Luận văn thạc sĩ đánh giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic nisin và khả năng ứng dụng trong bảo quản thực phẩm​

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN
SINH
THÁI VÀ
TÀI
NGUYÊN
SINH
VẬT

P
H
Ạ
M
T
H
Ị
T
H
U
P
H
Ƣ
Ơ
N

G

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG
KHÁNG KHUẨN CỦA
MÀNG AXIT
POLYLACTIC – NISIN


VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG
BẢO QUẢN THỰC PHẨM

LUẬN VĂN THẠC
SĨ SINH HỌC

1

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN



Hà Nội – 2014

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

PHẠM THỊ THU PHƢƠNG

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN CỦA MÀNG AXIT POLYLACTIC
– NISIN VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN THỰC PHẨM

Chuyên
ngành

: Vi Sinh Vật Học

:60420114
Mã số

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. LÊ THANH BÌNH

2

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Hà Nội – 2014

3

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




MỞ ĐẦU
Những vấn đề nan giải đối với thực phẩm hiện nay không những phải đối mặt
với thực trạng mất an tồn vệ sinh nghiêm trọng mà cịn phải đáp ứng các nhu cầu tiêu
dùng ngày càng cao về đảm bảo chất lượng, tươi, ngon và cung cấp toàn cầu. Trước
thực trạng đó, nghiên cứu nhằm tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn là một
ưu tiên trong xu hướng “đóng gói tích cực, active packaging”. Đóng gói tích cực là
giải pháp trong đó có sự tương tác giữa vật liệu bao gói, thực phẩm và mơi trường để
gia tăng thời gian bảo quản, độ an toàn, trong khi vẫn bảo đảm chất lượng, các tính
chất cảm quan, độ tươi ngon của thực phẩm.
Trong hơn thập kỷ vừa qua, đã có nhiều cơng trình nghiên cứu, tìm kiếm, các
loại chất bảo quản có nguồn gốc sinh học và vật liệu thay thế các polymer dầu mỏ,
giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học
như bacteriocin, trong đó, đặc biệt là nisin trong bảo quản, chế biến thực phẩm đang
được quan tâm nhiều. Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi
sinh vật gây bệnh, gây hỏng thối hỏng thực phẩm được xem là an toàn (GRAS). Hiện
nay, nisin nằm trong danh mục các chất phụ gia an tồn có ký hiệu quốc tế E234, đã và
đang được dùng để bảo quản thực phẩm ở hơn 50 quốc gia. Sử dụng nisin để bảo quản
thực phẩm đã khắc phục các nhược điểm của các phương pháp bảo quản bằng hoá
chất, chất kháng sinh, chiếu xạ. Ngồi ra, nisin có nhiều tính chất ưu việt như có bản
chất protein, khơng độc, hoạt tính cao, phổ kháng khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu
được nhiệt độ và chịu áp suất cao. Vì vậy, nisin là ứng cử viên hàng đầu cho hướng
nghiên cứu này.
Trong số các polymer phân hủy sinh học, axit polylactic (PLA) được tổng hợp
từ axit L-lactic, một loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật. Vì thế,
PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polymer sinh học có khả năng thay

thế các polymer từ dầu mỏ. Hiện nay, một số loại sản phẩm nhựa sinh học PLA đã ra
đời như Biota

TM

-Chai đựng nước bằng nhựa PLA, Noble

bằng nhựa PLA, Dannon

TM

- Bình đựng nước hoa quả

TM

-hộp đựng sữa chua bằng nhựa PLA.
4

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polymer sinh học và chất kháng khuẩn
nguồn sinh học, để tạo ra sản phẩm bao bì thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và
phân hủy sinh học- rõ ràng là một giải pháp “thân thiện môi trường” và là lựa chọn căn
cơ cho sự phát triển bền vững.
Xuất phát từ những thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Đánh
giá tác dụng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin và khả năng ứng dụng
trong bảo quản thực phẩm”. với mục tiêu :

- Đánh giá khả năng kháng khuẩn của màng axit polylactic – nisin
- Đánh giá khả năng phân hủy sinh học của màng axit polylactic – nisin
- Nghiên cứu điều kiện, thời gian bảo quản màng axit polylactic – nisin
- Ứng dụng màng axit polylactic – nisin để bảo quản thực phẩm lên men (nem chua)

và bánh cốm

5

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




PHẦN I. TỔNG QUAN
1.1. HIỆN TRẠNG VÀ XU HƢỚNG NGHIÊN CỨU BAO BÌ THỰC PHẨM
KHÁNG KHUẨN VÀ PHÂN HỦY SINH HỌC
Tình trạng thực phẩm hiện nay đang đứng trước các nguy cơ mất an toàn vệ
sinh cao trong khi lại phải đáp ứng các nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm đảm bảo
chất lượng, tươi, ngon và cung cấp tồn cầu. Xu hướng đó đã dẫn tới những thay đổi
mạnh mẽ của ngành cơng nghiệp bao bì và đóng gói thực phẩm [18; 71]. Các loại bao
bì an tồn và thân thiện môi trường được phát triển. Các loại chất bảo quản có nguồn
gốc sinh học đang dần thay thế các chất bảo quản hóa học và chất kháng sinh. Hướng
nghiên cứu tạo ra các loại bao bì có khả năng kháng khuẩn, có khả năng ức chế, tiêu
diệt vi khuẩn gây bệnh, gây ngộ độc thực phẩm, bảo đảm chất lương, độ tươi ngon của
thực phẩm, an toàn cho người sử dụng và thân thiện với môi trường đang thu hút nhiều
nghiên cứu [12; 46; 47; 48; 51; 56; 58; 82]. Trong thập kỷ vừa qua, đã có nhiều cơng
trình nghiên cứu, tìm kiếm, sử dụng các vật liệu có nguồn gốc sinh học để dần thay thế
các polyme dầu mỏ và giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Hiện nay, các loại vật liệu phân
hủy sinh học như axit polylactic (PLA), polyhydroxybutyrate (PHB) được xem là các

