Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata lour) và bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò

ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THÀNH TRUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ
(FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ
NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

HUẾ 2017

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THÀNH TRUNG

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA QUẢ VẢ
(FICUS AURICULATA LOUR) VÀ BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT KHẢ
NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Mã số: 60540101

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. VÕ VĂN QUỐC BẢO

HUẾ 2017

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong Luận văn là trung thực, được các
đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một tài liệu
nào khác.

Tác giả luận văn

Nguyễn Thành Trung

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


ii

LỜI CẢM ƠN
Để thực hiện và hoàn thành Luận văn cùng với sự cố gắng và nỗ lực của bản
thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các cá nhân và tập thể.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học Thầy

giáo TS. Võ Văn Quốc Bảo đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo điều kiện thuận lợi
để cho tơi hồn thành tốt Luận văn tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn đến Quý Thầy, Cô giáo Khoa Cơ khí - Cơng nghệ,
Phịng Đào tạo Sau đại học cũng như Quý Thầy, Cô trong Trường Đại học Nông Lâm,
Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế đã truyền đạt những kiến thức cơ bản về lý
luận và thực tiễn trong thời gian qua.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện thuận
lợi, giúp đỡ và ủng hộ khuyến khích trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài
luận văn tốt nghiệp
Trong quá trình thực hiện Luận văn có gì sai sót rất mong Q Thầy, Cơ và các
bạn đóng góp ý kiến để Luận văn được hồn thiện hơn.

Huế, ngày….. tháng….. năm 2017
Học viên cao học

Nguyễn Thành Trung

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


iii

TÓM TẮT
Protease được chiết xuất từ nhựa quả vả, chứa chủ yếu enzyme ficin; một loại
men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes). Trong cơng trình này, chúng tơi đã nghiên
cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thu nhận chế phẩm ficin từ dịch nhựa quả vả
cũng như khảo sát một số tính chất đặc trưng của chế phẩm enzyme ficin, nhằm nâng
cao giá trị sử dụng của quả vả tại Thừa Thiên Huế để từ đó nghiên cứu bước đầu về
khả năng làm mềm thịt của chế phẩm ficin.
Để tách một enzyme có kết quả tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn các

thơng số kỹ thuật thích hợp. Kết quả cho thấy, quả vả đạt độ chín thu hoạch cho hàm
lượng protein và hoạt độ protease cao nhất, tương ứng 2,212 (mg/ml) và 1,015 (Hp/ml)
khi tỷ lệ giữa dịch nhựa quả vả/ethanol 96% là 1/4 và nhiệt độ chiết 3°C. Thời gian thu
nhận enzyme này thích hợp nhất là 60 phút. Chế phẩm protease hoạt động thích hợp ở
nhiệt độ 45ºC, pH = 6, bền nhiệt từ 35ºC đến 50ºC trong một giờ.
Ngồi ra, chúng tơi đã nghiên cứu khả năng làm mềm thịt của chế phẩm khi khảo
sát được độ dai của thịt bò sau 20 phút là 50,60 N và tỷ lệ mất nước giảm còn 17,33%
so với mẫu đối chứng 25,13%.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


iv

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................................................ i
LỜI CẢM ƠN............................................................................................................................................. ii
TÓM TẮT................................................................................................................................................... iii
MỤC LỤC................................................................................................................................................... iv
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT.............................................................................................. vii
DANH MỤC BẢNG............................................................................................................................ viii
DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ...................................................................................................... ix
MỞ ĐẦU....................................................................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề................................................................................................................................................ 1
2. Mục đích của luận văn......................................................................................................................... 1
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn............................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................................. 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME....................................................................................................... 3
1.2. TỔNG QUAN PROTEASE.......................................................................................................... 5
1.2.1. Giới thiệu về protease.................................................................................................................. 5

1.2.2. Phân loại protease.......................................................................................................................... 5
1.2.3. Nguồn thu nhận protease............................................................................................................ 7
1.2.4. Sản xuất protease từ các nguồn thực vật khác nhau......................................................... 9
1.3. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU....................................................................................... 13
1.3.1. Giới thiệu chung về quả vả...................................................................................................... 13
1.3.2. Đặc điểm hình thái...................................................................................................................... 14
1.3.3. Đặc điểm sinh học....................................................................................................................... 15
1.3.4. Thành phần hóa học của nhựa vả.......................................................................................... 15
1.3.5. Enzyme ficin................................................................................................................................. 15
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƯỚC.......................................... 20
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngồi nước......................................................................................... 20
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................................................... 21

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


v

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................... 23
2.1. PHẠM VI, ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............................................................................ 23
2.1.1. Phạm vi nghiên cứu.................................................................................................................... 23
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu................................................................................................................ 23
2.1.3. Hóa chất.......................................................................................................................................... 24
2.1.4. Một số thiết bị chính.................................................................................................................. 24
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU....................................................................................................... 24
2.2.1. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm ficin từ nhựa quả vả.................................................... 24
2.2.3. Bước đầu khảo sát khả năng làm mềm thịt bò................................................................. 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................................ 25
2.3.1. Phương pháp tách chế phẩm ficin từ nhựa vả.................................................................. 25
2.3.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein......................................................................... 27

