Nghiên cứu phối hợp estcrase và bảo vệ enzyme thủy phân tử nằm trong chuyển hóa phụ phẩm công nông nghiệp để thu nhận bioethanol tt

I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN

1. Đặt vấn đề
Hiện nay, nhu cầu năng lượng luôn là vấn đề nan giải của bất kì quốc gia nào trên thế giới. Trong số các
nguồn năng lượng thay thế dầu mỏ đang sử dụng hiện nay (năng lượng gió, mặt trời, hạt nhân,…), năng lượng
sinh học đang là xu thế phát triển tất yếu, nhất là ở các nước nông nghiệp và nhập khẩu nhiên liệu. Dựa vào
nguyên liệu sản xuất, người ta chia NLSH thành 4 thế hệ: Thế hệ I (từ tinh bột như ngơ, sắn, mía đường), thế hệ
II (từ sinh khối thực vật như thân cây lúa, ngô, lúa mỳ, bã mía), thế hệ thứ III (từ các lồi vi tảo) và thế hệ IV nhiên liệu tiên tiến (dựa trên các chuyển hóa sinh - hóa, nhiệt – hóa). Chúng phân thành ba nhóm là dầu sinh học
(biodiesel), khí sinh học (biogas) và bioethanol (ethanol sinh học). Trong đó, bioethanol đang rất được quan tâm
do từ ngày 01/01/2018 chính phủ ban hành quyết định sử dụng xăng sinh học E5 (5% bioethanol) thay thế xăng
RON 92 trên toàn quốc. Do vậy, nhu cầu sản xuất và tiêu thụ bioethanol ngày càng tăng cao.
Việc sản xuất nhiên liệu sinh học nói chung và bioethanol theo thế hệ I từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường
(mía) rất phổ biến. Bên cạnh đó, bioethanol cịn được sản xuất từ lignocellulose theo thế hệ thứ II. Nguồn
nguyên liệu này chủ yếu bao gồm: gỗ, rơm lúa, bã mía, thân cây ngơ…là các sinh khối có thành phần
lignocellulose phổ biến nhất trong số các phụ phẩm công-nông nghiệp. Tuy nhiên, nguồn nguyên liệu này sử
dụng chưa hiệu quả mà chủ yếu theo phương pháp truyền thống như làm cơ chất nuôi nấm, thức ăn gia súc, ủ
làm phân bón, đốt... Do vậy, việc tận dụng nguồn cơ chất này để sản xuất bioethanol là một giải pháp thích hợp,
đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam. Mặc dù nguồn nguyên liệu giàu lignocellulose
rất phổ biến nhưng những khó khăn để có thể tận dụng hiệu quả nguồn sinh khối này cho sản xuất các sản phẩm
có giá trị cao hơn chủ yếu do lignocellulose có cấu trúc phức tạp, khó chuyển hóa sinh học. Do đó, nhiệm vụ tìm
kiếm giải pháp thích hợp để chuyển hóa hiệu quả vật liệu trên thành dạng năng lượng có ích ngày càng trở nên
cấp thiết. Theo phương thức truyền thống có thể sử dụng phương pháp hóa học (axít/bazơ) hoặc hóa lý
(nghiền/nổ hơi). Tuy nhiên, một trong những hướng đi mới để giải quyết nhiệm vụ này là sử dụng xúc tác sinh
học (enzyme từ các loài nấm), chúng được biết là có hệ enzyme xúc tác hiệu quả giúp chúng phân hủy tốt
lignocellulose để giải phóng các đơn vị đường cần thiết cho quá trình lên men bioethanol. Tuy nhiên, nhìn chung
các enzyme thủy phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp trên cơ chất thô và việc xúc tác chuyển
hóa hiệu quả cơ chất cần kết hợp nhiều enzyme có tác dụng hiệp đồng. Với mục đích như trên đề tài NCS
“Nghiên cứu phối hợp esterase và hệ enzyme thủy phân từ nấm trong chuyển hóa phụ phẩm công-nông
nghiệp để thu nhận bioethanol” sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme
esterase (acetyl esterase và feruloyl esterase), enzyme thủy phân và/hoặc oxy hóa từ nấm để phân hủy các cấu
trúc polymer phức tạp để lên men thu nhận bioethanol. Việc sản xuất bioethanol từ nguồn sinh khối phụ phẩm

công - nông nghiệp một mặt tận dụng nguồn nguyên liệu rồi rào thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống (vd:
ngũ cốc, bắp, sắn), mặt khác tạo thành nguồn năng lượng sạch giúp giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường do đốt
hoặc xử lý theo phương pháp truyền thống gây ra, đồng thời không ảnh hưởng tới an ninh lượng thực quốc gia.
Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II.

1


2. Mục tiêu nghiên cứu
Hiên nay, khả năng chuyển hóa các vật liệu thô từ sinh khối giàu lignocellulose bằng các phương pháp
truyền thống còn nhiều mặt hạn chế. Do vậy, mục tiêu của đề tài luận án nhằm khai thác nguồn đa dạng xúc tác
sinh học (enzyme thủy phân) từ nấm để chuyển hóa hiệu quả sinh khối giàu lignocellulose từ các phụ phẩm
công-nông nghiệp thành các đường (C5 và C6) có khả năng lên men cho sản xuất bioethanol. Đặc biệt, luận án sử
dụng “enzyme cocktail” xúc tác hiệp đồng để tăng khả năng chuyển hóa sinh học. Trong đó, nghiên cứu sử dụng
carbohydrate esterase [feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)] nhằm phối hợp với các enzyme tấn cơng
mạch chính (cellulase/xylanase) và mạch nhánh để thủy phân cấu trúc lignocellulose. Mục tiêu tiếp theo là đánh
giá khả năng lên men nguồn dịch đường sau thủy phân bằng “enzyme cocktail” thành bioethanol.
3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu chính đã thực hiện:
- Phân lập, sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme carbohydrate esterase
[feruloyl esterase (FAE), acetyl esterase (AE)];
- Sinh tổng hợp và tinh sạch protein enzyme hoạt tính FAE và AE từ mơi trường ni cấy nấm và xác định
đặc tính của enzyme tinh sạch.
- Chuyển hóa vật liệu lignocellulose thành các đường đơn (hexose và pentose) có khả năng lên men sử dụng
đơn enzyme và “enzyme cocktail” hoạt tính cellulase/xylanase và esterase xúc tác hiệp đồng.
- Tối ưu quy trình chuyển hóa và nghiên cứu sản xuất bioethanol từ dịch đường chuyển hóa quy mơ phịng thí
nghiệm.
4. Những đóng góp mới của luận án
- 44 chủng nấm thuộc 13 họ thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và nấm Đảm (Basidiomycota) được phân lập
và sàng lọc khả năng sinh tổng hợp carbohydrate esterase (feruloyl esterase và acetyl esterase).

- Lần đầu tiên, enzyme feruloyl esterase từ nấm Alternaria tenuissima và acetyl esterase từ nấm Xylaria
polymorpha được phân lập và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy giàu lignocellulose. Trong đó, feruloyl
esterase từ Alt. tenuissima (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3 kDa với hoạt tính đặc hiệu 11,2 U/mg.
Acetyl esterase từ X. polymorpha (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa với hoạt tính đặc hiệu 13,1
U/mg. Hai enzyme này có độ bền cao trong khoảng nhiệt độ 40 đến 450C và pH 5,0.
- Enzyme carbohydrate esterases tinh sạch kết hợp với enzyme thương mại (hỗn hợp “enzyme cocktail” hoạt
tính cellulase/xylanse (cell/xyl)) được tối ưu thành phần và sử dụng để chuyển hóa sinh khối thực vật thơ (vd.
mía bã mía, rơm rạ, bột gỗ, rong túi…) thành các đường đơn có khả năng lên men bioethanol. Trong đó, bã
mía được chọn làm cơ chất phù hợp để sản xuất các đường C5/C6 (vd: glucose, xylose).
- Bằng quy hoạch thực nghiệm đã xác định điều kiện tối ưu cho chuyển hóa bã mía bằng “enzyme cocktail” là
ở 400C, pH 5.0, trong 48 giờ và hoạt độ enzyme là cell/xyl: 100 U/g, AltFAE: 7,56 U/g, XpoAE: 10,8 U/g
sinh khối khơ. Khi đó, tổng các đường lên men là 251,86 mg/g. Kết hợp xử lý bã mía bằng “enzyme cocktail”
và axit H2SO4 lỗng (0,1%) thì các đường lên men sinh ra là 319,5 mg/g, đạt hiệu suất 49,8%.