ứng cử viên cho hướng phát triển này. Bởi vì, PLA, PHB có khả năng phân hủy trong
tự nhiên, khơng gây ơ nhiễm môi trường, không phụ thuộc vào tăng giá do quá trình
khan hiếm của dầu mỏ... Trong số các polymer phân hủy sinh học, PLA là loại được
tổng hợp từ axit L-lactic, loại axit được sản xuất từ quá trình lên men vi sinh vật từ các
nguồn nguyên liệu rẻ, có sẵn như ngơ, khoai, sắn hoặc từ sinh khối thực vật. Vì thế,
PLA được xem là lựa chọn hàng đầu trong số các polyme sinh học có khả năng thay
thế các polyme từ dầu mỏ.
Sử dụng các chất kháng khuẩn có nguồn gốc sinh học như bacterocin, trong đó,
đặc biệt là nisin trong quá trình bảo quản, chế biến thực phẩm đang được quan tâm
nhiều. Nisin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của một số nhóm vi sinh vật gây
bệnh, gây thối hỏng thực phẩm và được xem là an toàn (GRAS). Nisin là một
bacteriocin, cấu tạo gồm 34 axit amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp
bởi một số chủng thuộc loài Lactococcus lactis. Nisin được Tổ chức Nông Lương và Y
tế thế giới (FAO/WHO), cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm (FDA) của Mỹ cho phép
6

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




sử dụng trong bảo quản và làm phụ gia thực phẩm. Hiện nay, nisin nằm trong danh
mục các chất phụ gia có ký hiệu quốc tế E234, đã và đang được dùng để bảo quản thực
phẩm ở hơn 50 quốc gia. Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi
sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước. Sử
dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng, không để lại
dư lượng trong thực phẩm. Sử dụng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp, sẽ làm
giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng. Nisin đã trở thành chất chuyên biệt dùng để
bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc phục được
nhược điểm của các phương pháp sử dụng hố chất, chất kháng sinh, chiếu xạ. Nisin

có nhiều tính chất ưu việt như có bản chất protein, khơng độc, hoạt tính cao, phổ kháng
khuẩn tương đối rộng, khả năng chịu được nhiệt độ và chịu áp suất cao [18].
Hướng nghiên cứu tạo vật liệu từ các polyme sinh học và chất kháng khuẩn, để tạo
ra sản phẩm bao bì bảo quản thực phẩm có khả năng kháng khuẩn và phân hủy sinh học
đang là mục tiêu của nhiều nhóm nghiên cứu. Trong cơng trình của Kritos và cộng sự
[51], đã sử dụng màng natri – casein kết hợp với nisin để tạo ra màng kháng khuẩn. Trong
khi đó, Xu và cộng sự [81] lại tạo màng từ glucomana – gellan - nisin, Millette và cộng sự
[58] tạo ra màng kháng khuẩn sinh học bản chất alginate - nisin... Gần đây, trong công bố
của Liu và cộng sự [56], các tác giả đã sử dụng 80 % PLA, 20 % pectin và kết hợp với
200 IU nisin/g để tạo ra loại polyme sinh học có tính kháng khuẩn.

An toàn vệ sinh thực phẩm ở Việt nam là một vấn đề vô cùng cấp bách, đang
gây nhiều bức xúc, vấn nạn cho xã hội. Các loại thực phẩm được chế biến, bảo quản và
vận chuyển hầu hết trong điều kiện khơng an tồn. Thực phẩm chủ yếu chỉ được đựng
và bao gói bằng bao giấy và các màng polyme có nguồn gốc dầu mỏ. Những loại màng
này được tạo ra từ các loại polyme như polyethylene (PE), polypropylene (PP),
polyvinylclorua (PVC). Nhược điểm của các loại màng này và bao giấy là, ngoài việc
gây tổn thất chất dinh dưỡng trong q trình bảo quản, lại khơng có tác dụng đối với vi
sinh vật gây bệnh thực phẩm nội tại hay xâm nhập từ bên ngồi. Mặt khác, các màng
này khơng có khả năng tự phân hủy, nên lại là nguyên nhân gây ơ nhiễm mơi trường.
Ngồi ra, việc bảo quản thực phẩm thường lạm dụng quá mức các chất hóa học và đặc
biệt là việc sử dụng các chất kháng sinh trong y học vào bảo quản, chế biến thực
7

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




phẩm, đây là một nguyên nhân dẫn đến tình trạng phát tán nhanh tính kháng thuốc, là

nguy cơ lớn đối với sức khỏe con người.
Việt Nam chưa có nghiên cứu về bao bì có tính kháng khuẩn và tự phân huỷ.
Tuy đã có một số nghiên cứu về polyme sinh học như là chitosan, tinh bột biến tính và
một số polymer được tách từ tự nhiên nhưng những nghiên cứu về chất kháng khuẩn
có nguồn gốc sinh học đầu tiên phải kể đến nhóm nghiên cứu của Lê Thanh Bình và
cộng sự [3; 9]. Tuy nhiên, hầu hết các công trình trên chủ yếu tập trung vào vấn đề tạo
chủng giống, năng suất, công nghệ sản xuất, sản phẩm, hướng nghiên cứu tạo vật liệu
bao bì thực phẩm chưa được đề cập.
1.2.

NISIN

1.2.1. Lịch sử nghiên cứu về nisin
Năm 1877, Pasteur và Joubert đã lần đầu tiên ghi nhận hiện tượng ức chế lẫn
nhau giữa các chủng Bacillus anthracis, một loại vi khuẩn thường được tìm thấy có
mặt trong nước tiểu [73]. Những nghiên cứu tiếp theo của Florey và cộng sự cũng
khám phá ra bệnh than (anthrax) và bệnh bạch hầu (diphtheria) bằng các vi sinh vật
khơng gây bệnh, có tính đối kháng. Năm 1925, Gratia đã phát hiện đã ra sự ảnh hưởng
lẫn nhau của hai chủng E. coli. Đến năm 1928, Roges là người đầu tiên phát hiện ra
nisin, một polypeptide do chủng Lactococcus tổng hợp có khả năng ức chế chủng L.
lactis. Năm 1946, Gratia và Frederic đã phân lập thành công một chất sinh ra từ chủng
E. coli V có khả năng ức chế E. coi và gọi tên là “colicine”. Vào năm 1953, Jacob và
cộng sự đã sử dụng “bacteriocin” làm thuật ngữ chung cho các chất kháng khuẩn có
bản chất protein được sinh ra từ vi sinh vật. Năm 1982 theo Konisky thì thuật ngữ
colicine ngày nay được dùng để chỉ các bacteriocin được sản xuất bởi một số chủng
thuộc loài E. coli và có quan hệ gần họ với họ Enterobacteriaceae. Chính vì thế mà ý
nghĩa ban đầu của thuật ngữ bacteriocin có đặc trưng phổ biến của colicine như: có
phổ kháng khuẩn hẹp và có khả năng bám lên các thụ thể trên bề mặt tế bào [18]. Sau
đó, phát hiện bổ sung về mối liên quan giữa sự tổng hợp bacteriocin và plasmid. Tại
đây cho thấy có sự khác nhau giữa colicine và bacteriocin được sinh ra bởi các chủng

vi khuẩn Gram dương [18; 73]. Bateriocin được tổng hợp từ các vi khuẩn Gram dương
khơng có thụ thể đặc biệt để bám trên bề mặt tế bào, thường có khối lượng thấp hơn
8

