(Luận án tiến sĩ) sàng lọc các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo thành acid uric

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TỪ VĂN QUYỀN

SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG
ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE
ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH 62420201

2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TỪ VĂN QUYỀN

SÀNG LỌC CÁC THẢO DƯỢC CÓ KHẢ NĂNG
ỨC CHẾ ENZYME XANTHINE OXIDASE
ĐỂ GIẢM SỰ TẠO THÀNH ACID URIC

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ NGÀNH 62420201

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHÍNH
PGS.TS. ĐÁI THỊ XUÂN TRANG

2021


LỜI CẢM TẠ
Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn PGS.TS. Đái Thị
Xuân Trang, PGS.TS. Nguyễn Minh Chơn và PGS.TS. Nguyễn Trọng Tuân
đã dành thời gian q báu, hướng dẫn và giúp đỡ tơi hồn thành luận án.
Xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đức Độ, TS. Nguyễn Lộc Hiền, TS.
Huỳnh Kỳ, PGS.TS. Nguyễn Thị Thu Nga cùng Quý Thầy Cô thuộc Viện
Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ, chia sẻ những khó
khăn, khuyến khích và động viên tơi.
Xin cảm ơn tất cả các bạn và các em trong phòng thí nghiệm Sinh - Hóa,
Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học Phân tử, Viện Nghiên cứu & Phát triển Công
nghệ Sinh học; phịng thí nghiệm Hóa Sinh; phịng thí nghiệm Sinh học, Khoa
Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi và
động viên tôi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Kính gởi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần Thơ, Ban
lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Ban chủ nhiệm
Khoa Khoa học Tự nhiên, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của
Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành chương
trình đào tạo tiến sĩ.
Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn sâu sắc đến đồng nghiệp, gia đình và
người thân đã dành cho tơi tất cả tình u và sự khuyến khích, ủng hộ để tơi có
đủ nghị lực hoàn thành được luận án.
Xin trân trọng cảm ơn tất cả.

i

TĨM TẮT
Giới thiệu: Tăng acid uric khơng chỉ là ngun nhân gây ra bệnh gout,
mà còn làm tăng nguy cơ mắc các bệnh tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và
các hội chứng chuyển hóa. Acid uric được tạo ra do enzyme xanthine oxidase
(XO) xúc tác q trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và oxy hoá
xanthine thành acid uric. Việc tìm ra các thảo dược và các hợp chất có nguồn
gốc từ thảo dược có tác dụng ức chế enzyme XO đồng thời không gây tác
dụng phụ là vấn đề hết sức cần thiết.
Mục tiêu: (1) Phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bò của địa
phương; (2) đánh giá được khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết 8 thảo
dược; (3) phân lập được một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ
thảo dược tiềm năng; (4) đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm
năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
Phương pháp thực hiện: Phân lập enzyme XO được thực hiện theo
phương pháp kết tủa enzyme bằng ammonium sulfate. Khả năng ức chế
enzyme XO của cao chiết các thảo dược được khảo sát bằng phương pháp đo
quang phổ ở bước sóng 290 nm khi có và khơng có mẫu thử. Phân lập các hợp
chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo dược được thực hiện theo phương
pháp chạy sắc ký cột hở. Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm
năng lên nồng độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm được thực hiện bằng
phương pháp đưa cao chiết vào cơ thể chuột qua đường uống, sau đó đo nồng
độ acid uric trong máu chuột. Chuột được làm tăng acid uric trong máu bằng
phương pháp tiêm kali oxonate vào màng bụng.
Kết quả cho thấy, enzyme XO được phân lập từ sữa bị có hàm lượng
protein là 0,509 mg/mg enzyme thô, enzyme sau khi được phân lập có hoạt
tính và hoạt tính riêng lần lượt là 0,2095 U/mg enzyme thô và 0,412 U/mg
protein. Điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme XO đã phân lập được xác
định ở pH 7,5; 25°C; 0,02 U/mL enzyme XO và 0,15 mM xanthine. Hiệu quả
ức chế của allopurinol đối với hoạt tính của enzyme XO đã phân lập và
enzyme thương mại là tương đương nhau. Cao ethanol nở ngày, húng chanh,

dền gai ức chế enzyme XO yếu. Nồng độ ức chế 50% (IC50) enzyme XO của
các cao ethanol cây sương sáo, râu mèo, kinh giới, nở ngày đất và cỏ xước lần
lượt là 222±2,65; 143±4,04; 138±1,73; 42,5±2,99 và 17,5±0,1 µg/mL. Chất
đối chứng allopurinol có IC50 là 9,24±0,275 µg/mL. Năm hợp chất sạch đã
được phân lập từ cao ethanol cỏ xước. Trong đó, hai hợp chất khơng có hoạt
tính ức chế enzyme XO. Ba hợp chất còn lại đã được định danh là quercetin,
quercitrin và hesperetin có tác dụng ức chế enzyme XO với IC50 lần lượt là
ii


14,6; 37,7 và 103,2 µg/mL. Hợp chất quercitrin ức chế enzyme XO theo kiểu
hỗn hợp. Cao ethanol cỏ xước không có tác dụng làm thay đổi nồng độ acid
uric trong máu chuột bình thường, làm giảm đáng kể nồng độ acid uric trong
máu chuột bệnh (186±2,1; 129,4±15,2 và 128,7±31,9 µmol/L) và làm giảm
hoạt tính enzyme XO trong gan chuột tăng acid uric (2,62±0,084; 1,79±0,127
và 1,87±0,075 mM acid uric /phút/g protein) tương ứng với các liều 150; 300
và 450 mg/kg. Nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO trong gan
chuột bình thường lần lượt là 127,3±38,4 µmol/L và 3,11±0,033 mM acid
uric/phút/g protein. Allopurinol có tác dụng làm hạ acid uric trong máu trên cả
chuột bình thường và trên chuột bị tăng acid uric.
Kết luận: Từ các kết quả đạt được cho thấy, cao ethanol cỏ xước có tác
dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric trong máu chuột bị tăng
acid uric xuống mức bình thường. Cần có định hướng sử dụng cây cỏ xước
trong phịng trị tăng acid uric trong máu.
Từ khóa: acid uric, cỏ xước, quercitrin, xanthine oxidase

