Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy polyoxyethylene tallow amine tại Việt Nam

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kỷ yếu khoa học

PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY
POLYOXYETHYLENE TALLOW AMINE TẠI VIỆT NAM
Châu Mỹ Quân*, Phạm Thị Thanh Trà
Trường Đại học Tơn Đức Thắng
*
Tác giả liên hệ:
TĨM TẮT
Polyoxyethylene tallow amine (POEA) là chất hoạt động bề mặt được ứng dụng rộng rãi trong
các lĩnh vực công nghiệp như chất ��
rửa, chất ��
nhờn, chất bôi trơn, công nghệ nhuộm, chất
nhũ hóa, chất tạo bọt,... Lĩnh vực nơng nghiệp POEA thường được thêm vào các sản ��ã
������ì
ợc để tăng hoạt lực của các chất có hoạt tính và thường được gọi là thành phần
trơ sinh học. Tuy nhiên, theo nhiều nghiên cứu cho thấy rằng POEA gây ảnh hưởng đến màng
của động vật thuỷ sinh như cá và động vật lư�ng cư có màng khi tiếp xúc với POEA và gây phá
hủy hormone của các động vật lư�ng cư. Để hạn chế sự ảnh hưởng của POEA đến sức khỏe
con người cũng như các loài động vật thủy sinh các phương pháp xử lý POEA cần được quan
tâm và nghiên cứu. Phương pháp xử lý sinh học, sử dụng vi sinh vật để phân hủy POEA được
chú ý vì khơng gây hại đến con người và giúp bảo vệ môi trường. Trong nghiên cứu này, chúng
em đã phân lập được bảy chủng vi k���
gram âm có khả năng sử dụng POEA làm nguồn
Carbon duy nhất từ các mẫu đất nông nghiệp tại ba vùng là Bến Lức, Bình Phước, Long An.
Ba chủng vi k�� có khả năng phát triển mạnh nhất được lựa chọn để định danh dựa trên 16S
rRNA gene. Trình tự của ba chủng vi k���
đã được đưa lên Genbank với các số truy cập là:
Pantoea dispersa BL (MN153809), Klebsiella pneumoniae BP (LR588411.1), Kosakonia

oryzae LA (MK530094.1). Các đánh giá về khả năng phân hủy POEA đối với các chủng vi
k������ì
ợc tiến hành để làm rõ cơ chế phân hủy POEA của các chủng vi k���
Từ khóa: Chất hoạt động bề mặt, Polyoxyethylene tallow amine, POEA, phân hủy sinh học.
ISOLATION OF BACTERIAL STRAINS ABLE TO DEGRADE
POLYOXYETHYLENE TALLOW AMINE IN VIET NAM
Chau My Quan*, Pham Thi Thanh Tra
Ton Duc Thang University
*
Corresponding Author:
ABSTRACT
Polyoxyethylene tallow amine (POEA) is a surfactant that is commonly used in industrial fields
such as detergents, degreasers, lubricants, dyeing technology, emulsifiers, foaming agents, etc.
In agricultural fields, POEA is added to agrochemical formulation to increase active
component and is commonly referred to as inert biocompatibility. However, studies have shown
that POEA affects membranes of aquatic animals such as fish and amphibians when exposed
to POEA and destroys the hormones of amphibians. Therefore, POEA treatmentconcerned and
studied. Bioremediation of POEA will be an enviromentally favorable method to restore
enviroments. In this study, seven strains gram-negative bacterial strains that are able to use
POEA at sole Carbon source were isolated from agricultural soil samples of regions: Ben Luc
district, Binh Phuoc province, Long An province. Three bacterial strains with the high ability
grow on POEA were selected for sequencing and identification. The sequences of the three
bacterial strains were deposited in Genbank with the accession numbers: Pantoea dispersa BL
(MN153809), Klebsiella pneumoniae BP (LR588411.1), Kosakonia oryzae LA (MK530094.1).
Futher study on biodegradation of POEA using these strains are investigated to get a better
understanding of POEA biodegration pathway.
Keywords: Surfactant, Polyoxyethylene tallow amine, POEA, biodegrading.

85

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kỷ yếu khoa học

mặt không chứa ion, thuộc nhóm Alkylamine
ethoxylates (ANEOs), được sử dụng rộng rãi
trong các loại thuốc bảo vệ thực vật.

