Nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất chế phẩm chondroitin sulfate từ sụn chân gà

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HỒI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME
TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CHÂN GÀ

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội, 2021


BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP

NGUYỄN THỊ HỒI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME
TRONG SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
CHONDROITIN SULFATE TỪ SỤN CHÂN GÀ
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm
Mã số

: 8540101

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. Trương Hương Lan
Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS. Hồ Tuấn Anh

Hà Nội, 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn đều mang
tính khách quan, trung thực và chính xác.
Do vốn kiến thức cịn hạn chế nên luận văn này không tránh khỏi các thiếu
sót, tơi thực sự rất mong nhận được sự thơng cảm và chỉ bảo tận tình của các Thầy,
Cơ và các bạn bè, đồng nghiệp sau khi đọc luận văn này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2021
HỌC VIÊN

NGUYỄN THỊ HỒI

i


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành xong luận văn này và có được kết quả như trên tơi đã nhận
được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ, các anh chị, bạn bè, các đồng nghiệp và
những người thân yêu trong gia đình tơi.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Trương
Hương Lan, PGS.TS. Hồ Tuấn Anh các thầy cô đã trực tiếp hướng dẫn, động viên,
quan tâm và tạo mọi điều kiện giúp đỡ, chỉ bảo tơi trong suốt q trình thực hiện
và hồn thành ḷn văn nghiên cứu này.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên Khoa
Công nghệ thực phẩm – Đại học kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp đã tạo mọi điều
kiện tḥn lợi cho tơi trong q trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin cảm ơn các anh chị giảng dạy, làm việc tại Bộ môn dinh dưỡng và thực

phẩm - Viện Công nghiệp thực phẩm đã giúp đỡ tơi trong suốt q trình thực hiện
ḷn văn. đã tại tạo điều kiện cho tôi thực hiện luận văn nghiên cứu này.
Xin cảm ơn tập thể lớp cao học cơng nghệ thực phẩm khóa 2019-2021, các
bạn đồng nghiệp, gia đình và người thân đã đợng viên, khích lệ và giúp đỡ tơi hồn
thành tốt khóa học này.
Hà Nội, tháng 5 năm 2021
HỌC VIÊN

NGUYỄN THỊ HỒI

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ................................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ ............................................................................. viii
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................2
1.1. Giới thiệu về Chondroitin Sulfate (CS) ........................................................................... 2
1.1.1. Khái niệm: ..................................................................................................................2
1.1.2. Phân loại Chondroitin Sulfate (CS) .........................................................................2
1.1.3. Cấu trúc của Chondroitin Sulfate (CS) ...................................................................4
1.1.4. Tầm quan trọng của Chondroitin Sunfate đối với con người ...............................6
1.2. Các phương pháp hỗ trợ quá trình trích ly từ sụn chân gà ............................................. 7
1.2.1. Phương pháp hóa học và phương pháp vật lý ........................................................7
1.2.2. Phương pháp sử dụng enzyme .................................................................................7
1.3. Giới thiệu chung về hệ enzyme protease ......................................................................... 9
1.3.1. Khái quát về protease ................................................................................................9

1.3.2. Phân loại protease......................................................................................................9
1.3.3. Cơ chế xúc tác của enzyme protease .....................................................................11
1.3.4. Các ứng dụng phổ biến của hệ enzyme protease .................................................11
1.4. Ứng dụng của hệ enzyme protease trong sản xuất Chondroitin Sulfate..................... 12
1.5. Các phương pháp tinh chế Chondroitin Sulfate............................................................ 16
1.6. Cô đặc dịch chiết CS bằng các thiết bị cô chân không................................................. 17
1.6.1. Khái niệm về cô đặc ................................................................................................18
1.6.2. Các phương pháp cô đặc.........................................................................................18
1.7. Phương pháp sấy chân không ......................................................................................... 19
1.7.1. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động.............................................................................19
1.7.2. Các thiết bị sấy chân khơng....................................................................................21
1.8. Tình hình nghiên cứu và sử dụng Chondroitin Sulfate trên thế giới và Việt Nam.... 24

iii


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...26
2.1. Đối tượng nghiên cứu ...................................................................................................... 26
2.1.1. Nguyên liệu ..............................................................................................................26
2.1.2. Hóa chất và dụng cụ máy móc, thiết bị .................................................................26
2.2. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................... 27
2.3. Phương pháp nghiên cứu và bố trí thí nghiệm .............................................................. 28
2.3.1. Nghiên cứu ứng dụng enzym trong thủy phân sụn chân .....................................28
2.3.2. Nghiên cứu xác định phương pháp lọc dịch Chondroitin Sulfate sụn chân gà ......31
2.3.3. Nghiên cứu xác định phương pháp sấy thu hồi chế phẩm Chondroitin Sulfate32
2.5. Phương pháp phân tích .................................................................................................... 33
2.5.1. Xác định hàm lượng Chondroitin Sulfate ............................................................33
2.5.2. Phương pháp phân tích hóa lý khác.......................................................................34
2.5.3. Phương pháp phương pháp vi sinh vật ..................................................................34
2.5.4. Phương pháp phân tích kim loại nặng ...................................................................34

