Nghiên cứu nhân giống địa lan thanh ngọc cymbidium ensyolium bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

LỜI CẢM ƠN
Lý thuyết trong 4 năm đại học là vô cùng quý báu và quan trọng với
mỗi ngƣời sinh viên, đặc biệt với sinh viên ngành công nghệ sinh học nhƣ
chúng tơi; mỗi một mơn học đều có những kiến thức và những ứng dụng khác
nhau trong đời sống hằng ngày từ bé tới lớn. Vì vậy, để củng cố kiến thức của
mình tơi đã tiến hành thực hiện khóa luận: “Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống
Địa lan Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium) bằng phƣơng pháp nuôi cấy in
vitro”. Trong q trình thực hiện khóa luận, để đạt đƣợc kết quả tốt ngồi sự
cố gắng của bản thân, thì sự chỉ bảo, giúp đỡ tận tình của thầy cơ, bạn bè sự
động viên của gia đình đã góp phần giúp tơi vƣợt qua những khó khăn trong
học tập.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị Hồng Gấm Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp - Trƣờng Đại học Lâm nghiệp đã tận
tình hƣớng dẫn, tạo những điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực hiện và hồn thành khóa luận này.
Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị cán bộ
cùng các bạn sinh viên tại Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã giúp đỡ
chỉ bảo tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu để có thể hồn thành
khóa luận một cách tốt nhất trong thời gian sớm nhất.
Cuối cùng, tơi xin kính chúc các thầy, cô giáo trong Viện Công
nghệ sinh học Lâm nghiệp, trƣờng Đại học Lâm nghiệp luôn dồi dào sức
khỏe, đạt đƣợc nhiều thành công trong cuộc sống cũng nhƣ trong sự
nghiệp nghiên cứu và giảng dạy.
Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2018
Sinh viên thực hiện
Trần Văn Cƣơng

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i

MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. iv
DANH MỤC CÁC BẢNG................................................................................ v
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vi
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
PHẦN 1 TỔNG QU N VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................... 2
1.1. Tổng quan về nhân giống lan bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro .......... 2
1.1.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro..................................................................... 2
1.1.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................... 2
1.1.3. Các điều kiện trong nuôi cấy in vitro ...................................................... 4
1.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy in vitro ................................................................... 6
1.1.5. Các giai đoạn nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro lan ..... 10
1.1.6. Ý nghĩa của kỹ thuật nuôi cấy in vitro .................................................. 13
1.2. Tổng quan về Địa lan Thanh ngọc ........................................................... 14
1.2.1. Đặc điểm chung Địa lan Thanh ngọc ................................................... 15
1.3. Lịch sử nghiên cứu và thành tựu nuôi cấy in vitro hoa lan...................... 16
1.3.1. Trên thế giới .......................................................................................... 16
1.3.2. Ở Việt Nam ........................................................................................... 17
PHẦN 2 MỤC TI U - N I DUNG - PHƢƠNG PH P TH C HI N ......... 22
2.1. Mục tiêu nghiên cứu: ............................................................................... 22
2.2. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
2.3.Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 22
2.3.1.Phƣơng pháp luận................................................................................... 22
2.3.2. Địa điểm và điều kiện bố trí thí nghiệm ............................................... 23
2.3.3. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm cụ thể ................................................... 23
2.3.4. Phƣơng pháp thu thập và xử lý số liệu .................................................. 27
2.3.5 Thời gian thực hiện đề tài ...................................................................... 27
ii

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................... 29
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng tái sinh của
phôi hạt Địa lan Thanh ngọc ........................................................................... 29
3.1.1. Kết quả ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tái sinh
của phôi hạt Địa lan Thanh ngọc .................................................................... 29
3.1.2. Kết quả ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tái
sinh của phôi hạt.............................................................................................. 31
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi
Địa lan Thanh ngọc. ........................................................................................ 33
3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi
Địa lan Thanh ngọc ......................................................................................... 35
3.4 Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng ra rễ Địa lan
Thanh ngọc ...................................................................................................... 39
PHẦN 4 ........................................................................................................... 43
KẾT LUẬN- TỒN TẠI - KIẾN NGHỊ ........................................................... 43
4.1. Kết luận .................................................................................................... 43
4.2.Tồn tại ....................................................................................................... 43
4.3. Kiến nghị .................................................................................................. 43
T I I U TH M HẢO

iii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

TT

CHỮ VIẾT TẮT CHỮ ĐẦY ĐỦ

1

BAP

6-benzylamino purine

2

Kinetin

6-furfurylamino purine

3

IAA

Indole-3-acetic acid

4

IBA

Indole-3-butyric acid

5

GA3

Acid Gibberellic

6

NAA

Naphthyl acetic acid

7

ĐHST

Chất điều hòa sinh trƣởng

8

CTTN

Cơng thức thí nghiệm

10

ĐC

Đối chứng

11

TN

Thí nghiệm

iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tái sinh của
phôi hạt ............................................................................................................ 23
Bảng 2.2. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng tái sinh của phôi hạt..... 24
Bảng 2.3. Ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng nhân nhanh thể chồi .... 25
Bảng 3.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả năng tái sinh của
phôi hạt ............................................................................................................ 30
Bảng 3.2: Ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng tới khả năng tái sinh
phôi hạt ............................................................................................................ 31
Bảng 3.3: Ảnh hƣởng của các chất ĐHST tới khả năng nhân nhanh thể chồi......33
Bảng 3.4: Ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh
chồi Địa lan Thanh ngọc ................................................................................. 37
Bảng 3.5: Kết quả ảnh hƣởng của chất ĐHST đến khả năng ra rễ Địa lan
Thanh ngọc ...................................................................................................... 40

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cây Địa lan Thanh ngọc ................................................................. 14
Hình 3.1: Phơi hạt Địa lan Thanh ngọc tái sinh trên mơi trƣờng MS ............. 30
Hình 3.2: Phơi hạt Địa lan Thanh ngọc trên mơi trƣờng CT3 ........................ 32
Hình 3.3: Sự phát triển của phôi hạt lan sau 6 tuần ni cấy. ........................ 32
Hình 3.4: Biểu đồ ảnh hƣởng của hàm lƣợng các chất điều hòa sinh trƣởng tới
hệ số nhân nhanh thể chồi ............................................................................... 34
Hình 3.5: Thể chồi Địa lan Thanh ngọc sau 5 tuần trên môi trƣờng TC2 (A)
và TC4 (B) ....................................................................................................... 34
Hình 3.6: Sự phát triển của thể chồi sau 4 tuần (A) và 8 tuần (B).................. 35

