NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CAO TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN TỰ NHIÊN

<span class='text_page_counter'>(1)</span>Trần Văn Chí và Đtg. Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ. 177(01): 43 - 48. NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ NĂNG SINH BACTERIOCIN CAO TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN TỰ NHIÊN Trần Văn Chí, Phạm Thị Tuyết Mai* Trường Đại học Nông Lâm – ĐH Thái Nguyên. TÓM TẮT Vi khuẩn lactic đã được tìm thấy và sử dụng nhiều trong các sản phẩm lên men truyền thống, theo điều kiện tự nhiên. Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh vi khuẩn lactic có khả năng sinh ra bacteriocin (một loại kháng sinh sinh học có bản chất protein). Mục đích của nghiên cứu này là phân lập và tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao từ các sản phẩm lên men tự nhiên. Từ 6 sản phẩm lên men tự nhiên đã phân lập được 14 chủng vi khuẩn sinh axít lactic và xác định được đặc điểm sinh học, sinh lý và hóa sinh chúng. Những chủng đã phân lập được đã khảo sát khả năng sinh bacteriocin thể hiện ở khả năng kháng vi khuẩn kiểm định Staphylococcus aureus, trong đó có 8 chủng thể hiện tính kháng khuẩn tích cực (hiệu số đường kính vòng tròn kháng khuẩn lớn hơn 10 mm). Từ 8 chủng qua sơ loại đã chọn ra được chủng SC3 có khả năng sinh bacteriocin cao nhất, thể hiện hoạt tính kháng với cả 3 chủng kiểm định Staphylococcus aureus, E.coli, Samonella với hiệu số vòng kháng khuẩn từ 19,5 đến 24 mm. Bên cạnh đó, nghiên cứu đã chứng minh được tốc độ của quá trình ly tâm để tách sinh khối và tạp chất nhằm thu hồi bacteriocin thô không ảnh hưởng đến hoạt tính kháng khuẩn mà chỉ ảnh hướng đến độ sạch của chế phẩm, tốc độ ly tâm 13000 vòng/phút là phù hợp nhất. Từ khóa: Bacteriocin, kháng khuẩn, lactic, lên men, vi khuẩn. ĐẶT VẤN ĐỀ* Vi khuẩn lactic (LAB) được sử dụng nhiều trong thực phẩm lên men như dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, phomai, bia. Chúng có vai trò quan trọng trong đời sống như tăng cường miễn dịch, ức chế các vi sinh vật có hại, bổ sung các vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn [1]. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic sinh axít hữu cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn, kháng nấm [10]. Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ở riboxom từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương [5]. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu thành tế bào của vi khuẩn gây hại [3]. Vì vậy bacteriocin có rất nhiều ứng dụng trong sản xuất mỹ phẩm, xử lí môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, trong y học và trong công nghệ thực phẩm [2]. Ngoài ra, bacteriocin không gây ra phản ứng *. Tel: 0965 051220, Email: dị ứng cho con người và vấn đề về sức khỏe, do chúng bị phân hủy nhanh bởi enzym proteinase, lipase [9]. Hơn nữa, chúng hoạt động trong khoảng pH rộng, chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên tính thấm của màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di truyền [7]. NGUYÊN/ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên/ vật liệu Các sản phẩm lên men tự nhiên: Cà pháo muối, mẻ, dưa chuột muối, bắp cải muối, dưa cải muối – mua tại chợ trung tâm thành phố Thái Nguyên, sữa tươi lấy tại trại chăn nuôi của Khoa Chăn nuôi Thú y – Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên để lên men chua tự nhiên. Môi trường thạch MRS (g/l) Môi trường MPA nuôi vi sinh vật kiểm định (g/l) Vi sinh vật kiểm định: Staphylococcus aureus, Samonella, E.coli – lấy tại ngân hàng giống vi sinh vật của Khoa CNSH-CNTP – trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên. 43.