2


- Các đường đơn thu được bằng chuyển hóa enzyme đã được chứng minh có khả năng lên men bioethanol (cồn
sinh học) bởi chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae với hàm bioethanol thu được 178ml/kg bã mía, đạt
hiệu suất 79,8% so với lý thuyết.
5. Ý nghĩa khoa học thực tiễn của luận án
Bên cạnh sản xuất bioethanol từ nguồn tinh bột (sắn, bắp) và đường (mía), bioethanol có thể được sản xuất
từ lignocellulose. Lignocellulose là loại sinh khối (biomass) phổ biến nhất trong sinh quyển. Sản xuất bioethanol
từ nguồn sinh khối là một giải pháp thích hợp, đặc biệt là với các quốc gia với nền nông nghiệp như Việt Nam.
Hàng năm sản xuất công-nông nghiệp trong nước sản sinh hàng trăm triệu tấn phụ phẩm giàu lignocellulose là
nguồn cung cấp nguyên liệu vô cùng dồi dào cho sản xuất năng lượng sạch, mặt khác giải quyết vấn đề ô môi
trường do không được xử lý hay loại bỏ theo phương pháp truyền thống.
Theo các tài liệu công bố và kinh nghiệm nghiên cứu của chúng tơi cho thấy, nhìn chung các enzyme thủy
phân lignocellulose hoạt động yếu khi sử dụng trực tiếp (không qua tiền xử lý) trên cơ chất thơ. Điều này có thể
khắc phục bằng việc sử dụng hỗn hợp các enzyme phù hợp (“enzyme cocktail”) bao gồm hệ enzyme thủy phân

và/hoặc oxy hóa để phân hủy các cấu trúc polymer phức tạp. Ngoài ra, sàng lọc enzyme bằng ni cấy vi sinh
vật có vai trị quan trọng trong việc tìm ra các enzyme mới với hoạt tính xúc tác thủy phân cao và các đặc tính
hữu ích.
Đề tài luận án khơng nhằm giải quyết được tồn bộ các bước từ chuyển hóa vật liệu sinh khối thơ thành
bioethanol mà mục tiêu chính nhằm khai thác và sử dụng nguồn xúc tác sinh học từ nấm và tối ưu hóa cho
chuyển hóa sinh khối thành đường có khả năng lên men. Đây cũng chính là một trong những khâu then chốt
trong công nghệ lên men sản xuất bioethanol thế hệ II.
6. Bố cục luận án
Luận án gồm 163 trang với 21 bảng, 58 hình, 144 tài liệu tham khảo. Bố cục của luận án: Mở đầu (4 trang),
Chương 1: Tổng quan (39 trang), Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu (26 trang), Chương 3:
Kết quả và thảo luận: (67 trang), Kết luận (2 trang), Danh mục các cơng trình cơng bố (1 trang), Tài liệu tham
khảo (13 trang). Phụ lục (39 trang).
II. NỘI DUNG LUẬN ÁN
Phần mở đầu đề cập ý nghĩa khoa học, tính mới, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của luận án.
Chương 1. Tổng quan
Phần này trình bày:
- Tổng quan về phụ phẩm cơng - nơng nghiệp giàu lignocellulose, trong đó trình bày về nguồn gốc, hiện trạng sử
dụng phụ phẩm cơng-nơng nghiệp ở Việt Nam nói chung và nguồn gốc, hiện trạng sử dụng, các vấn đề môi
trường từ bã mía ở Việt Nam nói riêng.
- Chuyển hóa vật liệu giàu lignocellulose bằng xúc tác sinh học. Trong đó làm nổi bật được cơ chế chuyển hóa
của enzyme trong thủy phân lignocellulose, nguồn enzyme từ đa dạng nấm ở Việt Nam, enzyme thủy phân
lignocellulose từ nấm và vai trò enzyme carbohydrat esterase trong thủy phân lignocellulose.

3


- Tổng quan về tình hình sản xuất bioethanol và những nghiên cứu, sản xuất bioethanol trong và ngoài nước.
Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vi sinh vật
+ Quả thể nấm tươi được thu lượm từ vườn Quốc gia Cúc Phương – Ninh Bình được sử dụng để phân lập nấm,

sàng lọc và tinh sạch enzyme thủy phân phục vụ cho nghiên cứu.
+ Một số chủng nấm được chọn lọc từ bộ chủng giống lưu giữ tại phịng thí nghiệm Sinh học thực nghiệm, Viện
Hóa học các hợp chất thiên nhiên.
+ Enzyme thương mại được tinh sạch từ nấm Trichoderma reesei (carboxymethyl cellulase and
glucuronoxylanase; 1-1,6 U/mg, Cell/Xyl, AB Enzyme, Darmstadt, Germany) hoạt động tối ưu ở pH 5.0-5.5,
nhiệt độ 40-45oC.
+ Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 được cung cấp bởi phịng Vi sinh mơi trường, Viện Công
nghệ môi trường.
2.2. Các phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật: Phân lập nấm; Nuôi cấy và bảo quản nấm men; Lên men bioethanol.
2.2.2. Định danh nấm: Định danh bằng phương pháp hình thái giải phẫu; Định danh bằng phương pháp sinh học
phân tử.
2.2.3. Sàng lọc hoạt tính esterase và lựa chọn chủng nấm
2.2.4. Đánh giá hoạt độ acetyl esterase và feruloyl esterase
2.2.5. Xác định điều kiện thích hợp sinh tổng hợp esterase
2.2.6. Tinh sạch protein enzyme
2.2.7. Phương pháp hóa sinh: Sắc ký bản mịng (TLC); Sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC; Xác định peptide bằng
phương pháp phổ khối (MS); Định lượng đường khử theo phương pháp axit dinitrosalicylic (DNS); Xử lý
nguyên liệu (bằng kiềm, axít và gia nhiệt); Xác định hàm lượng bioethanol.
2.2.8. Xúc tác chuyển hóa sinh học các vật liệu giàu lignocellulose
2.2.9. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm
2.2.10. Phương pháp xử lý số liêu
2.3. Xây dựng sơ đồ nghiên cứu
2.3.1. Sơ đồ xác định các điều kiện thích hợp cho mơ hình tối ưu thực nghiệm
2.3.2. Sơ đồ thủy phân bã mía bằng phương pháp hóa lý kết hợp “enzyme cocktail”
2.3.3. Sơ đồ lên men bioethanol từ dịch đường chuyển hóa
Chương 3: Kết quả và thảo luận
3.1. Phân lập và sàng lọc nấm
Từ các mẫu nấm thu từ rừng QG Cúc Phương (Ninh Bình) đã phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ và
định tên khoa học đến loài. Các taxon nấm phân lập được:

3.1.1. Ngành nấm đảm Basidiomycota
Họ Polyporaceae: Coriolus unicolor, Tyromyces lacteus, Trametes insularis, Tr. consors, Tr. gibbosa,
Hexagonia apiaria, Nigroporus aratus
Họ Ganodermataceae: Ganoderma komingshegii, G. applanatum, Ganoderma sp.