Hình 3.7: Chồi lan hình thành từ thể chồi sau 4 tuần ni cấy ....................... 36
Hình 3.8: Biểu đồ ảnh hƣởng của hàm lƣợng các chất điều hòa sinh trƣởng
tới khả năng nhân nhanh chồi Địa lan Thanh ngọc......................................... 37
Hình 3.9: Chồi Địa lan Thanh ngọc trên mơi trƣờng VC5 (A) và VC1 (B) sau
4 tuần nuôi cấy. ............................................................................................... 38
Hình 3.10: Chồi lan lúc mới cấy chuyển (A) và sau 5 tuần (B) ..................... 39
Hình 3.11: Biểu đồ ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến số rễ
TB/chồi Địa lan Thanh ngọc ........................................................................... 40
Hình 3.12. Chồi Địa lan Thanh ngọc đƣợc ra rễ trên môi trƣờng RR3 (A) và
RR5 (B) ........................................................................................................... 41
Hình 3.13 Sơ đồ tổng quát quy trình nhân giống Địa lan Thanh ngọc bằng
phƣơng pháp ni cấy in vitro. ....................................................................... 42

vi


ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một đất nƣớc đƣợc thiên nhiên ƣu ái rất nhiều, tuy lãnh thổ
Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nhƣng khí hậu Việt Nam lại phân
bố thành 3 vùng khí hậu riêng biệt với miền bắc là khí hậu cận nhiệt đới ẩm,
miền Trung và Bắc trung bộ là kiểu khí hậy nhiệt đới gió mùa, miền Nam và
Nam Trung bộ mang đặc điểm kiểu nhiệt đới Xavan. Có thế nói Đơng Nam
nói chung và Việt Nam nói riêng là thiên đƣờng cho các chi lan Hoàng Thảo
sinh trƣởng và phát triển. Theo cuốn Phong lan Việt Nam của Trần Hợp thì
nƣớc ta có 137-140 chi gồm trên 800 lồi lan rừng trong đó có nhiều loại lan
quý có giá trị kinh tế và hoa học rất cao.
Trong những năm gần đây thú chơi lan của con ngƣời khiến cho các
loại lan bị săn lùng ráo riết khiến cho rất nhiều các loại lan bị đƣa vào trong
sách đỏ và có nguy cơ tuyệt chủng rất cao. Ở ngoài tự nhiên quần thể lan có
thể tái tạo lại khi gặp điều kiện thuận lợi tuy nhiên cũng phải mất một thời

gian rất lâu. Vì vậy việc nhân giống các lồi lan là vấn đề vơ cùng quan trọng.
Khi tìm hiểu về Địa lan Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium) thì khiến
tơi thật ấn tƣợng về mùi hƣơng nhẹ và là rất khác biệt với loại lan khác. Lan
Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium) là loại phong lan lá nhỏ, lá 3-4 chiếc dài
40-50cm, ngang rộng 2-3 cm. Dò hoa cao chừng 30cm, hoa từ 2-9 chiếc to
khoảng 1-3cm nở vào cuối mùa hạ, đầu mùa thu với hƣơng thơm tuyệt hảo và
nếu cây khỏe mạnh sẽ có nhiều dị hoa. Hoa bền 14 đến 21 ngày, có màu xanh
ngọc sở hữu vẻ đẹp dịu dàng, thanh nhã. Địa lan Thanh ngọc đƣợc trồng làm
cảnh rất đẹp và đƣợc đa số ngƣời chơi lan yêu thích.
Với những giá trị đem lại việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống mới với
mục tiêu tạo ra số lƣợng giống lớn cung cấp cho thị trƣờng là vấn đề hết sức
cấp thiết. Do đó, trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Địa lan Thanh ngọc (Cymbidium
ensifolium) bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro”

1


TỔN

PHẦN 1
QU N VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 . Tổng quan về nhân giống lan bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
1.1.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy in vitro là thuật ngữ mô tả các phƣơng thức nuôi cấy các bộ
phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trƣờng xác định ở điều kiện vô
trùng. Môi trƣờng có những chất dinh dƣỡng thích hợp nhƣ muối khống,
vitamin, các hoocmon sinh trƣởng và đƣờng [10].
1.1.2. Cơ sở khoa học của ni cấy mơ tế bào thực vật

1.1.2.1. Tính toàn năng của tế bào
Cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, Gottlibeb Haberlant - nhà thực vật học
ngƣời Đức đã đặt nền móng đầu tiên cho ni cấy mơ tế bào thực vật.Ơng đã
đƣa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào trong cuốn sách “Thực nghiệm
về nuôi cấy tách rời” năm 1902. Theo ông: “Tế bào bất kỳ của cơ thể sinh vật
nào cũng đều mang tồn bộ lƣợng thơng tin di truyền (DNA) cần thiết và đủ
của cả sinh vật đó.

hi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào có thể phát triển

thành một cá thể hồn chỉnh”.
Tính tồn năng của tế bào mà Haberlant đƣa ra chính là cơ sở lý luận của
phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Hơn 50 năm sau, các nhà thực nghiệm về nuôi cấy mô và tế bào thực vật
mới đạt đƣợc thành tựu chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập
của tế bào. Kỹ thuật tạo dòng (cloning) các tế bào đơn đƣợc phân lập trong
điều kiện in vitro đã chứng minh một thực tế rằng các tế bào soma, dƣới các
điều kiện thích hợp, có thể phân hóa để phát triển thành một cơ thể thực vật
hồn chỉnh.
1.1.2.2. Sự trẻ hóa
Thế kỷ XVII - XVIII, ngƣời ta cho rằng dịng vơ tính sẽ bị thối hóa theo
tuổi chỉ có thể trẻ hóa thơng qua sinh sản bằng hạt. Nhƣng thực tế cho thấy

2


đời sống của một dịng vơ tính là vơ hạn nều nhƣ nó sống trong mơi trƣờng
thích hợp và liên tục đƣợc đổi mới bằng sinh sản sinh dƣỡng. Sự thối hóa
chủ yếu do tác hại của virus mà thơi.
Khả năng ra chồi, rễ ở các thành phần khác nhau là rất khác nhau. Vì vậy