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




colicine, có thể có cơ chế tiêu diệt khác so với colicine, có phổ tác dụng rộng hơn và
khác nhau về cách vận chuyển và giải phóng trong tế bào và nó có thể có trình tự đầu
được phân chia trong giai đoạn thành thục [18; 45].
Trong suốt 2 thập kỷ gần đây, bacteriocin – một sản phẩm do vi sinh vật sinh ra
có khả năng giết hoặc ức chế sự phát triển của các vi sinh vật khác đã được nghiên cứu
rất nhiều về các đặc tính sinh hóa cũng như các đặc điểm về di truyền ở cấp độ phân tử
bởi vai trị của nó trong vấn đề bảo quản. Bacteriocin có đặc tính giống như một kháng
sinh vì nó có khả năng kháng khuẩn nhưng bacteriocin khơng phải là kháng sinh.
Bacteriocin khác với các kháng sinh bởi quá trình tổng hợp, cơ chế tác dụng, phổ tác
dụng, tính miễn dịch của chủng sản, đích tấn cơng… [19]. Bacteriocin có bản chất
protein, được tổng hợp ở ribosome và có phổ kháng khuẩn hẹp, có khả năng ức chế các
vi khuẩn có quan hệ họ hàng với nó [21; 25; 73]. Theo Joger và cộng sự năm 2000,
bacteriocin là một polypeptide được tổng hợp ở ribosome và bị phân hủy rất nhanh bởi
enzym phân hủy protein trong hệ tiêu hóa của người. Vì vậy, để nghiên cứu bản chất
protein của những bacteriocin mới người ta thường thử khả năng nhạy cảm của chúng
với các enzym phân hủy protein.
1.2.2. Cấu trúc của nisin
Nisin có cơng thức C143H230N42O37S7, là một bacteriocin thuộc nhóm I- cịn
gọi là nhóm lantibiotic trong hệ thống phân loại 4 nhóm. Nisin cấu tạo gồm 34 axit
amin, có khối lượng phân tử 3,5 kDa, được tổng hợp bởi một số chủng thuộc dưới loài
L. lactis subsp. lactis, thường được viết là L. lactis [18; 44; 77]. Nisin được phát hiện

từ năm 1928. Tuy nhiên, phải mãi tới năm 1957 mới xuất hiện nisin đầu tiên trong các
phân xưởng sản xuất pho mát quy mô nông trại, để bảo quản các sản phẩm làm ra.
Cũng trong năm này, hãng Aplin và Barrett đã đưa ra chế phẩm nisin thương mại sử
dụng trong thực phẩm. Mặc dù vậy, giá trị của nisin trong bảo quản thực phẩm cũng
chỉ được xác lập trong khoảng ba thập kỷ lại đây. Trong khi những nghiên cứu cơ bản
và công nghệ ngày càng được quan tâm nhiều hơn [18; 67; 77; 85]. Dạng chế phẩm
của nisin sẵn có nhất hiện nay trên thị trường là Nisaplin, với thành phần 2,5 % nisin.
Cấu trúc của nisin được Gross và Morell làm sáng tỏ năm 1971. Nisin là một
chuỗi polypeptide gồm 34 axit amin tạo thành 5 vòng cấu trúc A, B, C, D, E, được nối
9

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




với nhau bằng cầu nối disulfide (hình 1.1). Có ít nhất 6 dạng nisin đã được phát hiện,
ký hiệu từ A đến E và Z. Đến nay, 4 loại nisin đã được nghiên cứu đặc tính là nisin A,
Z, Q và nisin U. Trừ trường hợp nisin U được tổng hợp bởi lồi Streptococcus uberis,
tất cả các nisin cịn lại đều do lồi L. lactis sinh ra.
Phân tử nisin khơng chứa các axit amin thơm, nên không hấp thụ ở bước sóng
280 nm. Các axit amin dị thường đóng vai trị như một nhóm ái nhân (nucleophile),
được xác định thơng qua khả năng phản ứng với các mercaptan. Có thể vì các nhóm
này rất quan trọng để đảm bảo nisin có khả năng xâm nhập vào màng tế bào đích. Cấu
trúc gồm 5 vịng của nisin giúp cho nó có độ vững chắc, đồng thời góp phần đề kháng
lại các tác dụng của enzym proteinase và sự biến tính do nhiệt.
Phân tử nisin có thể tồn tại ở dạng monome với khối lượng phân tử 3500 Dal.
Tuy nhiên, do các phân tử nisin có thể tương tác, liên kết với nhau thơng qua các nhóm
axit dehydroamin và các nhóm amin. Vì vậy, nisin có thể tồn tại ở dạng dime hay

tetrame, với khối lượng phân tử tương ứng là 7000 Dal và 14000 Dal.

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử nisin
Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây, chứng minh nisin bao
gồm một số peptide có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen, bao gồm 11 gen như
sau: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E và Nis Z.
Trong tự nhiên, tồn tại chủ yếu 2 dạng nisin là A và Z, chúng khá bền vững.
Cấu tạo của nisin A và Z chỉ khác nhau bởi một axit amin ở vị trí thứ 27, histidine
trong cấu trúc của nisin A, trong khi axit aspartic ở nisin Z.
Do có bản chất là một protein, nên hầu hết các đặc điểm hóa lý của nisin phụ
thuộc nhiều vào pH của mơi trường xung quanh. Mức độ hồ tan của nisin phụ thuộc
10

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




rất nhiều vào pH. Nisin kém bền vững và dễ dàng mất hoạt tính ở pH cao.
o

Nisin là một bacteriocin bền nhiệt. Sau 60 phút xử lý ở 100 C, nisin vẫn cịn
o

50 % hoạt tính. Ở 121 C, sau 10 phút, hoạt tính cịn 46 %, sau 60 phút còn 22 %. Độ
bền nhiệt của nisin phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng cao. So với
các bacteriocin khác, nisin có độ bền nhiệt hơn hẳn.
Nisin khơng có khả năng tác động đối với vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm
mốc. Trong điều kiện thông thường, nisin chỉ tác động được đối với vi khuẩn Gram
dương, trong đó có vi khuẩn lactic, một số vi khuẩn gây bệnh như Listeria,