2.6. Phương pháp tính tốn và xử lý số liệu.......................................................................... 34
2.6.1 Phương pháp toán học .............................................................................................34
2.6.2. Phương pháp xử lý số liệu ......................................................................................35
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................36
3.1. Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình thủy phân sụn chân gà
bằng enzyme để tạo dịch chiết giàu Chondroitin Sulfate .................................................. 36
3.1.1. Xác định loại chế phẩm enzyme protease thương mại thích hợp cho quá trình
trích ly Chondroitin Sulfate từ sụn chân gà ....................................................................36
3.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp lọc thích hợp ..................................................... 42
3.3. Xác định các điều kiện thích hợp của q trình cô đặc chân không dịch chiết giầu
Chondroitin Sulfate ................................................................................................................ 43
3.4. Xác định phương pháp và điều kiện sấy thích hợp để thu hồi chế phẩm Chondroitin
Sulfate ....................................................................................................................................... 44
3.4.1. Xác định phương pháp sấy thích hợp để thu hồi chế phẩm Chondroitin Sulfate 44

iv


3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ sấy chân không thích hợp để thu nhận chế phẩm
Chondroitin Sulfate............................................................................................................45
3.4.3. Nghiên cứu xác định áp suất sấy chân khơng thích hợp để thu hồi chế phẩm
Chondroitin Sulfate............................................................................................................46
3.4.4. Nghiên cứu xác định thời gian sấy chân khơng thích hợp để thu hồi chế phẩm
Chondroitin Sulfate............................................................................................................47
3.5. Xác định chất lượng chế phẩm Chondroitin Sulfate .................................................... 49
3.5.1. Xác định các chỉ tiêu hóa lý của các chế phẩm Chondroitin Sulfate .................49
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................51

v

DANH MỤC TỪ CHỮ VIẾT TẮT
STT

Ký hiệu

Giải nghĩa

1

CS

Chondroitin Sulfate

2

GAG

Glycosaminoglycan

3

GalNAc

N-acetyl-D-galactosamine

4

GlcA

D-glucuronic acid

5

PG

Proteoglucan

6

Core protein

Protein lõi

7

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

8

TCA

axit trichloroacetic

9

CK

Chân không

10

CPC

Cetylpyridium chloride

11

CTAB

Cetyltrimethyl-amnonium bromide

12

KPH

Không phát hiện

13

EDTA

axit aminopolycarboxylic

vi


DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 1. 1. Tỷ lệ CS ∆Di – 4S/∆Di-6S từ khí quản vịt với alkal, enzyme và nhiệt độ............ 15

Bảng 2. 1.Các thông số công nghệ của quá trình thủy phân sụn chân gà bằng các
loại chế phẩm enzyme protease khác nhau .......................................................... 29
Bảng 2. 2. Bảng nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất và nhiệt độ của phương pháp
cô đặc chân không tới hiệu suất thu hồi dịch CS sau cô đặc ............................... 31
Bảng 2. 3. Thiết bị sấy và các điều kiện sấy tương ứng ...................................... 32
Bảng 2. 4. Xác định định lượng Chondroitin Sulfate bằng methylen blue .......... 34
Bảng 3. 1. Ảnh hưởng của các loại chế phẩm enzyme protease tới hiệu suất ..... 36
Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các phương pháp lọc đến hiệu suất thu hồi CS ......... 42
Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của các phương pháp lọc đến hàm lượng CS trong bột chiết
sụn chân gà thu được sau khi lọc, cô đặc và sấy khô. .......................................... 43
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của áp suất và nhiệt độ cô đặc chân không tới hiệu suất thu
hồi CS trong dịch cô đặc ...................................................................................... 44
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của các loại thiết bị sấy đến hiệu suất thu hồi CS ........... 45
Bảng 3. 6. Ảnh hưởng nhiệt độ sấy chân không tới hiệu suất thu hồi CS. ............... 46
Bảng 3. 7. Ảnh hưởng áp suất sấy chân không tới tới độ ẩm và hiệu suất thu hồi
CS sụn chân gà ..................................................................................................... 47
Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của thời gian sấy chân không tới độ ẩm và hiệu suất thu hồi
Chondroitin Sulfate sụn chân gà. ......................................................................... 48
Bảng 3. 10. Các chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm CS từ sụn chân gà qua 3 mẻ sản xuất
khác nhau.............................................................................................................. 49
Bảng 3.11. Xác định vi sinh vật và hàm lượng kim loại nặng của chế phẩm
Chondroitin Sulfate .............................................................................................. 49

vii


DANH MỤC CÁC HÌNH, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của các loại CS............................................................. 3

Hình 1.2. Các dạng đồng phân và cơng thức cấu tạo của CS ................................ 3
Hình 1. 3 Liên kết giữa chuỗi GAG và protein lõi ................................................ 6
Hình 1. 4. Sơ đồ phân loại protease ..................................................................... 10
Hình 1. 5. Cơ chế xúc tác của protease ................................................................ 11
Hình 1. 6. Hiệu suất trích ly CS từ sụn khí quản vịt bằng enzyme Papain. ......... 13
Hình 1. 7. Hiệu suất trích ly CS từ sụn khí quản vịt bằng enzyme Papain. ......... 14
Hình 1. 8. Mơ hình máy sấy chân khơng và ngun lý hoạt đợng....................... 20
Hình 1. 9. Tủ sấy chân khơng .............................................................................. 21
Hình 1. 10. Sơ đồ cấu tạo thùng sấy chân khơng có cánh đẩy ............................. 22
Hình 1. 11. Sơ đồ thiết bị sấy chân khơng liên tục .............................................. 23
Hình 1. 13. Sơ đồ hệ thống sấy phun chân khơng................................................ 24
Hình 2. 1. Ngun liệu chân gà cho sản xuất CS ................................................. 26
Hình 2. 2 Bóc tách phần sụn chân gà ................................................................... 28
Hình 3. 1. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu: nước tới hiệu suất trích ly CS từ sụn chân
gà. ........................................................................................................................................38
Hình 3. 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme/nguyên liệu tới hiệu suất trích ly CS ... 39
Hình 3. 3. Ảnh hưởng của nhiệt đợ thủy phân tới hiệu suất trích ly CS từ sụn chân gà.
.............................................................................................................................. 40
Hình 3. 4. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân tới hiệu suất trích ly................... 41