2.3.3. Phương pháp xác định hoạt độ protease............................................................................. 28
2.3.4. Phương pháp vật lý..................................................................................................................... 28
2.3.5. Phương pháp cơ học................................................................................................................... 28
2.3.6. Phương pháp xác định độ mềm thịt bị............................................................................... 28
2.3.7. Phương pháp tốn học............................................................................................................... 29
2.3.8. Phương pháp bố trí thí nghiệm............................................................................................... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................................. 32
3.1. HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT ĐỘ PROTEASE Ở BA GIAI ĐOẠN THU
HOẠCH KHÁC NHAU CỦA QUẢ VẢ....................................................................................... 32
3.2. KHẢO SÁT DUNG MÔI KẾT TỦA...................................................................................... 33
3.3. KHẢO SÁT TỶ LỆ DỊCH NHỰA/ETHANOL................................................................. 34
3.4. KHẢO SÁT THỜI GIAN KẾT TỦA PROTEASE........................................................... 35
3.5. KHẢO SÁT NHIỆT ĐỘ KẾT TỦA PROTEASE............................................................. 35
3.6. KHẢO SÁT MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA CHẾ PHẨM FICIN TỪ NHỰA
QUẢ VẢ..................................................................................................................................................... 38
3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của chế phẩm ficin............................................ 38
3.6.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của chế phẩm ficin...................................................... 39
3.6.3. Khảo sát độ bền nhiệt của chế phẩm ficin......................................................................... 39

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


vi

3.7. KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÀM MỀM THỊT BÒ............................................................. 40
3.7.1. Khảo sát độ dai của thịt............................................................................................................. 40
3.7.2. Khảo sát tỷ lệ mất nước của thịt............................................................................................ 41
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................ 42
4.1. KẾT LUẬN....................................................................................................................................... 42
4.2. KIẾN NGHỊ...................................................................................................................................... 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................................... 43

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CBB

Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue

Cys – EP

Cystein – proteinase

N

Newton

ĐC

Đối chứng

FC

Thuốc thử folin – clocalteau

TCA

Acid trichloroacetic

Ser-EP

Serin – proteinase

OD

Mật độ quang

kD

Khối lượng phân tử kilo Dalton

CT1

Công thức 1

CT2

Công thức 2

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


viii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo từng loại dung môi....................33
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến độ dai của thịt bò......................................... 40

Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chế phẩm ficin đến tỷ lệ mất nước của thịt bò......................... 41

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


ix

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Q trình tổng quát thu nhận Enzyme từ thực vật.................................................. 12
Hình 1.2. Quả vả...................................................................................................................................... 13
Hình 1.3. Nhựa quả vả........................................................................................................................... 15
Hình 1.4. Chế phẩm Enzyme Wied N.............................................................................................. 20
Hình 1.5. Chế phẩm Enzyme-Mix.................................................................................................... 20
Hình 1.6. Chế phẩm ficin...................................................................................................................... 20
Hình 2.1. Dịch nhựa thu nhận từ ba giai đoạn thu hoạch của quả vả.................................. 23
Hình 2.2. Thu mua thịt bò tại lò giết mổ gia súc......................................................................... 23
Hình 2.3. Sơ đồ quy trình thu nhận dịch nhựa từ quả vả [6], [18]........................................ 25
Hình 3.1. Hàm lượng protein và hoạt độ protease theo độ chín của quả............................ 32
Hình 3.2. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo tỷ lệ dịch
nhựa/ethanol 96%.................................................................................................................................... 34
Hình 3.3. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo thời gian....................35
Hình 3.4. Hàm lượng protein và hoạt độ protease biến thiên theo nhiệt độ......................36
Hình 3.5. Quy trình thu nhận chế phẩm enzyme ficin từ dịch nhựa quả vả..................... 37
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ chế phẩm ficin............................................ 38
Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ chế phẩm ficin....................................................... 39
Hình 3.8. Khả năng bền nhiệt của chế phẩm ficin...................................................................... 40