Staphylococcus, Mycobacterium và các vi khuẩn sinh bào tử Bacillus, Clostridium.
Nisin tác động có hiệu quả cao hơn ở trong các sản phẩm thực phẩm có độ pH thấp, có
trải qua giai đoạn gia nhiệt, như các sản phẩm rau quả, thực phẩm đóng hộp. Một trong
những cơ chế giải thích tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm là do sự tạo thành
các lỗ thủng, các kênh trên màng nguyên sinh chất, ngun nhân gây thất thốt các
phân tử, các ion có kích thước nhỏ trong nội bào, làm giảm lực vận chuyển proton
PMF (Proton Motive Force), ảnh hưởng tới quá trình tổng hợp ATP, dẫn tới sự chết tế
bào [43; 59; 68].
Cơ chế tác động của nisin đối với tế bào nhạy cảm được nghiên cứu nhiều hơn.
Phần lớn các quan điểm cho rằng, để tác động đối với vi khuẩn, nisin phải trải qua hai
bước chính:
-

Ban đầu bám trên thành tế bào vi khuẩn nhạy cảm thông qua các thụ thể

-

Sau đó xâm nhập qua thành tế bào và tạo các lỗ trên màng nguyên sinh chất và

thông qua các cơ chế theo mơ hình “kiểu chèn”, theo kiểu nêm và cơ chế tạo mao quản
có sự tham gia của lipide II [18; 35; 43].
1.2.3. Cơ chế tác dụng của nisin
Nisin có tác dụng ức chế vi khuẩn Gram (+), đặc biệt là các vi khuẩn gây bệnh,
gây hỏng thực phẩm như Clostridium butiricum và Cl. Tyrobutiricum, Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus... [17; 26; 30; 44]. Đối với bào tử, nisin có khả năng ức chế sự
nảy mầm của chúng. Mặc dù khơng có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram (-)
nhưng khi kết hợp với EDTA hoặc một vài nhân tố khác như nhiệt độ, axit ...thì nisin
có khả năng ức chế sự phát triển của vài loại vi khuẩn này [15]
11

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Nisin được xem là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi
khuẩn Gram (+). Tác dụng của nisin lên tế bào tại pha sinh trưởng thường mạnh hơn
rất nhiều so với tế bào tại pha cân bằng [26]. Nguyên nhân do sự phá vỡ các tổ chức
cục bộ trên màng tế bào nhạy cảm với nisin, sau đó phá vỡ màng tế bào, xâm nhập vào
tế bào chất và làm chết tế bào vi sinh vật đó [34; 73].
Nisin cũng như phần lớn các bacteriocin khác khơng có khả năng ức chế và tiêu
diệt vi khuẩn Gram (-), trừ Salmonella typhimurium, E. coli bị ức chế khi có mặt của
EDTA. Ngồi ra bất kỳ sự ức chế nào của vi khuẩn lactic đối với vi khuẩn Gram (-)
đều do các nguyên nhân khác chẳng hạn như pH thấp, H 2O2, cạnh tranh về dinh
dưỡng, hay do tính kỵ nước của chúng. Điều này được giải thích là do sự khác nhau
của thành tế bào của vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Bacteriocin chỉ tạo được lỗ thủng
trên thành tế bào Gram (+) mà không tạo được lỗ thủng trên thành tế bào Gram (-)
[26].
Tác dụng của nisin lên vi sinh vật nhạy cảm bao gồm 2 kiểu hình . Kiểu tác dụng
khơng đặc trưng: nisin bám dính lên bề mặt của tế bào nhạy cảm mà khơng cần phải
có bất kỳ một thụ thể đặc biệt nào của vi khuẩn Gram (+) và phá thủng màng tế bào
làm thoát các thành phần nội bào dẫn đến tiêu diệt vi khuẩn [30]. Kiểu hình thứ 2:
nisin tương tác đặc hiệu với lipid II tiền tố peptidoglucan để phá thủng màng tế bào
đích và sự tương tác đặc hiệu có sự tham gia của 2 peptide và lipid II tiền tố thành tế
bào [79].
Mức độ tác động của nisin lên các loại vi khuẩn rất khác nhau, phụ thuộc vào
thành phần của màng phospholipid của tế bào vi khuẩn. Ở vi khuẩn Gram (+),
peptidoglycan chiếm 90% khối lượng thành tế bào, số lớp peptidoglycan có thể lên tới
25 lớp. Trong khi đó ở vi khuẩn Gram (-) lượng peptidoglycan chỉ chiếm 10% tổng
khối lượng thành tế bào, ngồi ra chúng cịn có một lớp màng ngồi quan trọng (outer

membrane – OM). Lớp màng ngồi này có cấu tạo lipid kép tương tự màng nguyên
sinh chất nhưng khơng chỉ có phospholipids hình thành nên cấu trúc mà cịn có
polysaccharide và protein. Lipid và polysaccharide liên kết chặt chẽ với nhau tạo
thành một cấu trúc lipopolysaccharide đặc biệt bên ngồi thành tế bào. Vi
12

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




khuẩn Gram (-) có thể chống chịu lại nhiều tác nhân gây hại đối với tế bào là nhờ vào
lớp màng ngồi OM có khả năng ngăn chặn các tác nhân đó một cách có hiệu quả.
Lớp màng OM khơng cho phép các phân tử lượng lớn thẩm thấu qua mà chỉ cho phép
các hợp chất kỵ nước khuếch tán một cách hạn chế qua màng. Lớp ngoài cùng của
màng OM khơng có glycerophospholipid do vậy tăng cường được sự khuếch tán kị
nước.
Chính nhờ lớp màng ngồi OM mà vi khuẩn Gram (-) không bị tác động của các
bacteriocin. Tuy nhiên dưới ảnh hưởng của một số tác nhân thì có thể làm suy giảm
chức năng rào cản của lớp màng ngồi OM, ví dụ như các tác nhân tạo phức “càng”
(chelator) như ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sốc nhiệt, làm lạnh, axit, sốc
thẩm thấu. Chính nhờ điều này mà người ta đã ứng dụng để xử lý kết hợp với
bacteriocin nhằm tiêu diệt vi khuẩn Gram (-). EDTA là hợp chất được nghiên cứu
nhiều nhất về tác động kết hợp nisin đối với vi khuẩn Gram (- ). Stevens và các cộng
sự (1991) đã nghiên cứu sử dụng nisin kết hợp EDTA để tiêu diệt một số chủng
Salmonella. Kết quả cho thấy với nồng độ nisin 50 mg/ml và EDTA 20 nM thì sau 1
o

giờ xử lý ở 37 C, số lượng tế bào các chủng vi khuẩn nghiên cứu đều giảm từ 10
đến 10

