Tài liệu Phân tích cấu trúc di truyền DNA: Ứng dụng trong y pháp nhận dạng pptx

Phân tích cấu trúc di truyền DNA: ứng dụng trong Y pháp nhận
dạng.Nguyễn Đình Nguyên
Từ những năm 30s dấu vân tay được đưa vào ứng dụng trong Y Pháp
(Forensics) và trở thành một công cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm của
cảnh sát hình sự và thám tử để nhận dạng. Tuy nhiên dấu vân tay đã bộc lộ
nhiều khiếm khuyết một khi áp dụng trong thực tế. Chẳng hạn, dấu vân tay
thông thường chỉ có thể lấy mẫu được từ các đầu ngón tay mà thôi. Đã thế
ngày nay nó không còn đặc hiệu cho từng cá thể nữa từ khi phẫu thuật chỉnh
hình phát triển mạnh, người ta có thể chủ định thay đổi dấu vân tay qua phẫu
thuật. Chỉ trong vòng trên dưới 50 năm từ khi cấu trúc chuỗi di truyền DNA
được Watson và Crick công bố [1], ngành sinh học phân tử đã phát triển
mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong các ngành. Một trong những ứng
dụng quan trọng của sinh học phân tử là sử dụng đặc tính của cấu trúc chuỗi
di truyền DNA của từng cá thể vào trong Y pháp để nhận dạng đối tượng coi
như là một cuộc cách mạng trong Y học hình sự của nhân loại. Tương tự
như dấu vân tay, mỗi một con người đều có một đặc trưng riêng về cấu trúc
di truyền của mình, được xác định bằng chuỗi di truyền DNA. Cấu trúc của
DNA [1], và”điểm chỉ” DNA:Đặc tính của tất cả các sinh vật sống, kể cả con
người, đều nhất thiết được xác định bằng thông tin chứa đựng DNA (viết tắt
của từ DeoxyriboNucleic Acid) thừa kế từ cha và mẹ. Có thể hình tượng cấu
trúc phân tử của một DNA như là một cái phéc-mơ-tuya (zip), mỗi răng kéo
là một trong bốn khối chất liệu căn bản, viết tắt bằng các ký tự A (adenine),
C (cytosine), G (guanine), và T (thymine), mà mỗi một ký tự đó gọi là một
nucleotide, chúng cũng đứng song đôi như các răng kéo của phéc-mơ-tuya
theo cặp cố định A-T hoặc G-C. Thông tin chứa đựng trong DNA được xác
định cơ bản bằng chuỗi tiếp nối các ký tự này dọc theo cái “phéc-mơ-tuya”
di truyền đó. Lấy một ví dụ về một chuỗi di truyền DNA như sau:A A T G G
C A T T T A G C G| | | | | | | | | | | | | |T T A C C G T A A A T C G CTrong
một cơ thể con người có đến hàng tỷ đôi ký tự A-T G-C ghép lại để tạo nên
cấu trúc di truyền- chuỗi nhiễm sắc thể (chromosome), cơ thể người có 23
đôi nhiễm sắc thể (22 đôi thường và một đôi xác định giới tính). Các nhiễm

sắc thể này có mặt ở trong nhân mọi loại tế bào. Vì tính cấu tạo rất đa dạng
phức tạp của chuỗi DNA, cho nên chẳng thể có người nào giống người nào
về cấu trúc di truyền DNA cả, trừ đó là người sinh đôi cùng trứng. Lấy một
thí dụ nhỏ, chỉ có 4 chữ A, T, G, C nếu chỉ cho lặp lại một lần cho mỗi chữ
ta cũng đã có ATCG ACTG AGTC AGCT vân…vân đến 24 kiểu khác
nhau! Ấy thế mà con số các ký tự trong chuỗi DNA của con người lên đến
hàng tỷ thì hầu như xác suất để có hai cá thể có cùng một bộ cấu trúc DNA
như nhau là không có. ‘Hồ sơ’ DNA (tạm dịch từ DNA profiling) là một
phần nhỏ trích từ cấu trúc toàn bộ của chuỗi DNA (của một cá thể) mà đủ để
phản ánh đặc thù riêng nhất của mỗi cá thể không lẫn lộn với người khác,
nói nôm na như một biển số đăng ký xe. Và do tính chất đặc thù rất riêng
nhất đó mà hồ sơ DNA đã nhanh chóng trở thành một phương pháp tối ưu
nhất để nhận dạng và phân biệt giữa người này và người khác. Và cũng từ
đó mà xuất hiện từ “Điểm chỉ” DNA (tạm dịch từ DNA fingerprint)- cũng
chính là ‘hồ sơ DNA’, do một nhà Di truyền học người Anh, Alec Jeffreys
lần đầu tiên sử dụng chỉ trong khoảng 10 năm lại đây, để nói lên một đặc
trưng duy nhất cho mỗi cá thể giống như là dấu vân tay (hay điểm chỉ).