<span class='text_page_counter'>(2)</span> Trần Văn Chí và Đtg. Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật [1]. - Phương pháp xác định hoạt tính catalase: Nhỏ trực tiếp vài giọt H2O2 3% lên bề mặt khuẩn lạc vi khuẩn lactic đã được nuôi sau 48 giờ trong môi trường MRS ở 37oC. Quan sát sự xuất hiện bọt khí bằng mắt thường. Nếu thấy có xuất hiện bọt khí thì phản ứng là dương tính (+), ngược lại không xuất hiện bọt khí tức là phản ứng catalase âm tính (-) [8]. - Phương pháp xác định khả năng di động của vi khuẩn: Chủng vi khuẩn được cấy vào ống nghiệp chứa môi trường MRS đặc theo phương thẳng đứng, nuôi 37oC trong 48 giờ. Nếu vi khuẩn mọc lan ra xung quanh đường cấy chứng tỏ vi khuẩn có khả năng di động (+). Nếu vi khuẩn mọc thẳng đứng theo đường cấy thì vi khuẩn không có khả năng di động (-) [8]. - Phương pháp nhuộm Gram: Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 48 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí. Hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô. Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô. Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí. Soi kính: Dùng vật kính dầu 100×. Kết quả: Vi khuẩn Gram dương (+) bắt màu tím, Gram âm (-) bắt màu đỏ. - Khảo sát và chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có tính kháng khuẩn cao bằng phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch [6]. - Phương pháp đục lỗ thạch để nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chế phẩm. 44. 177(01): 43 - 48. bacteriocin thô: Chủng sinh tổng hợp bacteriocin được nuôi tăng sinh trên môi trường MRS lỏng ở nhiệt độ 37oC sau 48 giờ, chuyển 1 ml vào ống Eppendoff rồi đem ly tâm (5.000-14.000 vòng/phút) trong 10 phút để loại bỏ sinh khối, thu dịch nổi. Hút 10 µl dịch bacteriocin thô bơm vào giếng thạch đã đục lỗ với kích thước như nhau (đĩa thạch đã chang vi sinh vật kiểm định để khô). Tiến hành ủ các đĩa trong 48h ở 37oC, tiến hành quan sát và ghi nhận kích thước vùng kháng khuẩn xuất hiện quanh khuẩn lạc vi khuẩn. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân lập chủng vi khuẩn lactic Đã phân lập được 14 chủng vi khuẩn từ 6 mẫu thực phẩm lên men tự nhiên. Kết quả cho thấy: Đặc điểm sinh học, sinh lý và sinh hóa của các chủng rất đa dạng và đều có khả năng sinh axít lactic khi thử nghiệm trên môi trường MRS. Những khuẩn lạc đó được làm thuần bằng cách cấy chuyền nhiều lần rồi được giữ giống trong ống thạch nghiêng bảo quản trong tủ lạnh 3 – 5oC, sau 14 ngày cấy chuyển giữ giống một lần. Kết quả phân lập cho thấy đặc điểm hình dạng tế bào của các chủng tập trung ở 3 dạng: Que ngắn, cầu và elip và hình thái khuẩn lạc rất phong phú, kích thước các khuẩn lạc từ nhỏ khoảng 1 mm đến lớn 12 mm mọc riêng rẽ, các chủng đều có khả năng sinh axít lactic, âm tính với phản ứng catalase, không có khả năng di động và đều Gram dương. Sử dụng 14 chủng LAB phân lập được để tiến hành tuyển chọn chủng có khả năng sinh bateriocin cao nhất. Kết quả tuyển chọn chủng LAB sinh bacteriocin có tính kháng khuẩn cao Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các chủng LAB đã phân lập được với vi khuẩn kiểm định Staphylococcus aureus được thể hiện trong bảng 2..

<span class='text_page_counter'>(3)</span> Trần Văn Chí và Đtg. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14. Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ. 177(01): 43 - 48. Bảng 1. Đặc điểm sinh học, sinh lý và sinh hóa của các chủng LAB đã phân lập được Nguồn Kí Hình Khả Khả năng Hoạt tính Hình thái phân hiệu dạng tế Gram năng di sinh axit catalase khuẩn lạc lập chủng bào động lactic Tròn, rìa gọn, CPM1 Cầu + + trắng sữa Cà Tròn, nhẵn pháo CPM2 Que ngắn + + bóng, trắng ngà muối Tròn, trơn bóng, CPM3 Elip + + trắng ngà Tròn, trơn bóng, M1 Que ngắn + + trắng sữa Tròn, trơn bóng, Mẻ M2 Que ngắn + + trắng sữa Tròn, nhẵn DChM1 Cầu + + bóng, trắng ngà Dưa chuột Tròn, trơn bóng, DChM2 Cầu + + muối trắng ngà Tròn, trơn bóng, BCM1 Elip + + trắng sữa Bắp cải muối Tròn, trơn bóng, BCM2 Que ngắn + + trắng sữa Tròn, trơn bóng, DCM1 Cầu + + trắng sữa Dưa cải muối Tròn, rìa gọn, DCM2 Elip + + trắng sữa Tròn, ria đều, Sữa SC1 Cầu + + trắng ngà tươi để lên Tròn, trơn bóng, SC2 Que ngắn + + men trắng ngà chua tự Tròn, trơn bóng, SC3 Que ngắn + + nhiên trắng sữa Bảng 2. Hoạt tính kháng Staphylococcus aureus của các chủng LAB thử nghiệm. Chủng khảo sát CPM1 CPM2 CPM3 M1 M2 DChM1 DChM2. Đường kính vòng kháng khuẩn (R-r) (mm) 14 8 3 9 9 7 16. Chủng khảo sát BCM1 BCM2 DCM1 DCM2 SC1 SC2 SC3. Đường kính vòng kháng khuẩn (R-r) (mm) 15 11 14 18 3 20 24. 14 chủng vi khuẩn đã được kiểm tra tính kháng khuẩn, có 8 chủng thể hiện tính kháng tích cực (hiệu số đường kính vòng tròn kháng khuẩn ≥10 mm). Trong 8 chủng cho kết quả tích cực có hai chủng: SC2, SC3 thể hiện tính kháng khuẩn cao nhất, với hiệu số đường kính vòng kháng khuẩn lần lượt là 20 mm và 24 mm nên được chọn để tiến hành các khảo sát tiếp theo. Để chọn ra chủng có khả năng kháng khuẩn tốt nhất, thí nghiệm tiếp theo được tiến hành nhằm khảo sát khả năng kháng đa khuẩn của SC2, SC3 được thực hiện với chủng kiểm định là Samonella. Dựa vào kết quả nghiên cứu thể hiện trên hình 1 cho thấy chủng SC3 (cho đường kình vòng kháng khuẩn 19,6 mm) có khả năng kháng lại vi sinh vật kiểm định Samonella tốt hơn SC2 (cho đường kính vòng kháng khuẩn 9,5 mm) nên SC3 được tuyển chọn để tiến hành cho các nghiên cứu tiếp theo. 45.