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm

1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

Protease là enzyme công nghiệp rất quan trọng, được ứng dụng rộng rãi trong
công nghiệp chế biến thực phẩm cùng sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học –
thực phẩm, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều.Trên thế giới nhiều
nhà khoa học tiến hành nghiên cứu, đưa vào ứng dụng các chế phẩm protease trong
công nghiệp chế biến thực phẩm và thương mại hóa chế phẩm này. Ở Việt Nam, có rất
nhiều nghiên cứu về enzyme, tuy nhiên nghiên cứu ứng dụng vẫn cịn hạn chế và hiện
nay chưa có cơ sở nào sản xuất chế phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng để
sử dụng trong các ngành cơng nghiệp. Nước ta vẫn hoàn toàn phụ thuộc vào nguồn
enzyme từ nước ngồi nên giá thành rất cao. Vì vậy, việc hiểu biết, nghiên cứu và phát
triển sản xuất enzyme trong nước là việc rất cần thiết và là một ngành công nghiệp đầy
tiềm năng [2], [3].
So với protease động vật và vi sinh vật, protease thực vật cũng đã được nghiên
cứu và ứng dụng phổ biến. Bên cạnh hai loại enzyme bromelain và papain thì ficin
cũng là một enzyme có nhiều tiềm năng ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm
[6].
Ficin, có nhiều trong các loại quả cây họ sung (vả), được sử dụng nhiều nhất
trong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (làm formage, làm mềm thịt, bổ
sung để chống lại hiện tượng kết tủa protein trong q trình làm trong bia, ngăn cản sự
hóa nâu trong rau củ, xử lí phế phụ phẩm trong chế biến phế thực phẩm…), trong y
học như: làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa, tẩy giun. Ngồi ra, có nhiều ứng dụng đang được
nghiên cứu như: sản xuất thuốc làm tan máu bầm, trị bệnh ngoài da, mụn nhọt [10],
[33].
Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên các loại cây họ sung nói chung và
loại cây vả nói riêng phát triển rất thích hợp. Tuy nhiên, sản phẩm từ cây vả chỉ biết
đến qua các món thực phẩm được dùng hằng ngày như: vả trộn, vả kho thịt, hay dùng

làm rau... mà chưa có nhiều nghiên cứu về protease trên loại cây này. Lá và quả vả đều
chứa một lượng lớn protease trong đó chủ yếu là ficin, nguồn nguyên liệu để sản xuất
enzyme tự nhiên.
Từ những ý nghĩa thực tiễn trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận
chế phẩm ficin từ nhựa quả vả (ficus auriculata Lour) và bước đầu khảo sát khả
năng làm mềm thịt bò" để thực hiện nhằm tạo cơ sở cho những nghiên cứu sau.
2. Mục đích của luận văn
-

Thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm ficin ở quy mơ phịng thí nghiệm.

-

Khảo sát một số tính chất của chế phẩm ficin.

-

Bước đầu ứng dụng chế phẩm ficin thu được để làm mềm thịt bò.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiển của luận văn
- Nâng cao giá trị sử dụng của quả vả, nguồn thực vật phổ biến ở Huế.
- Góp phần bổ sung dữ liệu nghiên cứu về nguồn protease từ thực vật.
- Sử dụng thuốc nhuộm Coomasie Brilliant Blue liên kết với protein trong

dung dịch acid để xác định hàm lượng protein. Bên cạnh đó xác định hoạt độ protease
theo phương pháp Amano.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. TỔNG QUAN VỀ ENZYME
Enzyme là chất xúc tác sinh học được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của đời
sống, đặc biệt đóng vai trị quan trọng đối với các quy trình chế biến thực phẩm.
Enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho q
trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống tiến hành với tốc độ nhẹ nhàng, cân đối
theo những chiều hướng xác định [2], [14].
Enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật. Nó có thể
được tiết ra ngồi dịch tế bào, tồn tại trong các dịch của cơ thể, dịch môi trường (gọi là
enzyme ngoại bào) hoặc giữ lại bên trong tế bào (enzyme nội bào). Hiện nay trong các
nguồn nguyên liệu trên, vi sinh vật là nguồn sản xuất enzyme ở quy mô lớn cho công
nghiệp. Tuy nhiên, khi ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm, nguồn nguyên
liệu này cần phải lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố ảnh hưởng đến sức
khỏe con người. Chính vì thế, trong một số ngành sản xuất thực phẩm, nguồn enzyme
chính được khai thác từ động vật và thực vật [10], [16].
Để tách một enzyme có kết quả tốt cần phải tiến hành thí nghiệm để lựa chọn loại
nguyên liệu giàu enzyme và dễ dàng tinh chế enzyme. Cho đến nay, đã biết được nhiều
loại cấu trúc hóa học của nhiều loại enzyme quan trọng. Đáng chú ý là trong nhóm
ngoại của đa số enzyme hai cấu tử có chứa vitamin: piruvatdecacbonxylase chứa B1
(thiamin), aminotransferase chứa B6 (piridoxan),... Ngoài ra, một số hợp chất khác
như glutation dạng khử, nucleotid và các dẫn xuất, estephosphat của một số
monosacharid cùng tham gia vào thành phần coenzyme của enzyme [3], [17].
Enzyme là chất xúc tác sinh học, nó có đầy đủ các tính chất của một chất xúc tác.
Tuy nhiên, enzyme có cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác thơng

thường. Bên cạnh đó, tính chất đặc trưng của enzyme vẫn là tính đặc hiệu. Đó là một
trong những khác biệt giữa enzyme và các chất xúc tác khác [3]. Người ta phân biệt
hai kiểu đặc hiệu chính là đặc hiệu cơ chất và đặc hiệu kiểu phản ứng:
- Đặc hiệu kiểu phản ứng: thể hiện ở chỗ, mỗi enzyme chỉ xúc tác cho một trong
các phản ứng chuyển hóa nhất định.

Ví dụ: phản ứng oxy hóa khử, phản ứng chuyển vị, phản ứng thủy phân...
- Đặc hiệu cơ chất: cơ chất là chất có phản ứng kết hợp vào trung tâm hoạt động

của enzyme và bị chuyển hóa dưới tác dụng của enzyme. Mức độ đặc hiệu của các
enzyme khơng giống nhau. Có những enzyme có tính đặc hiệu tuyệt đối, nghĩa là
enzyme chỉ tác dụng lên một cơ chất nhất định và hầu như khơng có tác dụng với cơ
chất nào khác. Nhưng cũng có những enzyme có tác dụng lên một kiểu liên kết hóa

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


4

học trong phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các thành phần tham
gia tạo thành mối liên kết đó, chúng thể hiện tính đặc hiệu tương đối. Có enzyme chỉ
tác dụng với một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất, nó thể hiện đặc
hiệu quang học. Ngồi ra, enzyme cịn có khả năng phân biệt được hai gốc đối xứng
trong phân tử giống nhau hồn tồn về mặt hóa học [10], [14].
Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương
pháp vật lí, cơ học, hóa học. Có ba khó khăn khi tách enzyme khỏi tế bào cần hết sức
lưu ý [10]:
- Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần

khác. Do đó, việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó.

- Enzyme là chất hữu cơ khơng bền, chúng rất dễ bị biến tính khi tác động của

các yếu tố bên ngoài.
- Enzyme là protein. Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein khơng

phải enzyme nhưng lại có tính chất lý hóa rất giống protein enzyme. Do đó, việc tách
protein – enzyme ra khỏi các loại protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt
và không phải không gặp được những khó khăn nhất định.
Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch
muối trung tính để tách enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lí theo những phương pháp
trên. Dịch chiết thu được, người ta gọi là chế phẩm enzyme thơ vì trong chế phẩm này,
ngồi enzyme ra cịn có nước, protein khơng phải enzyme và các thành phần của tế
bào.
Như vậy, việc làm sạch enzyme chính là việc loại protein khơng phải là enzyme
(đôi khi loại bỏ cả các protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần
khác của tế bào ra khỏi enzyme. Cơng việc này hồn tồn khơng dễ dàng. Do đó việc
làm sạch enzyme địi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài sự hiểu biết về
enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất
hoạt tính hoạt động của enzyme [4]. Để loại bỏ những thành phần không phải là
enzyme ta đang cần, người ta thực hiện những phương pháp như: gây biến tính chọn
lọc dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối
hoặc dung môi hữu cơ, phương pháp hấp thụ chọn lọc khi cho chúng vào cột chất hấp
thụ, phương pháp sắc ký dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protien tan
trong nước và tác nhân trao đổi ion.
Để xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt
động của enzyme, người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác
định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt động của chúng hoặc thông qua khả năng làm
giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm

5

1.2. TỔNG QUAN PROTEASE
1.2.1. Giới thiệu về protease
Protease là nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptid (CO –
NH) trong phân tử protein hoặc trong các cơ cấu tương tự. Quá trình thủy phân liên kết
peptid được biểu diễn qua chuỗi phản ứng sau:
Protein ―> Pepton ―> Polypeptid ―> Acid amin
Đây là quá trình thủy phân tương đối phức tạp, có sự tham gia của nhiều protease
khác nhau [12], [14].
Trong các protease, protease của hệ tiêu hóa được phát hiện sớm nhất. Từ lâu
người ta đã tách được protease từ dạ dày và từ dịch tụy tạng của động vật. Bên cạnh
đó, một số nghiên cứu về protease thực vật cũng được nghiên cứu.
Năm 1874, người ta đã công bố nhận được protease từ hạt của một cây họ đậu,
nhiều tác giả thấy rằng, dịch chiết từ cây đại mạch, bơng lau, đu đủ có khả năng phân
giải protein [17].
Ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu, thăm dò, phát hiện và khảo sát

tính chất về enzyme này nhưng cho đến nay vẫn chưa có một cơ sở nào sản xuất chế
phẩm enzyme nói chung và protease nói riêng. Hầu hết các chế phẩm enzyme dùng
trong nghiên cứu và ứng dụng vào sản xuất đều phải nhập ngoại. Chính vì vậy việc
nghiên cứu tìm ra quy trình thu nhận các chế phẩm enzyme và ứng dụng là vấn đề cần
thiết và mang ý nghĩa thực tiễn [15].
1.2.2. Phân loại protease
Theo phân loại quốc tế, protease được chia làm hai phân nhóm (exo – peptidase,
endopeptidase) [10], [12].
1.2.2.1. Exopeptidase
Là nhóm enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptid ở đầu mạch, gồm có

3 loại:
+ Amynopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptid nằm kề nhóm amin tự do

trong chuỗi polypeptid
H2N–CH–CO–NH–CH –CO–...–NH–CH–COOH

R1

R2

R3

+ Cacboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid mà có nhóm cacboxyl

(-COOH) nằm gần kề trong chuỗi polypeptid.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


6

H2N–CH –CO –NH –CH –CO –...–NH – CH – CO – NH – CH – COOH

R1

R2

R3

R4

+ Dipeptid hydrolase: xúc tác thủy phân các liên kết dipeptid.

1.2.2.2. Endopeptidase (proteinase)
Là nhóm enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân các liên kết peptid bên trong
phân tử protein.
Endopeptidase được phân loại dựa vào cơ chế xúc tác của chúng. Trong thực vật,
endopeptidase được chia làm 4 loại: serin-proteinase, cystienproteinase, asparticproteinase và metallo-proteinase.
+ Serin – proteinase (Ser-EP) là những enzyme trung tính, có nhóm –OH, có

một phân tử Ser hoạt động tại vị trí xúc tác, vị trí này có tác dụng tương hỗ với cơ chất
protein. Các Ser – EP được tìm thấy có liên quan tới q trình sinh lý như sự lão hóa,
sự chết của tế bào, sự tạo gỗ, sự nảy mầm.
+ Cystein – proteinase (Cys – EP): là những enzyme có nhóm –SH trong trung

tâm hoạt động; là một nhóm proteinases thực vật được nghiên cứu nhiều nhất. Cơ chế
xúc tác của enzyme có liên quan đến nhóm cystein tham gia nhiều quá trình sinh học
như quá trình lão hóa sự tạo gỗ, sự cố định protein trong quá trình nảy mầm. Cys – EP
được biết đến nhiều nhất là protein giống caspase, các peptid giống papain, bromelain,
ficin và ngoài ra chứa các protein loại cathepsin.
+Aspartic – proteinase gồm các liên kết peptid có các nhóm bên của aminoacid
kỵ nước và hoạt động ở pH acid (pH < 7). Mặc dù, các enzyme này đã được tìm thấy ở
nhiều loại thực vật, nấm mốc. Tuy nhiên sự quan tâm đến nhóm này là rất ít, chủ yếu
gồm các protein cardosin và cathepsin.
Cardosin được chiết từ hoa Cynara cardunculus khô và được sử dụng trong sản
xuất phomat từ sữa cừu của Bồ Đào Nha và Tây Ban Nha. Cathepsin được tìm thấy
trong các hạt chưa nảy mầm, trong suốt thời gian nảy mầm và trong các mô sống của
đại mạch bao gồm cả chồi và rễ.
+ Metallo – proteinase: chủ yếu được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như

các loại vi sinh vật bậc cao. Hầu hết loại enzyme này chứa Zn, lượng rất ít chứa Co và
Mn. Một metallo – proteinase tồn tại trong lá đậu nành, có nhiều nhất trong các giai
đoạn sau của q trình phát triển của lá.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


7

1.2.3. Nguồn thu nhận protease
Protease là một enzyme rất cần thiết cho quá trình sinh lý trong cơ thể sống và
được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Chính vì vậy, chúng phân bố khá phổ
biến ở vi sinh vật, động vật và thực vật. Tuy nhiên, sự phân bố của chúng có tính
khơng đồng đều giữa các lồi, các cá thể và ngay cả các mô, các bộ phận trên một cơ
thể sinh vật [6], [15], [17].
1.2.3.1. Protease vi sinh vật
Thu nhận enzyme từ vi sinh vật đang được nghiên cứu và triển khai rộng rãi. Các
enzyme thu nhận từ nguồn này thường có tính đặc hiệu cao, cho các sản phẩm thủy phân
triệt để và đa dạng. Nguồn protease chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. Trong số các
vi khuẩn, chủng có khả năng tổng hợp protease mạnh là Bacillus subtilis, Bacillus
menseneterisus, Bacillus thermoproteoliticus và một số thuộc giống Clostridium [16].

Các chế phẩm proteinase được sản xuất từ vi sinh vật đa dạng, phong phú về
chủng loại và tính chất. Đặc biệt, các proteinase của vi khuẩn có nhiều ưu điểm hơn so
với proteinase của nấm mốc như tốc độ phản ứng nhanh, độ bền nhiệt lớn. Trên thế
giới, chế phẩm proteinase đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và đã được thương
mại hóa. Tuy nhiên, các nhà khoa học vẫn khơng ngừng tìm kiếm nguồn nguyên liệu
mới, nghiên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của chế phẩm enzyme thu được. Trong
khi đó, các nghiên cứu thăm dị thu nhận chế phẩm proteinsae từ nguồn vi khuẩn ở
nước ta vẫn còn quá ít so với trên thế giới. Vấn đề đặt ra là cần phải tuyển chọn được

những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp proteinase ngoại bào cao góp phần
tạo tiền đề phát triển cơng nghiệp sản xuất enzyme từ vi khuẩn ở Việt Nam.
1.2.3.2. Protease động vật
Protease thu nhận từ động vật được nghiên cứu và ứng dụng khá lâu. Tuy nhiên
khả năng thu nhận không cao do nó chỉ có ở các bộ phận nhất định trong cơ thể động
vật và chứa một lượng không nhiều. Enzyme thu nhận từ động vật có tính đặc hiệu ít
rộng rãi so với enzyme từ thực vật và vi sinh vật. Do vậy, khả năng thủy phân của
enzyme thuộc nhóm này thấp nhất. Hiện nay, người ta đã tách được renin từ dạ dày bê,
trypsin từ tụy tạng bò [16].
Trypsin: trypsin có khối lượng phân tử 23,3kD là enzyme tiêu hóa đường ruột
chính phù hợp với sự thủy phân protein thực phẩm. Nó là một serine proteinase và
thủy phân mối liên kết peptide giữa lysine và arginine.
Chymotrypsin: chymotrypsin có khối lượng phân tử 23,8kD được tìm thấy
trong dịch tụy. Nó đặc hiệu với mối liên kết peptide có các nhóm carboxyl của các
amino acid thơm như phenylalanine, tyrosine hoặc tryptophan.
Pepsin: pepsin có khối lượng phân tử 24,5kD là một proteinase acid được tìm

