(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn bản địa việt nam bằng kĩ thuật in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ
TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ
THUẬT IN VITRO

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN THỊ NHUNG

NGHIÊN CỨU NUÔI THÀNH THỤC TRỨNG VÀ
TẠO PHÔI LỢN BẢN ĐỊA VIỆT NAM BẰNG KỸ

THUẬT IN VITRO
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 9 42 02 01

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1.

TS. Bùi Xuân Nguyên

2.

TS. Nguyễn Việt Linh

Hà Nội, 2021


i
LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến TS. Bùi Xn Ngun, Ngun Trưởng
Phịng Cơng nghệ Phôi, Viện Công nghệ sinh học và TS. Nguyễn Việt Linh, Phó Trưởng
Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện Cơng nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, hỗ trợ kĩ
thuật và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tơi thực hiện và hồn thành luận án này.

Tơi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tơi
được học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn ơn các thầy cô giáo, các cán bộ Học viện Khoa học và
Công nghệ đã chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong q trình học tập nghiên cứu
và hồn thành các thủ tục liên quan đến luận án.

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc TS. Nguyễn Thị Ước, Phịng cơng nghệ
Phơi, Viện cơng nghệ sinh học đã chỉ bảo, hướng dẫn kĩ thuật và giúp đỡ tôi từ những
ngày đầu làm việc cho đến nay, sự giúp đỡ của TS. Nguyễn Thị Ước đã góp một phần
rất lớn không chỉ trong kết quả của luận án này mà cịn trong suốt thời gian làm việc
của tơi.
Tơi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ-Bác sỹ thú y Kazuhiro Kikuchi, trưởng nhóm
nghiên cứu Đơn vị sinh học sinh sản, Khoa Khoa học động vật, Viện khoa học sinh học,
tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm quốc gia-Nhật Bản (NARO); Tiến sỹ
Tamas Somfai, nghiên cứu viên chính Phịng nghiên cứu sinh sản và chăn nuôi, Viện
chăn nuôi và khoa học đồng cỏ (NILGS), Tổ chức nghiên cứu nông nghiệp và thực phẩm
quốc gia Nhật Bản (NARO); Giáo sư, tiến sỹ Takeshige Otoi, Tiến sỹ Đỗ Thị Kim Lành,
Phòng sinh sản động vật, đại học Tokushima, Nhật Bản đã hướng dẫn kĩ thuật, chia sẻ tài
liệu, kinh nghiệm, tận tình giúp đỡ tôi để thực hiện luận án.

Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hạnh, Trưởng Phịng Cơng nghệ Phơi, Viện
Cơng nghệ sinh học cùng các cán bộ Phịng cơng nghệ Phơi, Viện cơng nghệ sinh học
đã có những góp ý để tơi hồn chỉnh luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của Ban phụ trách đào tạo Học viện Khoa
học và Công nghệ, Ban phụ trách đào tạo Viện Cơng nghệ sinh đã tận tình hướng dẫn


ii
tơi hồn thành mọi thủ tục trong suốt q trình học tập và làm nghiên cứu sinh tại học
viện.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bố mẹ, chồng con đã luôn hỗ trợ và
tạo điểu kiện tốt nhất cho tơi chun tâm làm việc và hồn thành luận án.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè và đồng nghiệp đã luôn ủng hộ, cổ vũ và động
viên tơi những lúc khó khăn để hồn thành tốt luận án này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn./.
Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021

Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Nhung


iii
LỜI CAM ĐOAN

Tơi xin cam đoan
Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự
khác;
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã được cơng
bố trên các tạp chí khoa học chun ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng
tác giả;
Phần cịn lại chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2021
Tác giả

NCS. Nguyễn Thị Nhung


iv
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................. i
LỜI CAM ĐOAN ĐOAN....................................................................................................... iii
MỤC LỤC..................................................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.............................................................................................. viii

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................ x
MỞ ĐẦU......................................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU............................................................... 4
1.1.

Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, quá trình thụ tinh
và phát triển phôi in vivo ở lợn......................................................................... 4

1.1.1.

Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn.............................4

1.1.2.

Sự thụ tinh và phát triển phôi lợn in vivo.......................................................... 9

1.1.3.

Ảnh hưởng của mùa vụ đến hoạt động sinh sản ở lợn................................. 12

1.2.

Tình hình nghiên cứu tạo phôi lợn in vitro.................................................. 15

1.2.1.

Nuôi thành thục trứng lợn in vitro, ảnh hưởng của nguồn nguyên
liệu trứng và điều kiện nuôi thành thục............................................................. 15

1.2.2.

Tạo phôi lợn TTON, ảnh hưởng của chất lượng tinh trùng, chế độ
thụ tinh, nuôi và bảo quản phôi............................................................................ 19

1.2.3.

Tạo phôi lợn bằng kĩ thuật NBVT....................................................................... 26

1.3.

Nghiên cứu tạo phôi lợn Bản in vitro............................................................. 32

1.3.1.

Một số đặc điểm hình thái và sinh sản của lợn Bản...................................... 32

1.3.2.

Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo phôi lợn Bản tại Việt
Nam................................................................................................................................. 33

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP................................................................. 35
2.1.

Vật liệu, hoá chất nghiên cứu............................................................................ 35

2.1.1.

Mẫu nghiên cứu.......................................................................................................... 35

2.1.2.

Địa điểm nghiên cứu................................................................................................. 36


v
2.1.3.

Hóa chất và thiết bị.................................................................................................... 36

2.1.4.

Thiết bị nghiên cứu................................................................................................... 36

2.1.5.

Mơi trường thao tác, nuôi cấy, bảo quản........................................................... 37

2.2.

Phương pháp nghiên cứu..................................................................................... 37

2.2.1.

Phân loại tháng theo mùa........................................................................................ 37

2.2.2.

Phương pháp thu, bảo quản buồng trứng.......................................................... 37

2.2.3.

Phương pháp đo kích thước và khối lượng buồng trứng............................37

2.2.4.

Phương pháp phân chia nhóm nang.................................................................... 37

2.2.5.

Phương pháp thu trứng............................................................................................ 38

2.2.6.

Phương pháp phân loại chất lượng trứng.......................................................... 38

2.2.7.

Phương pháp đo kích thước trứng lợn................................................................ 39

2.2.8.

Phương pháp ni trứng.......................................................................................... 39

2.2.9.

Phương pháp đánh giá thành thục sau nuôi...................................................... 40

2.2.10. Phương pháp đông lạnh tinh từ mào tinh.......................................................... 40
2.2.11. Phương pháp kiểm tra chất lượng tinh trước và sau đông lạnh................42

2.2.12. Phương pháp TTON.................................................................................................. 43
2.2.13. Phương pháp đánh giá trạng thái thụ tinh......................................................... 44
2.2.14. Phương pháp đông lạnh phôi................................................................................. 44
2.2.15. Phương pháp thu, nuôi tế bào sinh dưỡng lợn................................................ 45
2.2.16. Phương pháp nhân nuôi tế bào.............................................................................. 45
2.2.17. Phương pháp đông lạnh tế bào.............................................................................. 46
2.2.18. Phương pháp NBVT (NBVT)............................................................................... 46
2.2.19. Phương pháp nuôi phôi............................................................................................ 49
2.2.20. Phương pháp nhuộm Hoechst............................................................................... 49
2.2.21. Phương pháp nhuộm Orcein.................................................................................. 50
2.2.22. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu............................................................ 50


vi
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................................. 54
3.1.

Đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng 54
ở lợn Bản theo mùa
.........................................................................

3.1.1.

Đặc điểm hình thái, kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa..............54

3.1.2.

Phân bố nang bề mặt buồng trứng lợn Bản...................................................... 56

3.1.3.

Đặc điểm phân loại chất lượng trứng theo mùa và kích thước trứng 59
lợn Bản
...............................................................................................

3.2.

Kết quả nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản.............................. 65

3.2.1.

Ảnh hưởng của mùa vụ lên kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản..

65

3.2.2.

Ảnh hưởng môi trường nuôi trứng lên kết quả nuôi thành thục

68

trứng lợn Bản
......................................................................................
3.3.

Kết quả tạo phôi lợn Bản bằng TTON.......................................................... 72

3.3.1.

Nghiên cứu đông lạnh tinh lợn Bản.................................................................... 73

3.3.2.

Nghiên cứu chế độ thụ tinh tối ưu....................................................................... 78

3.3.3.

Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục lên sự thụ tinh và phát 84
triển phôi ............................................................................................

3.3.4.

Đông lạnh phôi TTON............................................................................................. 89

3.4.

Kết quả nghiên cứu tạo phôi lợn Bản NBVT............................................. 91

3.4.1.

Kết quả nghiên cứu khảo sát chất lượng trứng lợn Landrace....................91

3.4.2.

Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Landrace................................................... 94

3.4.3.

Tạo nguồn tế bào cho nhân trong NBVT.......................................................... 96

3.4.4.

Kết quả tạo phôi lợn Bản NBVT.......................................................................... 97

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................................. 107
NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN ĐỀ TÀI ...................................................................................................

109

TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................................... 110
PHỤ LỤC....................................................................................................................................... 1


vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa............................................. 54
Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước.............................................. 57
Bảng 3.3. Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản…………………...…60
Bảng 3.4. Kích thước trứng lợn Bản (µm).............................................................. 62
Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản............................................................. 66
Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản................................................... 67
Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu..................................................................... 73
Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh................................................... 74
Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh....................... 77
Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng................................................................ 79
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản.. .80

Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong mơi trường thụ tinh có nồng độ
cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau.................................81

Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi.......85
Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh................................................................................... 86
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh................................................................................... 86
Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi TTON.............................................................. 89
Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace............................................913
Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi
trường nuôi.................................................................................................................. 94
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT...96
Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi
trường nuôi........................................................................................... 97


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1.

Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật
có vú.......................................................................................................................... 5

Hình 1.2.

Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình
giảm phân............................................................................................................... 6

Hình 1.3.

Quá trình thành thục của trứng lợn................................................................ 7

Hình 1.4.

Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với

nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng

10

Hình 1.5.

Các giai đoạn phát triển của phơi lợn............................................................ 11

Hình 1.6.

Sự phát triển của phơi lợn từ ngày 1 đến ngày 10.................................... 12

Hình 1.7.

Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận nỗn và sự
thành thục của trứng động vật có vú

19

Hình 1.8

Thụ tinh bình thường so với polyspermic.................................................... 24

Hình 1.9

Kĩ thuật NBVT....................................................................................................... 27

Hình 2.1

Buồng đếm tinh trùng.......................................................................................... 43

Hình 2.2

Bố trí dầu trong kim............................................................................................. 47

Hình 2.3

Đĩa mơi trương thao tác loại nhân tế bào trứng......................................... 47

Hình 2.4

Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân............................... 47

Hình 2.5

Đĩa mơi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng................................. 48

Hình 2.6

Xung điện trứng sau cấy nhân.......................................................................... 49

Hình 3.1

Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản:...................................... 55

Hình 3.2

Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản
theo mùa

57

Hình 3.3

Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C................................................ 59

Hình 3.4

Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn......................................... 62

Hình 3.5

Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng

64


ix
A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa
Hình 3.6

........................................

Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống

Ni IVM............................................................................................................... 67
Hình 3.7

Trứng lợn Bản sau ni thành thục trong các mơi trường.....................72

Hình 3.8

Đơng lạnh tinh dịch lợn Bản............................................................................. 77

Hình 3.9

Các giai đoạn phát triển của phơi sau thụ tinh........................................... 91

Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn
Landrace................................................................................................................... 94
Hình 3.11

Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi
trong TCM-199+10% pFF và trong POM.................................................. 95

Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển.............................. 96
Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace......................................... 101
Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT..................................... 102
Hình 3.15 Phơi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn
giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong
cơ thể lợn cái 104


x

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TỪ VIẾT
TẮT
BSA
COCs
CO2
CNSHSS
DMEM

ADN
dbc-AMP
DPBS

EGF
FF
FBS
FCs
FPN
FSH
GV
GVBD
hCG
ICSI
IVC
IVM


IVP

LH
MPN
MI
MII
NCSU-37
NSCU-23
NBVT
N2
O2
pFF
Pig FM
PZM-3
POM
PERVs
TALPPVA
TCM
TT
TCM-199
TTON
TB
β-ME
µm


xii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1. Kích thước buồng trứng lợn Bản theo mùa............................................. 54
Bảng 3.2. Số lượng nang trung bình theo kích thước.............................................. 57
Bảng 3.3. Ảnh hưởng mùa vụ đến chất lượng trứng lợn Bản……………………59
Bảng 3.4. Kích thước trứng lợn Bản (µm).............................................................. 62

Bảng 3.5. Sự thành thục của trứng lợn Bản............................................................. 66
Bảng 3.6. Kết quả nuôi thành thục trứng lợn Bản................................................... 67
Bảng 3.7. Chất lượng tinh sau khi thu..................................................................... 73
Bảng 3.8. Chất lượng tinh lợn Bản sau đông lạnh................................................... 74
Bảng 3.9. Thử nghiệm khả năng tạo phôi của tinh trùng sau đông lạnh....................... 76
Bảng 3.10. Đánh giá trạng thái thụ tinh của trứng................................................................ 78
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của lớp tế bào cận noãn lên trạng thái thụ tinh ở lợn Bản.. .79

Bảng 3.12. Trạng thái thụ tinh của trứng trong mơi trường thụ tinh có nồng độ
cafein khác nhau và thời gian thụ tinh khác nhau.................................81
Bảng 3.13. Sự thành thục và khả năng thụ tinh của trứng lợn Bản sau khi nuôi.......84
Bảng 3. 14. Ảnh hưởng của môi trường nuôi trứng lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh................................................................................... 83
Bảng 3.15. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi lên sự phát triển của phôi lợn
Bản sau thụ tinh................................................................................... 86
Bảng 3.16. Kết quả đông lạnh phôi TTON.............................................................. 89
Bảng 3.17. Phân loại chất lượng trứng lợn Landrace.............................................. 91
Bảng 3.18. Khả năng thành thục của trứng lợn Landrace trong các loại môi
trường nuôi.................................................................................................................. 94
Bảng 3.19. Ảnh hưởng của loại tế bào cấy lên sự phát triển của phôi lợn NBVT...96
Bảng 3.20. Sự phát triển của phôi lợn Landrae và phôi lợn Bản NBVT trong môi
trường nuôi........................................................................................... 97


xiii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1.

Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật
có vú.......................................................................................................................... 5

Hình 1.2.

Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thông qua quá trình
giảm phân............................................................................................................... 6

Hình 1.3.

Quá trình thành thục của trứng lợn................................................................ 7

Hình 1.4.

Trứng lợn sau thụ tinh được quan sát dưới kính hiển vi với

nhiều tinh trùng ở cả trong vùng giữa và trên màng sáng

10

Hình 1.5.

Các giai đoạn phát triển của phơi lợn............................................................ 11

Hình 1.6.

Sự phát triển của phơi lợn từ ngày 1 đến ngày 10.................................... 12

Hình 1.7.

Sự phát triển của nang, sự phát triển của tế bào cận nỗn và sự
thành thục của trứng động vật có vú

19

Hình 1.8

Thụ tinh bình thường so với polyspermic.................................................... 24

Hình 1.9

Kĩ thuật NBVT....................................................................................................... 27

Hình 2.1

Buồng đếm tinh trùng.......................................................................................... 43

Hình 2.2

Bố trí dầu trong kim............................................................................................. 47

Hình 2.3

Đĩa mơi trương thao tác loại nhân tế bào trứng......................................... 47

Hình 2.4

Micro pipet và trứng trong thao tác hút và cấy nhân............................... 47

Hình 2.5

Đĩa mơi trường thao tác cấy nhân tế bào vào trứng................................. 48

Hình 2.6

Xung điện trứng sau cấy nhân.......................................................................... 49

Hình 3.1

Kích thước và khối lượng buồng trứng lợn Bản:...................................... 54

Hình 3.2

Phân bố nang bề mặt theo kích thước buồng trứng lợn Bản
theo mùa

56

Hình 3.3

Trứng lợn Bản sau khi thu phân loại A,B,C................................................ 58

Hình 3.4

Trứng lợn Bản sau thu và tách tế bào cận noãn......................................... 61

Hình 3.5

Mối tương quan giữa số lượng nang > 2 mm và số trứng

63


xiv
A+B của lợn Bản thu được trong 4 mùa
Hình 3.6

........................................

Các giai đoạn phát triển của trứng lợn Bản trong hệ thống

Ni IVM............................................................................................................... 66
Hình 3.7

Trứng lợn Bản sau ni thành thục trong các mơi trường.....................71

Hình 3.8

Đơng lạnh tinh dịch lợn Bản............................................................................. 76

Hình 3.9

Các giai đoạn phát triển của phơi sau thụ tinh........................................... 90

Hình 3.10 Trung bình số trứng A+B thu được/BT trong 4 mùa của lợn
Landrace................................................................................................................... 93
Hình 3.11

Tỷ lệ thành thục của trứng lợn Bản và lợn Landrace nuôi
trong TCM-199+10% pFF và trong POM.................................................. 94

Hình 3.12 Độ ổn định của 2 loại tế bào qua các lần cấy chuyển.............................. 95
Hình 3.13 Các giai đoạn NBVT lợn Bản và lợn Landrace......................................... 100
Hình 3.14 Tỷ lệ tạo phôi và chất lượng phội TTON, NBVT..................................... 101
Hình 3.15 Phơi nang lợn ngày 7 được nhuộm cho thấy sự khác biệt lớn
giữa phôi trong ống nghiệm và phôi phát triển tự nhiên trong
cơ thể lợn cái 103


1
MỞ ĐẦU
Phát triển công nghệ sinh học sinh sản với sự bùng nổ các thành tựu mới về cấy
chuyển phôi, thụ tinh ống nghiệm (TTON), nhân bản vơ tính (NBVT), bảo quản lạnh
tế bào sinh sản và phôi, sự giao thoa giữa công nghệ sinh sản và các liệu pháp công
nghệ di truyền trên tế bào sinh sản đã và đang mở ra những tiềm năng ứng dụng to
lớn trong các lĩnh vực cải tiến năng suất vật nuôi, đảm bảo an ninh lương thực, bảo
tồn và khai thác đa dạng sinh học (ĐDSH), cân bằng sinh thái và phát triển công nghệ
y dược hiện đại.
Lợn là một trong các đối tượng quan trọng nhất của công nghệ sinh học. Ngồi
mục đích cung cấp thực phẩm cho con người, lợn còn là một trong những nhân tố trong
hệ thống bảo tồn đa dạng sinh học và có triển vọng ứng dụng lớn trong y học. Lợn cũng
là loài động vật có kích thước các cơ quan nội tạng tương đồng với các cơ quan của
người, có hệ gen, q trình sinh lý học, thể chất và hệ miễn dịch gần giống với người, vì
vậy lợn được xem là đối tượng khả thi nhất được lựa chọn cho hướng nghiên cứu cấy
ghép tạng khác loài (xenotransplantation). Năm 2009, các nhà khoa học đã tạo ra các tế
bào gốc cảm ứng đa năng ở lợn (induced pluripotent stem cell-iPS) với hầu hết các đặc
điểm giống với tế bào gốc phôi người và tế bào iPS của người. Năm 2018, các nhà
nghiên cứu của đại học Missouri cũng cho biết đã tạo được các cá thể lợn có hệ miễn
dịch suy yếu làm mơ hình cấy ghép tế bào gốc khơng bị đào thải. Kết quả này giúp cho
các nghiên cứu liệu pháp tế bào gốc tiến về phía trước nhanh hơn.

Việt Nam là nơi có nhiều giống lợn bản địa như lợn Ỉ, Bản, Cỏ, Mẹo, Mường
Khương … ít bị ảnh hưởng bởi quá trình lai tạo giống do được chăn thả tự nhiên ở
các vùng núi cao. Do khả năng tồn tại các cá thể không mang bản sao PERVs
(Porcine Endogenous Retroviruses-là virus nội sinh có sẵn trong bộ gen lợn từ thời cổ
xưa. Các virus này được tìm thấy trong DNA của lợn, mặc dù ở trạng thái bất hoạt,
chúng có thể hoạt động trở lại khi lây nhiễm sang loài khác) lợn Bản đang được đánh
giá là đối tượng tiềm năng quan trọng đối với công nghệ cấy ghép mơ tạng khác lồi
(xenotranspantation), là nguồn gen q cần được bảo tồn và phát triển [1] [2].
Tuy nhiên, cho đến nay các nghiên cứu và ứng dụng tiến bộ công nghệ sinh học
sinh sản vẫn chỉ được tiến hành chủ yếu trên các giống lợn ngoại, các nghiên cứu
tương tự vẫn chỉ mới được bắt đầu trên các giống lợn bản địa.
Các kết quả nghiên cứu tạo phôi các giống lợn mini bản địa tại Việt Nam đã được


2
một số tác giả công bố cho thấy một thực tế chưa được khắc phục đó là sự phát triển
phơi in vitro ở lợn bản địa vẫn còn thấp hơn rất nhiều so với các kết quả thu được trên
các giống lợn ngoại. Sự thành thục chưa hoàn toàn của trứng, môi trường nuôi trứng
và phôi chưa tối ưu cùng những tác động khác trong quá trình thụ tinh và nhân bản
được cho là nguyên nhân cơ bản làm chohiệu suất tạo phơi in vitro ở lợn nói chung,
lợn bản địa nói riêng cịn thấp.
Vì vậy chúng tơi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu nuôi thành thục trứng và tạo
phôi lợn bản địa Việt Nam bằng kĩ thuật in vitro”. Mục tiêu:

Nghiên cứu được tiến hành trên mơ hình lợn Bản là giống lợn bản địa được
đánh giá có ưu việt về số lượng bản sao PERV thấp với các mục tiêu:

3.

1.

Xác định được tiềm năng khai thác trứng của buồng trứng lợn Bản.

2.

Xác định được các điều kiện nuôi thành thục trứng lợn Bản.

Thiết lập thành công hệ thống tạo phơi lợn Bản có hiệu quả cao bằng cơng

nghệ TTON và NBVT
Dựa trên các nội dung nghiên cứu
1.

Nghiên cứu đặc điểm hình thái buồng trứng và tiềm năng khai thác trứng ở

lợn Bản theo mùa.
2.

Nghiên cứu nuôi thành thục trứng lợn Bản bằng phương pháp chuẩn hóa

mơi trường ni.
3.
Nghiên cứu nâng cao hiệu quả hệ thống tạo phôi lợn Bản TTON
thông qua
môi trường thụ tinh, điều kiện thụ tinh và ni phơi.
4.

Nghiên cứu hồn thiện hệ thống tạo phơi lợn Bản NBVT.

Tính mới của luận án
1. Luận án đã cung cấp các thông tin mới về ảnh hưởng của mùa vụ,
môi
trường nuôi thành thục trứng, môi trường và chế độ thụ tinh, nuôi phôi và bảo quản
lạnh phôi TTON tạo phôi NBVT bằng cấy nhân khác giống làm cơ sở thiết lập thành
công hệ thống tạo phôi lợn Bản có hiệu quả cao, có thể phát triển nhằm mục đích bảo
tồn đa dạng sinh học.


2.
Là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về sử dụng hệ thống Piezo để tạo
phôi


3
NBVT trên đối tượng lợn.
Hiện nay các giống lợn địa phương đang đối mặt với nguy cơ tuyệt chủng, số
lượng lợn bản địa thuần đã bị giảm đi nghiêm trọng và có nguy cơ mất giống do sự
lai tạp giao thoa với các giống lợn khác và nguy cơ gia tăng nhanh tỷ lệ đồng huyết
do tự phối giống trong cùng bầy đàn. Hơn nữa phương thức chăn nuôi lạc hậu, khơng
kiểm sốt được những đe dọa về dịch bệnh, đã góp phần làm giảm số lượng cá thể
các giống lợn này.
Việc xây dựng thành công hệ thống nuôi trứng và tạo phôi trên giống lợn bản
địa tại Việt Nam sẽ góp phần hỗ trợ nhiệm vụ bảo tồn đa dạng sinh học, nâng cao
hiệu quả chăn nuôi và khai thác giá trị nguồn gen các giống lợn này phục vụ các
nghiên cứu y-sinh học.


4
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. Cấu tạo buồng trứng, sự thành thục trứng, q trình thụ tinh và phát triển
phơi in vivo ở lợn
1.1.1. Cấu tạo buồng trứng và sự thành thục in vivo trứng lợn
Buồng trứng là một bộ phận của cơ quan sinh dục cái, có chức năng tạo tế bào
trứng (giao tử cái-nỗn bào). Khơng giống như tinh hoàn, buồng trứng nằm trong
xoang bụng, sau thận, dưới đỉnh và trước khung xương chậu. Buồng trứng ở các loài
gia súc là một tổ chức kép, mỗi cá thể cái có hai buồng trứng gắn với hai đầu sừng tử
cung (buồng trứng phải và buồng trứng trái).
Buồng trứng của phần lớn động vật có vú gồm có hai miền, miền tủy bên trong
và miền vỏ bên ngoài. Miền tủy có nhiều mạch máu, thần kinh và mơ liên kết. Miền
vỏ gồm các tế bào và các lớp mơ có chức năng tạo tế bào trứng, tổng hợp các
hormone progesterone và estrogen. Phía ngồi cùng của miền vỏ là một lớp tế bào lập
phương tạo thành lớp biểu mô bao phủ toàn bộ bề mặt buồng trứng. Ngay bên dưới
biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mơ kiên kết. Phía dưới lớp này là nhu
mơ chứa các nang trứng và các tế bào chức năng khác [3].
Miền vỏ buồng trứng chứa nang ở các giai đoạn phát triển khác nhau gồm nang
nguyên thủy, nang sơ cấp, nang thứ cấp và nang trứng thành thục (hình 1.1). Nang
trứng là đơn vị cấu trúc cơ bản của buồng trứng, có chức năng duy trì q trình phát
triển trứng (oogenesis), bảo đảm khả năng thụ tinh và hình thành phơi của chúng [3].
Trong q trình phát triển nang (folliculogenesis), nang khơng có xoang di
chuyển từ ngoại vi vào trung tâm buồng trứng, tạo thành nang có xoang, phát triển
tiếp thành nang trứng thành thục và di chuyển lại bề mặt buồng trứng để chuẩn bị cho
sự rụng trứng. Tế bào cận noãn của trứng trong các nang thứ cấp tiết ra dịch, phát
triển và tách rời, từ đó hình thành nang có xoang. Tế bào trứng tiếp tục phát triển cho
đến khi thành thục và được giải phóng khỏi buồng trứng (sự rụng trứng). Các hoạt
động tổng hợp các thành phần của tế bào chất, sắp xếp và giảm số lượng nhiễm sắc
thể liên kết chặt chẽ với nhau trong q trình này để đảm bảo sự tích hợp đồng thời
sự thành thục nhân và thành thục tế bào chất [4].