iii


ABSTRACT

Introduction: The elevation of uric acid levels might be the main cause of
not only gout but also cardiovascular diseases, kidney stones, diabetes and
metabolic disorder. The formation of uric acid is often associated with the
oxidation process catalyzed by xanthine oxidase enzyme (XO) in which
hypoxanthine can be oxidized to xanthine and then uric acid. The research and
exploration of herbs and plant-related substances that perform a potential in
inhibiting XO enzyme without causing any negative impacts are critical.
The purpose of this study is to (1) extract XO enzyme from local cow’s
milk; (2) evaluate XO enzyme inhibitory efficiency of extracts from 8 types of
herbs; (3) extract a number of substances that are able to inhibit XO enzyme
from potential herbs; (4) evaluate the effects of the extracts from potential
herbs on serum-uric acid concentration of experimental mice.
Methods: The extraction of XO enzyme was conducted followed by
method using ammonium sulfate in order to precipitate enzyme. The
inhibitory effect XO of the herbal was determined by spectroscopy at 290 nm.
The mixture reaction without sample was used as a blank control. The
extraction of substances functionalizing in the XO enzyme inhibition from
herbs was performed using a column chromatography. The investigation of
impacts of extracts from potential herbs in serum-uric acid concentration was
performed by giving mice extracts, and then measuring uric acid concentration
in rat blood. Rats had increased uric acid in the blood by injecting
potassiumoxonate into the peritoneum.
Results: XO enzyme extracted from cow’s milk contains 0.509 mg/mg
of raw enzyme. The extracted enzyme activity and specific activity were
calculated to be 0.2095 U/mg and 0.412 U/mg protein, respectively. The
optimal conditions for the activity of XO enzyme were determined at pH 7.5;
0.02 U/mL enzyme and 0.15 mM xanthine. The inhibitory efficiency of
allopurinol versus the activity of the extracted XO enzyme and commercial
enzyme was approximate. The ethanol extracts of Gomphrena globosa,
Plectranthus amboinicus, Amaranthus spinosus showed a low efficiency in the

inhibition of XO enzyme. The half maximal inhibitory concentration (IC50)
XO enzyme of ethanol extracts in terms of Mesona chinensis, Orthosiphon
stamineus, Elsholtzia ciliata, Gomphrena celosiodes and Achyranthes aspera”
were 222±2.65; 143±4.04; 138±1.73; 42.5±2.99 và 17.5 µg/mL, respectively.
The positive control allopurinol has the IC50 value of 9.24 µg/mL. Five
compounds from ethanol extract of Achyranthes aspera were isolated. Among
iv


them, two compounds did not exhibit an XO enzyme inhibitory activity. Three
other compounds have been identified as quercetin, quercitrin and hesperetin
indicated an effective activity in XO enzyme inhibition in which IC50 values
are 14.6; 37.7 and 103.2 µg/mL, respectively. Quercitrin compound inhibited
XO enzyme according to mixed type. Achyranthes aspera ethanol-extract did
not cause a change in serum-uric acid concentration in normal mouse but
significantly reduced the serum-uric acid concentration in mouse model
for hyperuricemia (186±2.1; 129.4±15.2 và 128.7±31.9 µmol/L) and XO
enzyme activity in increased-uric acid mouse liver corresponding to 150; 300
and 450 mg/kg treatments. The uric acid concentration in blood and XO
enzyme activity in normal mouse liver were 127.3±38.4 µmol/L and
3.11±0.033 mM acid uric /min/g protein, respectively. The result illustrated
that allopurinol had an effect on releasing serum-uric acid level in terms of
either normal mouse or increased-uric acid mouse.
In conclusion, Achyranthes aspera ethanol extract efficiently induced an
inhibition on XO enzyme and reduced the serum-uric acid concentration in
increased-uric acid mouse to a normal threshold. The use of Achyranthes
aspera in preventing increased uric acid level in blood should be further
investigated.
Keywords: Achyranthes aspera, uric acid, quercitrin, xanthine oxidase

v



MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ......................................................................................... i
TÓM TẮT ............................................................................................. ii
ABSTRACT ......................................................................................... iv
CAM KẾT KẾT QUẢ .......................................................................... vi
MỤC LỤC ........................................................................................... vii
DANH SÁCH BẢNG .............................................................................x
DANH SÁCH HÌNH ............................................................................ xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................. xiii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU .....................................................................1
1.1 Lý do chọn đề tài...................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ............................................................. 1
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................. 1
1.2.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................. 2
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................ 2
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................... 2
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu................................................................... 2
1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................ 2
1.4.1 Thời gian nghiên cứu ................................................................ 2
1.4.2 Địa điểm nghiên cứu ................................................................. 3
1.5 Những đóng góp mới của đề tài ............................................................... 3
1.6 Ý nghĩa của luận án.................................................................................. 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................4
2.1 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme ........................... 4
2.2 Enzyme xanthine oxidase (E.C 1.17.3.2) ................................................. 8
2.2.1 Cấu trúc .................................................................................... 8