Ttrong một cơ thể ‘điểm chỉ’ DNA là hoàn toàn giống nhau ở tất cả các tế
bào, tổ chức mô, tạng phủ; và điểm chỉ DNA không có thể thay đổi được
bằng bất cứ hình thức nào với tri thức của nhân loại hiện nay. Và cho đến
nay, các nhà di truyền học vẫn thừa nhận rằng “điểm chỉ” DNA là đặc trưng
duy nhất cho mỗi cá thể, ngay cả những người sinh đôi cùng trứng cũng có
điểm chỉ DNA không giống nhau [2], không như loại DNA (DNA typing) là
không đặc trưng cho một cá thể trong trường hợp này. Về nguyên lý nhận
dạng cá thể bằng DNA rất đơn giản. Đó là nguyên lý so sánh và ghép cặp, dễ
hiểu như biển số đăng ký xe. Mỗi một chiếc xe có một biển số riêng, một khi
có một chiếc xe không có chủ, người ta có thể dựa vào hồ sơ đăng ký có thể
xác định chính xác chủ nhân hiện thời của chiếc xe đó là ai; tương tự mỗi
chủ nhân có một thẻ đăng ký xe, khi mất xe họ có thể dùng số đăng ký đó đi
truy tìm chiếc xe ở đâu. Kỹ thuật nhận dạng bằng DNA cũng y như vậy

nhưng điều đặc biệt là DNA không thể thay đổi được, và nó ‘ẩn’ bên trong
nhân của tế bào cơ thể, phải dùng các phương pháp kỹ thuật nhất định để có
thể đọc được nó mà thôi.Ứng dụng thực tế của công nghệ điểm chỉ DNA:
Điểm chỉ DNA được ứng dụng trong cuộc sống hàng ngày với mục đích:
Trong Y pháp, hình sự: (a) để xác định quan hệ phụ hoặc mẫu hệ (b) để nhận
dạng tội phạm cũng như loại trừ nghi can thông qua dấu vết của cơ thể để lại
hiện trường, (c) nhận dạng cá nhân, nạn nhân vô thừa nhận.Trong Y học
điều trị: (a) để chẩn đoán các bệnh về di truyền, (b) phát triển các phương
pháp để chữa các rối loạn về di truyền.Trong các ngành khoa học khác: Như
trong khảo cổ học, một tin đăng trên tờ New York Times tháng 5 năm 1998,
các nhà khoa học đã nhận dạng được điểm chỉ của một con mối có độ tuổi
40 triệu năm tồn lưu trong một miếng hổ phách (amber), và đặt ra một nghi
vấn rằng có phải thuỷ tổ của loài gián đương đại ngày nay chính là loài mối
hay không, vì chúng có điểm chỉ DNA tương đồng nhau; hoặc trong nông-
lâm-ngư nghiệp dùng để vẽ bản đồ gien (mapping), tạp giao, lai giống,
chuyển gien, để nhận dạng dấu vết các loài thú quý hiếm. Một trong ứng
dụng mới nhất của công nghệ phân tích điểm chỉ DNA trong nông nghiệp là
để bảo vệ tác quyền thương mại các sản phẩm, hay giống lai tạo mới. Tuỳ
theo các mục đích khác nhau mà người ta tiến hành cách thức thu thập mẫu
để có được chuỗi DNA cơ bản đầu tiên để phân tích khác nhau. Trong ứng
dụng nhận dạng con người các mẫu thu thập cũng tuỳ theo yêu cầu mà có
thể lấy mẫu máu, tóc, lông, da v..v đặc biệt trong nhận dạng tội phạm hình
sự, mẫu thu thập rất đa dạng tuỳ theo tính chất sự kiện các dấu vết được để