viii


MỞ ĐẦU
Theo thống kê của ngành xương khớp Việt Nam hiện nay tỉ lệ người mắc
các chứng bệnh về xương khớp chiếm 35% dân số, trong đó lứa tuổi từ 50 đến 70
chiếm 70%. Trong độ tuổi từ 25 đến 45 tuổi cứ 100 người thì có 27 người bị đau
lưng, 20 người bị đau vai, 8 người bị đau khớp và 3 người bị viêm khớp. Việt Nam
đang trở thành mợt trong những nước có tốc đợ già hóa dân số nhanh nhất thế giới
với 10,1 triệu người cao tuổi, chiếm 11%. Theo các chuyên gia, tuổi thọ con người

càng được nâng cao thì tỷ lệ mắc các bệnh cơ-xương-khớp cũng dần phổ biến hơn.
Chondroitin Sulfate (CS) là một hợp chất thiên nhiên tḥc nhóm
glycosaminoglycan (GAG) hay mucopolysacchride có khối lượng phân tử từ
10.000 - 100.000 Dalton, được tổng hợp ở cơ thể động vật bậc cao và tồn tại
trong mô liên kết. CS khi được uống vào cơ thể có chức năng tái tạo các mơ sụn
và xương, phụ trợ cho quá trình tổng hợp của cơ thể giúp phòng ngừa và hỗ trợ
điều trị các bệnh về xương khớp ở người lớn tuổi hoặc người vận động cơ bắp ở
mức đợ cao. Nó cũng là thành phần cần thiết để nuôi dưỡng tế bào giác mạc.
Trên thế giới CS thường được sản xuất từ các loại sụn của động vật, như sụn cá
mập, cá đuối, sụn mũi lợn, trâu, bò hoặc sụn ức gà…..Ở Việt Nam, nguồn nguyên
liệu CS cho sản xuất thực phẩm bảo vệ sức khỏe đang phải nhập ngoại hoàn toàn.
Theo thống kê năm 2017, đàn gia cầm cả nước đạt 385,46 triệu con và ước
tính đến năm 2020, số lượng gia cầm tăng lên khoảng 397,9 triệu con. Nguồn phụ
phẩm sau quá trình giết mổ, sản xuất thịt như xương, sụn, đặc biệt chân gà là rất
lớn, sẽ là một nguồn nguyên liệu phong phú cho ngành công nghiệp sản xuất CS.
Để đáp ứng nhu cầu sử dụng CS cho phòng chống bệnh cơ xương khớp, đồng thời
tận dụng được được nguồn phế phẩm sụn chân gà, tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu ứng dụng enzyme trong sản xuất chế phẩm Chondroitin Sulfate
từ sụn chân gà” với các mục tiêu:

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về Chondroitin Sulfate (CS)
1.1.1. Khái niệm:
Chondroitin Sulfate (CS) là một glycosaminoglycan gồm các đơn vị
disaccharide lặp lại của galactosamine và axit glucuronic thông qua các liên kết β
(1→4) hoặc β (1→3) (cụ thể là N-acetyl-D-galactosamine (GalNAc) và Dglucuronic acid (GlcA). GAG được tìm thấy có hàm lượng cao trong các mơ sụn,
nợi mạng lưới collagen bám trong các cơ chất vô định hình có chứa axit

glycoprotein hyaluronic (HA).
CS là mợt polyme có phân tử lớn gồm 15-150 đến 200 đơn vị cấu trúc 2
đường đơn của GlcA và GalNAc. Cơng thức hố học của CS: (C14H21NO14S)n.
Khối lượng phân tử của CS thường biến động trong khoảng 10.000 - 100.000
Dalton. CS tinh khiết là chất bợt màu trắng hoặc trắng ngà, hịa tan tốt trong nước,
dễ hút ẩm, khơng hồ tan trong ethanol, methanol, cetone. Khối lượng phân tử của
CS nguyên liệu thường được sử dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe là thấp
hơn, khoảng 15.000 – 20.000 Dalton.
1.1.2. Phân loại Chondroitin Sulfate (CS)
Chondroitin có 3 loại chính là A, B và C (Hình 1.1) và 2 loại phụ là D và
E, chúng đặc trưng bởi số lượng và vị trí của nhóm Sulfate trong nhóm
disaccharide lặp lại của chuỗi polysaccharide.
- CS A: gốc Sulfate gắn ở vị trí C-4 (GlcA-GalNAc-4S: chondroitin-4Sulfate, viết tắt là CS4 hoặc CS-A), có nhiều ở mơ sụn.
- CS B: acid iduronic thay thế acid glucuronic (IdoA-GalNAc-4S), viết tắt
là CS4 hoặc CS-B. Tên cũ của nó là dermatan Sulfate thường có nhiều ở da, cịn
thấy có ở van tim, gân, thành mạch. Vị trí bị Sulfate hố ở C-4 của GlcNAc và C5 của glucuronic acid bị epime hoá thành iduronic acid.

