Etude et analyse de conopeptides de venins issus de cônes malacophages du vietnam

D ’HISTOIRE NATURELLE

MUSEUM NATIONAL

E cole Doctoraie Sciences de la Nature et de 1’Homme - ED 227

Année 2015

N°attribué par la bibliothèque

THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DU MUSEUM NATIONAL DTIISTOIRE NATURELLE
Spécialité : M ilieux et peuplement aquatiques-Aspects moléculaires et
cellulaires de la biologie

Présentée et soutenue publiquem ?nt par

Bao NGUYÊN
Le 24 janvier 2015

Etude et analyse de conopeptides de venins issus de cônes
malaeophages du Yietnam
Sous la direction de : M onsieur MOLGO, Jordi, Directeur de Recherche - CNRS

JURY:
Mme BOURGƯET-KONDRACKI, Marie-Lise

Directeur de Recherche, Muséum naíional d’histoire naturelle Présidení

M. MOLGO, Jordi

Dírecíeur de Recherche - CNRS,

Directeur de Thèse

M. SERVENT, Denis

Chef d’équipe - CEA

Examinateur

M. TYTGAT, Jan

Professeur, Universìté de Louvain, Belgique

Rapporteur

M. POUCHUS, Yves-Fran£ois

Professeur, Université de Nantes

Rapporteur

M. TOUBOUL, David

Chargé de Recherche - CNRS

Examinateur

Ce travail a été réaỉisé dans le Laboratoire de Neurobiologie et Déveioppement, UPR 3294 du
CNRS à Gif~sur-Yvette, dirigé par Monsieur le Docteur Philippe VERNIER.
Je tiens en premier lieu à remercier Monsieur le Docteur Jordi MOLGO (Equipe Transíerts
loniques et Pharmacologie du Système Neuromusculaire) pour m’avoir accueilli au sein de
son équipe et pour m ’avoir formé à la recherche scientiíique. Je le remercie d’avoir dirigé
mes recherches. Dans ces quelques lignes, je tiens à lui exprimer toute ma gratitude.
Je tiens à remercier particulièrement les membres de mon jury :
Madame le Docteur Marie-Lise BOURGUET-KONDRACKI, Directeur de Recherche CNRS
(Molécules de Communication et Adaptation des Micro-organismes, UMR 7245,
CNRS/Muséum National d’Histoire Naturelle, Paris) d’avoir accepté de participer au jury de
cette thèse.
Monsieur le Docteur Jan TYTGAT (Professeur à la Faculté de Sciences Pharmaceutiques de
1’Université de Louvain, KU Leuven, Belgique) et Monsieur le Docteur Yves-Franẹois
POUCHUS (Proíesseur à la Faculté de Sciences Pharmaceutiques, Université de Nantes,
Nantes) qui m ’ont fait 1’honneur d’être rapporteurs de ce mémoire. Je les remercie d’avoir
consacré une partie de leur temps à juger mon travail.
Monsieur le Docteur Denis SERVENT (Institut de Biologie et de Technologies de Saclay
(iBiTec-S) / Service dTngénierie Moléculaire des Protéines (SIMOPRO) / Laboratoire de
Toxinologie Moléculaire et Biotechnologies (LTMB)/ Equipe Toxines, Récepteurs et Canaux
Ioniques) et M onsieur le Docteur David TOUBOUL (Institut de Chimie des Substances
Naturelles du CNRS UPR 2301, Biochimie et Chimie Structurale des Substances Naturelles)
qui m ’ont fait Phonneur d’être examinateurs de cette thèse.
Je tiens également à exprimer toute ma reconnaissance à Madame le Docteur Evelyne
BENOIT pour son soutien et ses conseils au sein de 1’équipe qui ont été essentiels pour
effectuer ce travail de recherche dans les meilleures conditions. Merci pour cette íameuse
mise à niveau en électrophysiologie qui était plus que nécessaire pour que je puisse continuer
et qui ont fait que j ’ai aimé travailler dans ce laboratoire et particulièrement dans cette
équipe.
Je tiens à remercier Monsieur le Docteur Romulo ARAOZ pour ses judicieux conseils
scientifiques et aussi sa collaboration importante pendant ma thèse.

Je tiens aussi à remercier Monsieur Hung LAMTHANH pour le temps qu’il m’a consacré
lors de mon initiation à la HPLC et des nombreuses discussions concemant les sụịets
biochimiques. Je remercie également Messieurs les Docteurs Jean-Pierre LE CAER et Paul
MILLARES et 1’équipe avec qui j ’ai eu le plaisir de collaborer pendant ma thèse et aussi pour
le temps qu’ils m ’ont consacré lors de mon initiation à la spectrométrie de masse à rinstitut
de Chimie des Substances Naturelles de Gif-sur-Yvette.
Je tiens à remercier Messieurs les Docteurs Gilles MOUR1ER et Robert THAI de 1’lnstitut de
Biologie et de Technologies de Saclay pour leur disponibilité, leurs enseignements et pour