để chọn mẫu cấy phù hợp phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu.
Trong nuôi cấy in vitro, các mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và
mơi trƣờng nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt trong nuôi cấy mơ sẹo,
phơi.Ngồi ra mơ non trẻ mới đƣợc hình thành, sinh trƣởng mạnh, mức độ
nhiễm mầm bệnh ít hơn.
1.1.2.3. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào
Sự phát triển của một cơ thể trƣởng thành từ tế bào đơn (hợp tử) là kết
quả của sự hợp nhất sự phân chia và phân hóa tế bào.
Sự phân hóa tế bào là sự chuyển hóa các tế bào phơi sinh thành các mơ
chun hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể.
Sự phản phân hóa là sự chuyển các tế bào chuyên hóa chức năng trở lại
thành tế bào phơi sinh trong điều kiện ni cấy thích hợp.
Hai q trình đƣợc biểu thị bằng sơ đồ sau:
Biệt hóa tế bào
Tế bào phơi sinh

Tế bào giãn

Tế bào chun hóa

Phản biệt hóa tế bào
Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một q trình điều hịa
hoạt hóa gen. Tại một thời điểm nào đó trong hai q trình phát triển của cá
thể có một số gen đƣợc hoạt hóa (mà vốn trƣớc đây bị hạn chế) để tạo ra tính
trạng mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một
chƣơng trình đã đƣợc mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA ở mỗi tế bào.
Mặt khác khi cho tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thƣờng bị ức
chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích
thƣớc của khối mô sẹo sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của

3


tế bào, q trình hoạt hóa sẽ đƣợc xảy ra theo một cấu trúc nhất định sẵn có
trong bộ gen đó.
1.1.3. Các điều kiện trong ni cấy in vitro
1.1.3.1. Điều kiện vô trùng
Môi trƣờng để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đƣờng, vitamin,
muối khống,… rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Do tốc
độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu
trong môi trƣờng nuôi cấy chỉ cần nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn
thì chỉ sau vài ngày đến một tuần, tồn bộ bề mặt mơi trƣờng và mơ nuôi cấy
sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn. Thí nghiệm phải bỏ đi vì
trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần.
- Vô trùng dụng cụ và môi trƣờng nuôi cấy:
+ Khử trùng ƣớt: à phƣơng pháp áp dụng hiệu quả và phổ biến trong vô
trùng môi trƣờng nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy, nút bông bằng hơi nƣớc ở nhiệt
độ 117oC và áp suất 1,2-1,5 atm. Thiết bị sử dụng là nồi hấp vô trùng.
+ Khử trùng khô (sấy khô): Phƣơng pháp này dùng cho các dụng cụ
bằng kim loại, thủy tinh, nút bơng, các dụng cụ có tính chịu nhiệt. Thiết bị
dùng khử trùng khô là tủ sấy.Nhiệt độ đảm bảo là 160-200oC.
+ Màng lọc: Dùng để loại bỏ các tác nhân gây ơ nhiễm có kích thƣớc
0,025-10µm khỏi môi trƣờng nuôi cấy. Đây là phƣơng pháp phù hợp với các
mơi trƣờng mà thành phần của nó bị phân hủy ở nhiệt độ cao nhƣ dung dịch
enzyme và một số chất điều hòa sinh trƣởng. Hiện nay ngƣời ta cịn sử dụng
một hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi
cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào.
- Vô trùng mẫu cấy:
Với các loại mẫu cấy khác nhau hoặc cùng loại mẫu cấy nhƣng ở các vị
trí khác nhau thì phƣơng pháp khử trùng mẫu cấy là khác nhau. Phƣơng pháp

phổ biến trong vô trùng mẫu cấy hiện nay là sử dụng hóa chất có khả năng
tiêu diệt vi sinh vật.
4


Hiệu quả khử trùng phụ thuộc vào loại, nồng độ và thời gian xử lý hóa
chất khử trùng. Một hóa chất đƣợc lựa chọn để vô trùng phải đảm bảo 2 thuộc
tính: Có khả năng diệt vi sinh vật tốt và khơng hoặc ít độc đối với mẫu thực
vật. Các hóa chất hay đƣợc sử dụng đó là: Hypoclorit canxi (nồng độ 5-15%
w/v), Hypoclorit natri (nồng độ 10-20% w/v), Oxy già (nồng độ 10-12% w/v),
HgCl2 (nồng độ 0,1-1% w/v), chất kháng sinh (50-100mg/l), phối hợp xử lý
với cồn 70o.
- Vô trùng Box cấy:
Box cấy là nơi thực hiện thao tác cấy mẫu từ mơi trƣờng vào trong ống
nghiệm, bình trụ,…Box cấy đƣợc khử trùng bằng đèn cực tím trong thời gian
20 phút. Box cấy có quạt thổi gió vơ trùng để vi sinh vật không xâm nhập vào
trong môi trƣờng thực hiện thao tác cấy.
1.1.3.2. Ánh sáng và nhiệt độ
Sự phát sinh của mô nuôi cấy phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: Thời gian
chiếu sáng, cƣờng độ ánh sáng và chất lƣợng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng
có vai trị trong q trình phát sinh hình thái của mơ ni cấy, với đa số các
lồi cây thời gian chiếu sáng thích hợp từ 12-18h/ngày. Cƣờng độ ánh sáng
cũng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mơ
ni cấy, cƣờng độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong khi cƣờng độ
ánh sáng thấp sẽ hình thành mơ sẹo. Nhìn chung, cƣờng độ ánh sáng thích
hợp cho mơ ni cấy là 1000-7000 lux. Chất lƣợng ánh sáng cũng ảnh hƣởng
tới sự phát sinh hình thái của mơ thực vật.

nh sáng đỏ làm tăng chiều cao

thân chồi hơn so với ánh sáng trắng. Nếu mơ ni cấy trong ánh sáng xanh thì
sẽ ức chế sự vƣơn cao của mô nhƣng lại tốt cho sự sinh trƣởng của mơ sẹo.
Nhiệt độ phịng ni cấy mô - tế bào là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng tới
sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây.Tùy thuộc vào xuất xứ
của mẫu mơ nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp.Thƣờng cây nhiệt
đới đòi hỏi nhu cầu nhiệt độ cao hơn so với cây ơn đới.Nhiệt độ thích hợp cho
sinh trƣởng ở nhiều loài cây là 25 ± 2 0C.
5


1.1.4. Môi trƣờng nuôi cấy in vitro
Môi trƣờng nuôi cấy là nguồn cung cấp các chất dinh dƣỡng cần thiết
cho sự tăng trƣởng và phân hóa mơ trong suốt q trình ni cấy, cơ sở của
việc xây dựng các mơi trƣờng nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần
thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây.
1.1.4.1. Thành phần hóa học của mơi trường
Mơi trƣờng hố học là nguồn cung cấp các chất cần thiết cho sự tăng
trƣởng phân hố mơ trong suốt q trình sinh hố trong cây. Cơ sở của việc
xây dựng các môi trƣờng nuôi cấy là việc xem xét các thành phần cần thiết
cho sự tăng trƣởng và phát triển của cây. Hầu hết các loại môi trƣờng nuôi
cấy mô và tế bào thực vật đều bao gồm :
- Các loại muối khoáng đa lƣợng và vi lƣợng
- Nguồn Cacbon
- Vitamin
- Các chất điều hồ sinh trƣởng
- Nhóm chất bổ sung (than hoạt tính, chất tạo gel..) tùy từng loại cây.
 Các nguyên tố đa lượng và vi lượng:
a) Nguyên tố đa lƣợng.
Sử dụng ở nồng độ > 30 ppm (30 mg/l). Những nguyên tố N, S, P, K,
Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo từng đối tƣợng.

