Khảo sát thành phần hóa học của cây cành giao euphorbia tirucalli l thu hái ở tỉnh bình thuận

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC
BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L.
THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN

GVHD: TS. Bùi Xuân Hào
SVTT: Văn Thị Bích Hảo
MSSV: K39.106.029

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2017

-i-


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HĨA HỌC
BỘ MƠN HĨA HỌC HỮU CƠ


KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY
CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L.
THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN

GVHD: TS. Bùi Xuân Hào
SVTH: Văn Thị Bích Hảo
MSSV: K39.106.029

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 5 năm 2017
-i-


LỜI CẢM ƠN

Bằng sự trân trọng và lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành gửi lời cảm ơn

Thầy Bùi Xuân Hào và thầy Dương Thúc Huy đã nhiệt tình giảng dạy, theo sát,
hướng dẫn, quan tâm, giúp đỡ và động viên em trong q trình làm khóa luận tốt
nghiệp.
Tất cả q thầy cơ Khoa Hóa, đặc biệt q thầy cơ Bộ mơn Hóa hữu cơ đã tận
tình dạy dỗ, truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học vô cùng quý báu trong suốt
bốn năm học vừa qua.
Các bạn trong phịng thí nghiệm đã giúp đỡ, chia sẻ những vui buồn trong q
trình làm khóa luận.
Ba, Mẹ và những người thân trong gia đình là chỗ dựa tinh thần vững chắc nhất
giúp em vượt qua mọi khó khăn, tạo mọi điều kiện tốt nhất để em hoàn thành tốt khóa
luận này.

-i-


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

.i

MỤC LỤC

.ii

DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

.iv

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

.v

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

.vi

LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2
1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO............................................................ 2
1.1.1. Mô tả chung ...................................................................................................... 2
1.1.2. Vùng phân bố .................................................................................................... 2
1.2. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH .................................................................. 3
1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền ......................................................................... 3
1.2.2. Nghiên cứu về dược tính ................................................................................... 4
1.2.3. Độc tính ............................................................................................................ 4
1.2.4. Ứng dụng khác .................................................................................................. 4
1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC............................................ 5

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................... 10
2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ....................................................................................... 10
2.1.1. Hóa chất .......................................................................................................... 10
2.1.2. Thiết bị............................................................................................................ 10
2.2. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................... 10
2.2.1. Thu hái nguyên liệu ......................................................................................... 10
2.2.2. Xử lí mẫu nguyên liệu ..................................................................................... 11
2.3. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO ............................................................................... 11
2.4. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE ........... 11
2.4.1. Sắc ký cột sillica gel trên cao ethyl acetate ...................................................... 11
-ii-


2.4.2. Sắc ký cột trên phân đoạn HA.1.6...................................................................... 12
2.4.3. Sắc ký cột trên phân đoạn HA.1.6.12 ................................................................. 12
2.4.4. Sắc ký cột trên phân đoạn HA.2.4...................................................................... 12
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 14
3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.B1 .......................................................... 14
3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C2 .......................................................... 17
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT...................................................................... 19
4.1. KẾT LUẬN ............................................................................................................ 19
4.2. ĐỀ XUẤT ............................................................................................................... 19
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 20
PHỤ LỤC

-iii-


DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT

Ký hiệu,

Tiếng Anh

Tiếng Việt

chữ viết tắt
1

H-NMR

Proton (1) Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

Resonance

proton (1)

Carbon (13) Nuclear Magnetic

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân của

Resonance

carbon (13)

AcOH

Acetic acid

Axit axetic

C

Chloroform

Cloroform

Bu

Butanol

Butanol

d

Doublet

Mũi đôi

dd

Doublet of doublets

Mũi đôi đôi

ddd

Doublet of doublet of doublets

Mũi đôi đôi đôi

EA

Ethyl Acetate

Etyl axetat

Et

Ethanol

Etanol

H

n-Hexane

n-Hexan

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond

Phổ tương tác dị hạt nhân qua

Coherence

nhiều liên kết

Me

Methanol

Metanol

ppm

Par per million

Một phần một triệu

s

Singlet

Mũi đơn

13

C-NMR

SKC

Sắc ký cột

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

UV

Ultra Violet

Tia cực tím

W

Water

Nước

-iv-


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU
 HÌNH ẢNH
Hình 1.1.Cây cành giao ........................................................................................... 2
Hình 1.2.