TỔNG QUAN
Polyoxyethylene tallow amine (POEA), (Số
CAS 61791-26-2): là một chất hoạt động bề

Hình 1. Cơng thức cấu tạo của POEA
POEA được tổng hợp từ các acid béo được VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
chuyển đổi thành các amine béo và sau đó CỨU
phản ứng với ethylene oxide. Phân tử POEA Vật liệu
bao gồm một amine bậc 3 làm trung tâm, một POEA từ công ty Sino Japan Chemicalnhánh bao gồm nhóm tallow và hai nhánh các Taiwan với độ tinh khiết 99% được sử dụng
đơn vị ethoxylate lặp lại (Hình 1). Nhóm chức dùng để đánh giá sự phân hủy của vi khuẩn.
tallow amine là hỗn hợp của các amine bắt Các thí nghiệm trong nghiên cứu này sử dụng
nguồn từ acid palmitic, acid oleic, acid stearic môi trường nuôi cấy:
và các thành phần phụ khác. Độ dài của chuỗi Môi trường M9, thành phần 1 lít mơi trường
ethoxylate thay đổi theo các hỗn hợp kỹ thuật M9 stock 5X bao gồm: 30 g Na2HPO4.2H2O,
khác nhau và có thể cung cấp các tính chất vật 15 g KH2PO4, 5 g NH4Cl, 2.5 g NaCl. Bổ sung
lý khác nhau. Mặc dù POEA là một chất hoạt thêm POEA để làm nguồn Carbon cho vi
động bề mặt khơng ion, amine bậc ba có thể khuẩn.
hoạt động như một base và trở thành proton Môi trường LB Agar, thành phần 1 lít mơi
trong điều kiện acid trung tính; hằng số phân trường LB Agar: 10 g Peptone, 5 g Cao nấm
men, 10 g NaCl, 20 g Agar.
ly acid (pKa) khoảng 6.5 -7.0.

Hiện nay, trên thế giới có rất ít nghiên cứu về Môi trường nuôi cấy cùng với các mơi trường
hoạt tính, độc tính cũng như phương pháp xử pha loãng đều đươc hấp khử trùng ở 121˚C
lý POEA. Hiện tại mới chỉ có một nhóm 1atm trong 30 phút.
nghiên cứu về khả năng phân hủy POEA, Phương pháp
trong đó nhóm tác giả Rokade và Mali (2012) Phân lập và quan sát đặc điểm hình thái vi
đã phân lập ra chủng vi khuẩn Pseudomonas k��
desmolyticum NCIM 2112 có khả năng phân Các chủng vi khuẩn trong nghiên này được
hủy tallow amine ethoxylate thành phân lập từ đất nông nghiệp có sử dụng thuốc
diệt cỏ của các vùng: Bình Phước (BP), Long
ethylenmine và acetamid.
Tại Việt Nam chưa có bất kỳ nghiên cứu về An (LA), Bến Lức (BL) nơi có mức độ sử
phương pháp xử lý, phân hủy POEA mặt dù dụng thuốc trừ cỏ cao trong nhiều năm. Chọn
lượng tiêu thụ các chất bảo vệ thực vật của lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng phát
chúng ta là rất lớn. Hiện tại các tác động của triển mạnh và có hình thái khuẩn lạc khác
chất hóa học lên sức khỏe con người và môi nhau để tiến hành nghiên cứu. Quan sát đặc
trường ngày càng được quan tâm nên hướng điểm hình thái khuẩn lạc và nhuộm Gram để
xử lý môi trường với các biện pháp sinh học quan sát đặc điểm của vi khuẩn.
thân thiện với mơi trường được chú ý.
Phương pháp phân tích
Trong nghiên cứu này, phương pháp xủ lý Môi trường M9 chứa 0.1% POEA được sử
POEA sử dụng các chủng vi khuẩn phân lập dụng để nuôi cấy vi khuẩn, sự tăng trưởng của
các chủng vi khuẩn được xác định bằng cách
tại Việt Nam được tiến hành.
Trong đó các chủng vi khuẩn sẽ được phân lấy 0.5 ml mẫu môi trường nuôi cấy đo quang
lập, định danh và đánh giá khả năng xử lý phổ hấp thụ ở OD 600 nm bằng máy đo quang
phổ GENESYS 10S UV-Vis.
POEA.

86

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

khuẩn ở các điều kiện khác nhau và chọn được
điều kiện tối ưu nhất để vi khuẩn tăng trưởng.