2.2.2 Cơ chế hoạt động .................................................................... 11
2.2.3 Thông số động học của enzyme xanthine oxidase ................... 12
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme xanthine
oxidase ............................................................................................... 12
2.2.5 Phân lập enzyme xanthine oxidase .......................................... 14
2.3 Xanthine oxidase trong bệnh lý .............................................................. 14
2.3.1 Tăng acid uric máu và gout ..................................................... 14
2.3.2 Tăng acid uric máu và bệnh tim mạch, bệnh thận .................... 15
2.4 Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase . 15
2.4.1 Các phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzyme xanthine
oxidase in vitro ................................................................................... 15
2.4.1.1 Phương pháp đánh giá khả năng ức chế xanthine oxidase in
vitro bằng phương pháp quang phổ ....................................................... 15
2.4.1.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò huỳnh quang . 17
2.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của chất ức chế đến nồng độ
acid uric trong cơ thể động vật ............................................................ 17
2.5 Các nghiên cứu xác định một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme
xanthine oxidase................................................................................................ 18
2.5.1 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase trên
thế giới ............................................................................................... 18
vii


2.5.2 Các nghiên cứu thảo dược ức chế enzyme xanthine oxidase ở Việt Nam.. 29
2.6 Tổng quan các nguyên liệu trong nghiên cứu......................................... 31
2.6.1 Húng chanh ............................................................................. 31
2.6.2 Kinh giới ................................................................................. 32
2.6.3 Cây râu mèo ............................................................................ 32
2.6.4 Cây sương sáo ......................................................................... 33
2.6.5 Dền gai ................................................................................... 34

2.6.6 Nở ngày .................................................................................. 34
2.6.7 Nở ngày đất............................................................................. 35
2.6.8 Cỏ xước .................................................................................. 36
2.7 Các kỹ thuật ly trích cao chiết ................................................................ 37
2.7.1 Kỹ thuật chiết lỏng - lỏng ........................................................ 37
2.7.2 Kỹ thuật chiết ngâm dầm (rắn – lỏng) ..................................... 38
2.8 Các phương pháp phổ nghiệm xác định công thức phân tử các hợp chất 38
2.8.1 Phổ hồng ngoại (IR) ................................................................ 38
2.8.2 Phổ tử ngoại – Khả kiến (UV-VIS) ......................................... 39
2.8.3 Phổ khối lượng (MS) .............................................................. 39
2.8.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ....................................... 39
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……………………..45
3.1 Phương tiện nghiên cứu ......................................................................... 41
3.1.1 Nguyên liệu............................................................................. 41
3.1.2 Hóa chất.................................................................................. 41
3.2 Phương pháp nghiên cứu........................................................................ 41
3.2.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase ............................... 42
3.2.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò .......................... 43
3.2.1.2 Xác định hàm lượng protein hòa tan trong hỗn hợp enzyme XO
trích được theo phương pháp Folin-Lowry ........................................... 45
3.2.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi
phân lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE .................................. 46
3.2.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập... 47
3.2.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên enzyme xanthine
oxidase trích được ................................................................................... 48
3.2.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho
phản ứng.................................................................................................. 48
3.2.1.7 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase được phân lập
từ sữa bò và enzyme xanthine oxidase thương mại .............................. 49
3.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của 8 loại

thảo dược ............................................................................................ 50
3.2.2.1 Phương pháp trích cao bằng dung mơi ethanol 70% ............... 50
3.2.2.2 Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao
tổng ethanol được chiết từ 8 loại thảo dược .......................................... 51
3.2.2.3 IC50 và cách xác định................................................................. 52
3.2.3 Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase53
3.2.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng ức chế enzyme xanthine
oxidase của các cao phân đoạn được chiết từ thảo dược tiềm năng .... 53
3.2.3.2 Thí nghiệm 2: Phân lập các chất từ cao phân đoạn ethyl acetate .. 54
viii


3.2.3.3 Cách xác định kiểu ức chế ........................................................ 56
3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ
acid uric trong máu chuột thực nghiệm ............................................... 57
3.2.4.1 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ
acid uric trong máu chuột bình thường ................................................. 57
3.2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ
acid uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate58
3.2.4.3 Đánh giá ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính
enzyme xanthine oxidase gan chuột thí nghiệm ................................... 59
3.3 Phương pháp xử lí thống kê ................................................................... 61
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................62
4.1 Chuẩn bị nguồn enzyme xanthine oxidase ............................................. 62
4.1.1 Phân lập enzyme xanthine oxidase từ sữa bò ........................... 62
4.1.2 Hàm lượng protein hịa tan trong hỗn hợp protein thơ ............. 62
4.1.3 Xác định sự hiện diện của enzyme xanthine oxidase sau khi phân
lập bằng phương pháp điện di SDS-PAGE.......................................... 63
4.1.4 Xác định hoạt tính của enzyme xanthine oxidase sau khi phân lập .. 64
4.1.5 Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ lên xanthine oxidase trích

được ................................................................................................... 64
4.1.6 Khảo sát nồng độ xanthine và xanthine oxidase phù hợp cho phản
ứng ..................................................................................................... 65
4.1.7 So sánh hoạt tính của enzyme xanthine oxidase được phân lập từ
sữa bò và enzyme xanthine oxidase thương mại.................................. 66
4.2 Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của 8 loại thảo dược ........... 67
4.2.1 Kết quả trích cao bằng dung mơi ethanol 70% ........................ 67
4.2.2 Khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase của cao tổng ethanol
được chiết từ 8 loại thảo dược............................................................. 67
4.3 Phân lập hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme xanthine oxidase từ cao
ethanol cỏ xước ................................................................................................. 74
4.3.1 Kết quả phân lập các hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme
xanthine oxidase từ cao ethanol cỏ xước ............................................. 74
4.3.2 Kiểu ức chế của hợp chất CXQ05 (quercitrin) ......................... 83
4.4 Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric
trong máu chuột thực nghiệm ........................................................................... 84
4.4.1 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric
trong máu chuột bình thường .............................................................. 84
4.4.2 Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid uric
trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate. ............. 86
4.4.3 Ảnh hưởng của cao ethanol Cỏ xước đến hoạt tính enzyme
xanthine oxidase gan chuột thí nghiệm ............................................... 89
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................91
5.1 Kết luận .................................................................................................. 91
5.2 Đề xuất ................................................................................................... 91
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................1
PHỤ LỤC .............................................................................................13