6,9

3,2

CFU/ml. Trong khi đó khi sử dụng chỉ một trong hai tác nhân EDTA hoặc

nisin thì số lượng tế bào giảm không đáng kể.
1.2.4. Khả năng diệt khuẩn của nisin
Khả năng diệt vi khuẩn Gram (+)
Nisin thuộc bacteriocin nhóm I, có tác dụng diệt những vi khuẩn Gram (+) gồm
những lồi vi khuẩn có quan hệ họ hàng, các vi sinh vật gây bệnh như B. cereus,
Enterococus,

Lactobaccillus,

Lactococcus,

Leuconostoc,

Pediococus,

L.

monocytogens, L. innocua, L. grayi, L. ivanovii, L. murrayi, L. seeligeri, L.
welchimeri, Staphylococus spp, Mycobacterium. Giá trị quan trọng của nisin đối với
việc bảo quản thực phẩm được thể hiện ở tác động của nó lên các vi khuẩn sinh bào tử
như là Clostridium và Bacillus là tác nhân chính gây thối thực phẩm.
Khả năng diệt vi khuẩn Gram (-)
Trong một số điều kiện nhất định như khi kết hợp với các tác nhân chelate (ví dụ

EDTA), nisin có thể tiêu diệt Salmonella. Trong điều kiện đông lạnh, xử lý nhiệt, pH
13

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




thấp, nisin có thể ức chế một số vi khuẩn Gram âm như Salmonella, Shigella,
Klebsiella, E. coli.
Khả năng diệt nấm mốc
Sử dụng nisin để bảo quản phomat người ta thấy rằng nisin làm giảm đáng kể vi
sinh vật sinh bào tử bao gồm nấm mốc và Bacillus.
Tác dụng của nisin lên nấm men
Nghiên cứu mới đây cho thấy sử dụng nisin với nồng độ50 IU/g đã kéo dài thời
gian bảo quản phomat Galotyri của Hy lạp đến 42 ngày. Các vi sinh vật chiếm ưu thế
trong phomat như lactobacilli, lactoccoci và các nấm men đã giảm một cách đáng kể.
1.2.5. Ứng dụng của nisin trong bảo quản thực phẩm
Việc ứng dụng bacteriocin vào bảo quản thực phẩm, không chỉ do có tác dụng
kháng khuẩn rõ rệt, mang tính thời sự cao mà còn do con người nhận thức rõ hơn về
hậu quả của ô nhiễm môi trường, do việc sử dụng hóa chất và chất kháng sinh trong
bảo quản [18; 43; 59; 68]. Phạm vi ứng dụng của nisin khá rộng, từ các sản phẩm tươi
sống đến các loại thực phẩm lên men, đóng hộp, dạng rắn cũng như dạng nước [18;
77]. Sử dụng nisin không làm thay đổi cảm quan, không làm biến đổi chất lượng,
không để lại dư lượng trong thực phẩm. Dùng nisin để bảo quản thực phẩm đóng hộp,
sẽ làm giảm nhiệt độ và thời gian thanh trùng. Nisin đã trở thành chất chuyên biệt
dùng để bảo quản thực phẩm, là chất bảo quản nguồn gốc sinh học có giá trị, khắc
phục được nhược điểm của các phương pháp sử dụng hoá chất, chất kháng sinh, chiếu
xạ [18; 43]. Sử dụng nisin trong các loại đồ uống có cồn có thể ngăn cản sự lên men
axit lactic. Bổ sung nisin vào quá trình thanh trùng bia có thể kéo dài q trình cất giữ

bia. Nisin cịn được sử dụng để bảo quản các thực phẩm chế biến từ đậu tương và chế
biến từ ngũ cốc, các loại thức ăn đóng gói. Để bảo quản thực phẩm, nisin có thể bổ
sung với hàm lượng 100 mg/kg- 200 mg/kg và tối đa là 500 mg/kg.
Do đặc tính bền nhiệt, bền vững trong điều kiện pH axit hoặc trung tính,
bacteriocin là một giải pháp hay trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không
lên men.
Đối với thực phẩm lên men, người ta bổ sung vào đó các chủng vi khuẩn lactic
phân lập từ thịt có khả năng sinh bacteriocin như là giống khởi động [34]. Các vi
14

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




khuẩn lactic này sinh trưởng tạo ra pH thấp và sinh tổng hợp bacteriocin ức chế các vi
sinh vật gây thối cũng như các vi sinh vật gây bệnh vốn có trong các sản phẩm tự
nhiên. Do đó, sản phẩm lên men vừa có hương vị thơm ngon lại vừa an toàn cho người
sử dụng.
Đối với các sản phẩm thực phẩm khơng lên men (thịt, cá, rau xanh…),
bacteriocin đóng vai trò là chất bảo quản, giữ cho thực phẩm được tươi sống lâu hơn
do nó ức chế sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây thối, vi sinh vật gây bệnh
trong sản phẩm tự nhiên.
Bacteriocin của vi khuẩn lactic không những bảo quản thực phẩm được lâu hơn,
tươi hơn mà cịn khơng tạo màu sắc, mùi khó chịu cho sản phẩm bảo quản. Hơn nữa,
chúng được coi là an toàn đối với người sử dụng và làm hạn chế hiện tượng kháng
thuốc [55].
Theo tác giả B. Ten Brink thì bacteriocin của vi khuẩn lactic cịn được sử dụng
trong các nghiên cứu phân loại.
Một loại bacteriocin của vi khuẩn lactic được sử dụng như một sản phẩm

thương mại trong bảo quản thực phẩm là nisin. Nisin đầu tiên được sản xuất dưới dạng
thương phẩm là nisin A với tên thương mại là Nisaplin. Nisin được quan tâm nghiên
cứu nhiều cả ở trong phịng thí nghiệm cũng như trong cơng nghiệp. Nisin được chứng
minh là an tồn cho con người khi sử dụng từ năm 1962 bởi hai tác giả Frazer và Hara.
FAO/WHO cho phép sử dụng nisin trong bảo quản thực phẩm từ năm 1969. Năm
1988, tổ chức FDA của Mỹ cơng nhận nisin là an tồn cho sử dụng và nó được sử dụng
làm chất bảo quản thực phẩm.
Theo Linda J. Harris và cộng sự (1992), H. Chen và D.G. Hoover năm 2003
[18, 40], nisin rất nhạy cảm với enzym α – Chymotrypsin và không bị phân hủy bởi
enzym trypsin, elastase, carboxypeptidase A, pepsin và erepcin. Nisin có chứa axit
amin lanthionine (Ala-S-Ala) và β – methyllanthionine (Abu-S-Ala), axit amino
butyric (Abu), dehydroalanin (Dha), dehydrobutyrin (Dhb).
Nisin là một bacteriocin duy nhất được cho phép sử dụng trong bảo quản thực
phẩm. Nó được sử dụng trong rất nhiều loại thực phẩm, đặc biệt lĩnh vực áp dụng
chính của nisin vẫn là các sản phẩm thực phẩm thông dụng hàng ngày (nhất là phomat
15