Các hợp chất cơ lập được từ E.tirucalli ................................................ 7

Hình 3.1.

Cấu trúc vịng A của hợp chất G.B1................................................... 15

Hình 3.2.

Cấu dạng và tương quan HMBC của G.B1 ........................................ 15

Hình 3.3.

Cơng thức cấu tạo và tương quan HMBC của G.C2........................... 18

Hình 4.1.

Hai hợp chất cơ lập được từ cao ethyl acetate..................................... 19

 SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2.1.Q trình ly trích và cơ lập từ cây cành giao .......................................... 13
 BẢNG BIỂU
Bảng 1.1.Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây ............................................ 4
Bảng 1.2.Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây ................................................ 6
Bảng 2.1.Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate........................................................ 11
Bảng 3.1.

Dữ liệu phổ của hợp chất G.B1.......................................................... 16

Bảng 3.2.

Dữ liệu phổ của hợp chất G.C2 ......................................................... 18

-v-


DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

Phụ lục 1.

Phổ 1H-NMR của hợp chất G.B1

Phụ lục 2.Phổ 13C-NMR của hợp chất G.B1
Phụ lục 3.Phổ 13C-NMR giãn rộng của hợp chất G.B1
Phụ lục 4.

Phổ HMBC của hợp chất G.B1

Phụ lục 5.

Phổ 1H-NMR của hợp chất G.C2

Phụ lục 6.

Phổ 13C-NMR của hợp chất G.C2

Phụ lục 7.Phổ HMBC của hợp chất G.C2

-vi-


LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là một nước nhiệt đới có nhiều điều kiện thuận lợi cho các loài thực vật có
giá trị phát triển. Từ xa xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ để làm thuốc chữa bệnh, từ
đó tìm ra được nhiều phương thuốc có thể chữa được một số bệnh nan y như ung thư, sốt
rét… Ngày nay, ngành hóa học các hợp chất tự nhiên kết hợp với ngành y dược học, sinh
học không ngừng nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các dược thảo
có trong các phương thuốc cổ truyền để ứng dụng vào việc chữa bệnh. Tuy nhiên nhiều cây
thuốc chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa được nghiên cứu một cách có hệ

thống, trong đó có cây cành giao.
Cây cành giao mọc hoang tại nhiều vùng ở Việt Nam.Tuy nằm trong từ điển cây
thuốc Nam nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu hóa sinh học về cây cành giao được thực
hiện.Những nghiên cứu đi trước về Euphorbia tirucalli L. cho thấy cây cành giao là loại
cây có nhiều tiềm năng.
Xuất phát từ những ứng dụng y học quý giá, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần
hóa học của cây cành giao với mong muốn tìm ra những hợp chất có hoạt tính sinh học góp
phần nâng cao giá trị của các dược thảo Việt Nam.

-1-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo
CHƯƠNG 1.
TỔNG QUAN

1.1.

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY CÀNH GIAO[1]

Tên thông thường: Cành giao
Tên gọi khác: lục ngọc thụ, xương khơ, bút chì, thanh san hô, san hô xanh, nọc rắn.
Thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae).
Tên khoa học: Euphorbia tirucalli L.

Hình 1.1Cây cành giao
1.1.1. Mơ tả chung[1]
Cây cành giao có thể cao 4-7 m, thân có thể có đường kính bằng cổ tay, cành nhiều,

mọc so le hay hơi vịng, màu xanh, gầy.
Lá nhỏ, hình mác hẹp, hơi dày, rất chóng rụng, phiến lá dài 12-16 mm, rộng 2 mm.
Hoa tập trung ở những chỗ phân nhánh hoặc tận cùng ở đầu cành.Quả nang, hơi có
lơng, có 3 mảnh vỏ.Hạt hình trái xoan, nhẵn.
1.1.2. Vùng phân bố
Cành giao có nguồn gốc ở đảo Mangat (châu Phi). Phát hiện thấy ở Việt Nam từ
năm 1970.[1]
Cây cành giao có mặt ở hầu hết các châu lục, đặc biệt các vùng có khí hậu nhiệt đới
hoặc khơ như châu Phi, châu Á và Nam Mỹ. Cây cành giao được xác định bởi Linnaeus
vào năm 1973.[7]

-2-


Khóa luận tốt nghiệp
1.2.