ix

DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1: Tổng hợp một số thảo dược trên thế giới có khả năng ức chế
enzyme XO ................................................................................................ 20
Bảng 2.2: Sự ức chế XO bởi các loại flavonoid ................................. 22
Bảng 2.3: Khả năng ức chế enzyme XO của các flavonoid được phân lập
từ hoa của Chrysanthemum sinense ........................................................... 25
Bảng 2.4: Các hợp chất ức chế enzyme XO phân lập được từ thảo dược... 27
Bảng 2.5: Một số thảo dược ở Việt Nam có khả năng ức chế enzyme XO.. 30
Bảng 2.6: Thành phần trong cây nở ngày đất (Sharma et al., 2011) .... 36
Bảng 3.1: Bảng xây dựng đường chuẩn protein theo phương pháp Lowry . 46
Bảng 3.2: Bố trí hỗn hợp phản ứng trong từng giếng .......................... 52
Bảng 4.1: Hiệu quả ức chế enzyme XO của AP ................................. 67
Bảng 4.2: Kết quả sấy các mẫu ở 60°C và trích cao ethanol ............... 67
Bảng 4.3: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày,
húng chanh và dền gai ................................................................................ 68
Bảng 4.4: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây sương sáo,
râu mèo và kinh giới ................................................................................... 69
Bảng 4.5: Khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol cây nở ngày đất
và cây cỏ xước ........................................................................................... 71
Bảng 4.6: Giá trị IC50 của các thảo dược khảo sát .............................. 73
Bảng 4.7: Giá trị IC50 của các phân đoạn cao chiết cỏ xước và của AP74
Bảng 4.8 Giá trị IC50 của các hợp chất ............................................... 76
Bảng 4.9: So sánh phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CXQ02 với
phổ 1H-NMR và 13C-NMR của quercetin ................................................... 77
Bảng 4.10: So sánh dữ liệu phổ của CXQ03 và hesperetin ................. 79
Bảng 4.11: So sánh dữ liệu phổ 1D-NMR của hợp chất CXQ05 với
quercitrin ................................................................................................... 82
Bảng 4.12: Độ hấp thu tia UV (290 nm) của dung dịch xanthine ........ 83
Bảng 4.13: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid

uric trong máu chuột bình thường ............................................................... 85
Bảng 4.14: Ảnh hưởng của cao chiết ethanol cỏ xước lên nồng độ acid
uric trong máu chuột bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate ............... 87
Bảng 4.15: Ảnh hưởng của cao ethanol cỏ xước đến hoạt tính enzyme
XO gan chuột thí nghiệm ........................................................................... 89

x


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Kiểu ức chế cạnh tranh ......................................................... 4
Hình 2.2: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế cạnh tranh. ............ 5
Hình 2.3: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh............................................... 6
Hình 2.4: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế kháng cạnh tranh .. 6
Hình 2.5: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế hỗn hợp ................ 7
Hình 2.6: Kiểu ức chế khơng cạnh tranh .............................................. 8
Hình 2.7: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế khơng cạnh tranh .. 8
Hình 2.8: (A) Cấu trúc tổng thể của enzyme XO được phân lập từ sữa bò;
(B) Sự sắp xếp và khoảng cách giữa những trung tâm hoạt động oxy hóa–khử
của một đơn phân ......................................................................................... 9
Hình 2.9: Cấu trúc của một cụm [2Fe-2S] .......................................... 10
Hình 2.10: Các thành phần trong tâm hoạt động của enzyme XO được
phân lập từ sữa bị ...................................................................................... 11
Hình 2.11: Cơ chế của xúc tác tạo thành acid uric của XO ............... 12
Hình 2.12: Cấu trúc phân tử acid caffeic (A), vinyl caffeate (B) và
apigenin (C) .............................................................................................. 21
Hình 2.13: Cấu trúc phân tử của quercetine (A) và kaempferol (B) .... 21
Hình 2.14: Cấu trúc phân tử của cinnamaldehyde .............................. 23
Hình 2.15: Cấu trúc phân tử của hydroxychavicol ............................. 24
Hình 2.16: Cấu trúc phân tử của nudibaccatumin A (1), nudibaccatumin

B (2) và neotaiwanensol B (3) .................................................................... 24
Hình 2.17: Cấu trúc phân tử của tetrahydroxymentoflavone ............... 24
Hình 2.18: Cấu trúc phân tử của các flavonoid được phân lập từ hoa của
Chrysanthemum sinense ............................................................................ 25
Hình 2.19: Cấu trúc phân tử của riparsaponin .................................... 26
Hình 2.20: Cấu trúc phân tử của acid rosmarinic (A) và methyl
rosmarinate (B) .......................................................................................... 26
Hình 2.21: Cây húng chanh ................................................................ 31
Hình 2.22: Cây kinh giới .................................................................... 32
Hình 2.23: Cây râu mèo ..................................................................... 32
Hình 2.24: cây sương sáo ................................................................... 33
Hình 2.25: Cây dền gai ...................................................................... 34
Hình 2.26: Cây nở ngày ..................................................................... 34
Hình 2.27: Cây nở ngày đất................................................................ 35
Hình 2.28: Cây cỏ xước ..................................................................... 36

xi


Hình 3.1: Sơ đồ nghiên cứu chung của tồn luận án ...…….…………42
Hình 3.2: Sữa bị dùng để phân lập enzyme XO ................................. 43
Hình 3.3: Thẩm tích ........................................................................... 44
Hình 3.4: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập enzyme XO ..................... 45
Hình 3.5: Quá trình chiết lỏng-lỏng các cao phân đoạn ...................... 53
Hình 3.6: Sơ đồ tóm tắt q trình điều chế cao các phân đoạn cây cỏ
xước. .......................................................................................................... 54
Hình 3.7: Sắc ký cột phân đoạn ethyl acetate ..................................... 55
Hình 3.8: Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng hạ acid uric trên mơ
hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonate. ............................................ 59
Hình 4.1: Enzyme xanthine oxidase được phân lập từ sữa bị