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




và các sản phẩm thực phẩm đóng hộp). Năm 1969, theo JECFA (the Join FAO/WHO
Expert Committee on Food Additive) ngưỡng cho phép sử dụng nisin đầu vào (ADI –
Acceptable Daily Intake) là 0,13 mg/kg thể trọng/ngày nhưng ngưỡng này là quá cao
và đến năm 1988, FDA (Food and Drug Administration) dựa trên liều lượng tính tốn
đã đưa ra ADI là 0,049 mg/kg thể trọng/ngày tương ứng với một lượng là 2,9 mg/kg/1
người/ 1 ngày. Đến năm 1992, SCF (the Scientific Committee on Food) cho phép được
sử dụng 0,13 mg nisin tinh khiết/kg thể trọng (với hoạt tính là 40.000 IU/mg). Năm
2001 FDA cơng nhận tính an tồn của nisin trong việc sử dụng nisin để bảo quản sản

phẩm thịt lợn và thịt gia cầm đã chế biến với hàm lượng nisin có mặt tối đa là 0,0025
% ở trong sản phẩm hồn thiện. Theo FSANZ [32] thì nisin ngày nay đã được phê

chuẩn cho phép sử dụng như một chất kháng khuẩn an toàn ở hơn 50 quốc gia trên thế
giới bao gồm: Mỹ, Anh, EU, Trung Quốc, MERCOSUR (bao gồm Argentina, Brasil,
Urugoay, Paragoay, Venezuela)…
Ở Việt Nam, vi khuẩn lactic đã được nghiên cứu, ứng dụng trong công nghiệp

thực phẩm để chế biến cũng như bảo quản thực phẩm. Nhiều nông trường quốc doanh
đã sử dụng biện pháp ủ chua thức ăn xanh cho gia súc nhờ quá trình lên men lactic [2].
Nhiều cơ sở chế biến thực phẩm đã sử dụng vi khuẩn lactic để chế biến thực phẩm
dạng: thịt, cá hun khói, tơm chua, cá muối chua, xúc xích, sữa chua… Nhiều chế phẩm
có nguồn gốc từ các vi khuẩn lactic sống được sản xuất ứng dụng trong việc chữa các
bệnh rối loạn đường ruột cho người, các loại sữa có bổ sung khống và vi lượng như
Fe, Ca, Mn, Cr… để làm thức ăn bổ sung cho trẻ nhỏ và những bệnh nhân suy nhược
cơ thể. Cùng với sự phát triển của công nghệ chế biến các sản phẩm trong nước thì nhu
cầu sử dụng bacteriocin mà cụ thể là nisin trong bảo quản thực phẩm là rất lớn. Tuy
nhiên, các sản phẩm bảo quản nhập ngoại có giá thành tương đối cao. Thị trường các
chất bảo quản sinh học có nguồn gốc trong nước như bacteriocin còn đang là vấn đề
mở cho các nhà sản xuất.
1.2.6. Công nghệ sản xuất và các hƣớng nghiên cứu về nisin
Nisin là chất diệt khuẩn sinh học được thương mại hóa với mức độ lớn nhất
trong số các bacteriocin. Cho đến nay, nisin đã và đang được sản xuất công nghiệp
bằng việc lên men chủng L. lactis tự nhiên, thông qua việc tối ưu hố mơi trường, điều
16

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN

kiện lên men, hồn thiện cơng nghệ lên men, thu hồi và tinh sạch sản phẩm [18; 37;
49; 85]. Nhiều cơng trình nghiên cứu về việc nâng cao hoạt tính sinh tổng hợp nisin từ
vi khuẩn L. lactis đã được công bố. Jozala và đồng tác giả đã chứng minh, môi trường

MRS và M17 là môi trường gia tăng sự sinh trưởng và tổng hợp nisin từ các chủng L.
lactis. Một số tác giả khuyến cáo rằng, các môi trường tổng hợp thường không làm
tăng tổng hợp nisin [37]. Tuy nhiên, việc phối hợp các chất bổ sung khác để giảm 50
% lượng môi trường MRS và M17 lại giúp giảm giá thành sản xuất. Li và đồng tác giả

(2001) đã nghiên cứu tối ưu hóa, ảnh hưởng của đường saccarose, pepton đậu tương,
chiết nấm men, K2HPO4 , NaCl, MgSO4 đến sự sinh tổng hợp nisin [49]. Khi lên men
trong môi trường được tối ưu, năng suất tổng hợp nisin đã nâng lên từ 1074 IU/ml đến
2150 IU/ml. Taniguchi Mashayuki và cộng sự đã nghiên cứu nâng cao năng suất nisin
của L. lactis trong điều kiện ni cấy yếm khí với mơi trường có thành phần gồm
đường, các muối khống, các nguồn nitơ và sử dụng màng siêu lọc polycrylonitride để
thu nhận nisin trên quy mô công nghiệp [74]. Hiroshi Shmizu và cộng sự lại sử dụng
hệ thống nuôi cấy hỗn hợp loài L. lactis với Kluyveromyces marxianus. Các tác giả
nhận thấy, K. marxianus đã sử dụng lactat sinh ra trong q trình ni cấy L. lactis và
vì vậy đã có tác dụng kiểm sốt được pH trong mơi trường lên men. Kết quả là, sản
lượng nisin trong nuôi cấy hỗn hợp đạt 9,8 mg/l, cao hơn trong môi trường nuôi cấy
đơn chủng L. lactis (5,8 mg/l) [69]. Tại Trung quốc, sau khoảng gần 6 † 7 năm nghiên
cứu ở Viện Hàn lâm, việc sản xuất nisin ở quy mô công nghiệp trên nồi lên men 100
3

m , đã bắt đầu từ khoảng năm 1995.
Ngày nay, bên cạnh những nghiên cứu lý thuyết về cơ chế phân tử sự liên quan
giữa cấu trúc và chức năng, cơ chế tác dụng của nisin, cơ chế miễn dịch của chủng sản
cũng như vai trị của những enzym cải biên, thì hướng áp dụng kỹ thuật di truyền, kỹ
thuật protein nhằm cải tiến hoạt tính, độ hồ tan, tính bền vững, tăng cường tác động

của nisin đối với vi sinh vật thuộc nhóm Gram âm dành được sự quan tâm đặc biệt.
Ngoài ra, xu hướng nghiên cứu sử dụng nisin để chế tạo các màng bao gói thực phẩm,
thay thế phương pháp bổ sung trực tiếp nisin vào thực phẩm, đang hình thành bên cạnh
các nghiên cứu về năng suất và công nghệ tinh sạch cũng như cơng nghệ lên men.
1.3.