Văn Thị Bích Hảo

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

1.2.1. Dược tính theo y học cổ truyền
Tồn cây cành giao có vị cay, hơi chua, tính mát, hơi có độc, có tác dụng thúc sữa,
sát trùng, khử
phong, tiêu viêm, giải độc. Dân gian thường dùng cành giao để trị đau nhức, côn
trùng đốt, chấn thương…
Theo Schmelzer, Gurib-Fakim (2008) và Van Damme (1989) thì ở Đơng Phi, mủ
của cành giao được sử dụng để chống liệt dương, mụn cóc, động kinh, đau răng, trĩ, rắn
cắn. Ở Malaysia, rễ hoặc thân cành giao được dùng đểchữa trị loét mũi, trĩ và các chỗ sưng.
Các mảnh rễ trộn với dầu dừa chữa đau dạ dày. Ở Ấn Độ, Kumar (1999) ghi lại rằng cành

giao là loại cây không thể thiếu trong vườn nhà và được sử dụng như là một phương thuốc
cho các bệnh như: phì lá lách, hen suyễn, bệnh phù, bệnh phong, huyết trắng, khó tiêu,
vàng da, đau bụng, các khối u, sỏi bàng quang. Duke (1983) và Van Damme (1989) đề cập
rằng tại Brazil, cành giao được sử dụng chống lại bệnh ung thư, u dạng ung thư, ung thư
biểu mô, bướu thịt, các khối u và mụn cóc mặc dù vẫn cịn tranh cãi về cơ sở khoa học về
hợp chất chống ung thư của cây. Ở Malabar (Ấn Độ) và Moluccas, mủ được sử dụng như
thuốc gây nôn và trị giang mai.Ở Indonesia, dịch của rễ được sử dụng trị đau nhức xương
trong khi thuốc đắp của rễ hoặc lá cây được sử dụng điều trị loét mũi, trĩ.Nước sắc từ thân
cây để chữa bệnh phong và tê liệt tay chân sau khi sinh con (Duke, 1983). Ở Java, mủ được
sử dụng để chữa trị các bệnh về da và gãy xương.[15]
Một số bài thuốc theo y học cổ truyền:
Chữa viêm xoang, viêm mũi dị ứng: dùng khoảng 15 đốt cành cây cành giao, cắt
nhỏ từng đoạn 5mm, cho vào túi nilon đập nát rồi cho vào ấm có vịi với lượng nước vừa
đủ, đun sơi, dùng giấy cuộn thành ống lắp vào đầu vòi, cho vào mũi để hít hơi nước, hơi
thuốc vào mũi, thỉnh thoảng hít cả vào miệng. Thời gian xơng 10-15 phút.Xơng liên tục 3-5
ngày, bệnh nặng có thể xơng 7-10 ngày. Cần chú ý khơng dùng cho phụ nữ có thai.[22]
Chữa cơn trùng, ong đốt, rắn cắn, bị cạp đốt…: dùng cành cây cành giao giã nhỏ,
đắp lên vết thương.[22]

-3-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

Chữa mụn cơm: dùng nhựa mủ cây cành giao đắp lên mụn cơm.[22]
1.2.2. Nghiên cứu về dược tính
Cao chiết các bộ phận của cây được thử nghiệm các loại hoạt tính sinh học và dược
học, được mơ tả trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây
Hoạt tính
Kháng virus

Nguồn
Nhựa cây

Kháng ung thư và điều trị AIDS
Kháng viêm
Miễn dịch

Cao chiết cây
Nhựa cây
Cao chiết cây

Kháng khuẩn
Kháng oxi hóa và chức năng bảo vệ gan
Chất diệt côn trùng và sinh vật gây hại:
Brevicoryne brassicae
Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus
Biomphalaria gabrata
Lymneae natalensis

Cao chiết cây
Cao chiết cây
Nhựa cây

Tài liệu trích dẫn
Ramesh 2009[16]
Avelar 2011[2]