- Nitơ: Dùng ở dạng NO3ˉ và NH4 + riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau.
- Photpho: Là nguyên tố mà mô và tế bào thực vật ni cấy có nhu cầu
rất cao và thƣờng đƣợc đƣa vào môi trƣờng ở dạng đƣờng đơn.
- ƣu huỳnh ( S ): Đƣợc sử dụng ở dạng muối SO4 2- nồng độ thấp còn
dạng SO32- và SO22- kém tác dụng thậm chí cịn gây độc cho mơi trƣờng nuôi
cấy.
- Na+ và Cl - : Cần ở nồng độ thấp và đƣợc đƣa vào môi trƣờng cùng với
muối khống khi điều chỉnh pH mơi trƣờng.

6


b) Các nguyên tố vi lƣợng
Là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ < 30 ppm (30 mg/l). Các
nguyên tố vi lƣợng nhƣ: Fe, Cu, Zn, Bo, Co, Iot... Các ngun tố này đóng vai
trị quan trọng trong các hoạt động của enzyme. Chúng đƣợc dùng ở nồng độ
thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lƣợng.
- Fe: Thiếu Fe làm giảm

RN, protein nhƣng lại làm tăng

DN và các

axit amin tự do làm cho các tế bào không phân chia.
- Mn: Thiếu Mn làm cho ADN và các axit amin tự do tăng lên nhƣng
lƣợng mARN và sự sinh tổng hợp protein bị giảm nên làm giảm sự phân bào.
- Bo: Thiếu Bo trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng gây lên biểu hiện thừa
Auxin vì thực tế Bo làm cho các chất ức chế Auxin oxydase trong tế bào phát
triển. Mơ ni cấy có biểu hiện tạo mơ sẹo hố mạnh nhƣng thƣờng là mơ
xốp, mọng nƣớc, kém tái sinh.

 Nguồn Cacbon
Cây in vitro sống chủ yếu theo phƣơng thức dị dƣỡng, mặc dù dƣới ánh
sáng nhân tạo chúng có khả năng hình thành diệp lục và quang hợp nhƣng bị
hạn chế cho nên việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon dƣới dạng
hữu cơ là bắt buộc, giúp cho tế bào phân chia và tăng sinh khối.
Tùy thuộc mục đích và sự địi hỏi của từng hệ mơ có thể dùng các loại
đƣờng khác nhau: Sucrose, Maltose, Glucose, Galactose và Lactose. Hàm
lƣợng đƣờng bổ sung vào môi trƣơng nuôi cấy thƣờng là 20- 40g/l.
 Vitamin và các nhóm chất bổ sung
Các loại mơ và tế bào thực vật ni cấy in vitro đều có khả năng tự tổng
hợp đƣợc hầu hết các loại Vitamin, nhƣng không đủ về hàm lƣợng nên phải
bổ sung thêm từ bên ngồi vào, đặc biệt là các Vitamin nhóm B.
Tùy từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy mà các Vitamin đƣợc bổ sung một
lƣợng thích hợp để mơ đạt sinh trƣởng tối ƣu.
- Vitamin B1 (thiamin) đóng vai trị quan trọng trong quá trình biến đổi
cacbon và tham gia vào thành phần tổ hợp enzyme xúc tác quá trình oxy hóa
khử cacbon ở axit hữu cơ. Nồng độ thƣờng dùng từ 0,1-10mg/l.
7


- Vitamin B6 (piridoxin) tham gia vào thành phần các enzyme khử
cacbon và thay đổi vị trí các nhóm amin trong các axit amin. Nồng độ thƣờng
dùng từ 0,1-1mg/l.
- Myo-inositol cần đƣợc bổ sung một lƣợng khá lớn từ 50-500mg/l và tỏ
ra có tác dụng rất rõ đến sự phân chia của nó.
- Nƣớc dừa: Trong nƣớc dừa có nhiều axit amin tự do, axit amin liên kết, axit
hữu cơ, đƣờng, ARN...
- Dịch chiết mầm lúa mì (mạch nha) chứa một số đƣờng, vitamin, 1 số
chất có hoạt tính điều hoà sinh trƣởng.
- Dịch chiết nấm men: Thành phần chủ yếu chứa đƣờng, axit nucleic,

axit amin, vitamin, auxin, muối khoáng,...
- Dịch thuỷ phân Casein: Làm nguồn bổ sung axit amin.
- Chất nền (thạch): Để cố định mẫu cấy trong môi trƣờng nuôi cấy ngƣời
ta thƣờng sử dụng chất làm đông cứng môi trƣờng thạch. Nồng độ của thạch
dùng trong môi trƣờng nuôi cấy dao động tùy thuộc vào độ tinh khiết của hóa
chất và mục tiêu ni cấy (thƣờng từ 6-10 g/l).
 Các chất điều hồ sinh trƣởng
Auxin:
Auxin có tác dụng sinh lý lên rất nhiều mặt lên quá trình sinh lý của tế
bào, hoạt động của tầng phát sinh, quả... Tác dụng sinh lý của auxin chủ yếu
làm tăng thể tích của tế bào, kích thích sự hình thành rễ, kìm hãm sự sinh
trƣởng của chồi bên, kìm hãm sự rụng hoa, rụng quả. Auxin hoạt hoá các
hợp chất cao phân tử (protein, cellulose, pectin) và ngăn cản sự phân giải
chúng.

uxin đƣợc xem là nhóm chất ĐHST thực vật quan trọng nhất vì

chúng có vai trị rất cơ bản trong q trình phối hợp sinh trƣởng và biệt hố
tế bào cần thiết cho sự phát triển bình thƣờng của thực vật.
Trong nuôi cấy mô thƣờng sử dụng các chất nhƣ:
- Indol acetic acid (IAA)
- Naphthyl acetic acid (NAA).
- 2,4D Dichlorophenol acetic acid (2,4D).
- Indol butyric acid (IBA).
8


Cytokinin:
Bao gồm các chất:
- 6-Benzylaminopurin (BAP).