2


Hình 1.1. Cấu tạo phân tử của các loại CS
- CS C: gốc Sulfate gắn ở vị trí C-6 (GlcA-GalNAc-6S: chondroitin-6Sulfate, viết tắt là CS6 hoặc CS-C, phổ biến hơn hai loại trên).
- CS D: gốc Sulfate gắn ở vị trí carbon 2 của axit glucuronic and 6 của
GalNAc. Chondroitin-2,6-Sulfate (C2, S6).
- CS E: gốc Sulfate gắn ở vị trí Carbons 4 và 6 của GalNAc. Chondroitin4,6-Sulfate (C4, S6).
Loại A và B (CS4) thường được tìm thấy ở sụn đợng vật có vú (bị và lợn),
ngược lại loại C (CS6) được tìm thấy chủ yếu ở các lồi cá sụn (cá mập, cá đuối…).
Tuy nhiên, CS từ các nguồn nguyên liệu khác nhau rất đa dạng về cấu trúc và kích
thước, chúng chứa ở mức đợ nhiều hay ít các isome CS, có tới 16n-isome của CS,
do phụ tḥc vào sự thay đổi vị trí Sulfate hố của các cặp đường đơi tạo nên 16

isome/mỗi cặp. Trong đó, CS-A và CS-C là những thành phần chủ yếu hình thành
các Proteoglucan (PG).

Hình 1.2. Các dạng đồng phân và cơng thức cấu tạo của CS
CS với các disacarit khác nhau và khung carbohydrate tổng thể có thể được
sinh tổng hợp và có số lượng và vị trí khác nhau của các nhóm Sulfate (Hình 1.2).

3


Do đó, CS là mợt GAG khơng đồng nhất được hình thành từ các disacarit sunfate
xen kẽ và khác nhau của GlcA và GalNAc được liên kết bởi các liên kết β (13).
Hơn nữa, các disacarit khác nhau được liên kết với nhau bằng liên kết (14). CSA
và CSC được cấu thành bởi các disacarit sunfate ở vị trí C4 hoặc C6 của dư lượng
GalNAc, tương ứng, và có thể có tỷ lệ phần trăm nhỏ của disacarit monoSulfated
trên C2 của GlcA. Bên cạnh sự hiện diện chính của hai loại disacarit monoSulfated
này ở vị trí C4 hoặc C6 của GalNAc, các disacarit với số lượng và vị trí khác nhau
của các nhóm Sulfate có thể có mặt, với tỷ lệ phần trăm khác nhau, trong các chuỗi
carbohydrate. Các loại khác nhau của disacarit đã được disulfit hóa có thể có mặt
trong cấu trúc CS với số lượng khác nhau cũng liên quan đến các nguồn động vật
cụ thể (như ở sụn cá hoặc xương), chẳng hạn như disacarit diSulfated ở vị trí C2
của GlcA và C6 của GalNAc (được gọi là disacarit D), ở vị trí C4 và C6 của
GalNAc (disacarit E) hoặc C2 của GlcA và C4 của GalNAc (disacarit B) (Hình
1.2). Cuối cùng, mợt tỷ lệ phần trăm nhỏ của disacarit khơng sunfate hầu như ln
có trong khung CS trong khi disacarit tri-sunfate là ở dạng vết.
1.1.3. Cấu trúc của Chondroitin Sulfate (CS)
Trong tự nhiên, cấu trúc phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, đa phần nhóm
-OH ở vị trí carbon 4 và 6 của GalNAc được Sulfate hố, đối với mợt số chuỗi
GAG khác thì ở vị trí 2 của GlcA. Q trình Sulfate hoá là nhờ các enzym
sulfotransferase đặc hiệu. Việc Sulfate hoá ở các vị trí khác nhau tạo nên hoạt tính

sinh học đặc thù của CS. Do vậy, cho tới nay chưa thu nhận được CS bằng con
đường tổng hợp hoá học, mà mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharide
ngắn có trình tự giống mợt đoạn mạch CS như mợt số CS tetrasaccharide (4 gốc
đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hố của neron thần kinh,
cịn phân tử disaccharide thì khơng có tác dụng trên. Vì thế, cho tới nay các CS
chỉ được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên. Những năm trước đây, CS
được tinh chế chủ yếu từ sụn vây cá mập, sụn cá đuối, do đó giá thành rất cao và
có thể gây hại cho hệ sinh thái biển. Cho nên, đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới

4


nhằm tách chiết CS từ da cá, sụn của bò, lợn, đặc biệt là sụn lưỡi hái, chân gà và
khí quản vịt…
Trước đây, các loài cá sụn (Chondrichthyes) như cá mập, cá đuối là những
lồi đợng vật có xương sống nhưng bợ xương chứa hồn tồn sụn cả khi ở tuổi
trưởng thành là nguồn nguyên liệu sụn đắt tiền, nhưng có chứa hàm lượng CS cao,
thường được sử dụng để sản xuất CS trên thế giới. Hàm lượng CS thu được từ sụn
vây cá mập hoặc khí quản cá sấu là 18% (chất khô), nhỏ hơn 23% trong sụn xương
ức cá sấu, và đặc biệt là 30% trong sụn xương móng cá sấu và sụn ức gà. Điều này
cho thấy sụn ức gà là một loại phụ phẩm thải ra trong q trình chế biến gà fillet
có thể trở thành mợt ngun liệu rẻ tiền cho q trình sản xuất CS nhằm thay thế
cho các loại nguyên liệu truyền thống quý hiếm và đắt tiền từ sụn vây cá mập hoặc
sụn cá sấu….[4] Ngồi ra, trong khí quản vịt cũng có 3,6% CS và trong sụn chân
gà có khoảng 2,5% CS cũng là các nguồn nguyên liệu sẵn có để sản xuất CS.
CS gắn với các protein bằng liên kết O-glycosid tạo thành một proteoglycan
(PG) (hay glucoprotein), là hợp chất hữu cơ tḥc nhóm mucopolysaccharide.
Phân tử PG của mơ sụn (chứa khoảng 80 - 100 mạch CS) gắn kết cùng với protein
và acid hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ đợng học vững chắc. Sự kết hợp
giữa nhóm Sulfate (SO42-) của gốc đường với các nhóm carboxyl (-COO-) của gốc

đường axit làm cho phân tử CS có mật đợ điện tích âm rất cao (anion
polysaccharide) dễ dàng liên kết đồng hoá trị với các protein trong cấu trúc PG.
Chuỗi CS được gắn với nhóm -OH của gốc serine ở mợt số protein. Tuy
nhiên, các protein gắn chọn lọc chính xác như thế nào với GAG vẫn chưa được
làm sáng tỏ. GAG được tổng hợp trong mạng lưới nội bào và trong thể Golgi.
Theo hình 2 sự gắn kết của chuỗi GAG và protein lõi được bắt đầu với các gốc
đường đơn theo phương thức cố định là Xyl-Gal-Gal-GlcA; xylose được gắn với
phân tử serine của protein lõi trong mạng lưới nợi bào, cịn các phân tử đường
khác được gắn trong hệ Golgi.

5


Hình 1. 3 Liên kết giữa chuỗi GAG và protein lõi
1.1.4. Tầm quan trọng của Chondroitin Sunfate đối với con người
Ở cơ thể người, Chondroitin Sunfate là thành phần được tìm thấy ở sụn
khớp, xương, da, giác mạc mắt và thành các đợng mạch.
Các phân tử GAG (trong đó có CS) có chức năng tạo cấu trúc và điều khiển
trong cơ thể sống. Về cấu trúc, nó là thành phần chính của mơ sụn. CS có mặt
trong các tổ chức gân, cơ, dây chằng… tạo sự vận động linh hoạt và tính đàn hồi
trong hoạt đợng khớp, tạo đợ bền khi bị nén ép. Về điều khiển, CS rất dễ gắn kết
với protein trong mô tế bào, mối quan hệ này rất quan trọng cho việc điều hồ các
hoạt đợng của tế bào. Các liên kết cợng hóa trị CS và protein lõi tạo ra phân tử PG
của mô sụn (chứa khoảng 80-100 mạch CS) cùng với protein gắn kết với acid
hyaluronic tạo thành một phức hệ thuỷ động học có khả năng nén thuận nghịch rất
cần thiết cho sụn để chống lại sức ép nén với biến dạng nhỏ nhất.
ình bày ở bảng 3.2 và 3.3.
Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các phương pháp lọc đến hiệu suất thu hồi CS
Phương pháp lọc thu hồi dịch

Hiệu suất thu hồi

Tính chất cảm quan

chiết giầu CS

CS (%)

của dịch chiết sau lọc

1. Dịch CS được lọc chân không

80,8±3,6

qua giấy lọc Whatman số 5
2. Dịch CS được xử lý than hoạt

70,2±2,5

tính Norit CN1 và lọc chân không
qua giấy lọc Whatman số 5.

Hơi đục, mầu vàng
nhạt
Trong suốt, mầu hơi
vàng

Các kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.2 cho thấy ảnh hưởng rất
khác nhau của 2 phương pháp lọc tới hiệu suất thu hồi CS trong dịch chiết, tính
chất cảm quan của dịch chiết sau lọc.

Trong đó, phương pháp lọc thứ 1 là dịch CS được lọc chân không qua giấy
lọc Whatman số 5 cho hiệu suất thu hồi CS từ dịch chiết đạt 80,8 %. Phương pháp
lọc thứ 2 là xử lý qua than hoạt tính Norit CN1 và lọc qua giấy lọc cho hiệu suất thu
hồi CS từ dịch chiết là 70,2 %. Điều này có thể được giải thích là do CS bị thất thoát
2 lần, lần thứ nhất khi được lọc qua than hoạt tính Norit CN1 và lần thứ 2 khi được
lọc giấy. Về màu sắc dịch chiết, phương pháp lọc thứ 2 cho màu trong suốt, hơi
vàng trong khi đó phương pháp lọc thứ nhất cho dịch hơi đục, màu vàng nhạt.

42


Bảng 3. 3. Ảnh hưởng của các phương pháp lọc đến hàm lượng CS trong bột
chiết sụn chân gà thu được sau khi lọc, cô đặc và sấy khô.
Phương pháp lọc thu hồi dịch

Hàm lượng CS được sau sấy khô

chiết giầu CS từ sụn chân gà

(%)

1. Lọc chân không qua giấy lọc
Whatman số 5.

15,8 ±0,894

2. Lọc xử lý than hoạt tính Norit CN1
và lọc chân khơng qua giấy lọc

21,8 ±0,645

Whatman số 5.
Các kết quả được trình bày ở bảng 3.3 cho thấy phương pháp lọc thứ nhất
cho chế phẩm có hàm lượng CS là 15,8% thấp hơn so với phương pháp lọc thứ 2
qua than hoạt tính Norit CN1 và qua giấy lọc Whatman số 5 là 21,8%. Điều này
có thể được giải thích là do than hoạt tính hấp thụ mợt lượng đáng kể các tạp chất
như khống và protein của dịch chiết làm cho dịch chiết được tinh khiết hơn dẫn
đến hàm lượng CS trong bột chiết sau quá trình sấy tăng lên.
Từ các kết quả thu được ở trên (bảng 3.2; 3.3): Phương pháp lọc qua than
hoạt tính Norit CN1 và giấy lọc cho hiệu suất thu hồi CS từ dịch chiết là 70,2 %;
dịch chiết trong suốt, hơi vàng; hàm lượng CS trong bột chiết là 21,8%.
3.3. Xác định các điều kiện thích hợp của quá trình cơ đặc chân khơng dịch
chiết giầu Chondroitin Sulfate
Trong nghiên cứu này lựa chọn phương pháp cô đặc chân không để thực
hiện cô đặc dịch chiết giầu CS lọc. Xác định ảnh hưởng nhiệt độ và áp suất cô đặc
chân không tới hiệu suất thu hồi dịch CS, hàm lượng CS trong dịch cơ đặc kết quả
được trình bày ở bảng 3.4.

43


Bảng 3.4. Ảnh hưởng của áp suất và nhiệt độ cô đặc chân không tới hiệu suất
thu hồi CS trong dịch cơ đặc
Các thơng số của q trình cơ đặc

Hiệu suất

Hàm lượng CS trong

chân không

thu hồi CS

dịch CS cô đặc

Nhiệt độ (0C)

Áp suất (mBar)

(%)

(%)

65

300

79,5 ± 2,1

32,0 ± 1,2

60

250

82,0 ± 3,0

48,5 ± 1,5

55

200

92,7 ± 3,8

55,6 ± 1,9

50

150

93,8 ± 3,6

59,5 ± 2,1

Nhìn chung, nhiệt độ cô đặc chân không tăng từ 500C đến 650C thì hiệu suất
thu hồi CS giảm tương ứng từ 93,8% xuống còn 79,5% và hàm lượng CS trong
dịch CS cơ đặc cũng giảm từ 59,5 g/l xuống cịn 32,0 g/l, tương ứng (Bảng 3.4).
Hàm lượng CS trong dịch cô đặc giảm, hiệu suất thu hồi giảm khi nhiệt đợ tăng
lên, có thể giải thích là nhiệt đợ tăng áp suất tăng, dịch chứa CS sôi, tạo thành bọt
khiến cho dịch bị tổn thất trong q trình cơ đặc.
Như vậy, lựa chọn phương pháp cô đặc chân không ở áp suất chân không
bằng 200 đến 250 mBar và nhiệt đợ từ 55-600C cho q trình cơ đặc dịch CS sụn
chân gà, cho hiệu suất thu hồi CS lớn từ 82,0-92,7%. Không lựa chọn nhiệt độ ở
500C với hiệu suất thu hồi cao nhất 93,8%, hàm lượng dịch CS trong dịch cô đặc
là 59,5 % do thời gian cô đặc kéo dài hiệu suất chênh lệch không lớn gây ra tổn
thất lớn về nhiên liệu.
3.4. Xác định phương pháp và điều kiện sấy thích hợp để thu hồi chế phẩm
Chondroitin Sulfate
3.4.1. Xác định phương pháp sấy thích hợp để thu hồi chế phẩm Chondroitin

Sulfate
Trong nghiên cứu này, tiến hành xác định loại thiết bị sấy thích hợp để thu
hồi chế phẩm CS sụn chân gà. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại thiết bị

44


sấy đối lưu, sấy chân không và sấy phun đến hiệu suất thu hồi chế phẩm CS sụn
chân gà được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3. 5. Ảnh hưởng của các loại thiết bị sấy đến hiệu suất thu hồi CS
Hiệu suất thu hồi CS
Loại thiết bị sấy

(%)

Sấy đối lưu (600C, sau 24h)

80,09 ±2,2

Sấy chân không (600C, sau 24h)

82,76 ±2,5

Sấy phun (1100C; tốc độ cấp liệu 250ml/h)

69,79 ±2,4

Các kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.5 cho thấy ảnh hưởng rất
khác nhau của các loại thiết bị sấy tới hiệu suất thu hồi CS sụn chân gà. Phương
pháp sấy chân không cho hiệu suất thu hồi đạt 82,76% lớn nhất trong các phương

pháp sấy. Ngược lại, phương pháp sấy phun cho hiệu suất thu hồi thấp nhất đạt
69,79% đáng kể so với phương pháp sấy đối lưu thu hồi CS là 80,09%. Điều này
có thể giải thích là do phương pháp sấy phun có nhiệt đợ cao 1100C, các hạt bột
nhẹ của sản phẩm bị hút theo quạt gió ra ngồi mợt phần đồng thời mợt phần bị
bám dính ở thành thiết bị sấy phun.
Theo Patent CN1699428A (2005) thì trong q trình sản xuất cơng nghiệp,
các tác giả Trung Quốc cũng đã sử phương pháp chân không để thu hồi CS từ dịch
chiết sụn gà. Trong Patent WO2007/122179, người ta cũng đã sử dụng phương pháp
sấy chân không cho quá thu hồi CS từ sụn gia cầm [8].
Do vậy, lựa chọn phương pháp sấy chân không cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.4.2. Nghiên cứu xác định nhiệt độ sấy chân khơng thích hợp để thu nhận
chế phẩm Chondroitin Sulfate
Trong nghiên cứu này, cố định điều kiện áp suất sấy chân không 150 mbar;
trong thời gian 12htiến hành xác định ảnh hưởng của nhiệt độ sấy chân không ở (40,
45, 50, 60, 650C) đến hiệu suất thu hồi CS.

45


Bảng 3. 6. Ảnh hưởng nhiệt độ sấy chân không tới hiệu suất thu hồi CS.
Nhiệt độ sấy chân

Độ ẩm

Hiệu suất thu

không (0C)

(%)

hồi CS (%)

40

8,4 ±0,28

84,56 ±2,5

45

8,1 ±0,27

83,85 ±2,5

50

5,1 ±0,20

82,79 ±2,5

55

5,0 ±0,19

81,18 ±2,4

60

4,9 ±0,18

86,06 ±2,6

65

4,7 ±0,17

68,35 ±2,1

Các kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.6 cho thấy, khi nhiệt đợ sấy
chân khơng tăng từ 400C đến 550C, thì hiệu suất thu hồi CS sụn chân gà giảm nhẹ
tương ứng từ 84,56% xuống cịn 81,18%. Trong khi đó, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ
sấy chân không từ 550C đến 650C, thì lại làm giảm rất mạnh hiệu suất thu hồi CS
sụn chân gà, tương ứng từ 81,18% giảm xuống thấp nhất là 68,35%. Điều này cho
thấy dịch chiết CS từ sụn chân gà bắt đầu bị cháy bám lên khay của thiết bị sấy chân
khơng, do đó khối lượng và hàm lượng CS của chế phẩm bị tổn thất.
3.4.3. Nghiên cứu xác định áp suất sấy chân khơng thích hợp để thu hồi chế
phẩm Chondroitin Sulfate
Cố định nhiệt độ sấy chân không dịch chiết sụn chân gà ở 500C thời gian
sấy 2h thay đổi áp suất sấy chân không từ 50, 100,150,200,250 và 300 mbar;
nghiên cứu xác định độ ẩm và hiệu suất thu hồi CS sau quá trình sấy. Kết quả trình
bày ở bảng 3.7

46


Bảng 3. 7. Ảnh hưởng áp suất sấy chân không tới tới độ ẩm và hiệu suất
thu hồi CS sụn chân gà
Áp suất sấy chân
không (mbar)

Độ ẩm (%)

Hiệu suất thu
hồi CS (%)

50

5,0 ±0.17

84,09 ±2.5

100

5,2 ±0.19

83,68 ±2.5

150

5,8 ±0.20

82,81 ±2.5

200

6,1 ±0.24

80,06 ±2.4

250

7,9 ±0.26

77,65 ±2.3

300

8,8 ±0.29

72,72 ±2.1

Kết quả ở bảng 3.7 cho thấy ở điều kiện áp suất chân khơng 50 mbar thì
hiệu suất thu hồi CS được tạo thành cao nhất 84,09%. Tuy nhiên ở điều kiện
phương pháp như vậy rất khó ứng dụng cho quá trình sản xuất lớn do nhiệt độ thấp
thời gian sấy kéo dài, tổn thất nhiên liệu lớn, hiệu suất thu hồi chênh lệch không
cao. Không sấy ở điều kiến áp suất cao hơn do độ ẩm của chế phẩm CS rất cao.
Do vậy lựa chọn điều kiện sấy ở 100mbar cho hiệu suất thu hồi đạt 83,68%,
độ ẩm 5,2% ở điều kiện nhiệt độ 500C trong thời gian 12h.
3.4.4. Nghiên cứu xác định thời gian sấy chân khơng thích hợp để thu hồi chế
phẩm Chondroitin Sulfate
Tiến hành sấy dịch chiết sụn chân gà cô đặc ở điều kiện nhiệt độ sấy chân
không ở 500C, áp suất sấy chân không 100 mbar cứ sau mỗi 4h trong khoảng thời
gian 4- 24h. Xác định độ ẩm và hiệu suất thu CS được thể hiện ở 3.8.

47


Bảng 3. 8. Ảnh hưởng của thời gian sấy chân không tới độ ẩm và hiệu suất
thu hồi Chondroitin Sulfate sụn chân gà.
Thời gian sấy chân không

Độ ẩm

Hiệu suất thu hồi CS

(h)

(%)

(%)

4

8,7 ± 0,26

84,18 ±2,52

8

8,2 ±0,24

83,99 ±2,52

12

6,2 ±0,19

83,68 ±2,51

16

5,0 ±0,15

82,55 ±2,47

20

4,8 ±0,14

79,98 ±2,39

24

4,5 ±0,13

75,29 ±2,26

Các kết quả thu được được trình bày ở bảng 3.8 cho thấy nhìn chung, khi
thời gian sấy chân không tăng từ 4h đến 16h đã ảnh hưởng mạnh tới hiệu suất thu
hồi CS sụn chân gà, biến đổi tương ứng từ 84,18% xuống còn 82,55%. Trong khi
đó, nếu tiếp tục tăng thời gian sấy chân khơng từ 16h lên đến 24h, thì lại làm giảm
rất mạnh hiệu suất thu hồi CS sụn chân gà, tương ứng từ 82,55% giảm xuống thấp
nhất là 75,29%. Điều này cho thấy dịch chiết CS sụn chân gà bắt đầu bị cháy khi
thời gian sấy kéo dài sau 20h.
Trong tài liệu Dược học Việt Nam yêu cầu đối với độ ẩm của nguyên liệu
sản xuất thực phẩm chức năng khi để trong mơi trường khơng khí nhỏ 8% là đảm
bảo, tuy nhiên chế phẩm CS dễ hút ẩm khi mang ra ngồi khơng khí, vì vậy người
ta thường sấy đạt đến độ ẩm 5% là đảm bảo.
Đối với độ ẩm, sau 16h, độ ẩm của chế phẩm đã đạt 5%, là cần thiết làm
cho nguyên liệu cho sản xuất thực phẩm chức năng.

Lựa chọn thời gian sấy chân không là 16h với áp suất sấy chân không 100
mbar trong điều kiện nhiệt độ ở 500C.

48


3.5. Xác định chất lượng chế phẩm Chondroitin Sulfate
Thí nghiệm với các kết quả thu được từ mục 3.1 đến 3.4, thu được chế phẩm
CS có các chỉ tiêu chất lượng ở bảng 3.10; bảng 3.11; bảng 3.12.
3.5.1. Xác định các chỉ tiêu hóa lý của các chế phẩm Chondroitin Sulfate
Bảng 3. 9. Các chỉ tiêu hóa lý của chế phẩm CS từ sụn chân gà qua 3 mẻ sản
xuất khác nhau
TT

Tính chất của
sản phẩm

Mẻ 1

Mẻ 2

Mẻ 3

Trung
bình

Chỉ tiêu hóa, lý
1

Độ ẩm (%)

5,0

5,1

5,0

5,03

2

CS (%)

21,5

21,8

22,6

21,96

Trắng ngà

Trắng ngà

Trắng ngà

Bột mịn

Bột mịn

Bột mịn

Chỉ tiêu cảm quan
1

Màu

2

Trạng thái

3

Mùi đặc trưng Mùi đặc
của sản phẩm trưng của
sản phẩm

Mùi

Mùi đặc
trưng của
sản phẩm

Bảng 3.10. Xác định vi sinh vật và hàm lượng kim loại nặng của chế phẩm
Chondroitin Sulfate
TT

Chỉ tiêu thử nghiệm

Mẻ 1

Mẻ 2

Mẻ 3

9 x101

8 x101

I. Chỉ tiêu Vi sinh vật
1

Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g)

7 x101

2

Số bào tử nấm men tổng số (CFU/g)

1,5x101 1,6x101 1,8x101

3

Clostridium perfringens (CFU/g)

KPH

KPH

KPH

4

Salmonella (CFU/25g)

KPH

KPH

KPH

5

Staphylococcus aureus (CFU/g)

KPH

KPH

KPH

49


TT

Chỉ tiêu thử nghiệm

Mẻ 1

Mẻ 2

Mẻ 3

II. Chỉ tiêu kim loại nặng
1

Hàm lượng Chì (Pb) (ppm)

KPH

KPH

KPH

2

Hàm lượng Cadimi (Cd) (ppm)

KPH

KPH

KPH

3

Hàm lượng Thủy ngân (Hg) (ppm)

KPH

KPH

KPH

4

Hàm lượng Asen (As) (ppm)

KPH

KPH

KPH

Kết quả bảng 3.10 cho thấy cả 3 chế phẩm CS của 3 mẻ sản xuất thử khác
nhau có đợ ẩm tương tự như nhau là: 5,0-5,1%; Hàm lượng CS của chế phẩm dao
động rất nhỏ trong giá trị từ 21,5 -22,6%.
Về cảm quan các chế phẩm CS đều có màu trắng ngà, ở trạng thái bợt mịn
và có mùi đặc trưng của sản phẩm.
Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy cả 3 mẻ có: Tổng số vi sinh vật hiếu khí, tổng
số bào tử nấm men, nấm mốc không khác nhau đáng kể. Các mẻ thí nghiệm khơng
phát hiện các vi sinh vật như: Clostridium perfringens; Salmonella;Staphylococcus
aureus. Không phát hiện kim loại nặng như: Chì, Cadimi, Thủy ngân, Asen.
Kết quả ở bảng 3.11 cho thấy chế phẩm CS ở cả 3 mẻ thí nghiệm đều đạt các
chỉ tiêu an tồn thực phẩm theo quyết định 46/2007/QĐ-BYT làm cho nguyên liệu
sản xuất thực phẩm chức năng.

50


CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
1. Đã xác định được chế phẩm enzym Papain SCIYU Biotech (Trung Quốc)
phù hợp cho q trình trích ly CS từ sụn chân gà.
2. Đã nghiên cứu điều kiện tốt nhất để thực hiện trích ly CS từ sụn chân
bằng enzymePapain SCIYU Biotech (Trung Quốc) cụ thể: tỷ lệ sụn so với nước
là 1:6w/v, tỷ lệ enzyme Papain so với sụn là 0,8%w/w, ở nhiệt độ 600C, trong thời
gian 12h; hiệu suất trích ly CS từ sụn chân gà đạt 90,6%.
3. Đã lựa chọn phương pháp xử lý bằng than hoạt tính Norit CN1 và lọc
chân khơng qua giấy lọc Whatman số 5 cho cho hiệu suất thu hồi CS từ dịch chiết
là 70,2 %;
4. Đã xác định được phương pháp cô đặc chân không ở áp suất chân không
bằng 200 đến 250 mBar và nhiệt độ từ 55-600C là thích hợp nhất cho q trình cơ
đặc dịch CS sụn chân gà, cho hiệu suất thu hồi CS lớn từ 82,0-92,7% và hàm lượng
CS trong dịch CS cô đặc từ 48,5-55,6 g/l.
5. Đã xác định được thiết bị sấy chân không với các thông số sấy chân
không ở nhiệt độ 500C và áp suất chân không 100 mbar, trong thời gian 16h là tối
ưu để thu hồi chế phẩm CS sụn chân gà có hàm lượng 21,8%w/w, đợ ẩm 5,0% và
có mầu trắng ngà và mùi thơm đặc trưng của sản phẩm.
6. Nghiên cứu thành công sản xuất chế phẩm CS quy mơ phịng thí nghiệm
(1kg/mẻ) từ sụn chân gà có sự hỗ trợ của enzyme Papain. Đây là xu hướng mới ở
Việt Nam hứa hẹn mở ra tiềm năng sản xuất chế phẩm CS ở quy mô lớn, phục vụ cho
nhu cầu ngày càng tăng thị trường thuốc cơ xương khớp cho người cao tuổi.

51