Betancur-Galvis 2002[3]
Dias 2006[4]
Santana 2014[17]
Valadares 2006[19]
Lirio 1998[11]
Jyothi 2008[9]
Mwine J., Van Damme
2011[15]

1.2.3. Độc tính
Các lồi Euphorbia đều chứa nhựa nhưng nhựa cây cành giao được xem độc
nhất.Cây cành giao có nhiều diterpenoid loại phorbol gây độc tuy không gây chết người
nhưng làm tổn thương nặng da và mắt.Nhựa của cây cành giao có thể làm phồng da và
xung huyết da, gây nôn mửa với liều lớn nhưng nó lại là thuốc tẩy với liều nhỏ và chữa trị
đau răng, đau tai, thấp khớp, mụn cóc, ho, thần kinh và bọ cạp cắn.[5][6]
1.2.4. Ứng dụng khác
Nguồn năng lượng thay thế:Nhựa cây chứa hàm lượng lớn triterpenoid có 30 carbon
có thể thực hiện cắt mạch để cho xăng có chỉ số octane cao.[15]

-4-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

Nguồn cao su:Nhựa cây chứa nhiều terpene và resin có thể chuyển hóa thành cao su
với giá thành thấp. Trong suốt chiến tranh thế giới thứ II, nhựa cây được sử dụng ở Nam
Phi.[15]
Nông lâm nghiệp:Với đặc tính chống hạn cây được sử dụng ở các vùng đất bán hạn

hán để bảo vệ đất.[15]
1.3.

CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC

Euphorbia tirucalli có chứa chất nhựa màu trắng như sữa trong toàn cây khi cắt
ngang. Nhựa cây có thể chiếm tới 28% trọng lượng khơ, trong đó gồm 21-27% các hợp
chất tan trong nước, 59-63% resin và 12-14% các hợp chất như cao su.[15]
Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L.
tương đối ít và thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene,
diterpene, polyphenol…(Uchida Hidenobu Y.H. và cộng sự, 2009; Lin S.-J. và cộng sự,
2001; Yoshida T. và cộng sự, 1991).[11][18][21] Nhựa của Euphorbia tirucalli L. cũng được
nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene thuộc khung sườn ingenane
và tigliane (Fuerstenberger G. và cộng sự, 1985; Fuerstenberger G., 1977).[5][6]
Năm 1977, Fuerstenberger G. và Hecker E. cô lập được 4 hợp chất mới từ mủ của
cây Euphorbia tirucalli. Đó là các hợp chất 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1), phorbol (2),
3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) và ingenol (4).[5]
Năm 2001, Lin S.-J. đã cô lập được 14 hợp chất, đó là3,3',4-tri-O-methyl-4-Orutinosyl ellagic acid (22), gallic acid (23), 1-O-galloyl-β-D-glucoside (24), 1,2,3-tri-Ogalloyl-β-D-glucoside

(25),corilagin

(26),

pedunculagin

(27),casuariin

(28),quercitrin(29),putranjivain B (30), putranjivain A (31), 3,3'-di-O-methyl gallic
acid;2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside vàrutin 5-desgalloylstarchyurin.[10]

-5-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

Bảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây [15]
Hợp chất hóa học
4-Deoxyphorbol di-ester (5)

Nguồn
(bộ phận)
Nhựa cây

Tài liệu trích dẫn
Kinghorn 1979

Campesterol (7), stigmasterol (8),
β-sitosterol (9), isofucosterol (10),
cycloartenol (11) (sterol)
Cycloeuphordenol (12) (triterpene)

Toàn cây

Uchida và cộng sự 2010

Nhựa cây

Khan 2010

Cyclotirucanenol (13) (triterpene)

Nhựa cây

Khan và Ahmed 1988

Diterpene ester

Nhựa cây

Khan và Malik 1990

Euphol (14) và β-amyrin (15)
(triterpenoid)

Toàn cây

Uchida và cộng sự 2010

Euphorbin A (polyphenol)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Euphorcinol (16) (pentacyclic triterpene)

Vỏ thân cây Khan 1989

Euphorbol (17)

Nhựa cây

Furstenberger và Hecker 1977

Serine protease

Nhựa cây

Lynn và Clevett 1985

Steroid

Nhựa cây

Nielson và cộng sự 1979

Taraxerane triterpene (18)

Vỏ thân cây Rasool 1989

Tirucalicine (6) (diterpene)

Nhựa cây

Khan 2010

Tirucallin A (19) (tannin)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Tirucallin B (20) và euphorbin F (21)
(dimer)

Thân cây

Yoshida và Yokoyama 1991

Trimethylellagic acid

Nhựa cây

Chatterjee và cộng sự 1977

-6-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli
-7-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

H

H

H

H

H
Euphorbol (17)

Taraxerane (18)
OH

OH HO

OH

OH
OH

HO

O

OH
O OO
O O

O

O

O

OH

O

HO

OH
OH

OH

O

O O
O
O
O

O

O
OH

OH

OH

O
O

OH

O

O
H

O
OH

H O
O

OH
OH
OH

HO

OH

OH OH
Tirucallin A (19)

HO

OH

O O

HO

OH

OH

HO

HO

OH

O

OH HO

O

O

OHHO

HO

O

O

O

O

OH

O

HO

H

H

HO

OH
Euphorcinol (16)
HO

H

H

H

HO

HO
OH
OH
Tirucallin B (20)

O
O

HO

O

O

HO

O

O

O
O

O

OH

O

OH
OHHO

O

HO
OH
HO

OH

OH
HO
OH
HO

HO

O

O
OH
HO HO

H

OH

OH

b

O

O
O

O
CO

CO

OH

O

HO
Euphorbin F (21)

MeO

OH
O

CO

OH

H

OH

O
O

O

OMe O

OH
OH
OH

O

OH

O
CO

O
OH

OH
OH
O a

O

MeO

OH

OO
O

HO

O

HO

OH

OH
3,3',4-tri-O-methyl-4'-O-rutinosyl ellagic acid (22)

-8-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ E. tirucalli(tiếp)

-9-


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo
CHƯƠNG 2.
THỰC NGHIỆM

2.1.

HỐ CHẤT, THIẾT BỊ

2.1.1. Hoá chất
 Silica gel 0.04-0.06 mm, Himedia dùng cho cột sắc kí.
 Sắc kí bảng mỏng loại Kieselgel 60F

254

(20×20), Merck.

 Dung mơi dùng cho q trình thí nghiệm gồm: n-hexane, ethyl acetate, acetic
acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bản mỏng: sử dụng
vanillin/H2SO4.
2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
 Các cột sắc kí.
 Máy cơ quay chân khơng.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV bước sóng 254 nm và 365 nm.
 Cân điện tử.
 Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và

HMBCtrên máy Bruker, tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học
Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ
Chí Minh.
2.2. NGUYÊN LIỆU
2.2.1. Thu hái nguyên liệu
Mẫu được dùng trong nghiên cứu khoá luận là thân cây cành giao Euphorbia
tirucalli L. được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận vào tháng 3 năm
2015.
- 10 -


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

2.2.2. Xử lý mẫu nguyên liệu
Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khơ rồi xay thành bột
mịn. Sau đó tiến hành đun hoàn lưu với ethanol và phân lập các hợp chất.
2.3.

ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột cây 3.5 kg được trích kiệt với ethanol mỗi lần 10 lít và lặp lại hai lần theo
phương pháp đun hoàn lưu trong vịng 7 giờ, lọc, cơ quay thu hồi dung mơi. Trong q
trình cơ quay thu hồi dung mơi, thấy kết tủa xuất hiện, lọc riêng phần tủa ethanol thô
(250.4 g) và phần dịch ethanol thơ Et1(290.3g). Tiếp tục hịa phần tủa ethanol thơ với
ethanol đun nóng, thu được phần dịch Et2 (101.2 g) và phần tủa còn lại (149.2 g). Cao

ethanol Et1, Et2 được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và
butanol thu được các cao tương ứng như minh họa trong sơ đồ 2.1.
2.4.

CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE

2.4.1. Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate
Sắc ký cột cao ethyl acetate - EA1, EA2 trên silica gel pha thường sử dụng hệ dung
hexane: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần từ 50% đến 100% ethyl acetate. Dịch giải ly
qua cột được hứng vào các lọ.Theo dõi quá trình giải ly bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM).
Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gộp chung thành một phân đoạn.
Bảng 2.1Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate
Tên

Phân

Sắc kí lớp mỏng

Ghi chú

đoạn

EA1

EA2

EA1

EA2

EA1

EA2

1

HA.1.1 (1.58 g)

HA.2.1 (0.37 g)

Nhiều vết

Vệt dài

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

2

HA.1.2 (2.76 g)

HA.2.2 (3.14 g)

Vệt dài

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Đã khảo sát

3

HA.1.3 (1.15 g)

HA.2.3 (2.12 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

4

HA.1.4 (2.48 g)

HA.2.4 (4.21 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Đã khảo sát

5

HA.1.5 (2.35 g)

HA.2.5 (2.69 g)

Vệt dài

Nhiều vết

Chưa khảo sát

Chưa khảo sát

6

HA.1.6 (2.50 g)

HA.2.6 (3.15 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

7

HA.1.7 (1.95 g)

HA.2.7 (1.84 g)

Nhiều vết

Nhiều vết

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

- 11 -


Khóa luận tốt nghiệp
8

HA.1.8 (0.24 g)

Văn Thị Bích Hảo
HA.2.8 (0.89 g)

Nhiều vết

Vệt dài

Đã khảo sát

Chưa khảo sát

2.4.2. Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6
Phân đoạn HA.1.6 cho SKLM nhiều vết nên phân đoạn HA.1.6 được thực hiện SKC
sillica gel với hệ dung môi rửa giải H-EA (1:4). Dịch giải ly qua cột được hứng vào các lọ.
Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom
chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 12 phân đoạn (HA.1.6.1-HA.1.6.12), được
trình bày trong sơ đồ 2.1.
2.4.3. Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.1.6.12
Phân đoạn HA.1.6.12 cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn HA.1.6.12 được
thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải H:EA:Et:AcOH (5:1:0.2:0.1). Dịch giải
ly qua cột được hứng vào các lọ.Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM. Những lọ cho kết
quả SKLM giống nhau được gom chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 15 phân
đoạn (HA.1.6.12.1-HA.1.6.12.15).
Phân đoạn HA.1.6.12.11 có sắc kí lớp mỏng cho vết rõ đẹp màu cam ẩn dưới vết dơ
kéo thành đuôi dài.Từ phân đoạn HA.1.6.12.11 (356.0 mg), tiếp tục SKC nhiều lần với hệ
dung môi C:Me:W (4:0.38:0.02) thu được hợp chất kí hiệu là G.C2 (6.5 mg) có dạng bột
màu trắng. Q trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.
2.4.4. Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn HA.2.4
Phân đoạn HA.2.4 cho SKLM nhiều vết, tách rõ và xuất hiện kết tủa. Lọc thành 2
phần tủa và dịch. Lấy phần tủa rửa nhiều lần bằng acetone thu được hợp chất kí hiệu là
G.B1 (10.3 mg) có dạng bột màu trắng. Q trình thực hiện được tóm tắt theo sơ đồ 2.1.

- 12 -


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo
Bột cành giao khơ (3.5kg)
Đun hồn lưu với ethanol, lọc,

cơ quay thu hồi dung môi.
Phần cao tủa ethanol
250.4 g

Et1
290.3 g

Cao H1
94.2 g
HA.1.1-5
10.32 g

Cao EA1
61.8 g
HA.1.6
2.5 g

Cao Bu1
27.0 g
HA.1.7+8
2.19 g

Cao H2
50.2 g

HA.1.6.12
548 mg

HA.1.6.1-11
1.8 g

HA.1.6.12.11
356 mg

Cao EA2
32.0 g

HA.2.1-3
5.63 g

SKC/A
HA.1.6.12.1-10
150 mg

Cao tủa ethanol
149.2 g

Et2
101.2 g

HA.1.6.12.12-15
42 mg

HA.2.5-8
HA.2.4
8.57 g
4.21g
Lọc

Tủa

SKC/B

Rửa bằng acetone

G.C2
6.5 mg

GB1
10.3 mg

Sơ đồ2.1.Q trình ly trích và cơ lập từ cây cành giao

- 13 -

Cao Bu2
10.5 g

Dịch
Hệ dung môi A
H:EA:Et:AcOH (5:1:0.2:0.1)
Hệ dung môi B
C:Me:W (4:0.38:0.02)


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo
CHƯƠNG 3.
KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

3.1

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.B1
Hợp chất G.B1(10.3 mg)thu được được từ phân đoạn HA.2.4 của cao ethyl acetate

với các đặc điểm như sau:
 Chất bột vô định hình màu trắng.
 Khơng hấp thu UV, hiện hình với thuốc thử vanillin/H2SO4 cho vết màu xanh
dương khi hơ đun nóng.
 Phổ 1H-NMR (Acetone-d6): Phụ lục 1.

 Phổ 13C-NMR (Acetone-d6): Phụ lục 2, 3.
 Phổ HMBC (Acetone-d6): Phụ lục 4.
Biện luận cấu trúc
Phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của ba mươi carbon, trong đó có hai tín hiệu
carbon olefin ởvùng từ trường thấp tại δC 145.0 (loại carbon >C=) vàδC 122.9, có độ dịch
chuyển hóa học đặc trưng của nối đôi C=C tại C-12 và C-13 của hợp chất olean-12-ene,
giúp xác định hợp chất G.B1 là một triterpene có khung sườn olean.
So sánh số liệu phổ 13C-NMR của hợp chất G.B1 và oleanolicacid[20], nhận thấy các
tín hiệu của G.B1 và oleanolic acid giống nhau, ngoại trừ các tín hiệu của vịng A. Qua đó
giúp xác định G.B1 có cấu trúc giống oleanolic acid ở các vòng B, C, D, E.
Trên vòng A, phổ 1H-NMRcho thấy sự hiện diện của tín hiệu cộng hưởng tại vị trí
δH3.56 (1H, d, J= 10.5 Hz) ghép cặp với proton ở vị trí δH 3.28 (1H, d, J= 10.5 Hz),cùng
với dữ liệu phổ HMBC giúp xác định chúng là hai proton của nhóm methylene khơng
tương đương liên kết trực tiếp với oxygen. Ngồi ra phổ 1H-NMR cịn có tín hiệu cộng
hưởng của hai nhóm oxymethine H-2 (1H, ddd, J = 11.5, 9.5, 4.5 Hz) và H-3 (1H, d, J =
9.5 Hz). Phân tích hằng số ghép của hai proton này chứng tỏ chúng ghép cặp lẫn nhau với J
= 9.5 Hz giúp xác định vị trí axial của chúng.

- 14 -


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo

So sánh hợp chất G.B1 và oleanolic acid,cho thấy G.B1 mất đi một nhóm methyl –
CH3ở vị trí 23, thay vào đó là sự hiện diện của nhóm hydroxylmethylene H2-23. Phổ
HMBC của G.B1 cho thấy tương quan giữa H2-23 với C-3, C-4, C-5 và C-24 giúp xác định
nhóm -CH2OH ở vị trí 23. Đồng thời, proton H-3 có tương quan HMBC với C-2 và C-24
giúp xác định vị trí lân cận của H-2, H-3 và H3-24.
Cấu trúc vịng A của G.B1 đềnghị:

Hình 3.1 Cấu trúc vòng A của hợp chất G.B1
Từ các dữ liệu trên, kết hợp với so sánh dữ liệu phổ 13C-NMR của arjunolic acid [12],
thấy dữ liệu phổ của G.B1 và arjunolic acid có sự tương đồng, nên cấu trúc của hợp chất
G.B1 được đề nghị như hình 3.2. Arjunolic acid lần đầu tiên được cơ lập từ cây cành giao.

Hình 3.2Cấu dạng và tương quan HMBC của hợp chất G.B1

- 15 -


Khóa luận tốt nghiệp

Văn Thị Bích Hảo
Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của hợp chất G.B1

G.B1a

δH (ppm), J (Hz)

N

1

Oleanolic acida
δC(ppm)

δC(ppm)

Arjunolic acidb

G.B1a

δC (ppm)

N

δH(ppm), J (Hz)

Oleanolic acida

Arjunolic acidb

δC (ppm)

δC (ppm)

δC (ppm)

47.4

39.3

47.1

16

23.9

23.8

23.9

2

3.67 (ddd, 11.5, 9.5, 4.5)

68.9

28.1

68.9

17

46.9

46.9

47.0

3

3.39 (d, 9.5)

78.5

78.8

78.7

18

42.2

42.3

43.5

4

43.4

39.4

43.5

19

46.8

46.8

46.3

5

48.2

56.2

48.4

20

31.3

31.3

30.7

6

18.7

19.1

18.6

21

34.5

34.5

34.2

7

33.1

33.7

33.1

22

33.4

30.1

33.0

8

40.2

40.2

40.1

23

67.1

28.7

67.2

3.56 (d, 10.5)
3.28 (d, 10.5)

9

48.5

48.5

48.5

24

0.73 (s)

13.8

16.3

14.0

10

38.7

37.8

38.5

25

1.02 (s)

17.5

15.8

17.6

11

24.2

24.1

23.8

26

0.80 (s)

17.7

17.6

17.2

122.9

123.0

122.5

27

1.17 (s)

26.4

26.3

26.1

13

145.0

144.9

144.1

28

178.9

178.9

178.6

14

42.6

42.5

42.4

29

0.92 (s)

33.4

33.4

32.9

15

28.4

28.5

28.3

30

0.94 (s)

23.7

23.9

23.7

12

a

5.25 (dd, 7.0, 3.5)

ghi phổ trongacetone-d6;b trongpyridine-d5

- 16 -


Khóa luận tốt nghiệp
3.2

Văn Thị Bích Hảo

KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C2
Hợp chất G.C2thu được được từ phân đoạn HA.1.6 của cao ethyl acetate với các

đặc điểm như sau:
 Chất bột vơ định hình màu trắng.
 Hiện hình với thuốc thử vanillin/H2SO4khi hơ nóng cho vết màu cam, hấp
thu UV cho vết màu tím sáng rõ.
 Phổ 1H-NMR (Acetone-d6): Phụ lục 5.

 Phổ 13C-NMR (Acetone-d6): Phụ lục 6.
 Phổ HMBC (Acetone-d6): Phụ lục 7.
Biện luận cấu trúc
Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của một cặp proton nhân thơm ghép meta với nhau
tại H 5.96 và 5.94 (mỗi 1H, d, J = 2.0 Hz), ba proton nhân thơm ghép cặp lẫn nhau ở vị trí
1, 2, 4 trên nhân thơm benzene tại H 7.03 (1H, d, J = 1.5),H 6.87 (1H, dd, J = 1.5, 8.5Hz)
vàH 6.86 (1H, d, J = 8.5Hz), hai proton của nhóm methylene khơng tương đương tại H
3.14 (1H,dd, J = 12.5, 17.0 Hz) và H 2.72 (1H, dd, J = 3.0, 17.0 Hz), một nhóm
oxymethine tại H 5.40 (1H, dd, J = 3.0, 12.5 Hz), một nhóm hydroxyl kiềm nối tại δH
12.17. Những dữ kiện này chứng tỏ G.C2 sở hữu khung sườn flavanone.
Phổ

13

C-NMR cho thấy tín hiệu của mười lăm carbon tương ứng với năm nhóm

methine thơm, một nhóm oxymethine, một nhóm methylene và tám carbon tứ cấp (trong
đó có năm carbon liên kết với oxygen và một carbon carbonyl).
Trên nhân thơm A, độ dịch chuyển hóa học của H-6(H 5.94)và H-8(H 5.96)

chuyểndịch về vùng từ trường cao, chứng tỏ chịu ảnh hưởng của ba nhóm thế đẩy electron
ở vị trí 5, 7 và 9. Phổ HMBC cho thấy tương quan của proton H-6 và H-8 tương quan với
các carbon δC 167.4 (C-7), δC 103.2 (C-10), giúp xác định vị trí của các proton này trên
nhân A.
Trên nhân thơm B, độ dịch chuyển hóa học của H-2'(H 7.03), H-5' (H 6.87)vàH6'(H 6.86) chuyển dịch về vùng từ trường cao, chứng tỏ chúng chịu ảnh hưởng của hai
nhóm thế đẩy electron ở vị trí 3', 4' giúp xác định vị trí của chúng. Phổ HMBC cho thấy
- 17 -