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


8

thấy trong dạ dày của hầu hết động vật có xương sống. Dạng hoạt động của nó được
giải phóng từ dạng zymogen như pepsinogen do quá trình tự phân khi có mặt acid
HCl. Enzyme này thủy phân mối liên kết peptide giữa hai amino acid ưa béo.
Rennin: rennin là proteinase giống pepsin (rennin, chymosin: EC 3.4.23.4) được
sinh ra ở dạng tiền enzyme không hoạt động trong dạ dày của tất cả các động vật có vú
và được chuyển thành dạng rennin hoạt động do sự hoạt động của pepsin hoặc do quá
trình tự xúc tác của chúng.
Do đa số nguồn proteinase động vật phải thu nhận từ nội tạng, không mang lại

hiệu quả kinh tế cao nên gần đây các nghiên cứu về chúng rất hạn chế so với
proteinase thực vật và vi sinh vật.
1.2.3.3. Protease thực vật
Việc nghiên cứu protease thực vật được bắt đầu vào thế kỷ XIX gắn liền với cơng
trình của nhà bác học Kiecgov người Nga, ông đã chứng minh nước chiết từ hạt lúa
mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa bột thành đường. Và đến năm 1929, lần đầu
tiên Summer đã tách được protease từ thực vật ở dạng tinh thể (urease). Trong những
năm gần đây, nhiều tác giả trong nước đã nghiên cứu thu nhận được một số protease
thực vật ở các mức độ tinh khiết khác nhau tùy theo mục đích sử dụng. Protease thu
nhận từ thực vật chiếm một tỉ lệ quan trọng trong công nghệ enzyme. Một số enzyme
thu nhận từ thực vật đã được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và cơng nghiệp.
Trong đó, phải kể đến papain trong đu đủ, bromelain có trong dứa, ficin trong quả sung
và keratinase có trong các cây họ đậu [6], [14].
Papain: papain là một loại protease thực vật truyền thống, sử dụng lâu đời và được
tách chiết từ trái đu đủ (Carica papapya). Chế phẩm thơ của enzyme có tính đặc hiệu rộng
do có chứa nhiều enzyme peptydase và proteinase. Papain đặc biệt bền nhiệt, có thể chịu
được 100ºC trong 3 giờ, nhiệt độ tối thích 60 - 70ºC và pH tối thích thường là giữa 5 (với
gelatin) và 7 (với casein, hemoglobin, albumin trứng). Tính chất enzyme phụ thuộc vào
nguồn thực vật, các điều kiện khí hậu và phương pháp tách, tinh chế [14].
Ở Việt Nam, nhiều tác giả cũng đã nghiên cứu tách chiết, điều chế và khảo sát

một số tính chất của papain từ nhựa đu đủ xanh. Chế phẩm proteinase từ nhựa đu đủ là
hỗn hợp của papain, chymopapain, peptidase III và peptidase IV và bị ức chế hoàn
toàn bởi flavonoid tách từ bọ mẩy (Clorodendron cyrtophyllum Turez) ở nồng độ
200mg/l [14].
Bromelain: bromelain được thu từ thân cây và dịch chiết của quả dứa. Enzyme này
có tính chất giống như một cystein protease. Biên độ pH rộng từ 3 – 10 nhưng pH tối thích
giữa 5 và 8 tùy cơ chất (5-6 với gelatin và hemiglobin, 7-8 với casein), nhiệt độ tối thích là
50 - 60ºC. Nhiệt độ bất hoạt của enzyme là 70ºC. Bromelain có phổ tác dụng