4


Họ Coriolaceae: Poria versipora
Họ Marasmiaceae: Campanella junghuhnii, Marasmius maximus
Họ Agaricaceae: Coprinus disseminates
Họ Mycenaceae: Mycena galericulata
Họ Auriculariaceae: Auricularia delicate
Họ Hymernochaetaceae: Inonotus substygius, Polystictus didrichsenii
Họ Hygrophoropsidaceaee: Hygrophoropsis aurantiaca
3.1.2. Ngành nấm túi Ascomycota
Họ Xylariaceae: Xylaria polymorpha, X. carpophila, Hypoxylon monticulosum (CP629), Rosellinia sp.
(CP564), Nodulisporium sp. (CP582).
Họ Helotiaceae: Bisporella citrine
Họ Pleosporaceae: Alternaria tenuissima (SP66)
Họ Bionectriaceae: Bionectria sp. (CP587)
3.2. Khả năng sinh tổng hợp esterase và lựa chọn chủng nấm
3.2.1. Sàng lọc hoạt tính feruloyl esterase (FAE)
Khả năng sinh tổng hợp feruloyl esterase của 44 chủng nấm lựa chọn được đánh giá qua khả năng phân giải
cơ chất ethyl ferulate (ethyl 4-hydroxy-3-methoxycinnamate) trên đĩa thạch. Chủng Alt. tenuissima SP66 do biểu
hiện hoạt tính feruloyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp theo để xác định các điều kiện
nuôi cấy như thời gian, cơ chất/nguồn carbon, nguồn nitơ, nhiệt độ và pH.
3.2.2. Sàng lọc hoạt tính acetyl esterase (AE)
Dịch lên men của 44 chủng nấm sau khi ly tâm để loại bỏ sinh khối và các thành phần tạp để xác định hoạt
tính acetyl esterase (AE) qua khả năng thủy phân cơ chất p-nitrophenyl acetate. Chủng X. polymorpha A35 do

biểu hiện hoạt tính acetyl esterase cao nên được lựa chọn cho những nghiên cứu tiếp. Sau khi sàng lọc hoạt tính
feruloyl esterase và acetyl esterase đã lựa chọn hai chủng nấm có hoạt tính cao là Alt. tenuissima SP66 và X.
polymorpha A35. Sau đó các nghiên cứu về tối ưu các điều kiện lên men sinh tổng hợp enzyme, tinh sạch và đặc
tính AE và FAE cũng như sử dụng enzyme cho xúc tác chuyển hóa sinh khối lignocellulose sẽ được thực hiện.
3.3. Định danh nấm bằng phương pháp sinh học phân tử
SP66

A35

A

SP66 A35 M

B

Hình 3.1. (A) Hình ảnh điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% và (B) Sản phẩm PCR của nấm SP66 và A35

5


Từ kết quả phân loại bằng phương pháp sinh học phân tử và phân tích hình thái bào tử có thể kết luận mẫu
nấm phân lập ký hiệu SP66 là loài nấm túi Alternaria tenuissima SP66 thuộc họ Pleosporaceae và chủng nấm
A35 là Xylaria polymorpha A35 thuộc họ Xylariaceae.
3.4. Động học sinh tổng hợp enzyme esterase
Tối ưu hóa được các điều kiện sinh tổng hợp acetyl esterase và feruloyl esterase của hai chủng nấm X.
polymorpha A35 và Alt. tenuissima Sp66 như sau:
Hoạt tính acetyl esterase: Chủng X. polymorpha A35 ni cấy trên mơi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ
chất rơm, nguồn nitơ là pepton, thời gian nuôi cấy 10 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó,
hoạt tính acetyl esterase cao nhất đạt 135,4 U/l.
Hoạt tính feruloyl esterase: Chủng Alt. tenuissima ni cấy trên mơi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ

chất rơm, thời gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7, có khuấy lắc 200 v/ph, khi đó, hoạt tính acetyl
esterase cao nhất đạt 1154,4 U/l.
3.5. Tinh sạch enzyme từ môi trường nuôi cấy nấm
3.5.1. Tinh sạch và đặc tính acetyl esterase của nấm X. polymorpha A35 (XpoAE)
Dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 3 tuần được cô đặc bằng siêu lọc (màng lọc 10 kDa
cut-off). Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính XpoAE đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate được tinh sạch
bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion
DEAE Sepharose và kết quả đã thu được 3 phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE (ký hiệu phân đoạn I, II và III).
Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất (phân đoạn III) được nạp tiếp lên cột
SuperdexTM 75. Sau bước sắc ký lọc gel này, một phân đoạn hoạt tính enzyme XpoAE được thu (Hình 3.2).
Sau quá trình tinh sạch đã thu được lượng protein enzyme tinh sạch là 20,6 mg, tương đương 27 U và hiệu
suất 26,8 % với độ tinh sạch 18,3 lần. Phân đoạn enzyme tinh sạch này được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp
theo về đặc tính protein enzyme cũng như nghiên cứu chuyển hóa in vitro vật liệu giàu lignocellulose (Bảng
3.1).

Hình 3.2. Tinh sạch XpoAE từ nấm X. polymorpha A35 qua các bước sắc ký lỏng
(A) sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose và (B) sắc ký lọc gel SuperdexTM 75; (─) độ hấp thụ ở λ=280 nm
và (●) hoạt tính XpoAE trên cơ chất p-nitrophenyl acetate

6


Bảng 3.1. Các bước tinh sạch enzyme XpoAE
Protein tổng
(mg)

Hoạt tính tổng
(U)

Hoạt tính riêng

(U mg-1)

Hiệu suất
(%)

Độ tinh sạch
(lần)

Dịch chiết thơ

1408,0

1009

0.7

100

1,0

Siêu lọc 30-10 kDa

872,1

944

1.1

93,6

1,5

DEAE Sepharose
(phân đoạn III)
SuperdexTM 75

86,0

432

5.0

42,8

7,0

20,6

270

13.1

26,8

18,3

Các bước tinh sạch

Đặc tính hóa-lý của XpoAE: Điện di SDS-PAGE của phân đoạn III qua các bước tinh sạch ở trên cho thấy
một vạch protein hoạt tính XpoAE sau khi nhộm với Colloidal Blue Staining Kit với trọng lượng phân tử MW =

44 kDa. Trong khi đó, điện di điểm đẳng điện IEF cho thấy 2 vạch protein gần kề có giá trị pI lần lượt là 3,5 và
3,6 (Hình 3.3). Đặc tính hóa-lý của XpoAE tương ứng với đặc tính của các AE đã cơng bố (34-56 kDa).

Hình 3.3. Protein tinh sạch (1,3) biểu hiện hoạt tính acetyl esterase (XpoAE) trên gel điện di SDS-PAGE (A) và
IEF (B); (2,4) protein marke
Nhiệt độ và pH tối ưu: Để xác định nhiệt độ phản ứng tối ưu, phản ứng giữa enzyme XpoAE tinh sạch và cơ
chất p-nitrophenyl acetate được tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 35-70°C. Kết quả cho thấy, hoạt tính XpoAE
tăng dần từ 40% ở nhiệt độ 35°C lên cực đại ở 42°C (100%). Sau đó, khi tăng nhiệt độ thì hoạt tính của enzyme
giảm dần chỉ cịn 51% ở 61°C (Hình 3.4-B). Giá trị pH 5,0 thích hợp. Hoạt động tương đối giảm dần từ 100% ở
pH 6,5 xuống 57% ở pH 7.0 (Hình 3.4-A).

Hình 3.4. Ảnh hưởng của pH (A) và nhiệt

độ (B) đến hoạt tính enzyme XpoAE tinh sạch

7


Độ bền nhiệt và pH của enzyme XpoAE:
Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 400C sau 3 giờ ủ, sau đó giảm hơn 50% hoạt tính khi ủ thời gian 4 giờ và
lâu hơn. Hoạt tính của enzyme giảm nhanh ở 600C và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme
tinh sạch cho thấy bền hoạt tính ở pH 5,0 nhưng mất trên 90% hoạt tính trong thời gian ủ 1 giờ dưới điều kiện
axít mạnh (pH 3; Hình 3.5). Enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 tương đối bền trong khoảng
nhiệt độ 40°C ở pH 5.