- Kinetin (Ki).
- Zeatin (Z).
- Thidiazuron (TDZ).
Cytokinin có tác dụng kích thích sự sinh trƣởng của tế bào cấy mô và
làm tăng tốc độ phân bào. Khi ở hàm lƣợng cao, nó có tác dụng kích thích sự
tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hố rễ của mơ cấy.
Tùy từng hệ mơ và mục đích ni cấy mà cytokinin đƣợc sử dụng ở các nồng
độ khác nhau.Trong ni cấy mơ phân sinh để kích thích q trình nhân nhanhthể
chồi và chồi ngƣời ta thƣờng dùng nồng độ cytokinin trong khoảng 10-6 - 10-4M.
Gibberelin:
Đây là chất có tác dụng kích thích sự giãn tế bào, kéo dài lóng, đốt, thân,
cành cây. Ngồi ra, nó cịn có tác dụng phá tính ngủ nghỉ ở củ, hạt, ức chế tạo
rễ phụ cũng nhƣ tạo chồi phụ [8]. Chất thƣờng đƣợc sử dụng nhất trong nhóm
này là GA3 (Gibberelin).
Ngồi ba nhóm chất trên cịn có các chất có tác dụng ức chế sự sinh
trƣởng và phát triển khác nhƣ Etylen. Chất này cũng gây ảnh hƣởng khá rõ
đến sự phát sinh hình thái của một số lồi cây trồng trong nuôi cấy in vitro.
1.1.3.3. pH môi trường
PH

của đa số các môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh trong phạm vi

5,6-6,0. PH dƣới 5,5 làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, cịn ph lớn hơn
6,0 agar có thể rất cứng.
Nếu trong mơi trƣờng có GA3 thì phải điều chỉnh giá trị PH trong phạm
vi nói trên vì ở PH kiềm hoặc quá axit thì GA3 sẽ chuyển sang dạng khơng có
hoạt tính (Vab Braft & Pierk, 1971).
1.1.3.4. Tính thẩm thấu của mơi trường.
Các thành phần chính có ảnh hƣởng đến thế căng của nƣớc trong môi
trƣờng bao gồm: hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng agar, một số thành phần muối

khoáng.
9


Đƣờng vừa là nguồn cacbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời còn
tham gia vào điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trƣờng. Hàm lƣợng
đƣờng cao sẽ làm mơ ni cấy khó hút đƣợc nƣớc. Hàm lƣợng đƣờng thấp là
một trong những nguyên nhân gây ra hiện tƣợng thủy tinh hóa ở mẫu ni
cấy, đây là những trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vƣờn
ƣơm.
Tính thẩm thấu của mơi trƣờng đặc biệt quan trọng trong:
- Nuôi cấy mô sẹo.
- Nuôi cấy tế bào đơn và huyền phù.
- Dung hợp tế bào trần.
1.1.5. Các giai đoạn nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy in vitro lan
Chọn mẫu cấy

Chuẩn bị môi trƣờng

Khử trùng mẫu

Khử trùng môi trƣờng

Vào mẫu (môi trƣờng vào mẫu)

Nhân chồi (môi trƣờng nhân chồi)

Tạo rễ (môi trƣờng ra rễ)

Huấn luyện cây lan mô con

Ra cây, huấn luyện ngoài vƣờn ƣơm

10


Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị
Nhân giống bằng phƣơng pháp ni cấy in vitro lan có thể lựa chọn các
bộ phận sinh dƣỡng hoặc bộ phận sinh sản của cây. Do đó, việc thu thập vật liệu
cho q trình nhân giống có thể từ thân, lá, rễ, cành... hoặc từ hoa, quả.
Sau khi tiến hành chọn, mẫu cấy sẽ đƣợc khử trùng bằng một số loại hóa
chất nhƣ: Cồn, HgCl2 0,1%, NaOCl 10 - 20%, ... và rửa sạch lại bằng nƣớc cất vô
trùng.
Các thao tác đƣợc thực hiện trong box cấy vô trùng.
Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy
Đối với vật liệu từ các cơ quan sinh dƣỡng hoặc các bộ phận của cơ quan
sinh sản mang bộ nhiễm sắc thể 2n nhƣ cánh hoa, bao hoa, sau khi khử trùng,
các vật liệu này đƣợc cấy vào mơi trƣờng thích hợp (mơi trƣờng có bổ sung
chất ĐHST với nồng độ thích hợp), sau đó q trình phản biệt hóa tạo mơ sẹo
và q trình biệt hóa diễn ra, từ các mảnh của các bộ phân sinh dƣỡng sẽ tạo
ra thể chồi lan và chồi lan.
Với vật liệu là phôi hạt... đƣợc tách ra và đƣa vào môi trƣờng thích hợp,
sau một thời gian sẽ tái sinh tạo thể chồi và phát triển thành chồi.
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mẫu đƣợc khử
trùng và ni cấy trên mơi trƣờng thích hợp. Giai đoạn này cần đảm bảo tỷ lệ
nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trƣởng tốt.
Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra hệ số nhân nhanh cho mẫu cấy. Giai
đoạn này kích thích mơ ni cấy phát sinh nhiều chồi mầm cung cấp cho giai
đoạn sau bằng cách cắt nhỏ những bộ phận mới sinh ở giai đoạn 2 và cấy
chúng lên môi trƣờng phù hợp theo định kỳ. Đặc biệt với lan, ta có thể dễ

dàng nhân nhanh thể chồi bằng môi trƣờng nuôi cấy bổ sung các chất kích
thích sinh trƣởng thích hợp.
Sau khi thể chồi tái sinh tạo chồi ta lại có thể nhân nhanh chồi bằng mơi
trƣờng nhân chồi thích hợp. Vì vậy, hệ số nhân trong nhân giống in vitro lan
11


lớn hơn gấp nhiều lần so với các loài cây khác. Nhƣ vậy, sau một thời gian
nuôi cấy, từ một bình mẫu ta thu đƣợc rất nhiều bình chồi lan.
Đây là giai đoạn khá quan trọng bởi nó quyết định đến số lƣợng và chất
lƣợng của cây lan bằng việc sử dụng các chất điều hoà sinh trƣởng với nồng
độ thích hợp. Thơng thƣờng ngƣời ta sẽ bổ sung các chất điều hồ sinh
trƣởng thuộc nhóm Auxin, Cytokinin và các chất phụ gia (nƣớc dừa, khoai
tây...) là cực kỳ quan trọng. Tùy từng đối tƣợng mà có thể nhân nhanh theo
hƣớng kích thích sự hình thành đa chồi bất định hoặc kích thích sự hình
thành của chồi nách.
Mặt khác, cũng cần đảm bảo các nhân tố vật lý (nhiệt độ, ánh sáng...)
phù hợp. Trong giai đoạn này cần tăng cƣờng độ chiếu sáng (16 giờ/ngày,
cƣờng độ ánh sáng tối thiểu là 1000 lux) là yếu tố quan trọng kích thích mơ
phân hóa mạnh. Bảo đảm chế độ nhiệt độ từ 25- 28°C.
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Đây là giai đoạn quan trọng để có đƣợc cây lan con hồn chỉnh có đầy đủ
các bộ phận. Cấy chuyển các chồi đạt kích thƣớc nhất định và đƣợc chuyển từ
giai đoạn 3 sang mơi trƣờng ra rễ để hình thành cây hồn chỉnh. Cần bổ sung
vào mơi trƣờng các chất điều hịa sinh trƣởng thuộc nhóm Auxin, giảm hàm
lƣợng Cytokinin để rễ phát triển. Ngồi ra cịn có thể bổ sung các chất nhƣ
nƣớc dừa, dịch chiết khoai tây, để cây lan con sinh trƣởng tốt. Lúc này cây lan
con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của lá và rễ mới sinh rất
yếu, cây chƣa chuyển sang giai đoạn tự dƣỡng.
Giai đoạn 5: Huấn luyện cây lan mô con.

Đây là giai đoạn chuyển cây lan mơ con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra
ngồi trời để tạo điều kiện cho cây con tự dƣỡng hồn tồn và thích nghi dần với
điều kiện tự nhiên. Khi cây lan mơ cứng cáp thì chuyển ra ngồi vƣờn ƣơm.
Ở giai đoạn này cây đƣợc chuyển ra phải đủ tiêu chuẩn về kích thƣớc, số
lá, số rễ, có thể chuyển sang cấy vào giá thể (mùn cƣa, xơ dừa) vơ trùng có bổ
sung các chất dinh dƣỡng. Lúc này phải có giá thể tiếp nhận, giá thể đảm bảo
12


tơi xốp và sạch bệnh. Trong 2-3 tuần đầu cần duy trì độ ẩm trên 50%, tránh
ánh sáng trực tiếp, phòng trừ sâu bênh hại.
Giai đoạn 6: Đưa cây ra trồng ngoài vườn ươm.
Giai đoạn cây hoàn chỉnh đƣợc đƣa từ nhà kính ra ngồi vƣờn ƣơm, là
bƣớc cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bƣớc quyết định khả
năng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất. Giai đoạn này phải có
chế độ chăm sóc và bảo vệ cho cây phù hợp, phịng chống sâu bệnh và đảm
bảo về dinh dƣỡng.
Nhƣ vậy, thời gian thực hiện 01 quy trình nhân giống bằng phƣơng pháp
ni cấy in vitro lan cho đến khi cây con có 3- 4 lá chuyển ra vƣờn trồng mất
khoảng từ 8 đến 11 tháng
1.1.6. Ý nghĩa của kỹ thuật nuôi cấy in vitro
Sự ra đời của kỹ thuật nuôi cấy in vitro đã mang lại ý nghĩa vơ cùng to lớn.
Nó đã chứng minh đƣuọc tính tồn năng của tế bào thực vật. Kỹ thuật ni cấy in
vitro góp phần giải quyết đƣợc vấn đề lý luận và thực tiễn, đặc biệt là lĩnh vực
nghiên cứu quá trình phát sinh hình thái ở nhiều thực vật từ mức độ tế bào đến cấu
trúc mô.
Nuôi cấy in vitro đƣợc xem là một trong những giải pháp cơng nghệ mới có
ý nghĩa khoa học trong công nghệ sinh học. Trên các môi trƣờng nhân tạo, từ các
mô hay tế bào thực vật phân chia, phân hóa và phát triển thành cây hồn chỉnh.
Nhƣng ƣu việt của phƣơng pháp này:

- Đƣa ra sản phẩm nhanh hơn: từ một cây ƣu việt bất kỳ có thể tạo ra một
quần thể có độ đồng đều cao với số lƣợng không hạn chế, phục vụ sản xuất
thƣơng mại, dù cây đó có là dị hợp về mặt di truyền.
- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao: trong hầu hết các trƣờng hợp.
Công nghệ vi nhân giống đáp ứng đƣợc tốc độ nhân nhanh cao. Từ 1 cây mẹ ban
đầu, trong vịng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây con.

13


- Sản phẩm cây giống đồng nhất: vi nhân giống cơ bản là cơng nghệ nhân
dịng. Nó tạo ra quần thể có độ đều cao dù xuất phát từ cây mẹ có kiểu gen dị hợp
hay đồng hợp.
- Tiết kiệm khơng gian: vì hệ thống sản xuất hồn tồn trong phịng thí
nghiệm, khơng phụ thuộc vào thời tiết và các vật liệu khởi đầu có kích thƣớc nhỏ.
Mật độ cây tạo ra trên một đơn vị diện tích lớn hơn rất nhiều so với sản xuất trên
đồng ruộng và trong nhà kính theo phƣơng pháp truyền thống.
- Nâng cao chất lƣợng cây giống: nuôi cấy mô là một phƣơng pháp hữu
hiệu để loại trừ virus, nấm, khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh.
- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: các dạng sản phẩm
khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống nhƣ cây con in vitro hoặc trong
bầu đất. Các giống cây trồng có thể đƣuọc bán ở dạng cây, củ bi hay thân củ.
- Lợi thế về vận chuyển: các cây con có kích thƣớc nhỏ có thể vận chuyển
đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô trùng đƣợc
xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy định về vệ sinh
thực phẩm quốc tế.
- Sản xuất quanh năm: q trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kỳ thời
gian nào, không phị thuộc vào vụ mùa.
1.2. Tổng quan về Địa lan Thanh ngọc

Hình 1.1: Cây Địa lan Thanh ngọc
14


1.2.1. Đặc điểm chung Địa lan Thanh ngọc
1.2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố
Địa lan Thanh ngọc là một giống lan kiếm nhỏ thƣờng mọc ở các nƣớc Á
châu nhƣ: Hàn Quốc, Nhật Bản, Trung Hoa, Miến điện và Việt Nam.
Ngƣời Trung hoa gọi là (Jian Lan 建兰) "Yi Lian" hay "Ji si lan",
ngƣời Việt chúng ta gọi là lan Thanh Ngọc, Bạch Ngọc, Tứ Thời hay Tố Tâm
tùy theo sắc hoa.
Ngƣời Trung Hoa đã biết đến cây lan Cymbidium ensifolium từ 500
năm trƣớc Tây lịch, đức Khổng Tử đã gọi là Vƣơng Giả Chi Hƣơng và họ đã
vẽ loài lan này trong các bức cổ họa cả ngàn năm về trƣớc. Họ cũng biết cách
nuôi lan và lập ra những trại nuôi trồng từ đời nhà Đƣờng 618-907 [5].
1.2.1.2. Vị trí, phân loại
Địa lan Thanh ngọc (Cymbidium ensifolium)
- Giới (regnum):

Plantae

- Ngành :

Magnoliophyta (ngọc lan).