Giải trình tự và định danh các chủng vi
khuẩn
Các chủng vi khuẩn được giải trình tự là chủng
phát triển tốt nhất trong môi trường M9 với
0.1% POEA.Vi khuẩn được giải trình tự 16S
rRNA theo phương pháp Sanger tại cơng ty
Phù Sa Biochem. Sau khi giải trình tự, chủng
vi khuẩn được định danh dựa trên trình tự 16S
rRNA bằng cách dùng công cụ BLAST trên
ngân hàng dữ liệu NCBI (National Center for
Biotechnology Information). Trình tự 16S
rRNA được căn chỉnh bằng các phần mềm
BioEdit, Clustal X phiên bản 2.0.3 và tiến
hành xây dựng cây phân lồi với các trình tự
16S rRNA của các chủng vi khuẩn đã công bố
trên thế giới về khả năng phân huỷ thuốc trừ
cỏ.
Khảo sát các điều kiện tối ưu cho sự tăng
trưởng của các chủng v����
Nồng độ POEA: Sử dụng mơi trường M9 có
chứa POEA ở các nồng độ: 0.01%, 0.05%,
0.1%, 0.5%, 1%, 5%,
Nguồn Nitơ: thay thế nguồn nitơ trong môi
trường M9 bằng các nguồn: Urea, NH4Cl,

(NH4)2SO4 và bổ sung 0.5% POEA.
Nuôi cấy trong 72 giờ, sự tăng trưởng của các
chủng vi được xác định bằng cách lấy 0.5 ml
mẫu môi trường nuôi cấy đo quang phổ đo độ
hấp thụ ở OD 600 nm bằng máy đo quang phổ
GENESYS 10S UV-Vis. Mỗi nghiệm thức lập
lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Xây dựng đồ
thị để so sánh sự tăng trưởng của các chủng vi

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Kết quả phân lập vi khuẩn
Ban đầu trong các mẫu đất sẽ có khoảng 108
đến 1010 vi sinh vật, trải qua 4 lần ủ và phân
lập trong môi trường M9 số lượng vi sinh vật
sẽ giảm xuống còn khoảng 102 đến 105, đồng
thời việc bổ sung thêm 0.1% POEA giúp phân
lập được một số vi sinh vật chỉ có khả năng sử
dụng POEA là nguồn Carbon duy nhất.
Sau khi cấy trang và ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ
phịng, sẽ có các chủng vi sinh vật khác nhau
bao gồm nấm mốc và vi khuẩn trong cùng một
môi trường, các khuẩn lạc quan sát được đa số
có dạng hình tròn, nhỏ, hơi lồi màu trắng đục
và màu hơi vàng.
Lựa chọn ra được 48 chủng vi khuẩn có hình
thái khuẩn lạc khác nhau để cấy vạch nhằm
mục đích sàng lọc và làm thuần các chủng vi
khuẩn khác nhau.
Xây dựng đường cong sinh trưởng của vi
khuẩn

Xây dựng đường cong sinh trưởng của 48
chủng vi khuẩn sau khi làm thuần đã ghi nhận
lại qua 48 giờ. Dựa vào sự phát triển 48 chủng
vi khuẩn ta chọn lọc được 7 chủng vi khuẩn
phát triển tốt nhất trong môi trường nuôi cấy
M9 bổ sung 0.1% POEA: BL10-3 tube 1 và
tube 4, BP10-3 tube 1 và tube 4, LA10-3 tube 1,
LA10-5 tube 1 và tube 4.

OD(600nm)

0.800
0.600
0.400
0.200
0.000
-0.200

0

12h

24h

Kỷ yếu khoa học

36h

Time (hours)

48h

BL 10-3 tube1
BL 10-3 tube4
BP 10-3 tube1
BP 10-3 tube4
LA 10-3 tube1
LA 10-5 tube1
LA 10-5 tube4
Bacillus
Pseudomonas

Hình 2. Đồ thị thể sự phát triển của 7 chủng vi khuẩn được sàng lọc từ 48 chủng vi khuẩn sau
48 giờ ni cấy
Theo đồ thị (hình 2) 7 chủng được chọn lọc có diễn có xu hướng đi lên để giải trình tự và định
thể thấy được sự tăng trưởng mạnh mẽ của 3 danh. Và Trong nghiên cứu hai chủng vi
chủng vi khuẩn: BL10-3 tube 1, BP10-3 tube 1, khuẩn Bacillus subtilis, Pseudomonas
LA10-3 tube 1. Phát triển cao nhất là mẫu aeruginosa dùng làm đối chứng, theo đồ thị
BL10-3 tube 1 đạt được khoảng 0.6 ở OD thấy được hai chủng vi khuẩn làm mẫu đối
600nm tiếp theo là mẫu LA10-3 tube 1 và mẫu chứng khơng có khả năng phát triển trên môi
BP10-3 tube 1. Dựa và đồ thị và hình thái trường chứa POEA là nguồn Carbon duy nhất.
khuẩn lạc chọn lọc ra được 3 chủng vi khuẩn Đặc điểm hình thái của vi khuẩn
có khả năng phát triển mạnh và đường biểu

87


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Kết quả 3 chủng vi khuẩn sau khi nhuộm

Gram quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng

Kỷ yếu khoa học

đại 100X có thêm dầu soi cả 3 chủng vi khuẩn
đều thuộc Gram âm.