Hình 3.5. Độ bền enzyme XpoAE tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 ở các điều kiện nhiệt độ (A) và pH (B)
khác nhau: (A): ♦ 40 oC, ▲60 oC; (B): ▲ pH 3, ● pH 5, ♦ pH 6
3.5.2. Tinh sạch và đặc tính feruloyl esterase của Alt. tenuissima SP66 (AltFAE)
Dịch enzyme thô từ môi trường nuôi cấy nấm sau 2 tuần được siêu lọc 10 kDa cut-off, qua đó các protein
và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ cũng được loại bỏ. Sau đó, protein enzyme biểu hiện hoạt tính feruloyl

esterase đối với cơ chất methyl ferulate được tinh sạch bằng sắc ký lỏng. Bước đầu tiên của quá trình rửa giải
protein được thực hiện qua cột sắc ký trao đổi anion DEAE Sepharose. Sau bước sắc ký thứ nhất độ tinh sạch
tăng khơng đáng kể (từ 1,4 lần) nhưng có thể loại phần lớn các chất mầu (có thể là các hợp chất polyphenolic)
khỏi protein hoạt tính FAE đích. Tổng thể tích rửa giải của phân đoạn hoạt tính enzyme cao nhất được nạp tiếp
lên cột SuperdexTM 75. Hiệu quả tinh sạch cao nhất ở bước sắc ký lọc gel này, thể hiện ở độ tinh sạch tăng từ
~12 lên ~30 lần với hiệu suất ~ 44%). Trong khi đó, sử dụng sắc ký trao đổi anion mạnh (Q Sepharose; Hình
3.6) ở bước tiếp theo độ tinh sạch tăng lên 35,8 lần nhưng lượng protein và tổng hoạt tính tương ứng với hiệu
suất tinh sạch giảm tới gần ½ (hiệu suất cuối 28,9%; Bảng 3.2). Như vậy, bước tinh sạch cuối cùng cần thiết cho
các nghiên cứu cơ bản (yêu cầu độ tinh sạch tối đa), trong nghiên cứu ứng dụng enzyme AltFAE từ Alt.
tenuissima SP66 có thể sử dụng ngay sau bước sắc ký lọc gel để đảm bảo hiệu suất thu hồi cao và tiết kiệm thời
gian, chi phí.

8


Hình 3.6. Tinh sạch AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66 qua cột sắc ký trao đổi anion Q Sepharose®
(●) Hoạt tính AltFAE đối với cơ chất methyl ferulate, (─) protein hấp thụ ở λ=280 nm
Bảng 3.2. Tinh sạch enzyme AltFAE từ dịch lên men nấm Alt. tenuissima SP66
Các bước tinh sạch

Protein tổng
(mg)

Hoạt tính tổng
(U)

Hoạt tính riêng
(U mg-1)

Hiệu suất

(%)

Độ tinh sạch
(lần)

Dịch chiết thơ

1673,2

523,7

0,3

100

1,0

Siêu lọc 10 kDa

259,5

421,7

1,6

80,5

5,2

DEAE Sepharose

79,1

305,4

3,9

58,3

12,3

SEC SuperdexTM 75

24,1

228,3

9,5

43,6

30,3

Q Sepharose®

13,5

151,2

11,2

28,9

35,8

Đặc tính hóa-lý của AltFAE: Điện di SDS-PAGE sau bước tinh sạch cuối cùng qua cột Q Sepharose® cho
thấy một băng protein biểu hiện hoạt tính FAE (cơ chất methyl ferulate) sau khi nhộm với Colloidal Blue
Staining Kit với trọng lượng phân tử MW=30,3 kDa (Hình 3.7).

Hình 3.7. Protein tinh sạch (1) biểu hiện hoạt tính feruloyl esterase (AltFAE) trên
gel điện di SDS-PAGE (A); (2) protein marker

9


Nhiệt độ và pH tối ưu: Nhiệt độ enzyme AltFAE được xác định trong khoảng từ 30-800C và pH từ 4,0-9,0.
Hoạt tính tương đối giảm dần từ 100% ở pH 7.0 xuống 84% ở pH 9.0 (Hình 3.8-A). Enzyme được tinh sạch ổn
định trong suốt 2 giờ ủ ở pH trung hịa với hoạt tính cịn lại là 97% ở pH 6.0 và 89% ở pH 8.0. Ngược lại, khi ủ ở
môi trường axit (pH 4.0) làm mất hoạt độ enzyme 57% sau 2 giờ ủ. Khi ủ ở 600C làm cho hoạt tính mất hơn 50%
trong vịng 2 giờ, trong khi hơn một nửa hoạt độ ban đầu vẫn được xác định sau 8 giờ ủ ở 400C, khi nhiệt độ tăng
lên đến 700C hoạt tính enzyme giảm chỉ còn 30%. Do vậy, nhiệt độ tối ưu của enzyme AltFAE là 42°C và pH 7
(Hình 3.8-B).

Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ (A) và pH (B) lên enzyme AltFAE
Phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ từ 30-80°C và pH từ 4-9. Các thí nghiệm được thực hiện ba lần, độ
lệch chuẩn (SD) <5%
Độ bền nhiệt và pH của enzyme AltFAE: Enzyme tương đối bền ở nhiệt độ 250C và 400C sau 2 giờ ủ, sau
đó giảm hơn 10% hoạt tính sau 4 giờ ủ ở 250C và giảm 35% khi ủ lâu hơn 2 giờ ở 400C. Hoạt tính của enzyme
giảm nhanh ở 60oC và mất hầu hết hoạt tính sau 1 giờ ủ ở nhiệt độ này. Enzyme tinh sạch cho thấy bền hoạt tính
ở mơi trường có pH 5 và pH 6 nhưng mất trên 75% hoạt tính trong thời gian ủ 2 giờ dưới điều kiện mơi trường

pH 8 (Hình 3.9).

Hình 3.9. Độ bền nhiệt của AltFAE ở nhiệt độ (A) và pH (B) khác nhau theo thời gian

10


(A): 25°C (KH: kim cương), 40°C (KH: vòng tròn), 60°C (KH: tam giác); (B): pH 10 (KH: kim cương),
pH 8.0 (KH: vòng tròn), pH 7.0 (KH: sao), pH 5.0 (KH: tam giác)
Kết quả phân tích peptide của AltFAE: Trình tự chuỗi peptide của protein biểu hiện hoạt tính AltFAE từ
nấm Alt. tenuissima SP66 được xác định thành công bằng phổ khối lượng ESI-MS (Hình 3.10 & Bảng 3.3) là cơ
sở phân loại ban đầu và có thể sử dụng dữ liệu cho thiết kế mồi (primer) xác định gen mã hóa cho protein này.

Hình 3.10. Dữ liệu phổ ESI-MS/MS các đoạn peptide của AltFAE tinh sạch
Bảng 3.3. Các đoạn peptide của enzyme AltFAE tinh sạch từ nấm Alt.tenuissima SP66 xác định bằng thủy phân
với trypsin và LC-ESI-MS/MS
Peptide*

Trọng lượng phân tử (Da)

GAYSLSLR

865,99

GFFLFVEGGR

1128,3

GSSIFGLAPGK

1033,19

GKVALDDLLTQR

1327,75

LNTLETEEWFFK

1556,75

LNTLETEEWFFK

1556,75

*Ký hiệu cho các axit amin theo quy định của IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
3.5.3. Quy trình lên men, chiết tách và tinh sạch esterase từ nấm
+ Tinh sạch enzyme XpoAE từ nấm X. polymorpha A35
Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch esterase bao gồm các bước chính sau:
Ni cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ):
Chủng X. polymorpha A35 được lên men 5 lít/mẻ trong mơi trường cơ bản (cho mỗi 1 lít) với thành phần
như sau: MgSO4: 0,5 g; KH2 PO4: 1,5 g; Cao nấm men: 2,0 g; Dịch nguyên tố vi lượng (vết): 1 mL.
Mơi trường cơ bản có bổ sung nguồn cơ chất rơm, nguồn nitơ là pepton, nhiệt độ 25oC, pH 7 trong điều
kiện nuôi lắc 200 v/ph, thời gian lên men 10 ngày. Song song với quá trình lên men lỏng thì chủng nấm trên
cũng được lên men rắn sử dụng 2-3 kg rơm khô được ngâm trong nước qua đêm sau đó cho vào các túi plastic
chịu nhiệt và khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Sử dụng 2-3 hộp peptri mơi trường thạch-malt có khuẩn ty nấm
nghiền đồng thể. Tiếp theo, cấy chuyển toàn bộ dịch khuẩn ty vào mỗi túi plastic với cơ chất rơm, toàn bộ quá trình