m'avoir permis de suivre de près le travail de synthèse peptidique et de dégradation d’Edman
qui s’est fait à Saclay.
Je remercie à Madame KHUC Thi An et M onsieur le Docteur NGO Dang N ghĩa qui m’ont
aidé de collecter les spécimens précieux dans cette étude.
Je tiens à remercier Monsieur Jean-Francois GALLARD et Bogdan IORGA qui ont fait les
structures RMN et la modélisation des molécules, à rin stitu t de Chimie des Substances
Naturelles de Gif-sur-Yvette.
Je ne voudrais pas oublier Madame Patricia VILLENEƯVE pour tout son soutien technique
au cours de ma thèse et pour tous les nombreux détails au cours de mon séjour au laboratoire.
Je tiens également à remercier toutes les personnes avec qui j ’ai collaboré et qui nỳont
permis d’élargir mon champ de Vision.
Merci à Aurélie Couesnon pour les moments de dégustation d ’excellents gâteaux, et à Aren
Borgdorff et Adile Bakayan pour leurs conseils et leur écoute.
Eln très grand merci à Aurélien Drouard, Valérie Lavallée, Simon Agostini et Morgane
Roulot pour m ’avoir aidé au niveau de Eélevage des souris, poissons et patelles à
EAnimalerie du CNRS de Gif-sur-Yvette.
Merci à Patrick Parra et Jean-Yves Tiercelin de Eatelier de mécanique pour leur aide toụịours
efficace (1’installation et la maintenance du lyophilisateur, la construction des supports pour
les tests de bio-activité des patelles...).
Merci à Bernard Martin etN ordine Benakcha pour leur aide iníbrmatique.

Je tiens aussi à remercier Sabine De La Porte, Sara Vianello et Sandrine Picaud pour leur
disponibilité et pour nTavoir permis d ’utiliser tout le matériel dont j ’avais besoin.
Un grand merci à Pascal ABBAS, Odile LECQUYER, Cindy MARTIN et Dominique
SOUCHU pour leur gentillesse et leur aide quotidiennes.
Je remercie tous mes amis (Binh, Hoa, Hong, Mai Anh, Tuan) qui n ro n t toujours aidé avec
beaucoup d ’enthousiasme malgré les difficultés.
Je remercie EAmbassade de France à Hanoi (Vietnam) et le CNRS à Gif-sur-Yvette pour le
Tmancement de ma thèse.
Enfin, un grand merci à ma famille pour son soutien inconditionnel.


Au cours de 1’évolution, certains animaux ont développé un appareil venimeux leur permettant
d’attraper une proie, de concurrencer une autre espèce ou de se défendre contre un prédateur.
Certains animaux (serpents, scorpions, araignées, cônes marins) possèdent un appareil
venimeux dont le rôle consiste à injecter le venin dans 1’organisme de la proie géneralement
par morsure, piqure ou griffure. Leur venin est le reflet d’une grande biodiversité et plusieurs
des molecules contenues dans ces venins se sont revélées très intéressantes comme outils
pharmacologiques pour mieux comprendre notamment la physiologie des récepteurs de
neurotransmetteurs et la grande diversité des canaux ioniques. De plus, leur étude a permis de
mettre en évidence leur grand potentiel thérapeutique.
La famille des Conidae, mollusques vivant principalement dans les mers tropicales, passionne
non seulement depuis toụịours les collectionneurs par la beauté de leur coquille, mais aussi
les scientiíiques depuis une quarantaine d’années par leur venin. De nombreuses toxines
extraites de leur venin, nommées conotoxines ou conopeptides, se sont révélées très utiles
dans les domaines de la pharmacologie et de la neurobiologie. Leur puissance et Ieur
sélectivité d’action physiologique font de ces toxines des agents potentiellement utilisables
dans le traitement de pathologies très diverses. En 2004, un produit, nommée Prialt®, a été
commercialisé sur le marché comme agent analgésique et a été utilisé pour 1'amélioration de
la douleur sévère et chronique. Récement, certaines de ces conotoxines sont en phase.s
d’études cliniques.

Dans ce travail de recherche, nous nous sommes intéressés à deux cônes marins
malacophages, le Conus bandanus et le Conus marmoreus. Le venin de

c. bandanus n’avait

pas encore fait Lobjet d’une étude protéique apprịndie. Donc, l’objectif Principal de notre
recherche a été Lisolement et la caractérisation des nouvelles conotoxines de ce venin ainsi
que ridentifícation de leurs modes d’actions.
Cette thèse comporte quatre parties. La partie "Introduction", présente le genre Conus, une
description générale des venins

de cônes marins ainsi que les principales familles de

conotoxines, leurs cibles moléculaires et

leurs effets pharmacologiques. Dans la partie

"Matériel et Méthodes", nous décrivons toutes les méthodes (puriíication, tests de bioactivité, spectrométrie de masse, dégradation d’Edman, synthèse

peptidique, modèles

pharmacologiques) permettant de caractériser et de définir la spéciíicité des conotoxines
étudiées. A la suite de la partie "Matériel et Méthodes", nous présentons un troisième chapitre


contenant la partie "Résultats et Discussion". Cette partie traite des principaux résultats
obtenus (i) lors de la comparaison de conopeptides détectables dans les venins de Comis
bandanus et de Conus marmoreus d'une même région du Vietnam (Article 1). (ii) lors de la
caractérisation d’un nouveau conopeptide du venin de Comts bamỉamis, appartenant à la
superíamille M et contenant trois modiíications post-traductionnelles (Article 2). et (iii) lors

de risolement, purifícation et caractérisation biochimique d'une alpha-conotoxine (BnlA ) du
venin de Conus bandanus (Article 3) ainsi que d'autres conopeptides en cours d'études.
Finalement, un quatrième chapitre est consacré aux "Conclusions et Perspectives" et résume
dans son ensemble les résultats obtenus ainsi que les développements de reeherches íutures
possibles dans ce domaine.