lại hiện trường. Và cũng tuỳ mục đích mà cách nhận dạng DNA cũng có
khác nhau nhưng đều dựa trên một nguyên lý căn bản nêu trên là so sánh và
ghép cặp. Thí dụ trong nhận dạng mối quan hệ huyết thống thì mẫu thu thập
phải lấy từ hai đối tượng nghi ngờ, rồi so sánh hai kết quả thu được, trường
hợp này nôm na là có người, có xe chỉ đối chiếu xem có khớp chủ nhân với
xe không. Hoặc nếu trong truy tìm dấu vết thì lấy mẫu vết để lại hiện trường,
phân tích rồi đem mẫu đó so sánh với nghi phạm hoặc so với mẫu có sẵn

trong ngân hàng mẫu điểm chỉ DNA, ở đây là có biển số xe nhưng không có
chủ nhân, phải đi truy tìm ai là chủ nhân của nó. Vì tính chất nghiêm trọng
của việc nhận dạng cá thể, có thể gắn liền với tội phạm cho nên kỹ thuật thu
thập mẫu, cũng như cách thức tiến hành phân lập, phân tích, đọc kết quả đòi
hỏi phải có tiêu chuẩn rõ ràng, tương đối chính xác, chất lượng để giảm
thiểu những sai số và rủi ro của kỹ thuật. Thí dụ như nguyên tắc bảo toàn là
một trong những ưu tiên hàng đầu của việc thu thập mẫu. Cần phải có những
túi đựng mẫu đạt tiêu chuẩn để tránh lây nhiễm chéo, tự lây nhiễm. Người
lấy mẫu phải là chuyên viên có kiến thức, kinh nghiệm về Y pháp và công
nghệ DNA. Tránh để đụng chạm, dấy bẩn các vật ngoại lai vào. Ngay cả
quang cảnh hiện trường quanh chỗ lấy mẫu cũng đóng vai trò quan trọng để
góp phần đánh giá khi phân tích mẫu DNA sau này, nên cần phải chụp ảnh,
quay phim quanh hiện trường dưới nhiều góc độ càng nhiều càng tốt. Các
nguyên tắc này ít đề cập đến hơn trong những trường hợp nhận dạng không
liên quan đến tội phạm hình sự. Các kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA hiện
hành [3]: 1- Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của
Restriction Fragment Length Polymorphism)[4] Một điểm quan trọng cần tái
xác định lại ở đây là điểm chỉ DNA (hay hồ sơ DNA) của một cá thể dùng
để nhận dạng cá thể trong DNA y pháp không đại diện cho đặc tính di truyền
tạo nên cá thể đó. Nó chỉ đại diện cho một số mảnh của chuỗi DNA đặc
trưng của cơ thể đó mà thôi. Trở lại câu chuyện biển số xe, biển số xe chỉ
cho biết để nhận dạng chủ nhân và chiếc xe sở hữu mà thôi, chứ nó không
nói lên được đặc tính của xe cũng như cấu tạo cuả người đó. Các bước tiến
hành tạo điểm chỉ DNA:
a. Phân lập DNA: Trước hết là phải phục hồi DNA từ trong các tế bào hoặc
tổ chức đã lấy mẫu từ mô của cơ thể- như máu, tóc, da, vết tích để lại trên
hiện trường như quần áo, vật dụng v.v..b. Cắt đoạn, xếp theo kích thước,
phân loại: Sử dụng một số loại enzyme đặc biệt gọi là enzyme làm giới hạn
(restriction) (xem thêm phần phụ chú [4]) để cắt đoạn DNA tại một số vị trí