11

nuôi cấy được thực hiện ở điều kiện vô trùng. Khuẩn ty nấm được ủ ở 230C trong khoảng từ 10 - 14 ngày, sau đó
mơi trường lên men bề mặt được chiết với nước cất (d.H2O) qua đêm trên máy lắc.
Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc:
Sau khi ni cấy ở các điều kiện thích hợp trên mơi trường rắn và lỏng, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải
thô và giấy lọc (GF6 và RC 55, WhatmanTM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính esterase được loại khuẩn ty
nấm và cơ chất bằng ly tâm 5000-10 000 v/ph và siêu lọc 5, 10 và 30 kDa cut-off (hệ LongerPump K235 với
màng UFP 30MW, Amersham BioScience, Westborough, MA, USA, hoặc Vivaflow200, màng Polyethersulfon
10MW, Sartorius, Goettingen, CHLB Đức, hoặc amicon Ultra Centrifugal Filters, 5MW, Millipore, Bedford,
USA) ở 11oC.
Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký:
Để thu acetyl esterase tinh sạch từ nấm X. polymorpha A35 dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase
được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel sử dụng cột DEAE Sepharose và SuperdexTM
75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức).
Bước đầu tiên được thực hiện trên cột trao đổi ion DEAE Sepharose ở pH 4,5 với đệm Na-acetate 50 mM. Sau
khi lọc rửa có thể thu được các phân đoạn hoạt tính với lượng 86,0 mg protein hoạt tính AE (43,2 U).
Bước tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký lọc gel qua cột SuperdexTM 75 ở pH 6,5 với đệm Na-acetate 50
mM và nồng độ NaCl 100 mM, phân đoạn hoạt tính acetyl esterase (đối với cơ chất p-nitrophenyl acetate). Các
phân đoạn hoạt tính enzyme được trộn lẫn, cơ đặc và thẩm tách qua màng lọc kích thước 10 kDa như trên với
đệm Na-acetate 10 mM (pH 6,0) và bảo quản ở -200C. Sau quá trình tinh sạch thu được 20,6 mg protein
enzyme/mẻ tương đương hoạt tính enzyme tổng là 270 U.
Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng
phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) và Native-IEF (Novex IEF
gel) (Hình 3.11).

12


Dịch chiết môi trường lên men X.
polymorpha A35
(5 L/mẻ môi trường lỏng và 2-3 kg

rắn, protein tổng 1408 mg)
- Lọc chân không
(Whatman GF6)
- Ly tâm 5000 v/ph
trong 10 phút

Cặn ly tâm
(Loại bỏ)
Siêu lọc 30kDa cut-off
(cô đến 1000 ml)

Siêu lọc 10kDa cut-off
(872 mg protein)

Sắc ký DEAE Sepharose

Xác định hoạt độ enzyme; định lượng protein
Điện di SDS-PAGE và IEF

Dịch sau ly tâm

Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75

Acetyl esterase
tinh sạch
(20,6 mg protein,
270 U enzyme)

Hình 3.11. Quy trình chiết tách và tinh sạch XpoAE từ nấm X. polymorpha A35

13


+ Tinh sạch enzyme AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66
Quy trình lên men sinh tổng hợp và tinh sạch esterase bao gồm các bước chính sau:
Ni cấy nấm và sinh tổng hợp enzyme trên môi trường lên men dịch thể (5 L/mẻ):
Nấm Alt.tenuissima SP66 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản, sau đó, bổ sung nguồn cơ chất rơm, thời
gian nuôi cấy 12 ngày, nhiệt độ 25oC, pH 7 trong các bình Erlenmeyer 1000 ml hoặc trên thiết bị lên men AmAr
(Mumbai, Ấn Độ) ở điều kiện có sục khí và lắc liên tục 200 v/ph.
Chiết tách dịch enzyme thô bằng siêu lọc:
Sau khi nuôi cấy ở các điều kiện tối ưu, enzyme sẽ được lọc sơ bộ qua vải thô và giấy lọc (GF6 và RC 55,
WhatmanTM, Trung Quốc). Dịch chiết có hoạt tính enzyme esterase được loại khuẩn ty nấm và cơ chất bằng ly
tâm 5000-10000 v/ph và siêu lọc 10 và 30 kDa cut-off (UFP 30MW, Amersham BioScience, hoặc Vivaflow 200,
Polyethersulfon 10MW, Sartorius hoặc 5MW, Millipore) ở 110C.
Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký:
Dịch enzyme thô biểu hiện hoạt tính esterase được tinh sạch qua các bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc
gel sử dụng cột DEAE Sepharose, Q sepharose và SuperdexTM 75 (GE Healthcare, Freiburg, CHLB Đức) với
đệm rửa giải Na-acetate (10mM; pH 4,5), NaCl từ 0-1 M và cột Superdex 75, đệm Na-acetate (50mM; pH 6,5).
Protein rửa giải được xác định trực tiếp sử dụng đầu dò ở λ=280nm hoặc bằng phương pháp so màu theo quy
trình của Bradforf (1976) ở λ=590/450nm. Các phân đoạn có hoạt tính esterase được gộp chung, cơ loại bớt dịch
và hịa lại với đệm Na-acetate 10mM, pH 6,0. Mẫu được lưu giữ ở -200C.
Bước tinh sạch cuối cùng được thực hiện với cột trao đổi anion ở pH 5,0 với đệm Na-acetate 50 mM. Từ 5L
dịch lên men sau q trình tinh sạch có thể thu được 13,5 mg protein enzyme FAE/mẻ tương đương hoạt tính
enzyme tổng là 151,2 U.
Protein sau mỗi bước siêu lọc và sắc ký được đo hoạt độ, đánh giá độ tinh sạch và xác định trọng lượng
phân tử bằng điện di SDS-PAGE (Novex Xcell SureLock mini cell; Laemmli 1970) (Hình 3.12).

14

Dịch môi trường lên men
Alt.tenuissima SP66
(5 L/mẻ; protein 1673 mg)
- Lọc chân không
(Whatman GF6)
- Ly tâm 5000 v/ph
trong 10 phút

Cặn ly tâm
(Loại bỏ)

Siêu lọc 10 kDa cut-off
(cô đến 500 ml;
259,5 mg protein)

Sắc ký DEAE Sepharose

Sắc ký lọc gel SuperdexTM 75

Xác định hoạt độ enzyme; định lượng protein
Điện di SDS-PAGE và IEF

Dịch sau ly tâm

Sắc ký Q Sepharose

Feruloyl esterase
tinh sạch
(13,5 mg protein; 151,2
U enzyme)

Hình 3.12. Quy trình chiết tách và tinh sạch AltFAE từ nấm Alt. tenuissima SP66

15


3.6. Sàng lọc nguồn cơ chất giàu lignocellulose cho chuyển hóa sinh học
Tiến hành đánh giá sản phẩm đường khử sau chuyển hóa trên 5 cơ chất là rơm rạ (RR), bã mía (MIA), bã
cà phê (CAF), mùn gỗ (MG), rong túi (RT) bằng hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl = 50 U/gds, AltFAE = 5
0
U/gds và XpoAE = 5 U/gds) theo các thí nghiệm khác nhau, phản ứng được ủ trong 24 giờ , ở 40 C, sản phẩm
chuyển hóa được xác định bằng sắc ký bản mỏng (TLC).