Hình 4.2: Sự phụ thuộc của độ hấp thu quang phổ vào nồng độ dung dịch
protein chuẩn .............................................................................................. 63
Hình 4.3: Kết quả điện di SDS-PAGE của enzyme XO được phân lập từ
sữa bò và enzyme thương mại. ................................................................... 63
Hình 4.4: Hoạt tính của enzyme XO ở các điều kiện nhiệt độ và pH khác
nhau ........................................................................................................... 64
Hình 4.5: Đường chuẩn acid uric ....................................................... 65
Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ xanthine và enzyme
XO đến hiệu suất phản ứng hình thành acid uric......................................... 66
Hình 4.7: Đồ thị tuyến tính khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol
cây cỏ xước, nở ngày đất, râu mèo, kinh giới và sương sáo ........................ 71
Hình 4.8: Khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại cao chiết .............. 73
Hình 4.9: Sơ đồ tóm tắt q trình phân lập chất có hoạt tính ức chế
enzyme XO từ cao ethanol cỏ xước ............................................................ 75
Hình 4.10: Hợp chất CXQ02 (quercetin) ............................................ 77
Hình 4.11: Hợp chất CXQ03 (hesperetin) .......................................... 80
Hình 4.12: Cơng thức phân tử hợp chất CXQ05 (quercitrin) .............. 81
Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn 1/V0 theo 1/[S] với các nồng độ khác nhau
của hợp chất CXQ05 (quercitrin)................................................................ 84

xii


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AP: allopurinol
BSA: bovine serum albumin

CMC-Na: natri carboxymetyl cellulose
CPK: Corey – Pauling – Koltun

DEAE: Diethylaminoethyl
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid
IC50: Inhibition concentration of 50%
NT: Nghiệm thức
PMSF: Phenylmethylsulfonyl fluoride
SDS-PAGE: Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis

XO: xanthine oxidase

xiii


CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Lý do chọn đề tài
Enzyme xanthine oxidase (XO) là một phức hợp metallo-flavoenzyme xúc
tác hai bước cuối trong quá trình phân giải purine, cụ thể là biến đổi
hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành acid uric (Hille, 2006). Nồng độ
acid uric trong máu cao là nguyên nhân dẫn đến một số bệnh. Bệnh gout (Thống
phong) là biểu hiện lâm sàng của tình trạng tăng acid uric máu, với sự tạo thành
các tinh thể acid uric, đặc biệt là ở các khớp (Smalley et al., 2000; Kasper et al.,
2015). Bên cạnh đó, tăng acid uric trong máu thường kèm theo tăng nguy cơ mắc
các bệnh như tim mạch, sỏi thận, đái tháo đường và các hội chứng chuyển hóa
khác (Nakanishi et al., 1999). Ngồi ra, hoạt động của enzyme XO cũng là
nguyên nhân dẫn tới sự tạo ra nhiều gốc tự do có hại cho cơ thể (Cotelle, 2001;
Van et al., 2002). Những bệnh có liên quan đến tăng acid uric trong máu đang
khá phổ biến và có chiều hướng gia tăng trên thế giới (Li et al., 2017; Naz et al.,
2021).
Ức chế enzyme XO là mục tiêu căn bản trong việc điều trị tăng acid uric
trong máu (Terkeltaub, 2003; Pacher et al., 2006). Các thảo dược, các hợp chất
từ tự nhiên có hoạt tính ức chế enzyme XO ngày càng được quan tâm vì tính an

tồn và hiệu quả trong việc phòng trị tăng acid uric trong máu. Những năm gần
đây, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã được thực hiện nhằm mục đích tìm kiếm
các thảo dược, các hợp chất thiên nhiên có khả năng ức chế enzyme XO (Agustin
et al., 2013; Thiombiano et al., 2014; Xu et al., 2014). Ở Việt Nam cũng có một
số nghiên cứu tìm kiếm những thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO
(Nguyen et al., 2004; Hoàng thị Thanh Thảo và ctv, 2013). Tuy nhiên, Việt Nam
có nguồn thảo dược dồi dào (Đỗ Tất Lợi, 2014). Nhiều thảo dược có tiềm năng
vẫn chưa được khảo sát về khả năng ức chế enzyme XO. Vì vậy, đề tài “Sàng lọc
các thảo dược có khả năng ức chế enzyme xanthine oxidase để giảm sự tạo
thành acid uric” được thực hiện nhằm xác định thêm một số thảo dược có khả
năng ức chế enzyme XO.
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài được thực hiện nhằm đạt được các mục tiêu sau:
-

Phân lập được enzyme XO từ sữa bò và xác định được các điều kiện phù
hợp cho hoạt động của enzyme XO phân lập được.

-

Xác định được một số thảo dược có khả năng ức chế enzyme XO.

1


-

Phân lập và xác định được cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế
enzyme XO từ thảo dược.

-

Đánh giá được tác dụng của thảo dược có hoạt tính ức chế enzyme XO
lên nồng độ acid uric trong máu và hoạt tính enzyme XO gan chuột thực
nghiệm.