đặc biệt. Thí dụ, một loại enzyme gọi là EcoR1 (có trong một số loại vi

khuẩn) chỉ có cắt đoạn DNA ở chuỗi có cấu trúc GAATTC. Các đoạn cắt
DNA này sau đó được phân loại theo kích thước bằng một kỹ thuật ‘sàng
lọc’ gọi là điện di, sau đó các DNA này được cho nhúng qua môi trường gel
làm bằng thạch hồng của rau câu (seeweed agarose), nên gọi là kỹ thuật điện
di qua gel thạch hồng (agarose gel electrophoresis). Đây là một kỹ thuật
trong công nghệ sinh học để có thể xác định kích thước các mẩu DNA rất
bé. Sau đó các mảnh DNA này được làm biến chất bằng dung dịch kiểm,
qua đó các cầu nối (hydro) giữa các cặp ký tự song đôi bị bẻ gãy, chúng trở
thành các mảnh DNA đơn. c. Chuyển DNA sang tấm phim nhựa: Để có thể
chuyển các mẩu DNA này qua các tấm phim nhựa, người ta áp tấm phim
vào mặt thạch rau câu có các mẩu DNA và để ngâm qua đêm. Kỹ thuật này
gọi là “kỹ thuật thấm Southern” (do Edwin Southern đề xuất) hay còn gọi là
“chuyển dạng Southern”. d. Tạo thanh DNA(probe): Cho thêm vào các tấm
phim nhựa có các mẩu DNA này các que nhuộm màu hoặc các hoạt tính
phóng xạ để tạo ra điểm chỉ DNA. Mỗi một que này chỉ gắn vào một hay hai
vị trí đặc hiệu trên tấm phim nhựa DNA mà thôi. e. Điểm chỉ DNA: Cuối
cùng là khâu tạo điểm chỉ DNA bằng cách sử dụng một số thanh (probe) (5
hoặc 10), nó trông tương tự như các thanh mã (bar codes) trong các gói hàng
bán trong siêu thị vậy. 2- Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase chain
reaction/Short Tamdem Repeat) Tức là kỹ thuật dùng phản ứng chuỗi
enzyme đa phân để ‘khuếch đại’ các mảnh có độ lặp ngắn theo thứ tự [4]. Ở
đây polymesase tức là một loại enzyme có thể cho phản ứng tạo ra nhiều bản
copy của một đoạn DNA nào đó; phản ứng chuỗi tức là một phản ứng diễn
ra liên tục. Như vậy bằng kỹ thuật PCR trong một thời gian ngắn có thể tạo
ra hàng triệu triệu đến hàng tỷ bản copy của một STR. Kỹ thuật này còn
được gọi là kỹ thuật “khuếch đại DNA” hay “photocopy phân tử” trong một
lối nói rộng rãi hơn. Đây là một kỹ thuật hiện đại nhất hiện nay được dùng
trong Y pháp DNA. Về mặt cơ bản kỹ thuật này cũng tiến hành tương tự như
kỹ thuật RFLPs. Tuy nhiên lợi điểm của kỹ thuật này so với RFLP là: - Mẫu
thu thập không nhất thiết phải đạt tiêu chuẩn cao, những mẫu lấy từ các mô

bị huỷ hoại hoặc cháy bỏng nặng, xác thối rữa do chôn lâu đều có thể dùng
được, hoặc chỉ lấy các ‘vi vết’ như tàn thuốc lá, vết dính nước bọt, những
mẫu bệnh phẩm bị trộn lẫn như máu của nạn nhân lẫn với máu hay dịch của
phạm nhân. - Kỹ thuật PCR/STR này cũng tân tiến hơn so với kỹ thuật dựa
trên cơ sở PCR (tiến hành với VNTRs [4]) là nhờ độ nhạy của nó kém hơn,
nên giảm khả năng nhầm lẫn khi bị nhiễm tạp chất.