Hình 3.13. Vết chất đường đơn xuất hiện trên bản mỏng
Các chất chuẩn là các đường khử có khả năng lên men: glucose (Rf (Glu) = 0,34), galactose (Rf(Gla)=
0,28), xylose (Rf(Xyl) = 0,48) và mannose (Rf(Man) = 0,325)
Hàm lượng đường khử thu được sau chuyển hóa sinh học: Sử dụng phương pháp sắc ký bản mỏng (TLC)
để xác định vết chất đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa bằng hỗn hợp enzyme (XpoAE, AltFAE và
Cell/xyl) trên 5 cơ chất: rơm rạ, bã mía, bã cà phê, mùn gỗ, rong, bã mía được lựa chọn là vật liệu nguyên cứu do
trên bản mỏng xuất hiện vết đường đơn đậm nét và tổng đường khử thu được cao nhất đạt 154,7mg/g.

Hình 3.14. Tổng đường khử tạo thành sau chuyển hóa bằng các đơn enzyme và “enzyme cocktail”
3.7. Tối ưu hóa enzyme cocktail bằng mơ hình quy hoạch thực nghiệm
Áp dụng mơ hình quy hoạch thực nghiệm đã xác định được các điều kiện tối ưu cho hỗn hợp enzyme
cocktail để chuyển hóa bã mía (10%, w/v) thành các đường lên men, phản ứng diễn ra ở 400C, pH 5 và thời gian
ủ 48 giờ. Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch phi tuyến với phương trình quy hồi mơ tả hiệu quả chuyển hóa

16

biểu thị qua tổng hàm lượng đường khử sinh ra phụ thuộc vào thành phần tham gia của mỗi enzyme đơn với hoạt
độ enzyme (x) tương ứng: Cell/Xyl (x1), AltFAE (x2), XpoAE (x3), phương trình có dạng:


y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 x 12 , tương ứng hoạt độ (U) của “enzyme

cocktail” trên 1 gram bã mía sử dụng là Cell/Xyl = 100 U/gds, AltFAE = 7,56 U/gds, XpoAE = 10,8 U/gds với
giá trị ymax = 251,86 mg/g.
3.8. Kết hợp xử lý hóa học nâng cao hiệu quả chuyển hóa
3.8.1. Kết hợp thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail”
Để nâng cao hiệu quả cho q trình chuyển hóa bã mía trước khi thủy phân bằng “enzyme cocktail” ở điều
kiện tối ưu, bã mía được xử lý bằng NaOH với các nồng độ khác nhau để đánh giá hiệu quả chuyển hóa.
Bảng 3.4. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng kiềm và “enzyme cocktail”
Tổng hàm lượng đường khử (mg/g)
Stt

(*)

NaOH (M)
Xử lý bằng kiềm

Xử lý bằng kiềm và “enzyme cocktail” (*)

1

0

0

198,2

2

0,1

34,8

231,5

3

0,15

42,8

265,8

4

0,2

49,6

271,5

5

0,25

64,8

277,5

6

0,3

78,6

287,4

7

0,35

86,2

265,9

8

0,4

91,4

236,3

9

0,5

74,8

187,3

Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch NAOH, trong 2,5 giờ, ở 850C. Chuyển hóa sinh

học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (100U Cell/Xyl/gds, 7,56U AltFAE/gds và 10,8U XpoAE/gds), trong 48
giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại.
3.8.2. Kết hợp thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”
Bảng 3.5. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng axít và “enzyme cocktail”
Stt

H2SO4 (C%)

1

Tổng hàm lượng đường khử (mg/g)
Xử lý bằng axít

Xử lý bằng axít và “enzyme cocktail” (*)

0

0

198,2

2

0,05

42,51

253,1

3

0,1

74,23

319,5

4

0,15

81,58

304,8

5

0,2

97,32

294,9

6

0,3

90,15

269,2

7

0,4

74,81

227,2

8

0,5

70,97

193,7

9

0,6

68,07

156,8

17


(*)

Bã mía (10%; w/v) được nghiền nhỏ ngâm trong dung dịch H2SO4 trong 2,5 giờ, ở 850C. Chuyển hóa sinh

học sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U, AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), trong 48
giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung bình của hai lần lặp lại.
3.8.3. Kết hợp thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail”
Bảng 3.6. Tổng đường khử sau thủy phân bã mía bằng thiết bị gia nhiệt và “enzyme cocktail”
Tổng hàm lượng đường khử (mg/g)

(*)

Thiết bị gia nhiệt

Thiết bị gia nhiệt + “enzyme cocktail” (*)

32,18

221,73

Bã mía (10%; w/v) nghiền nhỏ ngâm trong nước cất được thủy phân trong thiết bị gia nhiệt, ở 1210C trong

120 phút dưới áp suất 1 atm. Chuyển hóa sinh học sử dụng “enzyme cocktail” (Cell/Xyl/gds: 100U,
AltFAE/gds: 7,56U, XpoAE/gds: 10,8U), trong 48 giờ, ở 400C, pH 5.0. Các dữ liệu được trình bày là trung
bình của hai lần lặp lại.

3.8.4. Hàm lượng đường đơn trong dung dịch sau chuyển hóa
Bảng 3.7. Hàm lượng carbohydrate sau chuyển hóa sinh học
Sản phẩm phản ứng (Carbohydrat; mg/g)

Enzyme
Hỗn hợp enzyme
cocktail (Cell/Xyl,
AltFAE & XpoAE)

Galactose

Glucose

Mannose

Xylose

Tổng Carbohydrat

Không xác
định

195,4

Không xác
định

60,5

255,9

Trong các phương pháp thủy phân bã mía bằng kiềm, axít, gia nhiệt kết hợp với hỗn hợp “enzyme cocktail”
(Cell/Xyl, AltFAE & XpoAE). Xác định được phương pháp thủy phân bã mía bằng axít H2SO4 lỗng (0,1%,
850C, 2,5 giờ) kết hợp thủy phân bằng “enzyme cocktail” cho hiệu quả tốt nhất với tổng đường khử đạt 319,5
mg/g cơ chất. Trong đó, hàm lượng glucose và xylose, tương ứng là 195,4 mg/g và 60,4 mg/g và các đường lên
men khác chiếm khoảng 18 %.
3.9. Nghiên cứu sản xuất bioethanol
3.9.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường
Nguồn dinh dưỡng là một trong số những nhân tố tác động trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển của
vi sinh vật nói chung và nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 nói riêng. Do vậy, cần tiến hành nghiên cứu
khảo sát để tìm ra mơi trường lên men bioethanol thích hợp. Thí nghiệm được tiến hành trên hai mơi trường BM
(dịch đường sau chuyển hóa) và mơi trường BM+ (dịch đường sau chuyển hóa bổ sung các thành phần từ môi
trường hansen). Bổ sung 3% giống nấm men trên tổng thể tích dịch lên men, lên men ở 300C, pH = 4,8.
Bảng 3.8. Hiệu suất quá trình lên men trên môi trường BM và BM+
12 giờ

Thời gian
Kết quả
Tổng đường khử còn lại (mg/g)

BM

(1)

24 giờ
BM

+ (2)

BM

(1)

BM+ (2)

173,32

146,38

162,71

132,34

Hàm lượng bioethanol (g/l)

2,65

3,50

3,17

4,82

Hiệu suất (g/g)

0,026

0,035

0,031

0,048

(1)

Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa

18


(2)

Môi trường lên men sử dụng dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm một số thành phần của mơi trường

Hansen
3.9.2. Thời gian lên men
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men được tiến hành ở 300C; pH 4,8, bổ sung 3% giống
nấm men theo thể tích và sử dụng môi trường bổ sung các thành phần dinh dưỡng của môi trường Hansen.
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất lên men
Stt