1.2.2 Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện với 4 nội dung chính như sau:
(1) Nội dung 1: Chuẩn bị nguồn enzyme XO từ sữa bò.
(2) Nội dung 2: Khảo sát khả năng ức chế enzyme XO in vitro của 8 loại
thảo dược.
(3) Nội dung 3: Phân lập một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ
thảo dược.
(4) Nội dung 4: Đánh giá ảnh hưởng của cao chiết lên nồng độ acid uric
trong máu chuột thực nghiệm.
1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.3.1 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là enzyme XO; 8 loại thảo dược bao gồm:
Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng.), kinh giới (Elsholtzia
ciliata (Thunb.) Hyl.), cây râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.), cây sương
sáo (Mesona chinensis Benth.), dền gai (Amaranthus spinosus L.), nở ngày
(Gomphrena globosa L.), nở ngày đất (Gomphrena celosiodes Mart.) và cỏ xước
(Achyranthes aspera L.); động vật được sử dụng trong nghiên cứu là chuột nhắt
trắng Mus musculus var. Albino.
1.3.2 Phạm vi nghiên cứu
Đề tài tập trung nghiên cứu phương pháp phân lập enzyme XO từ nguồn
sữa bò ở trường Đại học Cần Thơ, xác định các điều kiện phù hợp cho hoạt động
của enzyme XO như pH, nhiệt độ, nồng độ xanthine và nồng độ enzyme XO;
khảo sát khả năng ức chế enzyme XO của cao ethanol 8 loại thảo dược; phân lập

và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme XO từ thảo
dược tiềm năng; khảo sát ảnh hưởng của cao chiết thảo dược tiềm năng lên nồng
độ acid uric trong máu chuột thực nghiệm.
1.4 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
1.4.1 Thời gian nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 03 năm 2016 đến tháng 11 năm 2018
2


1.4.2 Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phịng thí nghiệm Sinh-Hố, Bộ mơn Cơng
nghệ Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học;
phịng thí nghiệm Sinh học; phịng thí nghiệm Hóa học thuộc Khoa Khoa học
Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ.
1.5 Những đóng góp mới của đề tài
Đề tài đã có một số đóng góp mới như sau:
- Phân lập được enzyme XO từ nguồn sữa bị địa phương có hoạt tính tương
đương với hoạt tính của enzyme thương mại. Các điều kiện phù hợp cho hoạt
động của enzyme XO đã được xác định.
- Khảo sát được khả năng ức chế enzyme XO của cao chiết 8 loại thảo dược
ở đồng bằng sông Cửu Long. Cao chiết ethanol cỏ xước là một đối tượng mới đã
được chứng minh có tác dụng ức chế enzyme XO và làm nồng độ acid uric trong
máu chuột bị tăng acid uric xuống đạt mức bình thường. Đề tài đã phân lập được
3 hợp chất có khả năng ức chế enzyme XO từ cây cỏ xước. Trong đó, quercitrin
có hoạt tính ức chế khá mạnh enzyme XO (IC50 = 37,7 µg/mL).
1.6 Ý nghĩa của luận án
Luận án đã mang lại ý nghĩa về mặt khoa học là tạo được cơ sở khoa học về
khả năng ức chế enzyme XO của 8 loại thảo dược bao gồm: Húng chanh, kinh
giới, cây râu mèo, cây sương sáo, dền gai, nở ngày, nở ngày đất và cỏ xước. Luận
án cịn có một ý nghĩa đặc biệt là chứng minh được cao ethanol cỏ xước có hoạt

tính ức chế enzyme XO mạnh và có tác dụng làm nồng độ acid uric trong máu
chuột bị tăng acid uric giảm xuống đạt mức bình thường. Từ đó, luận án đã mang
lại ý nghĩa về mặt thực tiễn là đã gợi ý hướng ứng dụng cây cỏ xước trong phòng
trị tăng acid uric trong máu.

3


CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Ảnh hưởng của chất ức chế đến hoạt động của enzyme
Phương trình động học enzyme là phương trình Michaelis-Menten:
V = Vmax [S]/(Km + [S])
V là vận tốc phản ứng, [S] là nồng độ cơ chất.
Km là hằng số Michaelis-Menten đặc trưng cho mỗi enzyme. Km đặc trưng
cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì ái lực của enzyme
với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc tác càng lớn.
Ý nghĩa thực tiễn của hằng số Michaelis-Menten là ở chỗ nó chính là giá trị của
nồng độ cơ chất khi tốc độ phản ứng bằng nửa tốc độ tối đa (Vmax) (Phạm Thị
Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2009).
Phương trình Michaelis-Menten có dạng đường cong. Năm 1934, trên cơ sở
của phương trình Michaelis-Menten, Lineweaver-Burk đã nghịch đảo để biến
thành dạng đường thẳng.
Phương trình Lineweaver-Burk:

K
1
1
1
có dạng:
 m 


V0 Vmax [ S ] Vmax

y = ax+b, nó có ý nghĩa lớn đối với việc nghiên cứu ức chế enzyme.
Chất ức chế là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme khơng
cịn khả năng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. Nó có thể là chất ức chế thuận
nghịch hay bất thuận nghịch.
Ức chế thuận nghịch (reversible inhibition) có thể là cạnh tranh
(competitive), không cạnh tranh (uncompetitive) hay hỗn hợp (mixed).
Ức chế cạnh tranh (competitive)
Chất ức chế cạnh tranh trực tiếp vào tâm hoạt động của enzyme được gọi là
chất ức chế cạnh tranh. Những chất ức chế này thường có cấu trúc giống với cơ
chất và làm giảm lượng enzyme tự do (Hình 2.1).
Enzyme
Cơ chất

Chất ức chế

Hình 2.1: Kiểu ức chế cạnh tranh
E: enzyme; S: cơ chất; I: chất ức chế; P: sản phẩm

4


Phương trình Lineweaver- Burk khi có chất ức chế cạnh tranh:
1 K m 1
1




V0 Vmax [ S ] Vmax

  1

(1)

[I ]
KI

Với [I] là nồng độ của chất ức chế cạnh tranh.
KI là hằng số thể hiện ái lực của chất ức chế và enzyme.
Dựa vào phương trình (1) ta thấy: nếu nồng độ cơ chất lớn, nồng độ chất ức
chế thấp thì có thể loại bỏ tác dụng của chất ức chế.
Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào
nồng độ cơ chất khi có chất ức chế cạnh tranh được trình bày trong Hình 2.2.