Hình 3. Kết quả nhuộm Gram của 3 chủng vi khuẩn tương ứng từ trái sang phải là: Bến Lức,
Bình Phước, Long An
Đặc điểm khuẩn lạc quan sát được là khuẩn
BP10-3 tube 1, LA10-3 tube 1 có màu trắng
lạc ở mẫu BL10-3 tube 1 có màu vàng, cịn lại đục. Hình dạng trịn. Bề mặt nhẵn, bóng.

Hình 4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 3 chủng vi khuẩn tương ứng từ trái sang phải là:
Bến Lức, Bình Phước, Long An
liệu ngân hàng Genebank của NCBI với kết
Kết quả định danh
quả như bảng 1.
Trình tự gen 16S rRNA của 3 chủng vi trong
nghiên cứu này được giải và gửi vào cơ sở dữ
Bảng 1. Kết quả định danh của các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng POEA
STT

Ký hiệu

1

BL10-3
tube 1
BP10-3

tube 1

2
3

LA10-3
tube 1

Nguồn
gốc
Bến Lức

Độ tương
đồng
99.41%

Bình
Phước

99.78%

Long An

99.93%

Các dịng vi khuẩn trên
cơ sở dữ liệu
Pantoea dispersa RIBBSCM12 (MK905711.1)
Klebsiella pneumoniae
NCTC9170

(LR588411.1)
Kosakonia oryzae VKA4
(MK530094.1).

Định danh
Pantoea dispersa
BL (MN153809)
Klebsiella
pneumoniae BP
(MN156286)
Kosakonia oryzae
LA (MN156288)

(LR588411.1), K.oryzae LA (MK530094.1).
Các chủng vi khuẩn phân lập được có khả
năng phân hủy POEA và phát triển trong điều
kiện bình thường, tạo điều kiện thuận lợi cho
việc ứng dụng nghiên cứu này vào thực tiễn
để xử lý các vấn đề môi trường trong tương
lai. Việc sử dụng vi khuẩn trong q trình
phân hủy sinh học POEA khơng chỉ hiệu quả
về mặt chi phí mà cịn đảm bảo an tồn về mặt
sinh thái.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Ba chủng vi khuẩn phân lập được đều là vi
khuẩn Gram âm, được sàng lọc từ các mẫu đất
nông nghiệp của ba vùng Bến Lức, Bình
Phước, Long An nơi có mức độ sử dụng thuốc
diệt cỏ cao. Trong nghiên cứu này, từ 48

chủng vi khuẩn ban đầu đã phân lập được 3
chủng vi khuẩn phát triển mạnh nhất. Trình tự
16S rRNA gen được giải và dùng để định
danh, ba chủng được xác định là: P.dispersa
BL (MN153809), K.pneumoniae BP

88


Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần thứ 21 năm 2019

Cần tiến hành thêm các nghiên cứu để khảo
sát sự tương tác giữa các yếu tố ảnh hưởng đến
sự phát triển của các chủng vi khuẩn sau khi
đã khảo sát từng yếu tố riêng lẻ để được mơi

Kỷ yếu khoa học

trường có các điều kiện phát triển tối ưu nhất.
Nghiên cứu thêm về khả năng phân hủy
POEA và tỷ lệ POEA được vi khuẩn phân giải
bằng phương pháp HPLC.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TUSH, D., M.T.J.E.S. MEYER, AND TECHNOLOGY, Polyoxyethylene tallow amine, a
glyphosate formulation adjuvant: soil adsorption characteristics, degradation profile,
and occurrence on selected soils from agricultural fields in Iowa, Illinois, Indiana,
Kansas, Mississippi, and Missouri. 2016. 50(11): p. 5781-5789.
TUSH, D., K.A. LOFTIN, AND M.T.J.J.O.C.A. MEYer, Characterization of polyoxyethylene
tallow amine surfactants in technical mixtures and glyphosate formulations using ultrahigh performance liquid chromatography and triple quadrupole mass spectrometry.

2013. 1319: p. 80-87.
KEDAR, B. AND V.J.I.R.J.O.B.S. GAJANAn, Biodegradation of tallowamine ethoxylate by
Pseudomonas desmolyticum NCIM 2112. 2012. 1(4): p. 56-60.

89