Thời gian

OD620

Tổng đường khử cịn lại

Hàm lượng

Hiệu suất (g/g)

bioethanol (g/l)
2,016

0,020

(giờ)
1

6

0,243

(mg/g)
187,9

2

12

0,440

146,5

2,709

0,027

3

24

0,960

119,0

4,704

0,047

4

30

1,045

108,3

5,166

0,052

5

36

1,059

102,5

5,691

0,057

6

48

1,235

95,4

6,758

0,067

7

54

1,296

89,4

6,952

0,069

8

60

1,357

85,2

7,367

0,073

9

72

1,494

79,5

7,644

0,076

10

78

1,702

73,4

7,959

0,080

11

81

1,279

65,2

6,951

0,070

3.9.3. Ảnh hưởng pH
Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men được tiến hành ở 300C; thời gian lên men
78 giờ và bổ sung 3% giống nấm men.
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất lên men
Stt

pH

OD620

Tổng đường khử còn lại

Hàm lượng

Hiệu suất

bioethanol (g/l)
4,17

(g/g)
0,042

1

4

1,395

(mg/g)
119,21

2

4,3

1,467

104,9

4,76

0,048

3

4,6

1,559

94,53

5,93

0,059

4

4,8

1,702

73,4

7,959

0,080

5

5,2

1,607

74,07

10,90

0,109

6

5,5

1,393

71,63

9,67

0,096

7

6

1,070

87,08

6,79

0,067

3.9.4. Ảnh hưởng nhiệt độ

Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men được tiến hành ở pH 5.2; thời gian
lên men 78 giờ và tỷ lệ nấm men bổ sung là 3%.

19


Bảng 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất lên men
Tổng đường khử còn lại

Hàm lượng

(mg/g)

bioethanol (g/l)

1,343

104,36

8,844

0,088

25

1,446

97,5

9,174

0,092

3

28

1,529

64,31

11,704

0,117

4

30

1,607

74,07

10,903

0,109

5

32

1,582

73,34

10,428

0,104

6

34

1,436

112,53

3,36

0,07

Stt

Nhiệt độ

OD620

1

23

2

Hiệu suất (g/g)

3.9.5. Tỷ lệ nấm men
Các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men được tiến hành ở 280C; pH 5.2; thời gian lên men 78
giờ và tỷ lệ nấm men (%) bổ sung. Kết quả thí nghiệm thể hiện bảng 3.22.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ nấm men đến hiệu suất lên men
Stt

Tỷ lệ

OD620

nấm men

Tổng đường khử còn lại

Hàm lượng

(mg/g)

bioethanol (g/l)

Hiệu suất (g/g )

(%)
1

2

1,206

94,40

9,648

0,096

2

3

1,522

64,31

11,704

0,117

3

4

1,634

72,39

12,48

0,124

4

5

1,649

63,14

14,088

0,140

5

6

1,657

75,59

12,168

0,121

6

7

1,662

78,20

11,328

0,113

7

8

1,711

81,17

10,968

0,109

8

9

1,898

89,12

9,264

0,092

9

10

1,965

99,53

7,104

0,071

Như vậy, hàm lượng bioethanol tạo thành cao nhất là 14,088 g/l. Khi đó, hiệu suất chuyển hóa đạt 0,140
gram/cơ chất bã mía, tương ứng với lượng bioethanol thu được 178,0 ml/kg bã mía. Hiệu suất lên men
bioethanol từ dịch đường sau chuyển hóa đạt 79,6% so với lý thuyết. Trong nghiên cứu này, hiệu suất chuyển
hóa bã mía thành bioethanol thu được khá cao đạt 178 ml/kg. Do vậy, lựa chọn phụ phẩm nơng nghiệp (bã mía)
là nguồn sinh khối giàu lignocellulose để làm đối tượng sản xuất bioethanol là một hướng đi mới, có ý nghĩa
thực tiễn cao. Việc sử dụng phế thải nơng nghiệp có ưu điểm là hàm lượng cellulose trong phụ phẩm nông
nghiệp cao khi thủy phân sẽ tạo ra lượng đường glucose lớn. Bã mía là một trong số nhiều nguồn sinh khối phổ
biến và có nhiều tiềm năng ở Việt Nam với thành phần chính là cellulose, lignocellulose chiếm 64%, là nguồn
nguyên liệu phong phú cho việc sản xuất bioethanol.

20


3.10. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía

Từ những kết quả đạt được, có thể tóm tắt tồn bộ q trình chuyển hóa bã mía thu hồi bioethanol theo sơ đồ
sau:
Bã mía (DS)
(10% w/v)

Nghiền nhỏ kích thước khoảng
0,5 – 1,0 mm
H2SO4 0,1%,
ở 850C, trong 2.5 giờ

Xử lý hóa học

Điều chỉnh pH 5
Enzyme cocktail:
Cell/Xyl:100-160 U/gds,
AltFAE:7.56 U/gds, XpoAE:10.8
U/gds, 400C, pH 5, 48 giờ

Thủy phân bằng
“enzyme cocktail”

Dịch đường thủy phân
Nguồn dinh dưỡng (g/l):
Peptone: 10; KH2PO4: 3;
MgSO4.7H2O: 3

Bổ sung dinh dưỡng

Điều chỉnh pH
môi trường

Khử trùng 1210C,
1atm, 20 phút
Điều kiện lên men:
ở 280C; pH 5.2; 78 giờ
5% nấm men

Lên men Bioethanol

Chưng cất

Thu nhận
bioethanol

Hình 3.15. Đề xuất quy trình sản xuất bioethanol từ bã mía

21


Các bước thực thiện:
Xử lý cơ học:
Bã mía sau thu hoạch được xử lý cơ học bằng cách xấy khô, xử lý bằng cách nghiền nhỏ bằng hệ
thống nghiền bi (thiết bị Fritsch, Oberstein, CHLB Đức) và lọc qua rây để đạt được kích thước khoảng 0,5 –
1,0 mm. Việc nghiền nhỏ với mục đích phá vỡ một phần cấu trúc của tế bào, tăng diện tích tiếp xúc giữa axít
và cơ chất. Tạo điều kiện cho q trình thủy phân diễn ra với hiệu suất cao nhất.
Xử lý bằng axít H2SO4:
Bã mía (10%; w/v) được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch H2SO4 loãng ở nồng độ 0,1% và ủ ở
0

85 C trong 2,5 giờ. Mục đích quá trình xử lý này giúp tách loại một phần lignin, phá vỡ cấu trúc phức tạp và
tăng khả năng xúc tác trên cấu trúc phân tử cellulose. Bên cạnh đó, q trình xử lý hóa học cịn thủy phân

hemicellulose có trong thành phần sinh khối. Hemicellulose có cấu trúc phân nhánh với những chuỗi mạch ngắn
hơn so với cellulose. Do đó, việc thủy phân hemicellulose dễ dàng hơn thủy phân cellulose. Hemicellulose bị
thủy phân tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân tiếp xúc thủy phân cellulose bằng “enzyme cocktail” ở quá
trình kế tiếp
Điều chỉnh pH:
Điều chỉnh dung dịch sau chuyển hóa về pH 5 nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho hỗn hợp “enzyme
cocktail” chuyển hóa sinh học.
Bổ sung hỗn hợp “enzyme cocktail”:
Dịch chuyển hóa sau khi điều chỉnh về pH 5 tiếp tục được thủy phân bằng hỗn hợp “enzyme cocktail”
với thành phần bao gồm: Cell/Xyl: 100-160 U/gds, AltFAE: 7,56 U/gds và XpoAE: 10,8 U/gds, hỗn hợp được ủ
ở 400C, pH 5, thời gian ủ 48 giờ trong điều kiện có khuấy đảo liên tục 200 vịng/phút.
Bất hoạt enzyme cocktail:
Dịch sau thủy phân được bất hoạt enzyme bằng cách đun cách thủy ở 90 oC trong 10 phút để dừng phản
ứng chuyển hóa.
Ly tâm, loại bã và xác định tổng hàm lượng đường khử:
Lọc bỏ cặn bã mía đã thủy phân bằng cách lọc và ly tâm. Dịch sau q trình chuyển hóa được đem đi
xác định tổng hàm lượng đường khử bằng phương pháp DNS.
Bổ sung thành phần dinh dưỡng:
Sau q trình chuyển hóa dịch đường thu được bổ sung thêm một số thành phần dinh dưỡng trong môi
trường Hansen.
Điều chỉnh pH môi trường lên men:
Điều chỉnh pH 5.2 trong môi trường lên men bioethanol, công đoạn này nhằm mục đích tạo điều kiện
thuận lợi cho nấm men Saccharomyces cerevisiae SH1 phát triển.
Lên men bioethanol:
Để lên men bioethanol hiệu quả, quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 280C, pH 5.2, thời gian lên
men 78 giờ, tỷ lệ nấm men bổ sung 5%, môi trường lên men là dịch đường sau chuyển hóa được bổ sung thêm
các thành phần từ môi trường hansen.
Chưng cất thu nhận bioethanol:

22

Kết thúc quá trình lên men tiến hành đo nồng độ bioethanol tạo thành trong dung dịch bằng hệ thống
chưng cất phân đoạn nhằm nâng cao độ tinh khiết của sản phẩm bioethanol tạo thành. Bioethanol được bảo quản
trong bình kín, thống gió, tránh ánh sáng và các nguồn nhiệt.
Xác định tổng hàm lượng đường khử còn lại trong dung dịch sau lên men:
Sau khi kết thúc quá trình lên men trong dung dịch sẽ còn một lượng nhất định đường khử (nhóm đường
pentose) mà nấm men chưa hoặc khơng tiêu thụ được. Để đánh giá hiệu suất của quá trình lên men ngồi việc
xác định hàm lượng bioethanol tạo thành thì việc xác định hàm lượng đường cịn lại (chưa lên men) là cần thiết.

23


KẾT LUẬN

Từ những kết quả nghiên cứu trên rút ra những kết luận như sau:
1. Phân lập được 44 chủng nấm thuộc 13 họ. Trong đó, 16 chủng thuộc ngành nấm Túi (Ascomycota) và 28
chủng thuộc ngành nấm Đảm (Basidiomycota). Sàng lọc được chủng nấm Xylaria polymorpha A35 có khả năng
sinh tổng hợp enzyme acetyl esterase và chủng Alternaria tenuissima SP66 có khả năng sinh tổng hợp enzyme
enzyme feruloyl esterase cao. Điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hai enzyme từ hai chủng nấm trên
tương ứng đạt 135,4 U/l và 1154,4 U/l.
2. Enzyme feruloyl esterase tinh sạch từ nấm Alt. tenuissima SP66 (AltFAE) có trọng lượng phân tử Mw = 30,3
kDa, hoạt tính đặc hiệu đạt 11,2 U/mg, enzyme hoạt động tối ưu ở 420C, bền ở pH 5. Enzyme acetyl esterase tinh
sạch từ nấm X. polymorpha A35 (XpoAE) có trọng lượng phân tử Mw = 44 kDa, hoạt tính đặc hiệu đạt 13,1
U/mg, enzyme hoạt động tối ưu ở 420C, bền ở pH 5.0.
3. Bã mía được lựa chọn là nguyên liệu nghiên cứu phù hợp khi sử dụng hỗn hợp “enzyme cocktail” thủy phân
năm cơ chất gồm: rơm rạ, bã mía, bã cà phê, mùn gỗ và rong biển. Áp dụng mơ hình quy hoạch thực nghiệm đã
xác định được điều kiện tối ưu cho hỗn hợp “enzyme cocktail” để chuyển hóa bã mía (10%, w/v) thành các
đường lên men được thực hiện ở nhiệt độ 400C, pH 5, thời gian ủ 48 giờ. Sử dụng thuật toán flexible quy hoạch
phi tuyến xác định được phương trình quy hồi mơ tả hiệu quả q trình thủy phân biểu thị thông qua tổng hàm

lượng đường khử tạo thành phụ thuộc vào thành phần và hoạt độ (x) của các “enzyme cocktail” [Cell/Xyl (x1),
AltFAE (x2) và XpoAE (x3)] tham gia chuyển hóa, phương trình có dạng:


y = 206,946 + 29,954x1 + 5,501x2 + 7,323x3 + 2,288x2x3 – 7,011 x12 , tương ứng với hoạt độ (U) của “enzyme

cocktail” trên 1 gram cơ chất bã mía sử dụng là Cell/Xyl: 100 U/gds, AltFAE: 7,56 U/gds và XpoAE: 10,8 U/gds
với giá trị Ymax = 251,86 mg/g.
4. Quá trình chuyển hóa bã mía được thực hiện ở điều kiện tối ưu bằng cách kết hợp giữa xử lý hóa học bằng
acid H2SO4 loãng ở nồng độ 0,1%, ủ trong 2,5 giờ, ở 850C và xúc tác sinh học bằng hỗn hợp “enzyme cocktail”.
Khi đó, tổng hàm lượng đường khử sinh ra đạt 319,5 mg/g cơ chất, hiệu suất chuyển hóa từ bã mía thành đường
đạt 49,8%. Trong đó, nồng độ glucose và xylose tương ứng là 195,4 mg/g và 60,4 mg/g, các đường lên men khác
chiếm khoảng 18%.
5. Quá trình lên men bioethanol thích hợp ở nhiệt độ 280C, pH 5.2, thời gian lên men 78 giờ, tỷ lệ nấm men 5%
trong môi trường với thành phần là dịch đường sau chuyển hóa bổ sung thêm các chất dinh dưỡng trong môi
trường Hansen. Trong điều kiện này, hàm lượng bioethanol tạo thành là 14,088g/l, hiệu suất lên men bioethanol
từ bã mía đạt 0,141 gram/gram, tương ứng 178ml bioethanol/kg bã mía. Hiệu suất lên men từ dịch đường chuyển
hóa đạt 79,8% so với lý thuyết.

24


DANH SÁCH CÔNG BỐ KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

A. Tạp chí quốc tế (SCIE):
1. Do Huu Nghi , René Ullrich, Franco Moritz , Le Mai Huong, Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Martin
Hofrichter, Christiane Liers. The Ascomycete Xylaria polymorpha Produces an Acetyl Esterase That
Solubilises Beech Wood Material to Release Water-soluble Lignin Fragments. Journal Korean Soci Appl
Biol Chem, 2015, 58 (3), 415-521.
2. D.H. Chi, V.D. Giap, L.P.H. Anh, and D.H. Nghi. An feruloyl esterase from Alternaria tenuissima that

hydrolyses lignocellulosic material to release hydroxycinnamic acids. Applied Biochemistry and
Microbiology, 2017, 53, (6), 654:660.
B. Tạp chí chuyên ngành trong nước:
1. Đỗ Hữu Nghị, Vũ Đình Giáp và Đỗ Hữu Chí. .Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme axetyl (xylan)
esterase của nấm Aureobasidium pullulans Var melanigenum SH1 trên cơ chất là các phụ phẩm cơng-nơng
nghiệp giàu-lignicellulose. Tạp chí nơng nghiệp và phát triển nông thôn – kỳ 2 tháng 3/2016, 56-62.
2. Vũ Đình Giáp, Đỗ Hữu Chí, Lê Mai Hương, Đỗ Hữu Nghị. Nghiên cứu sinh tổng hợp feruloyl esteraza bởi
nấm trên môi trường nuôi cấy lỏng với cơ chất giàu lignoxelluloza. TC Nông nghiệp & PTNT, 2016, 12,
103:110.
3. Đỗ Hữu Nghị, Lê Mai Hương, Lê Thị Bích Thảo, Vũ Đình Giáp, Nguyễn Trung Hiếu, Đỗ Hữu Chí.
Feruloyl esterase từ chủng nấm Alternaria tenuissima và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của sản phẩm
phản ứng enzyme. Tạp chí Y học VN, 2016, 445, 143:148.
4. Vu Dinh Giap, Do Huu Chi, Pham Hong Hai, Tang Thi Chinh, Do Huu Nghi. Using experimental planning
to optimize the hydrolysis of sugar cane bagasse into fermentable sugars for bioethanol production by
fungal enzyme mixture. Vietnam Journal of Science and Technology, 2017, 55 (4), 419:428.

25