Hình 2.2: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế cạnh tranh.
Kiểu ức chế cạnh tranh làm cho giá trị Km tăng nhưng giá trị Vmax không
thay đổi. Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy đường thẳng có nồng độ chất ức chế
càng cao thì có độ xiên càng lớn. Các đường thẳng khơng có chất ức chế và có
chất ức chế cắt trục tung ở một điểm là 1/Vmax. Phần lớn các chất ức chế cạnh
tranh và cơ chất có sự tương đồng về mặt hóa học.
Trường hợp đặc biệt của ức chế cạnh tranh là ức chế bằng sản phẩm.
Trường hợp này xảy ra khi một sản phẩm phản ứng tác dụng trở lại enzyme và
chốn vị trí hoạt động của phân tử enzyme.
Ức chế không cạnh tranh (uncompetitive)
Ức chế không cạnh tranh là kiểu ức chế mà chất ức chế bám trực tiếp vào
phức hợp enzyme-cơ chất nhưng không bám vào enzyme tự do (Hình 2.3).

5

Hình 2.3: Kiểu ức chế khơng cạnh tranh
E: enzyme; S: cơ chất; I: chất ức chế; P: sản phẩm

Phương trình Lineweaver-Burk khi có chất ức chế khơng cạnh tranh:
K
1
1

 m 

V0 Vmax [ S ] Vmax
  1 

'

(2)

[I ]
K I

Với [I] là nồng độ chất ức chế.
K’I là hằng số thể hiện ái lực của chất ức chế và enzyme.
Trong trường hợp này ta thấy khi E kết hợp với S làm thay đổi cấu trúc
không gian của phân tử enzyme và tạo trung tâm kết hợp với I, do đó khơng thể
loại bỏ tác dụng ức chế bằng cách tăng nồng độ cơ chất.
Đồ thị Lineweaver-Burk biểu thị sự phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào
nồng độ cơ chất khi có chất ức chế khơng cạnh tranh được trình bày trong Hình
2.4.

Hình 2.4: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế không cạnh tranh

6


Kiểu ức chế không cạnh tranh làm giảm giá trị Vmax nhưng giá trị Km không
thay đổi. Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy các đường thẳng có nồng độ chất ức
chế càng cao thì có độ xiên càng lớn và các đường thẳng cùng hội tụ tại một điểm
-1/Km nằm trên trục hoành.
Ức chế hỗn hợp (mixed)
Ức chế hỗn hợp là kiểu ức chế mà chất ức chế không những liên kết với
enzyme tự do mà còn liên kết với cả phức hợp ES tạo thành phức hợp EIS, không
tạo được sản phẩm P. Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế.
Vận tốc cực đại đo được khi khơng có mặt chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất
ức chế.
Phương trình Lineweaver-Burk cho kiểu ức chế hỗn hợp:
1 K m 1




V0 Vmax [ S ] Vmax

(3)
'

Lập đồ thị của phương trình (3), đường biểu diễn khi có chất ức chế và đường
biểu diễn khi khơng có chất ức chế cắt nhau tại một điểm khơng nằm trên trục
tung cũng khơng nằm trên trục hồnh (Hình 2.5).

Hình 2.5: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế hỗn hợp
Ức chế hỗn hợp làm tăng giá trị Km và giảm Vmax. Kiểu ức chế này cho thấy
các đường thẳng có nồng độ chất ức chế càng cao thì có độ xiên càng lớn. Các
đường thẳng khơng có chất ức chế và có chất ức chế cùng hội tụ tại một điểm
không nằm trên trục tung.
Ức chế kháng cạnh tranh là một trường hợp đặc biệt của ức chế hỗn hợp với
α=α’. Ở kiểu ức chế này enzyme có thể kết hợp với chất ức chế hoặc cơ chất
hoặc cả hai (Hình 2.6). Cơ chất và chất ức chế có cùng hệ số tương tác với
enzyme (Phạm Thị Trân Châu và Phan Tuấn Nghĩa, 2009).

7


Enzyme
Cơ chất
Chất ức chế

Hình 2.6: Kiểu ức chế kháng cạnh tranh
E: enzyme; S: cơ chất; I: chất ức chế; P: sản phẩm

Đồ thị Lineweaver-Burk của kiểu ức chế kháng cạnh tranh được trình bày
trong Hình 2.7.

Hình 2.7: Đồ thị Lineweaver-Burk của chất ức chế kháng cạnh tranh
Kiểu ức chế kháng cạnh tranh làm giảm cả giá trị Vmax và Km. Đồ thị
Lineweaver-Burk của kiểu ức chế này cho thấy các đường thẳng có chất ức chế
và khơng có chất ức chế có độ nghiêng bằng nhau, song song với nhau không hội
tụ tại một điểm.
2.2 Enzyme xanthine oxidase (E.C 1.17.3.2)

2.2.1 Cấu trúc
Enzyme xanthine oxidase được phân lập từ sữa bò là một enzyme nhị phân
đồng thể có khối lượng phân tử 283 kDa (Bray, 1975). Phân tử enzyme này có
hình dạng con bướm, với kích thước tổng thể 155Å × 90Å × 70Å. Trong đó, mỗi
tiểu đơn vị của enzyme XO có kích thước 100 Å × 90 Å × 70 Å (Enroth et al.,
2000). Mỗi tiểu đơn vị của enzyme XO mang một cofactor molybden ở trung
tâm, hai cụm sắt–lưu huỳnh (2Fe–2S) và một coenzyme flavin (FAD). Ở trung

8


tâm chứa molybden, nguyên tố này liên kết với pterin thơng qua nhóm dithiolene
sulfur để hình thành một cofactor được gọi là molybdopterin. Khoảng cách từ
trung tâm cofactor molybden đến cụm [2Fe-2S]I là 14,8 Å, từ [2Fe-2S]I đến
[2Fe-2S]II là 12,5 Å và từ [2Fe-2S]II đến FAD là 8,3 Å (Hình 2.8) (Pauff, 2008).