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


9

rộng như papain nên ngày càng được dùng thay cho papain vì papain rất đắt (làm mềm
thịt, chế biến bia, bánh, chế biến dầu cá, nước mắm...). Bromelain còn được sử dụng
trong y học và trong cơng nghiệp. Chính vì vậy, nhiều nhà khoa học trong nước và trên
thế giới quan tâm nghiên cứu về chế phẩm enzyme này [10], [18].
Các tác giả Nguyễn Đình Huyên, Trần Minh Tâm, Lê Thị Thanh Mai (1997) đã
nghiên cứu hoạt tính của promelain trong quá trình phát triển của quả dứa và cho thấy
rằng hoạt tính promelain cao nhất ở thời điểm 25 ngày trước khi quả chín.
Harrach và cộng sự (1995) đã tinh sạch, xác định tính chất của các proteinase có
trong chồi dứa đã phát hiện rằng chế phẩm này có tám phân đoạn khác nhau. Trong đó
có ba phân đoạn chính, hai phân đoạn trong số đó có pH thích hợp 4-4,5 và một phân
đoạn hoạt động ở pH trung tính.
Ficin: là mủ của một loại sung có màu vàng kem đến màu hồng và pH biến động
tương đối rộng (3-9) tùy thuộc vào cơ chất gelatin, hemiglobin hay casein. Ficin
thương mại là hỗn hợp của một số enzyme protease và peroxydase cộng thêm chất độn
(đường hay bột) [10].
Keratinase: người ta có thể sản xuất protease từ một số nhóm thực vật, các
protease này có khả năng thủy phân lơng, tóc. Sự phân giải lơng, tóc có phần quan
trọng để sản xuất acid amin thiết yếu – lysine và để tránh sự tắc nghẽn của hệ thống
nước tiểu.
Từ việc tìm hiểu về protease có nguồn gốc thực vật ở trên cho thấy các enzyme
này có mặt ở nhiều lồi thực vật và phân bố ở trong các mô khác nhau. Cho đến nay, ở
Việt Nam các tác giả chỉ mới tập trung nghiên cứu tách chiết và khảo sát tính chất của
các chế phẩm protease trên đối tượng đu đủ và dứa. Nghiên cứu thăm dò khả năng thu
nhận chế phẩm này ở các loài thực vật khác nhau như ở các loại cây họ sung (vả) vẫn
còn hạn chế.

1.2.4. Sản xuất protease từ các nguồn thực vật khác nhau
1.2.4.1. Nguyên tắc tách và tinh chế enzyme
Enzyme rất dễ bị giảm hoạt độ dưới tác dụng của các tác nhân bên ngồi, do đó
khi tinh chế enzyme, để tránh sự biến tính protein gây ảnh hưởng xấu đến hoạt độ của
enzyme cần tiến hành nhanh quá trình tinh chế trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời gian
ngắn và môi trường có pH thích hợp [10], [15], [17].
Khơng có quy trình cụ thể nào để chiết xuất và tinh chế enzyme khác nhau. Do
enzyme có mặt trong các tế bào động vật, thực vật và vi sinh vật nên quá trình tách và
tinh chế enzyme sẽ được thực hiện theo các bước tổng quan sau [6]:
- Thứ nhất phá vỡ cấu trúc tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau như:

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


10
+ Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh,

cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa....
+ Phương pháp vật lý: dùng sóng siêu âm.
+ Phương pháp hóa học: sử dụng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol,

ethylacetate.
- Thứ hai sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách

enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo phương pháp trên.
- Thứ ba dung dịch enzyme thô thu được chứa nước, protein không phải enzyme

và các tạp chất cần loại bỏ. Vì vậy, để thu được một enzyme nào đó ở dạng tinh khiết
có thể tiến hành theo nhiều phương pháp và nhiều giai đoạn tinh sạch khác nhau.

* Tách enzyme nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ [17]
Khi thêm dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme, lực hút giữa các phân tử
protein và các phân tử nước bao quanh chúng bị giảm. Nếu tiếp tục bổ sung dung môi
hữu cơ nồng độ dung dịch đạt đến một mức độ nào đó thì các phân tử protein liên hợp
với nhau tạo thành kết tủa. Tùy theo tính chất của từng loại protein, dung môi và điều
kiện kết tủa mà mỗi enzyme sẽ được kết tủa ở nồng độ enzyme thích hợp nào đó. Các
dung mơi thường được sử dụng phổ biến để kết tủa enzyme là rượu etylic, isopropylic,
ethanol hoặc aceton. Tuy nhiên các dung mơi có thể gây nên sự vơ hoạt enzyme vì vậy,
cần phải tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp.

* Tách enzyme nhờ kết tủa bằng muối trung tính [17]
Khi bổ sung muối đến nồng độ quá bão hòa, các ion muối có tác dụng phá vỡ lớp
vỏ hydrat bao quanh phân tử protein do sự hút các cực trái dấu của phân tử nước, kết
quả là các phân tử protein bị mất lớp vỏ nước và có thể liên hợp lại với nhau để tạo
thành phân tử lớn hơn. Tác dụng kết tủa của các ion muối tỷ lệ thuận với lực ion của
chúng và như vậy mỗi loại protein trong hỗn hợp sẽ được kết tủa tối đa ở một nồng độ
muối xác định nào đó. Muối được dùng phổ biến ở đây là (NH 4)2SO4. Ngoài ra, NaCl
cũng hay được dùng để kết tủa enzyme động vật.

* Tách enzyme bằng phương pháp hấp phụ không đặc hiệu [17]
Dựa vào tính tương tác của enzyme với chất hấp phụ khơng cực nhờ tương tác kỵ
nước và tương tác Vanderwaals hoặc tương tác protein với các chất hấp phụ có cực
nhờ liên kết ion và liên kết hydro. Để thực hiện phương pháp này người ta cho dịch
enzyme chảy từ từ qua cột chất hấp phụ (thường là hydrat oxit nhôm, silica gel hydrat
apatit...) khi đó tùy theo khả năng tương tác của chất hấp phụ với từng loại protein, các
protein khác nhau sẽ được hấp phụ khác nhau. Sau đó, dùng các dung dịch đệm thích
hợp để rút enzyme cần tách ra khỏi cột.

* Tách enzyme bằng phương pháp trao đổi ion [17]

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


11

Dựa vào sự trao đổi ion giữa protein (enzyme) tích điện và các chất nhựa trao
đổi. Khi cho dịch enzyme chảy từ từ vào cột của chất nhựa trao đổi, protein (enzyme)
nào có khả năng đẩy các ion linh động của chất nhựa trao đổi lớn hơn sẽ được giữ lại
trên cột trước tiên, cịn các protein (enzyme) nào có khả năng đẩy các ion linh động
này yếu hơn sẽ được giữ lại chậm hơn trên cột. Sau đó, cho dung dịch chất điện rửa
(dung dịch chất điện giải có nồng độ tăng dần) dẫn qua cột, các ion của dung dịch rửa
sẽ đẩy ra khỏi nhựa các protein vừa liên kết với nhựa. Khi đó, protein (enzyme) nào có
ái lực với nhựa kém nhất sẽ bị đẩy ra khỏi nhựa sớm nhất. Kết quả các protein
(enzyme) khác nhau sẽ được tách ra ở các thời điểm khác nhau.
1.2.4.2. Tách và tinh chế protease từ thực vật
Quá trình tách chiết và tinh sạch protein từ các nguồn vi sinh vật, động vật và
thực vật rất đa dạng và phong phú. Tuy nhiên, trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu và
theo nhiều cơng trình đã cơng bố [15], chúng tơi giới thiệu quy trình tổng quát thu
nhận enzyme từ thực vật như hình 1.1. Tùy theo loại enzyme có trong thực vật, vị trí
các mơ và tùy theo mục đích sử dụng mà có thể có các quy trình tách và tinh sạch khác
nhau.

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


12

Các loại hạt, khô
Các loại củ, quả

Nghiền thành bột
Xay nhuyễn, lọc

Tách dầu
Dịch lọc
Trích ly bằng cách ngâm
trong đêm ở pH = 4-7
Ly tâm (1400 vịng/ phút,
o
4 C, 5 phút)

Dung mơi hữu cơ

Thẩm tích để tách muối nếu
kết tủa bằng (NH4)SO4

Chế phẩm Enzyme thơ
Tinh chế (sắc kí lọc gel hoặc sắc kí
trao đổi ion hoặc sắc kí ái lực
Đơng khơ thu Enzyme tinh khiết
Hình 1.1. Quá trình tổng quan thu nhận Enzyme từ thực vật [3], [7], [28], [29]


PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm


13

1.3. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU
1.3.1. Giới thiệu chung về quả vả

Vả có tên khoa học Ficus auriculata Lour, là một lồi cây thuộc chi Ficus, nó có
quả giống như sung nhưng lớn hơn và có lá to hơn. Đây là lồi có nguồn gốc từ
Hymalaya, miền nam Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam. Quả vả có
rất nhiều tên gọi khác nhau, người Trung Quốc gọi là đại quả dung, đại diệp dung, viên
diệp dung, ở nước ta có nơi gọi là cây ngõa. Là lồi cây thường xanh nhưng trong một
số vùng khí hậu nó có thể rụng lá trong mùa đơng [39].

Hình 1.2. Quả vả
Ở Việt Nam, giống Ficus có khá nhiều lồi khác nhau. Có thể kể tên một số lồi

sung, vả như sau:
Sung trổ (Ficus variegata)
Sung (Ficus racemosa L.)
Sung ba thùy (Ficus hirta)
Sung thằn lằn (Ficus pumila L.)
Vả (Ficus auriculata Lour)
Sau đây là đặc điểm mơ tả của một số lồi thuộc giống Ficus có ở Việt Nam:
Cây vả (Ficus auricalata Lour): cây đại mộc nhỏ, thân to, nhánh to. Lá to gần
như trịn, mặt đưới có 5-7 gân lá, cuống lá khoảng 2,5cm, quả làm rau ăn. Cây được
trồng nhiều nơi ở Việt Nam và mọc hoang trong rừng.
Cây sung trổ (hay còn gọi là ngõa rừng, vả rừng) (Ficus variegata Blume) là cây
thân gỗ nhỏ, có nhánh, đường kính 5-6 cm rất nhẵn. Lá hình trái xoan ngược, tù và có
khi trịn ở gốc, đầu hơi nhọn hoặc khơng, mặt trên lá rất nhẵn, bóng, mặt dưới màu
nhạt, mép lá có hoặc hơi có răng cưa khơng đều, lá dài 13-22 cm, rộng 5-13 cm, cuống
2-4 cm. Quả xếp 1-2 quả trên các nhánh từ gốc hoặc trên thân già, có cuống, quả hình

PDF Watermark Remover DEMO : Purchase from www.PDFWatermarkRemover.com to remove the waterm