AXIT POLYLACTIC
17

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Axit polylactic (PLA)/polylactide là một loại polyme nhiệt dẻo bán tinh thể,
o

giịn và rắn, có nhiệt độ thủy tinh hóa tương đối thấp (~ 60 C) và có nhiệt độ chảy
o

mềm 175 ÷ 180 C. Vì thế PLA dễ dàng được gia công trong các thiết bị gia công chất
dẻo thông thường và PLA bị phân hủy theo con đường sinh học [10]. Hiện nay, trong
số các loại nhựa phân hủy sinh học, PLA là đối tượng được quan tâm nghiên cứu và
phát triển nhiều nhất trên thế giới do PLA rất thích hợp để chế tạo ra các bao bì, màng
bao gói thực phẩm, các sản phẩm sử dụng một lần nhằm thay thế các sản phẩm có
nguồn gốc polyme dầu mỏ gây ô nhiễm môi trường [31].
Mặc dù thời gian phát triển mới chỉ khoảng một thập kỷ, nhưng chỉ riêng tại
châu Âu tốc độ phát triển của nhựa phân hủy sinh học đã tăng gấp 10 lần. Điều này
cho thấy tiềm năng chiếm lĩnh thị trường rất lớn của loại sản phẩm này. Một số sản
phẩm đã được thương mại như túi sách, dụng cụ ăn uống sử dụng một lần của Công ty

Mater - Bỉ, các loại móc phát bóng golf, đĩa DVD, đinh tự tiêu trong phẫu thuật... của
Công ty Vegemat. Từ năm 2005, công ty đóng gói bao bì Coopbox của Ý đã sử dụng
PLA làm khay đựng và màng film bao gói bảo quản các loại thịt tươi, rau quả cho phân
phối và sử dụng khắp trong các nước thành viên của liên minh châu Âu [24].
Năm 2002 tập đồn hóa chất DowChemical và tập đoàn thực phẩm Cargill của
Mỹ đã liên kết đầu tư 300 triệu USD xây dựng nhà máy sản xuất PLA với công suất
140.000 tấn/năm. Cargill Dow đã sử dụng PLA như là nguyên liệu đáng tin cậy thay
cho các chất dẻo truyền thống [16].
Đường, tinh bột và
sinh khối thực vật

L-lactide

L-lactic

Phản ứng trùng ngưng (nhiệt
độ, áp suất)

Phản ứng cộng mở vòng
(nhiệt độ, chất xúc tác)

L-Polylactic Phân tử lượng cao

L-Polylactic Phân tử lương thấp

Hình 1.2. Sơ đồ quy trình sản xuất PLA của hãng Cargill Dow, Mỹ
Tại Nhật Bản, PLA được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Một số hãng điện tử
như NEC, Panasonic, Fujisu sử dụng PLA làm thẻ điện thoại, bàn phím máy tính, vỏ
điện thoại và một số thành phần linh kiện máy tính. Ngồi ra, một số hãng ơ tơ như
18

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Toyota, Honda sử dụng PLA làm một số thành phần và nội thất của xe. PLA còn được
sử dụng chế tạo các dụng cụ văn phòng, đồ chơi trẻ em, giầy dép trẻ em, vỏ chai, khay
đựng và màng film bao gói thực phẩm [62].
1.3.1. Sản xuất axit L-lactic
Axit lactic có lịch sử lâu đời và được áp dụng phổ biến trong lên men và bảo
quản thực phẩm. Axit lactic được khám phá lần đầu tiên bởi Scheele vào năm 1780,
như là một thành phần của sữa. Năm 1789, Lavoisier đặt tên nó là axit sữa. Đến năm
1857, Pasteur là người phát hiện, axit lactic còn được tạo ra từ quá trình trao đổi chất
của các vi sinh vật khác [13]. Hiện nay, axit lactic được sản xuất theo hai con đường:
tổng hợp hóa học từ nguyên liệu dầu mỏ, khí đốt và lên men vi sinh vật từ các nguyên
liệu có thể tái tạo (đường, tinh bột và sinh khối thực vật) (Hình 1.2) [78].
Tổng hợp axit lactic theo con đường hóa học địi hỏi các thiết bị cơng nghiệp
chịu nhiệt, chịu áp và axit, đồng thời sản phẩm tạo ra theo con đường này thường là
hỗn hợp hai dạng đồng phân D và L-lactic, dẫn đến chi phí cao do việc phân tách hai
loại đồng phân này [22]. Theo cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ (FDA),
axit D(–)-lactic, không được ứng dụng trong thực phẩm, bởi vì nó khơng được cơ thể
con người đồng hóa dẫn đến tích lũy axit D(–)-lactic, gây rối loạn axit và làm thất
thoát canxi trong cơ thể [42]. Đồng thời, tổng hợp theo con đường hóa học lại bị giới
hạn bởi hai vấn đề chính đó là sự khan hiếm nguyên liệu dầu mỏ và vấn đề môi trường
tạo ra. Để khắc phục các vấn đề trên, sản xuất axit lactic theo con đường lên men vi
sinh vật được cho là một lựa chọn tối ưu [42].
Sinh khối thực vật

Nguồn dầu mỏ

Tiền xử lý bằng axit hoặc enzyme
Lên men vi sinh vật

Acetaldehyde
(CH3CHO)

Lên men vi sinh vật
HCN, xúc tác

Dịch lên men

Lactonitrile(CH3CHOHCN)

Thu hồi và tinh sạch

Thủy phân bằng H2SO4
Tạo ra dạng racemic DL-lactic
axit

Tạo ra L- lactic hoặc D-lactic axit

19

(b) Lên men vi sinh vật

(a) tổng hợp hóa học

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN
- Các vấn đề về môi trường