SOMMAIRE
Abréviations............................................................................................ 1
Introduction............................................................................................3
1. Biologie des cơnes marins.........................................................................5
1.1. Classiíìcation.................................................................................5
1.2. Morphologie..................................................................................5
1.3. Distribution géographique et bathymétrique........................ 5
1.4. Comportement alimentaire des cônes......................................7
1.5. Appareil venimeux.......................................................................7
1.6. Stratégies d’envenimation......................................................... 9
2. Venin des cônes marins.......................................................................... 10
2.1. Techniques de récupération du venin.................................... 10
2.2. Composants du venin................................................................11
3. Les conopeptides et les conotoxines......................................................13
3.1. Nomenclature et classiíication desconotoxines...................13
3.2. D’un gène à la petite protéine ma tu re....................................17
4. Familles pharmacologiques des conotoxines ou conopeptides.......19
4.1. Conotoxines agissant sur des canaux ioniques activés par
des neurotransmetteurs ou des ligands..........................................19
4.1.1. Conotoxines actives sur les récepteurs nicotiniques
de l'acétylcholine..................................................................... 19
4.1.1.1. Récepteurs nicotiniques de racétylcholine.......... 19
4.1.1.2. a-conotoxines............................................................. 22

4.1.2. Inhỉbiteurs des récepteurs de la sérotonine (5-HT3):
les ơ-conotoxines..................................................................... 28
4.1.3. Conopeptides agissant sur les récepteurs de 1'acide
a-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique
(AMPA)................................
28


4 1.4. Inhibiteurs des récepteurs N-m éthyl-D-aspartate
(NMDA): les "conantokines".................................................. 29
4.2. Inhibiteurs des canaux calcium dépendants du potentiel :
les (D-conotoxines.................................................................................... 31
4.2.1. Les canaux calciu m ......................................................... 31
4.2. 2. co-conotoxines................................................................ 33
4.3. Les conotoxines agissant sur les canaux sodium dépendants
du potentiel.............................................................................................. 36
4.3.1. Les canaux sodium .......................................................... 36
4.3.2. Inhibiteurs des canaux sodium dépendants du
potentiel......................................................................................... 37
4.3.2.1. Les p-conotoxines.............................................. 40
4.3.2.2. Les pO-conotoxines...........................................40
4.3.2.3. Autres conotoxines inhibant les canaux
sodium dépendants du potentiel..................................41
4.3.3. Activateurs des canaux sodium dépendants du
potentiel : les 5-conotoxines..................................................... 42

4.3.4. Activateurs des canaux sodium dépendants du
potentiel : les 1-conotoxines (iota)........................................... 43
4.4. K-conotoxines agissant sur les canaux p o ta ssiu m ...............43
4.4.1. Les canaux potassium .................................................... 43

4.4.2. K-conotoxines..............................................................45
4.4.2.1. KA-conotoxines.................................................. 45
4.4.2.2. KO-conotoxine.................................................... 45
4.4.2.2. KM-conotoxines.................................................. 47

4.4.2.3. Kj-conotoxine................................................. 47
4.4.2.4. Kl2-conotoxines.............................................. 48
4.4.2.5. Contryphan-Vn .............................................. 48
4.4.2.Ó. Conkunitzin-S1.................................................. 48


4.5. Les conotoxines agissant sur les récepteurs couplés aux
protéines G (GPCR) et les transporteurs de
neurotransmetteurs.......................................................................... 48
4.6. Applications thérapeutiques................................................... 49
5. La jonction neuromusculaire et la contraction des m uscles........ 51
5.1. Potentiel membranaire.............................................................52
5.2. Potentiel de repos et potentiel d’action..................................53
5.3. Libération d’acétylcholine et transmission
neuromusculaire squelettique.........................................................53
5.4. Les différents canaux ioniques au niveau des terminaisons
nerveuses de vertébrés.....................................................................54

But de la Thèse......................................................................................56
Matériels et Méthodes.........................................................................58
1. Préparation de deux venins et puriíication de conopeptides......... 60
1.1. Collection de cơnes au Vietnam...............................................60
1.2. Fractionnement du venin brut et puriíĩcation par HPLCR P ........................................................... ",.......................................... 60
1.3. Préparation et comparaison des venins bruts de c.

bandanus et c.marmoreus............................................................... 60
2. Tests de bio-activités préliminaires et identiíìcation des fractions
actives............................................................................................................ 62
2.1. Injection intramusculaire chez le poisson............................. 62
2.2. Injection intramusculaire chez la patelle.............................. 62
2.3. La jonction neuromusculaire de souris..................................63
2.3.1. Préparations neuromusculaires........................................... 63
2.3.2. Enregistrements mécanỉques de la íorce contractỉle......64
3. Spectrométrie de masse.......................................................................... 65
3.1. Réduction et alkylation des íractions et des venins bruts. .65
3.2. Détermination de la connectivité des ponts disulíures de
conotoxines par la technique de "réduction partielle"...............66


3.3. Digestion enzymatique des conopeptides............................... 67
3.4. Analyse par M ALDI-TOF/TOF-M S et M S /M S .................. 68
3.4.1. Noiĩienclature pour la fragm entation des peptides68
3.4.2. Analyse de la íraction purifiée par M ALDITOF/TOF-MS et M S/M S.....' ................................................... 69
3.5. Analyse "ESI-MS et/ou MS/MS" et "nanoLC-ESI-M S et
M S/M S"....................................................................................................70
3.5.1. Analyse ”ESI-MS et/ou M S /M S " .............................. 70
3.5.2. Analyse MnanoLC-ESI-M S et M S/M S” .................... 70
3.6. Production de base de données de la p ro téin e.......................71
3.7. Identiíícation de conopeptides en MS et M S/M S..................71
3.8. Analyse des données MS et M S /M S .........................................72
3.8. 1. Inventaire des conopeptides natiĩs par M S ............72
3.8. 2. Détermination du nombre de cystéin e..................... 72
4. Quantiílcation de peptid es......................................................................... 72
4.1. Peptides contenant du tryptophane ou de la tyrosine.........72
4.2. Peptide sans tryptophane et/ou tyrosin e................................. 73

5. Dégradation d ’Edman (Séquenẹage en N -term inal).......................... 73
5.1. Séquenẹage d’E d m an ................................................................... 73
5.2. Fonctionnement du séquenẹage autom atique........................74
5.3. Préparation de Péchantỉllon et mise en place dans la
cartouche..................................................................................................74
5.4. Obtention des chromatogrammes et traitem ent................... 75
6. La synthèse des conopeptides en phase solide (méthode F m oc).....76
6.1. Principe............................................................................................. 76
6.2. Protocole de synthèse pep tid iq u e.............................................. 78
7. L'enregistrement électrophysiologique dans les ovocytes de
X en o p u s................................................................................................................ 78
7.1. Expression de récepteurs nicotinique Ct7 sur 1’ovocyte...... 78
7.2. Technique du potentiel imposé à double m icroélectrode ..79


82
Résultats et Discussion.........................................................................82
1. Comparaison de conopeptides détectables dans Ies venins de Conus
bandanus et de Conus marmoreus d’une même région du Vietnam ..84
1.1 Position du problème................................................................. 84
1.2. Résumé des résultats obtenus et discussion..........................84
1.3. Conclusion..................................................................................86
1.4. Article 1....................................................................................... 87
2. Caractérisation d’un nouveau conopeptide du venin de Conus
bandanus, appartenant à la superíamille M et contenant trois
modifications post-traductionnelles........................................................100
2.1. Position du problème.............................................................. 100
2.2. Résumé des résultats obtenus et discussion........................ 100
2.3. Conclusion................................................................................ 102
2.4. Article II.................................................................................... 103

3. Isolement, purification et caractérisation biochimique d’une alphaconotoxine (BnlA) du venin de Conus bandanus.................................. 119
3.1. Position du problème...............................................................119
3.2. Résumé des résultats obtenus et discussion........................ 119
3.3. Conclusion................................................................................ 121
3.4. Article III...................................................................................121

Conclusions et Perspectives...............................................................140
Bibliographie....................................................................................... 146
Annexe.................................................................................................. 168
Production scientiíìque.............................................................................170
Communications à des congrès ou des symposiums............................170


Abréviations
ACN : acétonitrile
AF: acide formique
ARNm : acide ribonucléique messager
ACh : acétylcholine
ADNc : acide désoxyribonucléique complémentaire
AChBP : ACh Binding Protein
AMPA : récepteurs de 1’acide a-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazole propionique
c ID :Colỉisionaì Induced Dissocỉation
CNS : système nerveux Central
Cav: canal calcium dépendant du potentiel
DTT : dithiothréitol
Da : Dalton (unité de mesure de masse moléculaire, équivalente au gramme/mole)
DRG : ganglion spinal dorsal
ESI : ionisation par électronébulisation
eV : electron volt (leV=l,602.10"^J)
ECD : domaine extracellulaire

EDL : Extensor Digitorum Longus
Fmoc : groupe 9-fluorenylmethyloxycarbonyle
G PC R s: récepteurs couplés aux protéines G
PIPLC : chromatographie liquide à haute períbrmance
HEPES : 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazineethanesulfonic acide
ICD : domaine intracellulaire
ICK : nceud de cystine d’inhibiteur
Ky: canal potassium dépendant du potentiel
LC: ỉiquid chromatography (chromatographie liquide)
LC-MS : chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse
MS : spectrométrie de masse
MS/MS :spectrométrie de masse en mode tandem
M ALDI : Matrìx Assisted Laser Desorption Ionization (désorption ionisation laser assistée par
matrice à pression atmosphérique)
m/z : rapport masse sur nombre des charges
nanoESI : ncmo-electrospray ionization
nanoLC : Liquid nano-chromatography
nAChR : récepteur nicotinique de 1'acétylcholine
NMDA : acide N-méthyl-D-aspartique
NE : noradrénaline
NMDA : récepteurs du N-méthyl-D-aspartate
Nav: canal sodium dépendant du potentiel

1


pH : potentiel hydrogène
ppm : partie par million
PTMs: modiíications post-traductionnelles
PTH-AA : amino acide en phényl thio-hydantoíne

s s : pont disulíure
SAR : relation structure-activité
TCEP : tris(carboxyethyl)phosphine
TOF: temps-de-vol (time-of-Jlight)
TFA: triíluoroacétique
TMD : domaine transmembranaire
5-PIT3: récepteurs 5-hydroxytryptamine 3
u v : ultraviolet
Notation des acides aniinés
Acide aminé
Alanine
Arginine
Asparagine
Aspartate
Cystéine
Glutamate
Glutamine
Glycine
Histidine
Isoleucine

Code
A
R
N
D

c
E

Ọ
G
H
I

Abrév.
Ala
Arg
Asn
Asp
Cys
Glu
Gln
Gly
His
He

Acide aminé
Eeucine
Eysine
Méthionine
Phénylalanine
Proline
Sérine
Thréonine
Tryptophane
Tyrosine
Valine

Code

L
K
M
F
p

s
T

w

Y
V

Abrév.
Leu
Evs
Met
Phe
Pro
Ser
Thr
Trp
Tvr
Val

Alphabet grec
Lettre grecque
Aa
BP

Fy
Aô
Ee
H ĩ|
0 0
11
KK
A X.
Mn

Nom
aipha
beta
gamma
delta
epsilon
zeta
eta
theta
iota
kappa
lambda
mu

Lettre grecque
NV
u,
0 o
ri n
Pp

Nom
nu
xi
omicron

V Vị/

pi
rbo
sigma
tau
upsilon
phi
chi
psi

ÍÌM

omega

YG
1T
Yn

Xi


Introduction

Introduction
1. Biologie des cônes marins
1.1. ClassiHcation
Embranchement: Mollusca
Classe : Gastropoda
Sous-classe : Prosobranchia
Ordre : Nẻogastropoda (ou Caenogastropoda)
Super-famille : Conoidae (ou Conacea ou Toxogỉossa)
Famille : Conidae
Genre : Conus
Le genre Conus a été décrit pour la première fois par Linné (1758) dans la lOème
édition du Systema Naturae. II existe environ 700 espèces de cônes principalement réparties
dans les zones marines chaudes de la région Indo-Pacifique, de 1’Atlantique Sud et des
Caraíbes. Chaque espèce est défínie à partir de critères conchyologiques (étude de la
coquille), de critères anatomiques [1] et de critères génétiques de phylogénie [2].
1.2. Morphologie
Les cônes se caractérisent par une grande variété de íịrme et taille ainsi que de
motiís et de couleurs arborés par leur coquille (Figure 1). La taille des cônes varie entre 1 et
20 cm, pouvant atteindre 30 em chez Conus prometheus de TAírique Occidentale, mais ont le
plus souvent une taille comprise entre 5 et 10 cm. La coquille peut être de forme conique,
biconique, cylindro-conique et s’enroule de faẹon dextre autour d’un axe, la columelle, en 5 à
8 spires. L'ouverture de la coquille, ou péristome, est étroite et longue. Les motifs et couleurs
de la coquille sont d'une diversité extraordinaire et constituent des caractères importants pour
reconnaĩtre chaque espèce [1]. Beauté et diversité sont les deux qualités qui attirent toujours
les collectionneurs de coquillages.
1.3. Distribution géographique et bathymétrique
Le genre Conus (environ 700 espèces) est distribué dans des zones de latitude
comprise entre le 40° Nord et le parallèle 40° Sud dans les régions maritimes suivantes: IndoPaciíique, Caraíbes, Aửique de 1'Ouest, Afrique du Sud, Pérou, Patagonie, Méditerranée

(Giancarlo Paganelli, 1998-2013). Les quelques espèces qui vont plus loin que 40° de latitude
Nord ou de latitude Sud sont localisées en Aírique du Sud, en Australie du Sud, dans le Sud
du Japon et la mer Méditerranée. Mais la distribution est plus diversiíìée dans la région Indo-


Introduction
Paciĩique (Figure 2) [1]. Elle atteint une densité maximale de 40 individus/m2, mais est
généralement beaucoup moins abondante.

Figure 1. Biodiversité du genre Conus (d’après Olivera, et al., 2009).

Les cones marins habitent surtout dans les boues, les bancs de sable ou coraux où il y
a des marées et des zones rocheuses dangereuses. Dans cet environnement. les cônes
6


Introduction
vermivores sont très íréquents, les cơnes malacophages moins abondants, et les cônes
piscivores plus rares. Les cônes vivent en mer dans les eaux peu prịndes mais aussi jusqu'à
400 m de prbndeur.
Í.4. Comportement alimentaire des cônes
Tous les cônes sont des prédateurs camivores ayant un appareil venimeux très évolué
pour capturer leurs proies. Ils sont classés en trois catégories suivant leur régime alimentaire
(Figure 3) [1]. II existe ainsi plus remarquablement des cônes piscivores (Conus geographus,
C o ỉìu s

consors, Conus magus, Conus striatus ...) qui se nourrissent de poissons, des cônes

malacophages (Conus textile, Conus marmoreus...) qui se nourrissent strictement de
mollusques, et des cônes vermivores (Conus imperiaỉis, Conus quercinus...) qui se

nourrissent de vers (annélides, polychètes). Olivera et coll. (2009) ont estimé que 65% des
cônes étaient vermivores contre 20% de piscivores et 15% de malacophages. Des études plus
récentes coníĩrmeraient ces résultats et tendraient à démontrer 1’existence d’une quatrième
catégorie incluant des cônes omnivores (Conus californicus, Conus pictus...)

[3]. Ces

différents régimes montrent un degré d’adaptation remarquable pour des gastéropodes. La
stratégie de chasse, le venin ainsi que la forme de la dent radulaire qui sert à períbrer et à
envenimer la proie vont varier suivant le régime alimentaire.
1.5. Appareil venimeux
L’appareil venimeux des cônes marins est composé de quatre organes distincts
(Figures 4): la glande à venin, le conduit à venin, le sac radulaire et le proboscis. La glande à
venin est une masse volumineuse, d’une coloration blanchâtre. Son rôle est mécanique et sert
à 1’expulsion du venin du conduit vers le proboscis par ses contractions.
Le sac radulaire est de íorme angulaire (en Y ou en L) composé de deux branches,
l’une courte, 1’autre longue. Dans la plus grande branche, libre, courbée et aveugle, d'une
longueur de 2 à 15 mm, sont élaborées les dents radulaires qui serviront à "harponner" et à
envenimer les proies. Les dents sont constituées d’un tube de chitine, dans lequel le venin
peut s’introduire à la base et s’écouler en amont.

7


Introduction

Figure 3. Régime alimentaire et phylogénie des cônes marins (cPaprès O livera et
al., 2009).

sac radulaire

*

ốlande
musculaire

proboscis

Conduit à
ventn

Figure 4. Représentation schématique d ’une coupe transversale d ’un cône Conus
consors. (d’après Stocklin et al., 2010). Appareil venimeux disséqué de
textile
(d’après Favreau et al., 1999).

c.

Ọuand la confection des dents radulaires est achevée, elles sont transférées dans
1'autre branche radulaire. Celle-ci est plus courte, débouche dans le pharynx en avant du canal
glandulaire, et contient une dizaine de dents prêtes à être utilisées. Les pointes de ces
véritables petites ílèches sont dirigées vers l'ouverture dans le pharynx [4, 5]. Les dents sont
initialement ílexibles. Elles n’acquièrent leur rigidité qu'au cours de leur migration entre les
deux branches radulaires. La morphologie de la dent varie énormément d 'une espèce à
1 autre, mais est toujours en relation avec le type de proie capturée (Figure 5). La taille de la
dent varie de quelques dixièmes de millimètres à plus de 2 cm. La dent chez les espèces
vermivores et malacophages est relativement simple, par opposition à celle de certaines
especes piscivores qui présente des barbelures très élaborées. Le sac radulaire s ’ouvre sur le
pharynx qui constitue la liaison entre le conduit à venin, le proboscis et le tube digestir.

8

Introduction
Le proboscis est un organe souple, situé à 1’intérieur du rostre. C ’est une trompe
extensible fíne qui ne mesure que quelques millimètres à rétat de repos. II a pour rôle de
prélever une dent puis de Teníbncer dans la proie.
1.6. Stratégies d’envenimation
Pour améliorer leur manque de rapidité de déplacement, les cônes sMmmobilisent
et/ou s'enfouissent dans le sable, sous des pierres ou des coraux pendant le jour et ils ne sont
actifs que pendant la nuit, à la recherche de leur nourriture. II y a aussi différentes stratégies
de capture des proies en íịnction de leur régime alimentaire:
- Les cônes piscivores qui pêchent au "harpon" ou "íìlet" (Figure 6).
- Les malacophages qui attaquent "derrière" ou "en face" des proies (Figure 7).
- Les cônes vermivores qui chassent "ensemble" ou de manière "individuelle" (Figure8).

Figure 5. Représentations de dents radulaires. A Dents radulaires 50x de c.
striatus (chasseur de poissons), B de
textiìe (chasseur de mollusques), c de
Conus pulicarius (chasseur de vers) (d’après Legall et al., 1999).

c.

Figure 6. Deux stratégies différentes d’envenimation utilisées par les cônes piscivores
pour capturer leurs proies. En haut, la stratégie dite du "harpon" (C. striatus) et en bas
celle dite du "filet" (C. geographus) (d’après Olivera et al., 1999).

9


Introduction

Figure 7. Deux stratégies différentes d’envenimation utilisées par les cônes
malacophages pour capturer leurs proies. En haut, la stratégie "attaque derrière" d'un
autre cône venimeux (par
marmoreus) et en bas celle "attaque en face" d'un
mollusque normal (par
textilè) (d’après Biggs, 2009).

c.

c.

Figure 8. Deux stratégies différentes d ’envenimation utilisées par les cônes vermivores
pour capturer leurs proies En haut, les petits Conus californicus attaquent ensemble un
vers et en bas Conus quercinus pique le vers et est en concurrence avec des petits
caỉifornicous. (d’après Olivera et al., 1999).

c.

2. Venin des cônes marins
2.1. Techniques de récupération du venin
II existe principalement deux techniques diffẻrentes pour la récolte du venin des
cônes. La première consiste à disséquer 1'animal afin d’en extraire le venin à partir du conduit
a venin. Ce demier sera coupé en plusieurs petits morceaux qui seront ensuite écrasés dans
une solution contenant 0,1% d'acide triíluoroacétique (TFA) eưou un peu de solvant
acetomtrile (ACN) pour 1 extraction du venin. L’inconvénient majeur de cette méthode est
qu elle provoque la mort du cône étudié. Par ailleurs, le venin récolté est en cours
d ?élaboration et probablement ne correspond pas exactement au produit íìnal inịecté.

10

Introduction
ưne deuxième technique a été développée par Hopkins et al., (1995). Elle consiste à
récupérer le venin au moment même de l’injection à la proie. Pour cela, il faut présenter au
cône une proie (par exemple un petit poisson) jusqu’à ce que le cơne distende son proboscis.
Au moment ó le cơne est prêt à piquer sa proie, on substitue le poisson par un tube collecteur
(par exemple un tube eppendorí) eníermé par une membrane de "parafilm". L’inconvénient
de cette technique est qu’elle íịumit de très faibles quantités de venin, nécessite beaucoup de
patience et prend beaucoup de temps.
2.2. Composants du venin
La toxicité des cônes a été mentionnée pour la première fois il y a plus de 300 ans
par le naturaliste hollandais Rumphius. Le venin des cônes ne suscita la curiosité de B.M.
Olivera et L.J. Cruz qu'au début des années 1970, en particulier ses mécanismes d’action
toxiques. Plusieurs études du venin de cônes portèrent sur des approches traditionnelles pour
la découverte de conopeptides (le test de bio-activité guidé par le ữactionnement, la
puriíication, la dégradation d’Edman eưou le séquenẹage MS /MS) et de composants de venin
qui ont ainsi été isolés et caractérisés grâce aux progrès des techniques de séparation
chromatographique ainsi que des méthodes d’identification par spectrométrie de masse et
résonance magnétique nucléaire. En effet, le venin des mollusques de la íamille des Conidae
contient une remarquable hyper-diversité et une quantité importante de substances bioactives.
11 se présente sous la forme d'un liquide laiteux blanchâtre contenant de petits granules
insolubles [6]. Actuellement, et depuis 2000, une nouvelle approche intégrée (la protéomique,
la transcriptomique et la bioiníịrmatique) a permis la découverte de nombreux peptides actifs
à partir des cônes marins (Figure 9) [7].
L’approche intégrée permet de surmonter la nécessité des étapes initiales trouvées
dans 1'approche traditionnelle et permet un gain de temps. En outre, l'approche intégrée
requiert une plus petite quantité de matière et présente donc des avantages par rapport à la
méthode traditionnelle [7]. Généralement, le venin de chaque espèce possède plus de 1000
peptides (conopeptides ou conotoxines) [8], ainsi que des protéines vasoactives (telles que

1’ébumétoxine,

la tessulatoxine) [9,

10],

des

protéases

(des

acétylcholinestérases,

phosphodiestérases, phospholipases) [11] et des molécules organiques de faible poids
moléculaire (ammonium quaternaire, N-méthylpyridium,

11


Introduction

Figure 9. Flux de travail séquentiel pour les approches traditionnelles (fond
blancs) et intégrées (fond noirs) (d’après la Réf. [7]). PTMs: modifications posttraductionnelles.

homarine,

y-butyrobétaine,

sérotonine,

acide

arachidonique) [12,

13 Ị.

Pourtant,

les

conotoxines sont les plus étudiées pour plusieurs raisons. La première est leur diversité et
spéciíĩcité qui peuvent permettre de différencier pharmacologiquement certains types et soustypes de récepteurs des neurotransmetteurs et de sous-types de canaux ioniques [6, 14, 15]. La
deuxième raison est que les séquences peptidiques sont plus accessibles en synthèse chinuque
12


Introduction
comparée à celles des toxines de serpents, de scorpions et d'araignées [16. 17]. En plus de la
séquence peptidique linéaire, la présence de nombreux ponts disulíures confère aux
conotoxines une structure tridimensionnelle bien rigide. Ces toxines se présentent comme une
excellente base pour 1'étude des interactions ligand-récepteur et des relations structureactivité-sélectivité. En plus, les conotoxines tournissent de nouvelles alternatives dans le
domaine thérapeutique.
3. Les conopeptides et les conotoxines
3.1. Nomenclature et classification des conotoxines
Tout peptide isolé du conduit à venin d'un cône est considéré comme un conopeptide
et, au cours des dernières années, le nombre de conopeptides découverts a augmenté de
manière significative. II y a maintenant plus de 1800 séquences de conopeptides déclarées et
idéalement

cataloguées

dans

une

base

de

données

sur

le

Web,

ConoServer

(u \\ \\ .conoserver.oru) [ 18Ị. La nomenclature actuellement utilisée pour classiíier les
conopeptides est celle qui a été proposée à ]'origine par Cruz et al. [6] en 1985 et mise à
jour [19, 20, 21]. Les conotoxines sont classées en superĩamilles basées sur une séquence
signal précurseur (Tableau 1) et une homologie de motif (Tableau 2), puis en familles
pharmacologiques basées sur les cibles avec lesquelles elles interagissent (Tableau 3). Les
peptides de cônes sont également divisés en deux groupes principaux, ceux ayant un fort taux
de ponts disulfures et ceux avec un faible taux de ponts disulíures, comme le montre la Eigure
10. Les peptides à faible taux de ponts disulíures contiennent soit un ou deux ponts disulíures
soit aucun pont disulíure. Les peptides qui ne contiennent pas de pont disulfure sont réunis en
huit/neuf groupes, à savoir les contulakines (qui ciblent le récepteur de la neurotensine) [22],

le conantokines (qui ciblent le récepteur NMDA (acide N-méthyl-D-aspartique) [23], les
conorfamides (ciblant le récepteur RFamide) [24], les conolysines (qui ciblent les membranes
cellulaires) [25],

les

conophans

(cible

inconnue) [26],

les

conomarphines

(cible

inconnue) [27], le conopeptide Y (bloquant des canaux K ) [28], le conoprin (cible
inconnue) [29] et le conomap (cible inconnue) [30]. Les peptides contenant un pont disulíure
sont classés comme les contryphans (modulateur des canaux K

dépendants du Ca2+

intracellulaire) [31] ou les conopressines (homologues de la vasopressine) [32]. Les peptides
riches en ponts disulfures sont appelés conotoxines et c'est le groupe qui présente un intérêt
majeur en thérapeutique. Ces peptides peuvent varier de 11 à 71 acides aminés, mais environ
80% d'entre eux contiennent entre 12 et 33 résidus. Les protéines comme la conopidine

13

Introduction
(phospholipase) [11] et la conohyale (cible inconnue) [33] sont aussi retrouvées dans les
venins de cônes.
Tableau 1. Superfamilles de gènes des conopeptides (mise àjo u r 17/10/2013) [34].
Superfamilles
de gènes
A

Précurseurs
de protéines

Cadre de cystéine

216

I, I I , I V , X I V

BI

18

B2

V III

B3

X X IV

1
1

c

4

D

XV, XX

E

X X II

28
1

F

1

G

X III

1

H

V I /V I I

7

11

V I /V I I , X I

17

12

X I, X II, X IV

57

13

V I /V I I , X I

J

X IV

K

X X III

4

L

X IV

14

9
26

M

I, I I , I I I , I V , V I /V I I , I X , X , X I V , X V I

N

XV

O l

373
3

1, V I / V I I , I X , X I I , X I V

493

02

V I /V I I , X I V , X V

101

03

V I /V I I

34

p

IX

9

s

V III

17

T

I, V , X , X V I

V

XV

2

Y

X V II

1

163

Réf.
_ m i___
1361
[371
[381
[361
[391
[371
[371
[401
[371
1411
[421
[431
[441
[451
[461
[471
T371
[481
[491