- Lớp:

Liliopsidae (thực vật một lá mầm).

- Bộ (ordo):

Asparagales

- Họ (familia):

Orchidaceae

- Chi (genus):

Cymbidium

- Loài (species):

Cymbidium ensifolium.

1.2.1.3. Đặc điểm về hình thái.
Trong tự nhiên, Cymbidium ensifolium thƣờng mọc ở bên dòng nƣớc
chảy hoặc nơi ẩm ƣớt thuộc các cao độ khoảng từ 330-1970 thƣớc.
Mỗi thân có 3-4 lá dài 40-50 cm, ngang rộng 2-3 cm. Dò hoa cao chừng
30 phân, hoa từ 2-9 chiếc to khoảng 6.5 cm nở vào cuối mùa Hạ, đầu mùa
Thu với hƣơng thơm tuyệt hảo và nếu cây khỏe mạnh sẽ có nhiều dò hoa. Hoa
Địa lan Thanh ngọc nở bền vững khoảng 2 -3 tuần [11,16].

15


1.2.1.4. Giá trị kinh thế.
Cymbidium ensifolium là giống rất phong phú về màu sắc và hình dạng
hoam có hƣơng thơm. Bởi vậy đƣợc ngƣời chơi hoa rất là ƣa thích.
Ngồi giá trị làm cảnh Cymbidium ensifolium cịn có cơng dụng làm

thuốc trong y học cổ truyền. Hoa để nấu nƣớc rửa mắt, lá đƣợc sử dụng nhƣ
thuốc lợi tiểu, rễ đƣợc dùng phối hợp với các vị thuốc khác làm thuốc bổ
phổi, trị ho [14,11].
1.3. Lịch sử nghiên cứu và thành tựu nuôi cấy in vitro hoa lan
1.3.1. Trên thế giới
Ni cấy mơ đã đƣợc thí nghiệm từ thế kỷ 17 nhƣng đƣợc áp dụng vào
đối tƣợng lan bắt đầu từ thế kỷ 19.
Năm 1844, một nhà làm vƣờn ở Pháp là Neumann lần đầu tiên làm nảy
mầm hạt lan bằng cách gieo hạt trên đất quanh gốc cây [4].
Năm 1904: Noel Bernard & Burgerff ngƣời Đức cộng tác với nhau để
đƣa ra phƣơng pháp gieo hạt lan có nhiễm nấm trong chai thạch. Phƣơng pháp
này đã làm tăng số lƣợng lớn cây con trồng từ hạt [4].
Năm 1922,

nudson ngƣời Mỹ lại thành công trong việc thay thế nấm

bằng đƣờng ở môi trƣờng thạch để gieo hạt. Theo nghiên cứu của

nudson

thì hạt của các lồi Cattleya, Epidendrum và nhiều lồi lan khác có khả năng
nảy mầm khơng cộng sinh với nấm trong nuôi cấy in vitro [3]. Mặc dù đã có
phát hiện của nudson nhƣng vào năm đó vẫn chƣa thể tạo ra mơi trƣờng mà
các lồi phong lan đƣợc lựa chọn có thể nảy mầm và phát triển.
Năm 1960, Georges Morel lần đầu tiên thành công trong nuôi cấy đỉnh
sinh trƣởng để nhân nhanh phong lan [15].
Năm 1970, M. Vajrabhaya và T. Vajrabhaya đã ni cấy mơ thành
cơng lồi lan đơn thân [5].
Cho tới năm 1974, các nhà khoa học đã ni cấy mơ thành cơng hầu
hết các lồi lan thuộc nhóm đơn thân khác [5].

16


Từ đó đến nay nhân giống in vitro đã thành công đối với nhiều chi khác
thuộc họ lan, nhƣ: Hồ Điệp (Phalaenopsis), Cát lan (Cattleya), Hoàng thảo
(Dendrobium), im tuyến (Anoectochilus),… và các giống lai của chúng. Với
Cattleya thì có khó khăn hơn vì địi hỏi phải cấy ở mơi trƣờng lỏng với máy
lắc liên tục. Cho đến nay, đối tƣợng chƣa thể nuôi cấy bằng phƣơng pháp nuôi
cấy mô là lan Phaphiopedium.
- Những thành tựu nghiên cứu lan Dendrobium:
Sagawa và Shoji (1967);

im và cộng sự (1970), nuôi cấy đỉnh chồi

thuộc chi Dendrobium trên mơi trƣờng Vacin & Went có bổ sung 150ml/l
nƣớc dừa, mẫu cấy tạo thể chồi sau 3 tháng [2].
rditim (1973) đã ni cấy chồi bên ngồi tự nhiên sau 28 ngày tạo
chồi và cây con sau 45 ngày. Fu năm 1978 đã nuôi cấy lá cây con trong điều
kiện in vitro để tạo cây con.
im Ho, 1981, đã thực hiện nhân giống 3 loài và 17 giống Dendrobium
lai tại Singapore.
Price và Earle, 1984; Yasugi, 1986, dung hợp tế bào trần lấy từ cánh
hoa, lá và rễ.
Nayka và cộng sự (1997), trong cơng trình nghiên cứu sự nhân nhanh
chồi khi kết hợp Cytokinin và uxin trên hai đối tƣợng Dendrobium aphyllum
và Dendrobium moschatum đã cho kết quả tần số tái sinh chồi đạt tối ƣu ở
nồng độ 44µm B (9,91 mg/l B ).
Naajak NR và cộng sự (2001) đã nhân giống Cymbidium aloifolium
(L.) SW và Dendrobium nobile indl bằng phƣơng pháp nuôi cấy lát cắt mỏng

(TCS). Mẫu cấy tạo protocom [2].
1.3.2. Ở Việt Nam
Đã có những nghiên cứu về lan nhƣ: “Cây cỏ Miền Nam, phong lan
Việt Nam” của giáo sƣ Phạm Hồng Hộ.
Các cơng trình nghiên cứu về kỹ thuật gây trồng phong lan nhƣ của
Huỳnh Văn Thới, Nguyễn Thiện Tịch.
17