Molypdopterin
[2Fe-2S] II
[2Fe-2S] I
FAD

(A)

[2Fe-2S] I
Molypdopterin

[2Fe-2S] II
FAD

(B)

Hình 2.8: (A) Cấu trúc tổng thể của enzyme XO được phân lập từ sữa bò;
(B) Sự sắp xếp và khoảng cách giữa những trung tâm hoạt động oxy hóa–khử của
một tiểu đơn vị của enzyme XO (Hall, 2014)
Ghi chú:
- Cấu trúc tổng thể của enzyme XO (PDB ID: 3NRZ) với 3 domain khác nhau. Domain có gắn
kết với molybden màu xám, domain chứa cụm sắt–lưu huỳnh màu vàng và domain gắn với FAD màu
hồng. Các trung tâm hoạt động oxy hóa–khử được thể hiện bởi những khối cầu.
- Sự sắp xếp và khoảng cách giữa những trung tâm hoạt động oxy hóa–khử của một tiểu đơn vị
của enzyme XO được biểu diễn dưới dạng hình que và màu CPK (Corey, Pauling, Koltun). Những trung
tâm hoạt động này được phóng to và xoay 90° theo chiều ngược kim đồng hồ.
- Quy ước màu CPK: Carbon được hiển thị bằng màu trắng, nitrogen màu xanh dương, oxygen
màu đỏ, sulfur màu vàng, phosphorus màu vàng sậm (gold) và molybdenum màu mòng két (teal).

Mỗi tiểu đơn vị của enzyme XO được chia ra 3 domain là domain đầu N,
domain ở giữa và domain đầu C với khối lượng phân tử tương ứng 20 KDa, 40
KDa và 85 KDa. Hai cụm sắt–lưu huỳnh nằm ở domain đầu N, FAD thuộc
domain giữa và trung tâm molybden ở domain đầu C của mỗi tiểu đơn vị của
enzyme XO (Hille and Nishino, 1995). Nghiên cứu của Enroth et al. (2000) trên
enzyme XO của bò còn cho thấy rằng: domain đầu N (từ acid amin 1 đến 165)
nối với domain chứa FAD (acid amin 226 đến 531) nhờ 1 đoạn 59 acid amin và

9


domain chứa FAD tiếp tục nối với domain thứ 3 (acid amin 590 đến 1332) nhờ
đoạn liên kết từ acid amin 532 đến 589.
Các trình tự acid amin đầy đủ của enzyme XO từ nhiều nguồn được suy ra
bởi trình tự của cDNA hoặc gen tương ứng. Mỗi đơn phân của enzyme XO bao
gồm khoảng 1330 acid amin. Ngoại lệ là ở enzyme XO của gà bao gồm 1358

acid amin. Enzyme XO được phân lập từ các loài khác nhau có tính tương đồng
cao về trình tự sắp xếp của các acid amin cũng như trung tâm hoạt động oxy
hóa–khử. Ví dụ như enzyme XO từ sữa bị chứa 1332 acid amin và enzyme XO ở
gan người chứa 1333 acid amin, tương đồng với nhau đến 90% (Keith et al.,
1987; Terao et al., 1992; Wright et al., 1993; Hille and Nishino, 1995; Sato et al.,
1995; Enroth et al., 2000).
Domain đầu N ở mỗi tiểu đơn vị của enzyme XO chứa hai cụm [2Fe-2S]
gồm hai vùng phụ. Vùng phụ ở đầu N chứa một cụm [2Fe-2S], cụm này phối hợp
với cysteine (Cys) 43, Cys48, Cys51, Cys73 và nằm ở gần những nhóm 7α,8αmethyl của vịng flavin (Sticht and Rưsch, 1998). Vùng phụ cịn lại phía đầu C
gồm bốn bó xoắn; cụm [2Fe-2S] phối hợp với Cys113, Cys116, Cys148, Cys150
(Hình 2.9) và gần với nhóm molypdopterin (Enroth et al., 2000).

Hình 2.9: Cấu trúc của một cụm [2Fe-2S] (Palmer, 1975)
Đoạn giữa của mỗi đơn phân chứa FAD (Ichida et al., 2012). Domain đầu C
của mỗi tiểu đơn vị chứa trung tâm hoạt động của enzyme XO. Trung tâm hoạt
động này chứa molypden và thường chứa những acid amin sau: Phenylalanine
(Phe) 914, Phe1009, Glutamic acid (Glu) 802, Glu1261, Glutamine (Gln) 767 và
Arginine (Arg) 880. Ở những loài khác nhau, tâm hoạt động này thường giữ
nguyên thành phần. Tuy nhiên, vị trí của các acid amin có thể thay đổi. Ví dụ như
enzyme XO được phân lập từ sữa bị có tâm hoạt động bao gồm molypdopterin
và các acid amin Phe914, Phe1009, Glu802, Glu1261, Gln767 và Arg880; tâm
hoạt động của enzyme XO ở Rhodobacter capsulatus bao gồm molypdopterin và
các acid amin Phe334, Phe459, Glu232, Glu730, Gln197 và Arg310 (Hall, 2014)
(Hình 2.10); trong khi tâm hoạt động của enzyme XO ở người bao gồm
molypdopterin và các acid amin Phe915, Phe1010, Glu803, Glu1262, Gln768 và
Arg881 (Yamaguchi et al., 2007).

10