Hai đặc điểm khác nhau về kỹ thuật cơ bản giữa PCR/STR vơi RFLP là: (a)
dùng kỹ thuật PCR để khuếch đại số lượng mảnh DNA trong mẫu bệnh
phẩm, (b) kỹ thuật PCR/STR gắn huỳnh quang rất tốt, nên rất dễ phát hiện tự
động, thuận lợi cho phân tích pháp y, bảo quản và dễ phục hồi số liệu. Cho
đến nay điểm chỉ DNA được coi là công nghệ tối tân nhất trong khoa học
nhận dạng cá thể đặc hiệu và chính xác, đặc biệt khi kỹ thuật phân tích
PCR/STR ra đời thay thế kỹ thuật RFLP trong một số trường hợp khó xác
định. Nó không những cho phép khoa học hình sự nhận dạng tội phạm mà
còn xác minh những trường hợp bị hàm oan. Tuy nhiên công nghệ DNA
cũng như moị khoa học khác, ưu điểm và nhược điểm vẫn luôn song đôi với
nhau, đó là thách thức cho các khoa học gia phải chinh phục.Một số vấn đề
đối với điểm chỉ DNA Về mặt lý thuyết thì điểm chỉ DNA bản thân nó là một
phương thức tối ưu và lý tưởng để nhận dạng một cá thể sống, thế nhưng các
sai sót hoặc hạn chế của nó là tất yếu của bất kỳ một phương pháp một kỹ
thuật đo lường, hay đánh giá nào. Những kết quả sai lầm của điểm chỉ DNA
không phải do sự trùng hợp giữa cấu trúc di truyền của nhiều người mà do
sai sót trong khâu kỹ thuật cũng như điều kiện tối ưu để cho ra kết quả chính
xác. Ngoài ra kỹ thuật phân tích điểm chỉ DNA còn liên hệ đến mặt đạo đức.
Thứ nhất phải kể đến tình trạng nhiễm DNA ngoại lai tại môi trường lấy
mẫu, có khi bị nhiễm ngay trên kính hiển vi khi soi tiêu bản. Do đó cần phải
đặt vấn đề tiêu chuẩn chất lượng của phòng thí nghiệm phải đạt yêu cầu. Và
nên nhớ rằng ngay ở Mỹ cũng chỉ có 20 trên tổng số 60 phòng thí nghiệm
làm DNA tiêu bản được Hội đồng Kiểm nhận Phòng thí nghiệm của Hiệp
Hội Tội phạm của Mỹ công nhận đạt tiêu chuẩn mà thôi. Ở Úc, cho đến

1991 vẫn chưa có một cơ quan kiểm nhận chất lượng các phòng thí nghiệm
DNA nào [5], cũng như không có các chương trình kiểm tra chất lượng của
nội bộ phòng thí nghiệm đó. Thứ hai, liên quan đến kỹ thuật chọn mẫu,
nhiều khi mẫu không đại diện, không điển hình, hoặc mẫu bị thoái hoá. Tuy
nhiên với kỹ thuật mới PCR/STR nêu trên có thể khắc phục được nhược
điểm này, nhưng kỹ thuật này lại không cho độ chính xác cao. Cũng trong
vấn đề phân tích kết quả, cần phải đề cập đến độ tin cậy của dữ kiện trong
quần thể (population data). Xác suất để có thể tìm ra được một mẫukhớp với
một mẫu DNA đặc hiệu nào đó được tính bằng tích xác suất của nhiều đoạn
riêng biệt trong một quần thể tham khảo đặc biệt. Thí dụ FBI đã xây dựng
được một hệ dữ liệu thống kê quần thể tham khảo cho các sắc dân da trắng,
đen, da màu và dân Á châu. Vấn đề là ngay trong mỗi nhóm sắc dân đó cũng
có sự biến đổi (chẳng hạn Á châu thì gồm Đông Á, Tây Á, Nam, Đông Nam
Á v.v..) Trong khi đó xác suất để có thể khớp được một mẫu DNA với một
mẫu trong quần thể tham khảo là rất thấp (một phần 6 triệu!), do đó xác suất
này có thể cao hơn nếu dùng phụ nhóm của quần thể tham khảo (có thể tăng