5

Trứng sơ cấp

Mạch
máu

Bạch thể

Thể vàng

Thể vàng giai
đoạn sớm

Giải
phóng
trứng

Hình 1.1. Cấu trúc buồng trứng và sự phát triển nang, trứng ở động vật có vú [5].
Ở

lợn, các tế bào mầm nguyên thủy xuất hiện vào ngày 18 sau thụ tinh và tuyến

sinh dục bắt đầu hình thành vào giai đoạn phơi 24-26 ngày tuổi. Sau khi sinh, mỗi cá
thể lợn cái có khoảng 500.000 nang nguyên thủy gồm một tế bào trứng được bao
quanh bởi một lớp tế bào cận noãn [6]. Ước tính thời gian để nang nguyên thủy phát
triển thành nang thứ cấp là 84 ngày và sau đó cần thêm 19 ngày để đạt được đến giai
đoạn nang thành thục [7]; [8].
Các giai đoạn phát triển của nang liên quan chặt chẽ với sự gia tăng kích thước

và sự thành thục của trứng (Hình 1.2). Trong giai đoạn đầu, kích thước của nang và
của tế bào trứng có sự biến đổi song song và tuyến tính. Ở các giai đoạn tiếp sau, tế
bào trứng bước vào quá trình phân chia giảm phân và đạt kích thước gần như tối đa,


kích thước của trứng khơng đổi nhưng kích thước nang tiếp tục tăng trưởng [9].
Đường kính tế bào trứng tăng từ khoảng 30 µm đến 120 µm và trứng hồn thành quá
trình tăng trưởng trong các nang 1,8 mm. Trứng lợn ở giai đoạn này có hình cầu,
đường kính trứng khơng màng sáng dao động trong khoảng 120-170 µm [10].


6

84 ngày

14 ngày

19 ngày

Trước khi
rụng trứng

Đường kính
trứng
Đường kính
nang và sự
phát triển

Nang hình

thành

Hình 1.2. Sự phát triển của nang, tế bào trứng lợn thơng qua q trình giảm phân [8].
Q trình phát triển của trứng (oogeneisis) từ khi hình thành đến khi thành thục,
có khả năng thụ tinh trải qua các giai đoạn biến đổi về hình thái và chức năng, phân
chia giảm nhiễm đặc trưng cho các loài động vật có vú [11].
Giai đoạn tăng số lượng nỗn ngun thủy diễn ra khi cá thể cái chưa thành
thục về tính, bắt đầu từ ngày thứ 13 sau thụ tinh cho đến ngày thứ 7 sau khi sinh.
Noãn nguyên thủy gồm một tế bào trứng (ovocyt I) được bao bọc bởi lớp tế bào nang
mỏng, dẹt được sinh ra từ biểu mơ mầm của bào thai. Số lượng nỗn ngun thủy
được tăng lên do quá trình phân chia nguyên phân lặp lại liên tiếp nhiều lần, các nỗn
bào được hình thành ở giai đoạn này đều mang bộ nhiễm sắc thể 2n.
Giai đoạn sinh trưởng với đặc điểm các noãn nguyên thủy tích lũy chất dinh
dưỡng, tăng kích thước và khối lượng, phát triển thành các noãn bào sơ cấp và noãn bào
cấp I. Tất cả các tế bào này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n. Nỗn sơ cấp của lợn bao gồm
một ovocyt I có đường kính khoảng 30-60 µm, nhân to, có hạt dự trữ Balliani, bên ngồi
được bao bọc bởi một lớp tế bào nang mỏng. Noãn thứ cấp gồm một ovocyt

I đã phát triển lớn hơn và chứa nhiều nỗn hồng. Vỏ của ovocyt I dày lên tạo thành
màng trong suốt, có nhiều lớp tế bào bao quanh. Ovocyt I có đường kính khoảng 120150 µm [12].
Giai đoạn hình thành trứng khi nỗn bào cấp I trải qua hai lần phân bào giảm phân
liên tiếp để tạo một trứng và ba cực cầu đều chứa bộ nhiễm sắc thể đơn bội 1n. Ở