Dƣơng Công Kiên và cộng sự đã nghiên cứu lai tạo và gieo hạt
lanDendrobium trong ống nghiệm.
Theo cuốn “Phong lan Việt Nam” của Trần Hợp thì tại Việt Nam có tới
750 chi gồm 25.000 loài lan rừng. Hiện tại ngoài lan mọc ngồi hoang dã, lan
cịn đƣợc gây trồng đại trà tại một số nơi, nhiều nhất là ở Tây Nguyên trong
đó Đà

ạt là một trong số nơi hoa lan đƣợc trồng rộng rãi nhất. Đến nay

“Vƣơng quốc” lan rừng Đà ạt đã có gần 400 lồi thuộc hơn 100 chi.

hơng

ít lồi lan lần đầu tiên đƣợc phát hiện trên thế giới mang tên Đà Lạt, 10/12
loài lan quý của Việt Nam phân bố ở vùng rừng âm Đồng [5].
Năm 2002, tác giả Phạm Thị iên đã nghiên cứu nhân giống in vitro
thành cơng cho một số lồi địa lan ở khu vực phía Bắc Việt Nam và đƣa ra
quy trình nhân giống cho lồi Địa lan Hạc đính nâu nhƣ sau:

hử trùng mẫu

bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút. Đƣa mẫu đã khử trùng vào môi
trƣờng F + 3% đƣờng sucrose + 0,8% agar +B P 1,0 mg/l + inetin 0,7 mg/l
+IB

0,5 mg/l. Môi trƣờng F + 3% đƣờng Sucrose +0,8% agar +10% nƣớc

dừa + 0,5mg/l N

để tạo cây hồn chỉnh.[2]

Năm 2003, trƣờng Đại học Nơng nghiệp I Hà Nội đã tiến hành nghiên
cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Hồ Điệp (Phalaenopsis)
của Nguyễn Quang Thạch và cộng sự cho thấy: Thời vụ khác nhau ít ảnh
hƣởng đến tỷ lệ sống của cây khi chuyển ra vƣờn ƣơm, cây in vitro đạt khối
lƣợng tiêu chuẩn có thể đƣa ra vƣờn ƣơm bất cứ thời điểm nào vẫn đạt tỷ lệ
sống > 80%, cây sinh trƣởng mạnh trên giá thể rong biển , chế độ nƣớc tƣới
khác nhau ảnh hƣởng tới tỷ lệ sống của cây: Chế độ tƣới 2 lần/ngày cho tỷ lệ
sống cao nhất (97,1%), tỷ lệ tƣới 1 lần/ngày và 5 lần/ngày cho tỷ lệ sống thấp
nhất (56,67%). [2]
Năm 2004, Tiến sĩ Dƣơng Tấn Nhựt đã nhân giống in vitro thành công loài
lan Hài Hồng quý hiếm với cách gây vết thƣơng rồi mới tiến hành nuôi cấy [3].
Năm 2005, Viện Di truyền Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu
nhân nhanh phong lan Hồ Điệp từ phát hoa và chóp rễ của huất Hữu Trung và
18


cộng sự cho thấy: Môi trƣờng phát sinh chồi từ chồi ngủ của phát hoa là MS +
10% nƣớc dừa + 3% đƣờng + 1g/l than hoạt tính +1mg/l B P + 0,1mg/l N

;

mơi trƣờng tạo cây hồn chỉnh từ chồi ngủ của phát hoa là: MS + 10% nƣớc dừa
+ 3% đƣờng + 1g/l than hoạt tính +0,1mg/l B P +1mg/l N

[2].

Năm 2005, trƣờng Đại học Nông nghiệp I - Hà Nội đã tiến hành nghiên
cứu xây dựng quy trình sau in vitro cho cây Địa lan của Nguyễn Quang Thạch
và cộng sự cho thấy: Để đảm bảo cho cây sinh trƣởng và phát triển tốt ngoài
vƣờn ƣơm cây Địa lan in vitro phải đạt khối lƣợng 1,0 gam, giá thể Dớn biển
thích hợp nhất để ra cây in vitro, sau 3 tháng trồng ở vƣờn ƣơm cấp I chuyển
sang cây trồng ở vƣờn ƣơm cấp II với giá thể thích hợp nhất là dƣơng xỉ [14].
Năm 2009, trƣờng Đại học Huế đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro cây
Mỹ Dung Dạ lan của Nguyễn Thanh Tùng và cộng sự cho thấy: Cây con (cao
3-4cm, có 4-5 lá , có 2-3 rễ) đƣợc huấn luyện 10 ngày sau đó rửa sạch và sau
đó nhúng vào dung dịch sát khuẩn Viben C 50BTN 0,25-3% trong 1 phút rồi
trồng lên giá thể rêu nƣớc và dƣơng xỉ (tỷ lệ 1:2) sau 3 tuần cây hình thành
các rễ tơ, sau 1 tháng hình thành lá mới. Tỷ lệ cây con sống sót là 97,67% sau
1 tháng trồng ở vƣờn ƣơm [12].
Trƣờng Đại học âm nghiệp Việt Nam cũng có rất nhiều đề tài nghiên
cứu về phong lan tiêu biểu nhƣ: Đề tài “Nhân giống một số loài lan bản địa
bằng phƣơng pháp nuôi cấy trong ống nghiệm” của Thạc sĩ Vũ Thị Huệ cho
thấy: Phƣơng pháp khử trùng bằng quả đạt hiệu quả tốt hơn hẳn so với
phƣơng pháp khử trùng trực tiếp hạt, tỷ lệ mẫu sống đạt trên 90% đối với lồi
lan Phi Điệp và lan Hƣơng. Mơi trƣờng tạo thể chồi và chồi cho 2 lồi lan là
mơi trƣờng dinh dƣỡng

nudsonC, sau 4 tháng tỷ lệ tạo thể chồi và chồi đạt

100% với loài lan Phi Điệp và 5 tháng đối với lồi lan Hƣơng. ồi lan Phi

Điệp thì

inetin và B P có ảnh hƣởng tốt tới khả năng phân hóa thể chồi

thành chồi cũng nhƣ nhân nhanh ở chồi. Sự kết hợp inetin và B P đạt hệ số
nhân chồi trung bình 5,8 lần, cơng thức phối hợp tốt nhất là môi trƣờng
nudsonC + 0,5mg/l kinetin + 0,5 mg/l B P…[13].
19