<span class='text_page_counter'>(4)</span> Trần Văn Chí và Đtg. Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ. 177(01): 43 - 48. Hình 1. Khả năng kháng khuẩn của chủng SC2 và SC3 đối với Samonella Bảng 3. Khảo sát điều kiện tách bacteriocin từ chủng nghiên cứu Tốc độ ly tâm Vòng kháng khuẩn (R-r) (mm) (vòng/phút) S. aureus E. coli Samonella 5000 24,1* 20,4* 19,6* * * 6000 24,2 20,4 19,6* * * 7000 24,2 20,4 19,6* * * 8000 24,2 20,5 19,5* * * 9000 24,3 20,4 19,5* * * 10000 24,3 20,5 19,5* * * 11000 24,3 20,5 19,5* * * 12000 24,4 20,6 19,5* + + 13000 24,4 20,6 19,5+ + + 14000 24,4 20,6 19,5+ Ghi chú: Vòng kháng khuẩn vẫn còn khuẩn lạc nghiên cứu phát triển (*) Vòng kháng khuẩn không còn khuẩn lạc nghiên cứu phát triển (+). Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chế phẩm bacteriocin thô Các thí nghiệm ở hai nội dung trên đã chứng minh khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy SC3. Tuy nhiên, đây mới chỉ là kết quả nuôi cấy tổng hợp giữa chủng SC3 và chủng kiểm định. Để tách bacterocin ra khỏi dịch nuôi cấy nhằm kiểm tra khả năng kháng khuẩn của dịch nuôi cấy sau khi đã loại bỏ sinh khối vi sinh vật và tạp chất, phương pháp thông thường được sử dụng nhất là ly tâm rồi thu dịch trên, vì vậy thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới độ sạch của dịch bacteriocin thô và khả năng kháng khuẩn của nó đã được thực hiện với quá trình ly tâm khảo sát theo tốc độ từ 5000-14000 vòng/phút 46. và thực hiện ở nhiệt độ 15oC trong thời gian 10 phút. Ec. St Sm. Hình 2. Hoạt tính kháng khuẩn của SC3 với các chủng kiểm định. Kết quả từ bảng 3 và hình 2 cho thấy tốc độ ly tâm hầu như không ảnh hưởng đến tính kháng khuẩn của dịch nuôi cấy chủng vi khuẩn SC3.

<span class='text_page_counter'>(5)</span> Trần Văn Chí và Đtg. Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ. sau ly tâm, nhưng ảnh hưởng đến độ tinh sạch của dịch chứa bacteriocin. Thực nghiệm cho thấy, dịch sau ly tâm với tốc độ từ 5000 – 12000 vòng/phút khi nhỏ vào giếng trên đĩa nuôi cấy kiểm nghiệm vẫn xuất hiện khuẩn lạc của chủng nghiên cứu SC3. Tuy nhiên, với tốc độ 13000 – 14000 vòng/phút thì không còn thấy có sự xuất hiện khuẩn lạc của chủng nghiên cứu. Điều này chứng tỏ với tốc độ ly tâm lớn hơn 13000 vòng/phút sinh khối và các tạp chất bên trong dịch nuôi cấy đã bị loại hết ra khỏi dịch thu được sau khi ly tâm. Vậy tốc độ ly tâm cho việc tách bacteriocin từ dịch cấy để loại bỏ sinh khối và tạp chất là 13000 vòng/phút. Cũng từ bảng 3 cho thấy khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin thô là khác nhau với các chủng kiểm định khác nhau. Trong thí nghiệm được bố trí sử dụng 03 chủng kiểm định Staphylococcus aureus, Samonella, E.coli, thì khả năng kháng Staphylococcus aureus tốt nhất, tiếp đến là E.coli và khả năng kháng Samonella thấp nhất. Cụ thể, hiệu số đường kính vòng kháng khuẩn của dịch nuôi SC3 sau ly tâm với các chủng kiểm định Staphylococcus aureus, E.coli, Samonella lần lượt là: 24,4 mm; 20,6 mm và 19,5 mm. KẾT LUẬN Từ các sản phẩm lên men tự nhiên đã phân lập được 14 chủng vi khuẩn sinh axít lactic và xác định được đặc điểm sinh học, sinh lý và hóa sinh, trong đó có 8 chủng thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tích cực. Từ 8 chủng tích cực đã chọn ra được chủng SC3 có khả năng kháng khuẩn tốt nhất, thể hiện hoạt tính kháng với cả 3 chủng kiểm định Staphylococcus aureus, E.coli, Samonella với hiệu số vòng kháng khuẩn từ 19,5 đến 24 mm. Tốc độ của quá trình ly tâm để tách sinh khối và tạp chất khác nhằm thu hồi bacteriocin thô không ảnh hưởng đến hoạt tính chế phẩm mà chỉ ảnh hướng đến khả độ. 177(01): 43 - 48. sạch của chế phẩm, tốc đô ly tâm 13000 vòng/phút là phù hợp nhất. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Muộn, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội. 2. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội. 3. Bằng Hồng Lam, Nguyễn Hữu Hiệp (2015), “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic chịu nhiệt sinh bacteriocin từ thực phẩm lên men truyền thống”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học An Giang, số 7, tr. 45-51. 4. Lê Thị Hồng Tuyết (2004), Nghiên cứu bcateriocin sản xuất bởi Lactobacillus acidophilus NrrlB – 2092, Luận văn thạc sĩ Sinh học, ĐHQG TPHCM. 5. Dobson A., Cotter P. D., Ross R. P., Hill C. (2012), “Bacteriocin Production: a Probiotic Trait”. Applied Environmental Microbiology, 78(1), pp. 1 – 6. 6. Huhne K., Axelsson L., Holck A., Krockel L. (1996), “Analysis of the sakacin P gene cluster from Lactobacillus sake Lb674 and its expression in sakacin-negative Lb. sake strains”. Microbiology (Reading, Engl.), 142(6), pp. 14371448. PMID 8704983. 7. James G. C. and Natalie (2002). Microbiology – A Labaratory Manual, Nineth Edition, Pearson Education, Inc., Sanfransisco, CA. 8. Juan C. Oscáriz, Antonio G. Pisabarro (2010), “Classification and mode of action of membraneactive bacteriocin produced by gram positive bacteria”, Int. Microbiol., 4, pp. 13-19, DOI 10.1007/s101230100003, published online 25 August 2001. 9. Katla T., Moretro T., Sveen I., Aasen I. M., Axelsson L., Rorvik L. M., Naterstad K. (2002), “Inhibition of Listeria monocytogenes in chicken cold cuts by addition of sakacin P and sakacin Pproducing Lactobacillus sakei”, Journal Applied Microbiology, 93(2), pp. 191-196, DOI 10.1046/j.1365-2672.2002.01675.x PMID 12147066.. 47.

<span class='text_page_counter'>(6)</span> Trần Văn Chí và Đtg. Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ. 177(01): 43 - 48. SUMMARY RESEARCH ON SELECTION OF LACTIC ACID BACTERIA WITH ABILITY TO PRODUCE HIGH BACTERIOCIN FROM NATURAL FERMENTED PRODUCTS Tran Van Chi, Pham Thi Tuyet Mai* TNU – University of Agriculture and Forestry. Lactic acid bacteria (LAB) have been found and used in many traditional fermented products in natural conditions. Recent researches have proved that LAB are able to produce bacteriocin (a biological antibiotic with nature of protein). The aim of this study was to isolate and select LAB capable of producing high bacteriocin from natural fermented products. From six natural fermented products, we isolated 14 LAB strains and identified their biological, physiological, and biochemical characteristics. From the isolated strains, we tested the ability of bacteriocin production which is expressed in the antibacterial activity with control bacteria Staphylococcus aureus, 8 of which exhibited positive antibacterial activity (substraction of antibacterial circle diameters greater than 10 mm). From the 8 above strains, we selected SC3 strain having the highest bacteriocin production, showing activity against all tested strains Staphylococcus aureus, E. coli, Samonella with substraction of antibacterial circle diameters ranged from 19.5 to 24 mm. In addition, research has shown that speed of centrifugation to separate biomass and impurities for recovery of crude bacteriocin does not affect the antimicrobial activity but only affect on purity of the product, the centrifuge speed of 13000 rpm is best suitable. Key words: Bacteriocin, antibiotic, lactic, fermentation, bateria. Ngày nhận bài: 24/10/2017; Ngày phản biện: 16/12/2017; Ngày duyệt đăng: 30/01/2018 *. Tel: 0965 051220, Email: 48.

<span class='text_page_counter'>(7)</span>