[491
[501
[511
[521
[531
[541

Pour la nomenclature des conopeptides individuels, une lettre grecque est utilisée
pour désigner la famille pharmacologique à laquelle ils appartiennent. Une ou deux lettres
sont ensuite utilisées pour indiquer les espèces de cônes à partir desquels le peptide a d'abord
été extrait, par exemple G pour

c. geographus,

Bn pour

c.

bandanus, suivie d'un chiffre

romain pour indiquer le m otif des cystéines. Le m otif des cystéines se réíère à la disposition
des résidus cystéine dans la séquence primaire (à ne pas coníịndre avec la connectivité de
ponts disulfures qui spéciíìe les paires de cystéine íịrmant les ponts disulíures). La
nomenclature des conotoxines se termine, dans la plupart des cas, avec une lettre majuscule
pour représenter 1'ordre de découverte spéciíique à certe catégorie.

14


Introduction

Tableau 2. Les motifs de cystéine des conotoxines [34].
Cadre
XXIV
XXVI
XXV
I
II
III
IV
V
VI/VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII
XIV
XV
XVI
XVII
XVIII
XIX
XX
XXI
XXII
XXIII

Motif de cvstéine

Cvstéines

c -c c -c
c -c -c -c -c c -c c
C-C-C-C-CC
c c -c -c
c c c -c -c -c
CC-C-C-CC
c c -c -c -c -c
CC-CC
C-C-CC-C-C

4
8
6
4
6
6
6
4
6

C-C-C-C-C c C-C-C-C

10

C-C-C-C-C-C
CC-C.IPOIC
C-C-CC-CC-C-C
c -c -c -c -c c -c -c

C-C-C-CC-C-C-C
C-C-C-C
c -c -c c -c -c -c -c
C-C-CC
c -c -c c -c -c c -c
c -c -c c -c c
c -c -c -c c c -c -c -c -c
C-CC-C-CC-C-C-C-C
CC-C-C-C-CC-C-C-C
C-C-C-C-C c -c -c
C-C-C-CC-C

6
4
8
8
8
4
8
4
8
6

10
10
10
8
6

Connectivité

I-III, Il-IV
I-V, II-III, IV-VI
I-III, II-IV
I-IV, II V, III-VI
I-IV, II-V, III-VI
I IV, II-II1
I-IV, II-VI, III-VII, V-VIII
I-III, II-IV

Réf.
m
[55 Ị
156]
ỉm
[581
159]
1601
[521
[61]
[621
[501
[631
[411
[641
|65|
1661
1531
|67|
[54]

Ị68|
|69|
[39|
[701
[711
[451

Tableau 3. Les familles de conotoxines d’après leurs cibles pharmacologiques [34].
Déílnition
Toxine Réf.
Famille
[57]
a (alpha)
Récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine (nAChR) GI
Canaux cationiques non-spécifiques de pacemaker
PnVIIA,
y (gamma)
TxVIlA
dépendants du potentiel
m
TxVlA
5 (delta)
CanauxNa+ dépendants du potentiel
[73]
Canaux C a +présynaptiques ou de récepteurs
£ (epsilon)
TxVA
présynaptiques couplés aux protéines G
[74]
CanauxNa+ dépendants du potentiel

RX1A
V(iota)
[75]
K(kappa)
Canaux K+ dépendants du potentiel
PV1IA
[76]
[77]
GUI A
p (mu)
Canaux Na^ dépendants du potentiel
Récepteurs alphal-adrénergiques (GPCR)
TIA
p (rho)
[78]
GVII1A
ơ (sigma)
Récepteurs de la sérotonine ( 5 HT3) (GPCR)
[62]
[79]
CnVA
X(tau)
Récepteurs de la somatostatine
MrlA,
Transporteur de la noradrénaline
X (chi)
[781
GVIA
co (oméga)
Canaux Ca2’ dépendants du potentiel

_J801_

15


Introduction

Figure 10. Système de classiíĩcation utilisé pour des groupes de conotoxines. Les
conopeptides "pauvres en ponts disulíures" sont affichés au-dessus de la ligne
pointillée et le groupe "riche en ponts disulíures" en-dessous de la ligne pointillée.
Dans le groupe "riche en ponts disulíures", les conotoxines, sont classées en
superíamilles basées sur un consensus d ’homologie de séquence. Elles sont
ensuite caractérisées en íịnction de leur motif de ponts disulĩures et de leurs
cibles. Les superíàmilles B, I et o sont divisées en superfamilles distinctes de
gènes B l, B2, B3, II, 12, 13, et O l, 0 2 , 0 3 [42, 49, 81] ayant des séquences signal
uniques. Dans le document original [54], le m otif de ponts disuiíures de la
superfamille Y a été nommé XVI, mais est enregistré comme XX dans le
Conoserver (www.conoserver.org) parce que le m otif XVI existe déjà dans la
superíàmille M. Aucun récepteur cible a été identiĩié à présent pour les
conolysines, mais elles sont soupẹonnées de cibler les membranes cellulaires [25].

Par exernple, a-BnlA cible les récepteurs nicotiniques, a été isolé à partir de venin de c.
bandanus et a été le premier peptide de cette íamille découvert avec un m otif 1. Ainsi. le nom
officiel de certains peptides ont des noms plus personnalisés tels que, par exemple, le peptide
King Kong", ainsi nommé [82] d'après 1’observation que les homards inịectés avec ce
16