định sơ bộ khả năng loại bỏ ion Fe3+, Cu2+ ................. 28
CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 29
3.1. Phân lập .................................................................................................... 29
3.2. Tuyển chọn đƣợc các chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp PGA
cao. .................................................................................................................. 31
3.3. Định tên .................................................................................................... 34
3.3.1 Đặc tính sinh lý, sinh hóa ....................................................................... 34
3.3.2. Định danh bằng sinh học phân tử.......................................................... 35
3.4. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng sinh tổng hợp PGA
của chủng TN5 ................................................................................................ 39
3.4.1. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp PGA.......................... 39
3.4.2. Khảo sát thời gian nuôi cấy ................................................................... 40
3.4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng – Natri glutamate .................... 41
3.4.4. Ảnh hƣởng của tỉ lệ cấp giống .............................................................. 42
3.4.5. Ảnh hƣởng của nồng độ nitơ................................................................. 43
3.5. Xác định sơ bộ khả năng kết tủa ion Fe3+, Cu2+ ....................................... 44
CHƢƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 45
4.1. Kết luận .................................................................................................... 45
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo γ-PGA (Candela và Fouet) .......... 8
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn phân lập ........................... 29
Bảng 3.2. Khả năng phát triển của các chủng vi sinh vật trên môi trƣờng đặc
hiệu (E đặc) ..................................................................................................... 31
Bảng 3.3. Sự thay đổi hàm lƣợng PGA trong thời gian nuôi cấy của các chủng
vi sinh vật ........................................................................................................ 32

iv


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA (Shih, Van, 2001) .................................................... 2
Hình 1.2. Ứng dụng của PGA trong sản xuất nơng nghiệp ................................................... 5
Hình 1.3. Bacillus subtilis (A&A Bio) .................................................................................. 9
Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp γ-PGA (Lou và cs, 2016) ............................................ 11
Hình 1.5. Quá trình polymer hóa γ-PGA (Sung và cs, 2005) .............................................. 12
Hình 2.1. Đồ thị đường chuẩn γ-PGA.................................................................................. 28
Hình 3.1. Sự phát triển của các chủng vi sinh vật trên môi trường E sau 96 giờ..................... 33
Hình 3.2. Hình thái chủng TN5............................................................................................ 34
a. Hình thái khuẩn lạc .......................................................................................................... 34
b. Kết quả phản ứng VP ....................................................................................................... 34
c. Kết quả phản ứng catalase ................................................................................................ 34
d. Kết quả nhuộm Gram ....................................................................................................... 34
Hình 3.3. Điện di đồ DNA tổng số chủng TN5 .................................................................... 35
Hình 3.4. Sản phẩm PCR vùng 16S RNA của chủng TN5 .................................................. 36

Hình 3.5. Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng TN5 ............................................................. 37
Hình 3.6. So trình tự 16s RNA của chủng TN5 trên NCBI .................................................. 38
Hình 3.7. Biểu đồ biểu hiện ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh PGA của chủng
B.subtillis TN5 ..................................................................................................................... 39
Hình 3.8. Khảo sát thời gian ni cấy chủng B. subtillis TN5 .............................................. 40
Hình 3.9 Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến khả năng sinh PGA .......................... 41
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của tỉ lệ cấp giống đến khả năng sinh PGA của
chủng B. subtilis TN5 ........................................................................................................... 42
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ NH4Cl đến khả năng sinh PGA của chủng B. subtilis
TN5....................................................................................................................................... 43
Hình 3.12. Khả năng loại ion Fe3+, Cu2+(a. kết tủa ion Fe3+, b. kết tuả ion Cu2+) ............ 44

v


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
γ-PGA: Poly γ- glutamic acid

rRNA: Ribonucleic aicd

PDGA: Poly- D glutamic aicd

PCR: Polymelase Chain Reaction

D, L-γ-PGA: D, L-poly gammar glutamic acid
C: Canxi

TE: Đệm Tris- HCL và EDTA

H: Hidro

Rpm: vòng/ phút.

O: Oxi

TCA: Trichloroacitric acid

N: Nito

CET: CTAB 0,1M + NaCl 1M

g/l: Gam/lit

CTAB: Cityltrimethyl ammo

E: môi trƣờng đặc hiệu

CS: Cộng sự

ATP: Adenosine triphosphate
OD: Độ đục
DNA: Deoxylribonucleic acid
EDTA: Ethylene diamine tetra citric
rRNA: Ribonucleic aicd riboxom
LB: Luria Bertani
v/v: thể tích/ thể tích
w/v: khối lƣợng/thể tích

vi

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ở Việt Nam, các sản phẩm lên men truyền thống rất phong phú. Trong
đó các sản phẩm lên men từ đậu tƣơng với hệ vi sinh rất đặc trƣng, cung cấp
nhiều hợp chất có lợi cho con ngƣời. Việc khai thác các hệ vi sinh vật từ các
sản phẩm lên men hiện nay đang rất phát triển và cung cấp rất nhiều các hợp
chất có khả năng ứng dụng rộng rãi. Các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên đƣợc
vi sinh vật tổng hợp và sử dụng vào chu trình sống của chúng. So với các hợp
chất đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng hóa học chúng có những ƣu điểm vƣợt
trội nhƣ an toàn cho sức khỏe con ngƣời, thân thiện với mơi trƣờng. Do đó,
acid poly γ-glutamic (PGA) đƣợc sản xuất từ vi khuẩn đƣợc xem là một
nguồn năng lƣợng tiềm năng trong ngành công nghệ sinh học.
Axit Poly γ-glutamic (PGA) đƣợc tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn
Bacillus có rất nhiều trong các sản phẩm lên men từ đậu tƣơng: Natto,
Chungkookjang, Thua nao... PGA là polymer mang điện tích âm, tồn tại dƣới
dạng homo-polyamide và đƣợc hình thành do D - và L - glutamic nối với
nhau bởi liên kết giữa hai nhóm α-amino và γ-carboxyl. PGA có khối lƣợng
phân tử rất lớn và nằm trong khoảng khối lƣợng từ 100 – 2000kDa. Chính vì
vậy đặc tính của PGA rất phong phú: khả năng hịa tan trong nƣớc rất lớn, có
khả năng bị phân hủy sinh học, không gây độc hại cho cơ thể sinh vật và mơi
trƣờng.
Do vậy axit Poly γ-glutamic có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực:
thực phẩm, y tế, môi trƣờng, nông nghiệp và một số ngành công nghiệp
khác... Đã đƣợc nhiều công ty trên thế giới sản xuất với giá thành cao. Tại
Việt Nam, chƣa có một nghiên cứu về sản xuất PGA từ vi khuẩn đƣợc phân
lập từ Tƣơng. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Phân lập, tuyển chọn các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng
hợp Poly gamma glutamic acid”.

1

CHƢƠNG 1
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về Polygammar Glutamic Acid
1.1.1. Giới thiệu về PGA
Axit poly gamma glutamic (γ-PGA) là một polymer tự nhiên, mang
điện tích âm có các đơn phân là axit L – glutamic hay axit D – glutamic hoặc
chứa cả hai đơn phân trên liên kết với nhau bằng mối liên kết giữa nhóm γ –
carboxyl và nhóm α – amino (Shih và Van, 2001). Khả năng tham gia phản
ứng hóa học với nhóm α – NH2 của nhóm α – COOH tạo nên liên kết α –
peptit, tạo ra sản phẩm là α – PGA thơng qua các phản ứng hóa học bằng cách
trùng hợp nucleophile. Nhƣng khi có đƣợc một hệ xúc tác thích hợp, nhóm α
– NH2 sẽ liên kết với nhóm γ – COOH để tạo nên liên kết γ – peptit. Sự hình
thành γ – PGA khác với sự hình thành của protein, vì glutamate đƣợc polymer
hóa bên trong tế bào thông qua các mối liên kết γ – amide, tổng hợp một cách
độc lập với ribosome. Do vậy, các chất ức chế của protein, chẳng hạn chứa
chloramphenicol khơng có ảnh hƣởng đến việc tổng hợp y – PGA. Nhờ q
trình polymer hóa, γ – PGA có thể đƣợc hình thành từ hơn 10000 phân tử axit
glutamic. Tùy theo môi trƣờng và phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, γ – PGA
có thể đƣợc hình thành với 3 loại khác nhau, trong đó một loại đƣợc tạo thành
từ tồn bộ D-γ-PGA, một loại đƣợc tạo thành nhờ toàn bộ L-γ-PGA và một
loại đƣợc tạo thành nhờ polymer hóa hỗn hợp D,L-γ-PGA. Sự khác biệt này
có đƣợc khi vi khuẩn có khả năng chuyển hóa trực tiếp hay gián tiếp axit Lglutamic thành axit D-glutamic và hai dạng này thành sẽ đồng trùng hợp tạo
ra D,L-γ-PGA gọi chung là γ-PGA.

Hình 1.1. Cấu trúc của phân tử γ-PGA (Shih, Van, 2001)
2

γ – PGA lần đầu tiên đƣợc phát hiện bởi Inovovics và Brukner khi một
viên nang Bacillus anthracis đƣợc thả vào trong môi trƣờng sau khi hấp khử
trùng (Shih và Van, 2001). Một nguồn tự nhiên khác của γ – PGA là chất
nhầy của natto (đậu nành lên men – một loại thực phẩm truyền thống ở Nhật
Bản), có chứa hỗn hợp γ – PGA và fructan đƣợc sản sinh bởi Bacillus subtilis
Sawamura (Shih và Van, 2001; Candela và Fouet, 2006).
1.1.2. Tính chất PGA
Cơng thức phân tử: (C5H7NO3)n
Kích thƣớc cũng nhƣ khối lƣợng của polyme này rất đa dạng phụ thuộc
vào cấu trúc cũng nhƣ dạng liên kết của nó với các chất khác trong canh trƣờng
vi sinh vật. Khối lƣợng trung bình của các phân tử γ-PGA từ vài kDa đến hàng
triệu kDa. Nhìn chung, các phân tử γ – PGA thƣờng có khối lƣợng lớn hơn nhiều
so với D-PGA hay L-PGA. Dạng neo thƣờng có kích thƣớc nhỏ hơn dạng tự do.
(Sung và cs, 2005)
Tính chất vật lý: Axit poly γ-glutamic là một polymer tự nhiên, tinh thể
có màu trắng, khơng màu, khơng mùi, khơng vị. γ-PGA có thể bị phân hủy
sinh học, không độc với môi trƣờng, sinh vật và con ngƣời. Axit poly γglutamic hòa tan tốt trong nƣớc và tạo đƣợc các liên kết bền vững với nƣớc,
do vậy khả năng giữ nƣớc đƣợc xem là một tính chất nổi trội của axit poly γglutamic. Nó có thể đƣợc phân tách với các thành phần trung tính khác nhờ
sắc kí giấy (Ho và cs, 2006).
Tính chất hóa học: Do liên kết của dƣ lƣợng glutamate trong thành phần
nên γ – PGA có khả năng kháng protease, loại bỏ các liên kết α – amino. γ –
PGA có thể tồn tại ở dạng acid tự do khơng tan trong nƣớc hoặc hịa tan hồn
tồn trong nƣớc dƣới dạng muối với nhiều loại cation (Na+, Mg2+, K+, NH4+ hay
Ca2+). Do tính chất của nhóm cacboxyl và amoni nên PGA có tính chất lƣỡng
tính (Ho và cs, 2006).

3


1.1.3. Phân loại PGA

Có nhiều hình thức phân loại γ-PGA tùy thuộc vào cấu trúc, chủng vi
sinh vật tổng hợp hay phƣơng thức tồn tại của polymer này trong canh trƣờng
vi sinh vật. Tuy nhiên có hai phƣơng thức phân loại phổ biến là:
Theo cấu trúc γ-PGA đƣợc phân làm 3 loại sau:
- Acid poly γ-D-glutamic (D-γ-PGA): chỉ chứa các đơn phân là acid Dglutamic và loại polymer này hiện nay mới đƣợc chứng minh chỉ tạo ra bởi
chủng vi khuẩn B. anthracis một chủng vi khuẩn đƣợc tìm thấy trên các vật
chủ bị bệnh than. (Cadela & Fouet, 2006).
- Acid poly γ-L-glutamic (L-γ-PGA): là polymer chỉ chứa các đơn phân
là acid L-glutamic, loại này đƣợc sản xuất chủ yếu từ các loại vi khuẩn
Natrialba aegyptiacia một loài ƣa mặn, γ-PGA đƣợc sinh ra trong vi khuẩn
này nhằm để chống lại sự mất nƣớc của vi khuẩn trong điều kiện mơi trƣờng
nƣớc biển. L- γ-PGA cũng đƣợc tìm thấy rất nhiều trong các động vật có xúc
tu (sứa biển, san hơ) và thành phần chính trong chất dính của Hydra. L-γPGA kết hợp với các cation nhƣ Ca2+, Mg2+ và K+ giúp vi khuẩn và các sinh
vật điều hòa áp suất thẩm thấu bên trong tế bào (Cadela và Fouet, 2006).
-Acid poly γ-D,L-glutamic (DL-γ-PGA): là polymer trong phân tử chứa
cả acid L-glutamic và acid D-glutamic, DL-γ-PGA đƣợc sản xuất chủ yếu dựa
vào Bacillus đƣợc chia làm 2 nhóm:
+ Cần bổ sung acid L-glutamic vào trong môi trƣờng nuôi cấy để tổng
hợp γ-PGA.
+ Không cần bổ sung acid L-glutamic vào trong môi trƣờng nuôi cấy
để tổng hợp γ-PGA (Cadela và Fouet, 2006).
Theo hƣớng tồn tại trong canh trƣờng vi sinh vật, γ-PGA đƣợc chia làm
2 dạng nhƣ sau:
- Acid polygammar glutamic dạng tự do: chủ yếu đƣợc tìm thấy trong
các lồi lành tính của chi Bacillus mà điển hình là B. subtilis. γ-PGA chủ yếu
tạo độ nhầy bao quanh tế bào vi khuẩn và có vai trị cung cấp chất dinh dƣỡng
4


cho chúng trong trƣờng hợp môi trƣờng thiếu dinh dƣỡng và trong quá trình

suy vong của vi khuẩn (Sung và cs, 2005)
- Acid polygammar glutamic acid dạng neo giữ: chủ yếu có ở vi khuẩn
B. anthracis (một loại vi khuẩn gây bệnh than phổ biến ở gia súc và con
ngƣời). Đối với loài vi khuẩn này γ-PGA là một hợp chất có tác dụng kháng
thực khuẩn thể, ngăn cản chúng tấn công vào bên trong tế bào. γ-PGA dạng
này thƣờng đƣợc tìm thấy dƣới dạng nội bào, đƣợc tiết ra ngoài dƣới dạng các
sợi liên kết giữa vi khuẩn và mơi trƣờng bên ngồi khi gặp điều kiện bất lợi.
Vì vậy nên việc sự dụng γ-PGA từ dạng neo giữ ít đƣợc nghiên cứu (Ho và
cs, 2006)
1.1.4. Ứng dụng PGA
PGA là một hợp chất đƣợc nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
nhƣ: nông nghiệp, thực phẩm, y dƣợc, môi trƣờng.
1.1.4.1.Ứng dụng trong nông nghiệp
Trong lĩnh vực nông nghiệp, do γ-PGA có khả năng liên kết bền vững với
nƣớc và có khả năng trƣơng nở (giãn cấu trúc mạch) nên đƣợc ứng dụng trong
sản xuất phân bón. Đối với cây trồng, γ-PGA có tác dụng kích thích phát triển bộ
rễ, nâng cao khả năng hấp thụ dinh dƣỡng của cây trồng, giúp cây tăng trƣởng
nhanh, tán lá phát triển mạnh, quả lớn, tăng sản lƣợng và chất lƣợng nông sản
(Shih và Van, 2001).

Hình 1.2. Ứng dụng của PGA trong sản xuất nông nghiệp

5


γ – PGA đƣợc sử dụng nhiều trong ngành sản xuất thức ăn chăn ni bởi
các tính năng nhƣ tăng tác dụng hấp thụ khoảng chất, tăng sản lƣợng trứng, làm
giảm lƣợng chất béo không cần thiết của vật nuôi (Shih, Van, 2001).
1.14.2. Ứng dụng trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm
Theo Bhat và cs (2013), PGA cho thấy có khả năng sống sót của vi

khuẩn trong q trình đơng khô. Kết quả cho thấy rằng khi bổ sung 10% γPGA vào trong quá trình để bảo vệ Lactobacillus paracasei có tác dụng tốt hơn
đáng kể so với khi bổ sung 10% đƣờng sucrose. So sánh với các báo cáo trƣớc
đây về q trình làm khơ Lactobacillus đã đƣợc chứng minh có khả năng bảo
vệ tốt hơn so với khi bổ sung trehalose, sorbitol (Siaterlis và cs, 2009).
Trong công nghệ sản xuất bánh kem xốp, γ – PGA đƣợc bổ sung vào
nguyên liệu làm kem cùng với chất nhũ hóa có tác dụng làm tăng tính chất
nhũ hóa, ổn định sản phẩm và tăng cƣờng tính chất của kem giữa hai mặt
bánh mà không ảnh hƣởng đến chất lƣợng bánh (Hiroyuki, 2010).
Theo Lim và cs (2012) đã cho thấy sự ảnh hƣởng của γ – PGA đối với
sự hấp thụ dầu trong quá trình chiên rán. Kết quả cho thấy khi bổ sung 1g γ
– PGA trong 100g bột và chiên trong thời gian 4 phút, độ hấp thụ dầu đã
giảm gấp 5 lần so với bánh rán thông thƣờng. Nhƣ vậy, γ – PGA có khả
năng làm giảm lƣợng hấp thụ chất béo trong chiên rán. Do đó, γ – PGA là
một sản phẩm tiềm năng có thể sử dụng để làm giảm lƣợng chất béo hấp thụ
trong nền sản xuất công nghiệp thực phẩm.
Tác dụng của γ – PGA đối với độ nhớt, tính ổn định của bọt và đặc tính nhũ
hóa của bột bánh xốp ở các nồng độ khá nhau (0,05; 0,1 và 0,5g/kg w/w) đã đƣợc
Shuy và Sung (2010) chứng minh đƣợc rằng việc bổ sung 0,5 g/kg vào bột bánh
xốp cho thấy sự tăng độ nhớt, ổn định bọt và ổn định nhũ tƣơng. Độ cứng và độ
dai của bánh xốp cũng giảm trong quá trình bảo quản khi bổ sung γ – PGA.
γ – PGA với khối lƣợng phân tử < 20 kDa đã đƣợc chứng minh là có
hoạt tính chống đơng cao hơn các chất chống đông khác nhƣ glucose và
không ảnh hƣởng đến mùi vị của thực phẩm (Mitsuiki và cs, 1998).
6


1.1.4.3 Ứng dụng trong lĩnh vực y dược
Tác dụng hút ẩm và giữ ẩm của γ – PGA đƣợc so sánh và thay thế cho
acid hyaluromic (HA) nhƣ một loại kem dƣỡng ẩm (Bajaj, 2010). Mối liên hệ
giữa hàm lƣợng vitamin C và hàm lƣợng collagen có liên quan mật thiết đến

nhau. Vitamin C là một chất chống oxy hóa hiệu quả trong việc bảo vệ da khỏi
tổn thƣơng bởi tia cực tím, ngăn chặn sự hủy hoại của sắc tố da. Tuy vậy vitamin
C rất dễ bị phân hủy bởi nhiệt độ, ánh sáng và nhiều các yếu tố khác. Phức chất γ
– PGA – vitamin C hình thành do liên kết giữa nhóm cacboxyl trong γ – PGA và
hydroxyl của vitamin C có tác dụng hiệu quả hơn trong việc chăm sóc da. γ –
PGA – vitamin C có tác dụng bảo vệ Vitamin C, ngồi ra cịn có tác dụng chất
ức chế collagenase, dƣỡng ẩm. Trong các liệu pháp chăm sóc da, γ – PGA đƣợc
kết hợp với ánh sáng hồng ngoại có tác dụng làm giảm kích thƣớc của lỗ chân
lơng giúp bề mặt da nhẵn mịn hơn sau khi trị liệu (Shih, 2001)
1.1.4.4. Ứng dụng trong mơi trường
Do tính chất của γ-PGA là một polymer có nguồn gốc sinh học, có khả
năng phân hủy sinh học, không độc với con ngƣời và môi trƣờng nên γ-PGA
đƣợc sử dụng nhƣ một chất tạo chelate trong xử lý nƣớc thải, có khả năng liên
kết bùn làm đơng tụ, kết lắng bùn thay thế cho muối nhôm sunfat, chitosan,
acid polyacrylic. Trong xử lý mơi trƣờng, γ-PGA có tác dụng bao bọc, cô lập
các yếu tố gây hại thành nhóm và khơng phát tán ra mơi trƣờng nhƣ kim loại
nặng, chất phóng xạ. γ-PGA đƣợc sử dụng nhƣ một chất xử lý nguồn nƣớc
sinh hoạt và nguồn nƣớc cho quá trình lên men (Jiang và cs, 2006).
1.1.4.5. Các ứng dụng khác
Trong ngành công nghiệp chất dẻo dẫn xuất este của γ-PGA đƣợc ứng
dụng làm vật liệu bao bì có khả năng phân hủy sinh học trong suốt, có độ đàn hồi
và độ dai cao thay thế cho các bao bì khơng có khả năng phân hủy sinh học
(Tsutomu và cs, 2002)
Hoạt tính kháng khuẩn là một đặc tính quan trọng của γ-PGA. Theo
Tsao & cs (2010) đã chứng minh rằng các hạt từ tính đƣợc phủ γ-PGA và
7


hydrogel phức hợp đa chitosan γ-PGA cho thấy hoạt động chống lại E. coli và
S. aureus. Tuy nhiên có rất ít thông tin chứng minh hoạt động kháng khuẩn

của γ-PGA tinh khiết.
Ứng dụng làm hydrogel có khả năng thấm hút nƣớc, tác nhân phản ứng
có khả năng chứa đựng nhƣ cố định enzyme, chất mang, chất hấp thụ đƣợc
dùng trong xử lý môi trƣờng, mỹ phẩm, nông nghiệp, y dƣợc…
1.2. Các nguồn thu nhận PGA
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng γ-PGA đƣợc sinh ra bởi nhiều chủng
vi sinh vật khác nhau và chúng thuộc các loài: B. subtilis, B. thuringensis, B.
cereus, B. licheniformis, B. anthracis, B. pulumis, Staphylococcus
epidermidis,

Natrialba

aegyptiaca,

Lysinibacillus

sphaericus

và

Fusobacterium nucleatum. Các nghiên cứu trƣớc đó cũng cho thấy tất cả các
vi khuẩn có khả năng sinh γ-PGA đều là vi khuẩn Gram dƣơng và chủ yếu
thuộc chi Bacillus.
Bảng 1.1. Các chủng vi khuẩn có khả năng tạo γ-PGA (Candela và Fouet)
Sinh vật

Dạng cấu tạo

Cấu trúc

D

D

Bacillus mesentericus
(Bacillus subtilis)

D

D

Bacillus licheniformis

D và L

D và L

Bacillus megaterium

D và L

D+L

Bacillus pumilus

D và L

ND

Bacillus subtilis

Planococcus halophilus
Sprorosarcina halophila

D và L
D
D

L và D +L
D
D

Staphylococus epidemidis

D và L

ND

L
ND

L
ND

Bacillus anthracis

Natriaba aegyptiaca
Hydra

8

Tác giả
Hanby and Rydon
(1946)
Bruckner and
Ivanovics (1937)
Thorne and Leonard
(1958)
Ashiuchi và cs
(2003)
Schneerson và cs
(2003)
Tanaka và cs (1997)
Kandler và cs (1983)
Kandler và cs (1983)
Kocianova và cs
(2005)
Hezayen và cs (2001)
Weber (1990)


1.2.1. Bacillus subtilis
Bacillus subtilis đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 bởi
Christion Erenberg và đƣợc đặt tên là Vibrio subtilis. Năm 1872, Ferdimand
Cohn đặt tên loài trực khuẩn này là Bacillus subtilis (A&A Bio).
Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 30 – 50oC. Nhiệt độ tối ƣu là
37oC, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4 (A&A Bio).
Bacillus subtilis phân bố hầu hết trong môi trƣờng tự nhiên, phần lớn ở
trong đất, rơm rạ, cỏ khô. Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu trịn, bắt
màu tím Gram (+), kích thƣớc 0,25 – 1 µm x 1,5 – 10 µm, đơn lẻ hoặc thành

chuỗi ngắn, có khả năng di động, có 8 – 12 lơng, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ
hơn nằm giữa hoặc lệch tâm tế bào, kích thƣớc từ 0,8 – 1,8µm. Bacillus
subtilis có khả năng tạo bào tử nên có thể tồn tại đƣợc trong các điều kiện mơi
trƣờng thiếu dinh dƣỡng, có các chất độc hại và nhiệt độ cao…(A&A Bio).
Bacillus subtilis cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên tố vi
lƣợng để phát triển; quan trọng nhất là carbon và nitơ; có khả năng dùng các
hợp chất vô cơ làm nguồn carbon. Bacillus subtilis ở thể hoạt động có thể
tổng hợp các chất có hoạt tính sinh học: vitamin, axit amin, kháng sinh,
enzym protease, α-amylase và một số enzym có lợi khác.

Hình 1.3. Bacillus subtilis (A&A Bio)

9


Trong công nghệ thực phẩm, B. subtillis là chủng vi sinh vật có khả
năng sử dụng các nguồn cơ chất đa dạng, có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA
và sinh trƣởng, phát triển tốt. B. subtilis an toàn đối với con ngƣời. Một số
chủng B. subtilis đƣợc phân lập và nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp γPGA nhƣ: B. subtilis NX-2, ZJU-7, TAM 4, IFO 3335, RKY3,
chungkookjang, natto… là những vi sinh vật điển hình đƣợc phân lập từ các
sản phẩm thực phẩm. Các chủng này khi sử dụng để ứng dụng trong sản xuất
γ-PGA trên thực tế cho sản lƣợng ổn định từ 20 – 50g/l, đặc biệt an toàn đối
với ngƣời và động vật (Shi và cs, 2006; Wang và cs, 2001; Wu và cs, 2001)
1.2.2. Bacillus licheniformis
Bacillus licheniformis thƣờng đƣợc tìm thấy trong đất, trên lơng của
các lồi chim mặt đất và thủy cầm. Bacillus licheniformis là vi khuẩn Gram
dƣơng (+) và ƣa ấm, nhiệt độ sinh trƣởng tối ƣu là khoảng 37oC. Bacillus
licheniformis đƣợc phân lập và ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp, xử
lý môi trƣờng và xử lý các sản phẩm nông nghiệp.
1.2.3. Bacillus anthracis

Vi khuẩn B. anthracis là vi khuẩn gây bệnh than – một căn bệnh phổ
biến ở gia súc và con ngƣời. Vi khuẩn B. anthracis sinh tổng hợp chủ yếu là
D-PGA dƣới dạng neo giữ và ít đƣợc sử dụng trong lĩnh vực cơng nghiệp thực
phẩm bởi tính chất gây bệnh của nó (Ezzell và cs, 2009).
1.3. Cơ chế sinh tổng hợp PGA
Theo các nghiên cứu mới, quá trình sinh tổng hợp PGA diễn ra rất phức
tạp đƣợc điều khiển bởi nhiều hệ gen khác nhau. Sinh tổng hợp γ – PGA có
thể đƣợc chia thành bốn giai đoạn riêng biệt: Q trình racemic hóa, polymer
hóa, phân cắt và điều tiết γ-PGA.

10


Hình 1.4. Con đường sinh tổng hợp γ-PGA (Lou và cs, 2016)
Q trình racemic hóa γ-PGA: γ-PGA đƣợc tổng hợp từ D-glutamic
hoặc L-glutamic hay từ D, L-glutamic với nhau. Tuy nhiên, để kết hợp Dglutamate vào chuỗi γ – PGA đang phát triển, L-glutamate (nội sinh hoặc
ngoại sinh) cần đƣợc chuyển hóa thành D-glutamate bằng phản ứng racemic
hóa từ L – glutamic. Vi khuẩn B. subtilis có hai gen tƣơng đồng liên quan đến
q trình racemic hóa glutamate là racE/glr và yrpC (Ashiuchi và cs, 1998).
Chức năng của các gen này vẫn chƣa đƣợc làm rõ vì có nhiều báo cáo khác
nhau về tầm quan trọng của từng gen (Ashiuchi và cs, 2003b; Kada và cs,
2004; Kimura và cs, 2004). RacE là một enzyme cytosolic có tính chọn lọc
cao đối với acid glutamic và ƣu tiên cho L – glutamic (Buescher và
Margaritis, 2007). Theo Kimura và cs (2004), racE chỉ quan trọng đối với sự
tăng trƣởng trong môi trƣờng phức tạp, trong khi yrpC đƣợc phát hiện là hoạt
động khi các tế bào phát triển trên môi trƣờng tối thiểu. Cả hai gen glutamate
racemase đều không chịu trách nhiệm cho việc tổng hợp γ – PGA mặc dù cả
hai dƣờng nhƣ rất cần thiết cho q trình dị hóa D – glutamate.
11

Trái lại, Kada và cs (2004) đã tìm thấy đƣợc rằng glr rất cần thiết cho
việc chuyển đổi L – glutamate thành D – glutamate để tổng hợp γ – PGA và
peptidoglycan cũng nhƣ sự phát triển của B. subtilis. Tuy nhiên, nghiên cứu
đã chỉ ra rằng Mn2+ ảnh hƣởng đến thành phần đồng phân của γ – PGA
(Cromwich & Gross, 1995; Perez – Camero và cs, 1999; Wu và cs, 2006).
Ashiuchi và cs (2004) cho thấy Mn2+ ảnh hƣởng đến thành phần enatiomeric
bằng cách thay đổi sự biểu hiện của gen glr. Tỉ lệ giữa L và D – glutamate
trong Bacillus licheniformis γ – PGA cũng phụ thuộc vào nồng độ Co2+ và
Zn2+. Các nghiên cứu khác cũng đã xác nhận sự phụ thuộc của thành phần
enantiomeric của γ – PGA vào Mn2+ trong cả B. licheniformis và B. subtilis
(Cromwick và Gross, 1995; Wu và cs, 1996).
Quá trình polymer hóa γ – PGA: Q trình polymer hóa đã đƣợc
chứng minh là phụ thuộc vào ATP. Trong đó, nhóm phosphoryl của ATP kết
hợp với nhóm carboxyl ở cuối phân tử γ-PGA, tiếp theo đó nhóm amino của
acid glutamic thay thế vào các phần tử phosphoryl trên nhóm carboxyl, kết quả
hình thành nên liên kết amin mới làm kéo dài mạch γ-PGA (Sung và cs, 2005).

Hình 1.5. Q trình polymer hóa γ-PGA (Sung và cs, 2005)
12


Quá trình phân cắt γ-PGA (depolymer γ-PGA): 2 enzyme endo – γ –
glutamyl peptidase và exo – γ – glutamyl peptidase là những enzyme đƣợc
chứng minh là có khả năng phân cắt γ-PGA. Thực tế đã chứng minh đƣợc rằng
có sự phân cắt γ-PGA trong canh trƣờng vi sinh vật do enzyme ngoại bào của
vi khuẩn B. subtilis NX2, là nguyên nhân gây nên sự giảm khối lƣợng phân tử
γ-PGA (Wu và cs, 2010). Quá trình này đƣợc thể hiện rõ ở pha cuối của quá
trình sinh tổng hợp.
Quá trình điều tiết γ-PGA: Quá trình sinh tổng hợp γ-PGA đƣợc điều

tiết bởi các gen ComPA, DegSU, DegQ điều khiển mức độ phiên mã để thể
hiện các đặc tính cảm ứng tối thiểu, thẩm thấu và sự biến đổi pha.
1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp PGA
1.4.1. Ảnh hưởng của các yếu tố dinh dưỡng
Nguồn dinh dƣỡng là yếu tố cốt lõi để vi sinh vật có thể sinh trƣởng, phát
triển và hình thành nên các sản phẩm mong muốn. Các chủng vi sinh vật đƣợc
nuôi cấy trên các mơi trƣờng dinh dƣỡng khác nhau có thể tạo ra những sản
phẩm khác loại.
1.4.1.1. Nguồn cacbon và chất cảm ứng
Trong tế bào nguồn cacbon trải qua một loạt q trình chuyển hố phức
tạp sẽ tạo thành bộ khung tế bào và các sản phẩm trao đổi chất. Cacbon có thể
chiếm đến khoảng một nửa trọng lƣợng khơ của tế bào. Đồng thời hầu hết các
nguồn cacbon trong các phản ứng sinh hố cịn sinh ra nguồn năng lƣợng cần
thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật.
Các lồi Bacillus sinh tổng hợp PGA có thể sử dụng nhiều nguồn
cacbon khác nhau, tùy đặc điểm từng loài nguồn cacbon có thể đơn giản nhƣ
đƣờng đơn, đƣờng đơi hoặc các acid hữu cơ: glucose, lactose, fructose, axit
citric…. Nguồn chất cảm ứng tổng hợp PGA là acid glutamic, lƣợng glutamic
bổ sung vào quá trình lên men phụ thuộc tùy từng chủng hầu hết các nghiên
cứu cho rằng việc bổ sung 20-30g/l axit glutamic vào canh trƣờng lên men tối
ƣu để tổng hợp PGA (Cromwick và cs, 1996).
13


1.4.1.2. Nguồn nito
Nitơ cung cấp dinh dƣỡng cho vi sinh vật tổng hợp nên các hợp chất
trong tế bào: protein, enzyme… không những là nguồn cung cấp chất dinh
dƣỡng mà mà còn là nguồn cung cấp năng lƣợng (chỉ một số ít vi sinh vật tự
dƣỡng thuộc nhóm ammon hố, nhóm nitrate hố dùng muối ammon, muối
nitrate làm nguồn năng lƣợng. Các lồi vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác

nhau đối với nguồn nitơ. Nhìn chung, hầu hết các lồi đều có khả năng sử
dụng cả nguồn nitơ vơ cơ và hữu cơ. Đối với q trình tổng hợp PGA nguồn
nitơ đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ: cao nấm men, amon sunfat, amon nitrate,
anom clorua, pepton…Trong đó nguồn nitơ vơ cơ đƣợc đánh giá có khả năng
tổng hợp PGA tốt hơn so với nitơ hữu cơ (Cromwick và cs, 1996).
1.4.2. Ảnh hưởng của các yếu tố ngoại cảnh
1.4.2.1. Ảnh hưởng của pH
pH môi trƣờng ban đầu ảnh hƣởng mạnh mẽ đến khả năng sinh tổng
hợp PGA. Tùy thuộc vào từng lồi, từng chủng mà pH mơi trƣờng ban đầu
thích hợp là axit, kiềm hay trung tính. Hiện nay có một số cơng trình nghiên
cứu cho rằng pH thích hợp để tổng hợp PGA là pH 6,0 - 7,5. Các nghiên cứu
cũng chỉ ra rằng pH thay đổi rất ít trong quá trình tổng hợp (Cromwick và cs,
1996).
1.4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố có ảnh hƣởng lớn đến tốc độ sinh trƣởng và khả năng
sinh tổng hợp PGA của chủng vi sinh vật. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều
ảnh hƣởng đến phát triển. Dựa trên nhiệt độ sinh trƣởng, các loài vi sinh vật
đƣợc chia làm 3 nhóm: các lồi chịu lạnh, các loài ƣa ấm và các loài chịu
nhiệt. Các loài ƣa lạnh có khả năng sinh trƣởng trong khoảng nhiệt độ dƣới
15oC, các loài ƣa ấm sinh trƣởng, phát triển tốt trong khoảng nhiệt độ 20oC
đến 37oC, cịn các lồi chịu nhiệt lại phát triển ở nhiệt độ cao trên 50oC. Theo
các nghiên trƣớc nhiệt độ thích hợp cho q trình tổng hợp PGA dao động
14


trong khoảng từ 30 – 40oC tùy thuộc chủng giống vi sinh vật. Kunioka (1994)
cho rằng nhiệt độ tối ƣu trong việc sinh tổng hợp PGA là 37°C.
1.5. Thu hồi PGA
Đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoa học về phƣơng pháp tinh
sạch γ-PGA, phần lớn đều sử dụng dung môi hữu cơ 98 % để tinh sạch γ-PGA

từ canh trƣờng lên men. Dung môi hữu cơ đƣợc sử dụng ở đây có thể là
ethanol, methanol, propanol. Tỉ lệ cồn lạnh và dịch nổi thu hồi từ quá trình lên
men thƣờng đƣợc sử dụng theo tỉ lệ 3:1 (Pe´rez-Camero& cs, 1999) hay 4:1
(Goto & cs, 1991). Dung môi hữu cơ sau khi sử dụng để tinh sạch γ-PGA
đƣợc thu hồi và xử lý.
1.6. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam
Tình hình nghiên cứu trên thế giới:
Hiện nay việc nghiên cứu ứng dụng của PGA và ƣu điểm của Bacillus
đang đƣợc nhiều nghiên cứu trên thế giới quan tâm và ứng dụng. Hiện tại trên
thế giới một số công ty đã sản xuất γ – PGA nhƣ Wako Pure, Chemical
Industries, Vedan Enterprise Corp (Đài Loan), Alamanda (Canada)...
Năm 1913, γ – PGA chỉ đƣợc biết đến trong hỗn hợp với Fructan, ở lớp
màng nhầy của Natto – sản phẩm đậu tƣơng lên men của ngƣời Nhật Bản
(Sawamura, 1913).
Năm 1937, γ – PGA đƣợc tìm thấy đầu tiên bởi Ivanovic và các cộng
sự khi họ nghiên cứu về lớp màng bao quanh vi khuẩn Bacillus anthrasis một
loại vi khuẩn gây bệnh than rất nguy hiểm cho các động vật ăn cỏ, động vật
có vú và con ngƣời [6].
Năm 1942, Bovarnick đã chứng minh rằng hợp γ – PGA là một sản
phẩm tiết trực tiếp vào canh trƣờng nuôi cấy giống nhƣ một sản phẩm lên
men ngoại bào thông thƣờng.
Năm 1962, House và cs phân tích đƣợc một hệ enzyme tổng hợp PGA
cũng từ chủng Bacillus licheniformis 9945A. Tuy nhiên, hệ enzyme này xúc
tác tạo tạo ra một loại γ – PGA chứa 60% là acid L- glutamic.
15


Năm 1973, Troy đã tìm ra một phức hợp các enzyme poly glutamyl
synthetase ở màng nhầy bao quanh vi khuẩn B. licheniformis 9945A xúc tác
cho hàng loạt phản ứng trên màng, trong đó acid L- glutamic đƣợc hoạt hóa,

đồng phân và polymer hóa thành cấu trúc rất giống D, PGA nhƣ là một sản
phẩm tiết vào canh trƣờng dạng hòa tan. Hệ enzyme xúc tác cho các phản ứng
đòi hỏi phải sự có mặt của ion Mg2+ và khơng thể thay thế bằng các ion kim
loại hóa trị khác.
Năm 1982, trong một số nghiên cứu đã công bố việc phân lập đƣợc một
số enzyme ngoại bào từ Bacillus natto tham gia xúc tác cho phản ứng chuyển
hóa amin đặc biệt là cho glutamine. Các đơn phân này đƣợc chuyển hóa thành
đơn phân cịn lại, sau đó chúng sẽ liên kết với nhau nhờ các liên kết γ-peptit và
tồn tại ở dạng đồng hình chỉ chứa một loại đơn phân. Kết quả là có hàng loạt
enzyme phải tham gia vào quá trình tổng hợp này (Toshio và Seinosuke, 1982).
Năm 1997, Kunioka đã giải thích rõ cơ chế, đƣa ra đƣợc các phản ứng
cùng cơ chế tổng hợp PGA ở chủng Bacillus subtilis. Từ đó đến nay rất nhiều
nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp PGA từ các chủng tự nhiên.
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng các phế phụ phẩm nơng nghiệp, tách dịng và
biểu hiện gen tổng hợp PGA trên E. coli, trên vi nấm nhằm giảm giá thành.
Năm 2006, Masaaki và cs đã thực hiện một nghiên cứu về sự hình
thành màng sinh học từ chủng B. subtilis ATCC 14593 và chỉ ra rằng γ-PGA
là thành phần chính của màng sinh học. Nghiên cứu này đã mở ra một hƣớng
ứng dụng mới cho γ-PGA.
Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Nghiên cứu về γ-PGA ở Việt Nam còn rất hạn chế, chủ yếu là nghiên
cứu chọn lọc các chủng vi sinh vật có liên quan đến γ-PGA. Sản phẩm γ-PGA
chỉ thấy xuất hiện tại Việt Nam ở các dạng mĩ phẩm gia dụng, màng sinh
học... và hầu hết các sản phẩm này đềy có nguồn gốc nƣớc ngồi: Nhật Bản,
Hàn Quốc, Mỹ, Đức...
16


Có thể tìm thấy một vài nghiên cứu về PGA ở Việt Nam nhƣ: “Nghiên
cứu công nghệ sinh tổng hợp và thu nhận acid poly γ-glutamic và hƣớng ứng

dụng trong thực phẩm” của Nguyễn Chí Dũng và cs (2016). Một nghiên cứu
khác của Đào Văn Minh và cs: Từ các mẫu thực phẩm tuyền thống đã đƣợc
phân lập đƣợc 27 chủng vi khuẩn và đã tuyển chọn đƣợc chủng B. subtilis B5
có khả năng sinh tổng hợp γ - PGA cao từ sản phẩm.

17


CHƢƠNG 2
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn đƣợc chủng vi sinh vật B. subtilis có khả năng sinh tổng
hợp PGA có hàm lƣợng cao.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
PGA.
- Tuyển chọn các chủng B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp PGA cao.
- Định tên chủng vi sinh vật tuyển chọn.
- Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp của chủng tuyển chọn để sinh
tổng hợp PGA cao:
+ pH
+ Thời gian thu hồi
+ Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng
+ Ảnh hƣởng của nồng độ NH4Cl.
- Nghiên cứu xác định sơ bộ khả năng loại bỏ ion Fe3+, Cu2+
2.3. Vật liệu
2.3.1. Nguồn phân lập
Các mẫu đƣợc dùng cho phân lập vi sinh vật là các sản phẩm lên men
truyền thống nhƣ tƣơng nếp Úc Kỳ, tƣơng Nam Đàn – Nghệ An, Natto (một
loại đậu tƣơng lên men truyền thống của Nhật Bản).

2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong phân lập và tuyển chọn: Cao nấm men,
peptone, NaCl, Acid L–glutamic, acid citric, glycerol lỏng, NH4Cl,
MgSO4.7H2O, FeCl3.6H2O, K2HPO4, CaCl2.2H2O, MgSO4.H2O, agar, ethanol
(99,69%).
2.3.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trƣờng phân lập: LB
18