- Cạn kiệt dầu mỏ

- Giải pháp thay thế


Hình 1.3. Sơ đồ sản xuất axit lactic
(a): bằng con đường hóa học; (b): con đường lên men vi sinh vật
Những vi sinh vật có thể sản sinh ra axit lactic được chia thành hai nhóm: nhóm
vi khuẩn và nhóm vi nấm.
Hiện nay, sản xuất axit lactic bằng lên men vi khuẩn thường sử dụng các loài
Lactobacillus rhamnosus, L. helveticus, L. bulgaricus, L. casei, L. plantarum, L.
pentosus, L. amylophilus, L. delbrueckii.
Vi khuẩn lactic có khả năng lên men đường glucose và lactose thành axit lactic với
hiệu suất cao. Axit lactic tạo ra theo con đường lên men vi khuẩn thường khơng phải chỉ
có axit L-lactic mà cịn có thêm sản phẩm phụ là D - lactic. Tỷ lệ giữa hai đồng phân này
phụ thuộc vào bản chất sinh học của từng loài và từng chủng [54; 83]. Hiện nay, nhiều
nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật di truyền để bất hoạt gen D-lactate dehydrogenase tổng
hợp ra D-lactic, để điều khiển tổng hợp ra 100 % axit L-lactic [17; 27; 28].

Sản xuất axit L-lactic từ vi nấm khác với ở vi khuẩn lactic. Một số loài vi nấm
như Rhizopus oryzae và Rhizopus arrhizus, có thể thủy phân, đồng hóa tinh bột và tạo
ra 100 % đồng phân axit L-lactic. Quá trình này diễn ra trong điều kiện hiếu khí
nghiêm ngặt [50; 75]. Nếu như quá trình lên men vi khuẩn lactic địi hỏi mơi trường
giàu dinh dưỡng thì q trình lên men của Rhizopus chỉ cần mơi trường muối khống
thơng thường. Vi nấm trong q trình sinh trưởng trong mơi trường dịch thể, sợi dinh
dưỡng bó lại thành dạng pellet, vì thế dễ dàng loại bỏ sinh khối trong quá trình thu hồi
sản phẩm sau lên men [82]. Mặc dù, quá trình sản xuất axit L-lactic từ vi nấm có
nhược điểm là tạo ra lượng nhỏ axit fumaric và ethanol. Tuy nhiên, hai dạng sản phẩm
phụ này có thể bị hạn chế sinh ra bằng cách điều khiển quá trình lên men và loại bỏ

hồn tồn thơng qua q trình trưng cất thu hồi axit L-lactic [61].
Như vậy, việc sử dụng lên men R. oryzae và R. arrhizus có thể thu nhận được
axit L-lactic có phần dễ dàng hơn so với sử dụng các vi khuẩn lactic.
1.3.2. Tách và thu hồi axit L-lactic từ dịch lên men
20

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Hiện nay, axit L-lactic sau lên men được tách và thu hồi theo những cách sau:
Sử dụng phương pháp hóa học: Trong quá trình lên men và sau lên men L-lactic
được kết tủa bằng CaCO3 hoặc Ca(OH)2 để tạo ra L-lactate-Ca. Hợp chất này được
tách ra khỏi dung dịch và hoàn nguyên trở thành L-lactic bằng cách cho L-lactate-Ca
phản ứng với H2SO4. Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thiết bị chịu axit
cao và không thu hồi L-lactic một cách triệt để [60].
Sử dụng phương pháp điện thẩm tách-electrodialysis: Hiện nay trong sản xuất
quy mô công nghiệp phương pháp này được sử dụng để tách L-lactic ra khỏi dịch lên
men. Nguyên tắc của phương pháp điện thẩm tách được mơ tả trong sơ đồ hình 1.3.
Thiết bị gồm điện trường một chiều và hai màng cation và anion. Dịch lên men đi vào
điện trường các ion dương (Ca

2+

+

hoặc Na ) được đi qua màng cation và về phía cực

âm. Các điện tích âm L-lactic đi qua màng anion và về cực dương. Dựa trên nguyên lý

này dịch L-lactic được tách và thu ở phía đầu cực dương của thiết bị. Ưu điểm của
phương pháp là hiệu suất thu hồi, độ tinh sạch cao và tốn ít năng lượng [38].
1.3.3. Tổng hợp polylactic
Polylactic được tổng hợp từ L-lactic theo hai con đường:
+ Con đường thứ 1 (dựa trên phản ứng trùng ngưng của axit L-lactic): từ monome ban

đầu là L-lactic được trùng ngưng loại nước để tạo ra PLA. Quá trình này được tiến
hành đơn giản trong thiết bị gia nhiệt và bay hơi. Tuy nhiên, sản phẩm PLA tạo ra
thường có phân tử lượng khơng cao với Mn và Mw từ 1000 ÷ 10.000 [36; 41].
+ Con đường thứ 2 (dựa trên phản ứng trùng hợp cộng mở vòng của L-lactide): từ
monomer là L-lactide dưới tác động của chất xúc tác và nhiệt độ L-lactide được trùng
hợp để tạo ra PLA. Phương pháp cộng mở vòng thường thu được PLA có phân tử
lượng cao với Mn và Mw > 100.000. Hiện nay, chủ yếu các PLA được sử dụng làm vật
liệu phân hủy sinh học được tổng hợp theo con đường này [57].
Để tổng hợp PLA bằng phản ứng cộng mở vòng từ monome axit L-lactic phải
tiến hành qua hai giai đoạn sau:
Giai đoạn I: Tổng hợp dime vòng (lactide) từ axit L- lactic bằng phương pháp trùng
ngưng chọn lọc có xúc tác:
O

HO C

Số hóa bởi trung t

O



Chi tiết các phản ứng của giai đoạn I:
O

O

C

n

HO

L-A-xit lactic

O

C

HO

oligome PLA

Bước 2: phản ứng vịng hóa Unzipping
B- í c 2: Phản ứng vòng hoá Unzipping

Giai on II: Trựng hp m vịng L-lactide thành PLA:

Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về khả năng sản xuất bao bì dễ phân hủy

từ các vật liệu như tinh bột biến tính, vật liệu blend của polyetylen với các loại polyme
dễ phân hủy có nguồn gốc tự nhiên như PHB [5]. Tuy nhiên, đến nay chưa có loại bao
bì nào thuộc dạng này được đưa ra thị trường. Một số công ty TNHH tại Tp. Hồ Chí

Minh, Vĩnh phúc đã nhập nguyên liệu để sản xuất bao bì dễ phân hủy, nhưng khơng
phải là polylactic và khơng có các chất kháng khuẩn nên chỉ đóng vai trị làm bao gói.
1.3.4. Khả năng phân hủy sinh học của polylactic

22

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN