Tạo bào tử bacillus subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------

BÙI THU THỦY

TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN
STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HÓA
KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2011


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-----------------------

Bùi Thu Thủy

TẠO BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS BIỂU HIỆN
STREPTAVIDIN GẮN KHÁNG THỂ BIOTINYL HÓA
KHÁNG VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN THỊ VÂN ANH

Hà Nội - 2011


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................... i
BẢNG VIẾT TẮT..................................................................................................... iv
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................3
1.1 BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI
TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ ..........................................................................................3
1.1.1. Nội bào tử vi khuẩn ...........................................................................................3
1.1.2. Bào tử Bacillus subtilis .....................................................................................4
1.2. STREPTAVIDIN ...............................................................................................10
1.2.1. Giới thiệu chung về streptavidin .....................................................................10
1.2.2. Cấu trúc của streptavidin .................................................................................11
1.2.3. Cấu tạo của biotin............................................................................................11
1.2.4. Tƣơng tác streptavidin-biotin ..........................................................................12
1.2.5. Thiết kế trạng thái đơn hóa trị của streptavidin với một vị trí gắn biotin
duy nhất .....................................................................................................................13
1.3. VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM ...................................................15
1.3.1. Giới thiệu chung về bệnh đốm trắng ở tôm và virus gây bệnh đốm trắng ......15
1.3.2. Protein vỏ VP28 của virus WSSV ..................................................................17
1.3.3. Các phƣơng pháp phát hiện virus gây bệnh đốm trắng ở tôm ........................17
1.3.4. Bào tử B. subtilis biểu hiện streptavidin trên bề mặt (bào tử-strep) và ứng
dụng ...........................................................................................................................18

1.4. PHẢN ỨNG NGƢNG KẾT MIỄN DỊCH VÀ ỨNG DỤNG ...........................19
Chƣơng II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .................................................21
2.1. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................21
2.1.1. Chủng vi khuẩn ...............................................................................................21
2.1.2. Các bộ kit ........................................................................................................21
2.1.3. Các cặp mồi .....................................................................................................21
2.1.4. Mẫu tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng ................................................................22
2.1.5. Các nguyên liệu khác ......................................................................................22
2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................23
2.2.1. Tách chiết ADN hệ gen từ vi khuẩn Gram dƣơng ..........................................23
2.2.2. Tách chiết plasmid từ vi khuẩn .......................................................................23
2.2.3. Tách chiết ADN hệ gen của virus từ mẫu tơm nhiễm WSSV.........................24
Khóa 2009-2011

1


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

2.2.4. Nhân bản đoạn gen đích đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR ....................................24
2.2.5. Nhân dịng các đoạn gen đích vào vector pCR 2.1 .........................................25
2.2.6. Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5 ..25

2.2.7. Xử lý plasmid bằng các cặp enzyme giới hạn....................................................26
2.2.8. Phản ứng gắn đoạn gen đích (insert) vào vector bằng T4 ADN ligase...........26
2.2.9. Dung hợp đoạn gen đích vào ADN hệ gen của Bacillus subtilis chủng PY79....27
2.2.10. Kiểm tra sự có mặt của đoạn gen đích trong ADN hệ gen của B. subtilis ........27
2.2.11. Nuôi cấy tạo bào tử .........................................................................................28

2.2.12 Kiểm tra sự biểu hiện của protein dung hợp bằng phƣơng pháp thẩm tách
miễn dịch (Western blotting) ......................................................................................28
2.2.13. Biotinyl hóa kháng thể kháng VP28 .............................................................30
2.2.14. Gắn kháng thể kháng VP28 đã đƣợc biotinyl hóa lên trên bào tử-strep .......30
2.2.15. Nhuộm màu bào tử-strep đã gắn kháng thể kháng VP28-biotinyl ................31
2.2.15. Thu dịch nghiền có chứa virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm sú nhiễm
bệnh ...........................................................................................................................31
2.2.16. Phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc (Reverse passive latex agglutination) 31
2.2.17. Định lƣợng số bản copies của WSSV bằng kỹ thuật PCR đúng thời điểm
(Realtime PCR) .........................................................................................................31
Chƣơng III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................33
3.1. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN STREPTAVIDIN VÀO VECTOR PDG364 COTB
VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B. subtilis .............................................................33
3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa cotB và streptavidin bằng phƣơng pháp PCR ... Để
thu đƣợc lƣợng lớn đoạn gen mã hóa cho streptavidin từ nguồn ADN hệ gen của
Streptomyces avidinii và cotB từ ADN hệ gen của B. subtilis chúng tơi tiến hành
thực hiện phản ứng PCR với chu trình nhiệt cho từng đoạn gen nhƣ sau: ...............33
3.1.2. Nhân dòng đoạn gen cotB vào vector pDG364...............................................35
3.1.3. Nhân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB ..........................37
3.1.4. Đƣa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin trên vector vào hệ gen B. subtilis ....40
3.2. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP COTBSTREPTAVIDIN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ B. subtilis..........................................42
3.2.1. Kiểm tra khả năng tạo bào tử của tế bào B. subtilis tái tổ hợp........................42
3.2.2. Kiểm tra biểu hiện của cotB-streptavidin trên bào tử bằng phƣơng pháp
thẩm tách miễn dịch ..................................................................................................43

Khóa 2009-2011

2

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

3.3. ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ LIÊN KẾT CỦA BÀO TỬ-STREP VỚI KHÁNG THỂ
KHÁNG VP28-BIOTINYL. .....................................................................................44
3.3.1. Đánh giá mức độ liên kết của bào tử-strep với kháng thể đa dòng
kháng VP28-biotinyl .................................................................................................45
3.3.2. Đánh giá hằng số phân ly của phức hệ bào tử-strep- kháng thể
kháng VP28-biotinyl .................................................................................................48
3.4. PHẢN ỨNG NGƢNG KẾT MIỄN DỊCH THỤ ĐỘNG KIỂM TRA
SỰ CÓ MẶT CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM WSSV. .....50
3.4.1. Xác định nồng độ virus trong dịch nghiền bằng Realtime PCR .....................51
3.4.2. Đánh giá khả năng hình thành ngƣng kết giữa bào tử-strep gắn kháng thể
đa dòng kháng VP28-biotinyl với dịch nghiền tơm nhiễm WSSV ...........................54
3.4.3. Đánh giá khả năng hình thành phản ứng ngƣng kết giữa bào tử-strep gắn
kháng thể kháng VP28-biotinyl với các nồng độ virus pha loãng ............................56
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO .....................................................................60
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................61
I. TÀI LIỆU TRONG NƢỚC ...................................................................................61
II. TÀI LIỆU NƢỚC NGỒI ...................................................................................61

Khóa 2009-2011

3


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1

Hình ảnh hiển vi điện tử quét của bào tử Bacillus subtilis

4

Hình 2

Hình dạng ngồi của nội bào tử B. subtilis

4

Hình 3

Cấu tạo nội bào tử B. subtilis.

5

Hình 4

Chu kỳ sống của bào tử

6

Hình 5

Ảnh điện di SDS-PAGE một số protein của lớp áo ngồi bào tử

8

Hình 6

Trình tự axit amin của cotB với 3 trình tự lặp lại liên tiếp đƣợc gạch
chân gồm 27 axit amin giàu serine

9

Hình 7

Hệ thống biểu hiện trên bề mặt bào tử sử dụng protein của lớp áo
bào tử

9

Hình 8

Trình tự gồm 183 axit amin của streptavidin

11

Hình 9

Cấu trúc không gian của Streptavidin với 4 tiểu phần giống nhau

11

Hình 10

Cơng thức cấu tạo và cấu hình khơng gian của biotin

12

Hình 11

Tƣơng tác giữa 4 phân tử trytophan với biotin

12

Hình 12

Mạng lƣới liên kết hydro trong vùng tƣơng tác giữa streptavidin với
biotin

13

Hình 13

Cấu trúc thịng lọng (loop) của streptavidin

13

Hình 14

Streptavidin dạng đơn hóa trị

14

Hình 15

Tơm bị bệnh đốm trắng với các đốm trắng xuất hiện ở đầu

15

Hình 16

Virus gây bệnh đốm trắng ở tơm

16

Hình 17

Phản ứng ngƣng kết hồng cầu

19

Hình 18

Phƣơng thức chèn của gen dung hợp vào ADN hệ gen B. Subtilis

27

Hình 19

Sơ đồ vector pDG364

21

Hình 20

Sơ đồ tóm tắt các bƣớc tạo vector tái tổ hợp pDG 364 cotB
streptavidin

32

Hình 21

Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen streptavidin và
cotB

33

Khóa 2009-2011

i


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c
Hình

Bùi Thu Thủ y
Tên hình

Trang

Hình 22

Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn của vector pDG364

35

Hình 23

Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra các khuẩn lạc bằng cặp mồi
364Fw/Rv

36

Hình 24

Kết quả điện di sản phẩm sau khi tinh sạch gel của streptavidin và
pDG 364 cotB

37

Hình 25

Kết quả điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c bằ ng că ̣p mồ i
của vector pDG 364

38

Hình 26

Kết quả điện di sản phẩ m PCR ki ểm tra thể tái tổ hợp bằng các cặp
mồi

39

Hình 27

Kết quả điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn của vector tái tổ hợp
pDG364 cotB-streptavidin

40

Hình 28

Xƣ̉ lý enzyme giới ha ̣n cho pDG364-cotB-streptavidin

41

Hình 29

Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong ADN hệ gen Bacillus
subtilis

42

Hình 30

Bào tử quan sát dƣới kính hiển vi laser qt

43

Hình 31

Kết quả thẩm tách miễn dịch kiểm tra sự biểu hiện của protein dung
hợp

44

Hình 32

Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa
dịng

45

Hình 33

Mẫu bào tử-strep gắn với kháng thể đa dịng kháng VP28-biotinyl
sau 2 tháng bảo quản

46

Hình 34

Kiểm tra khả năng gắn của bào tử với kháng thể biotinyl hóa đa
dịng

47

Hình 35

Biểu đồ thể hiện lƣợng kháng thể kháng VP28-biotinyl hấp phụ trên
bào tử-strep ở các nồng độ kháng thể khác nhau

49

Hình 36

Hình dạng của ngƣng kết

51

Hình 37

Kiểm tra sự có mặt của virus trong mẫu dịch nghiền

52

Hình 38

Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra WSSV ở các nồng độ pha
lỗng

52

Khóa 2009-2011

ii

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Hình 39

Kết quả realtime xác đinh số bản copies trong dung dịch virus ở các
nồng độ pha lỗng

54

Hình 40

Kiểm tra khả năng hình thành phản ứng ngƣng kết của bào tử

55

Hình 41

Phản ứng ngƣng kết giữa bào tử-strep-kháng thể kháng VP28 đa
dịng với các nồng độ WSSV pha lỗng

57

Hình 42

Phản ứng ngƣng kết giữa bào tử-strep-kháng thể đơn dòng kháng
VP28- biotinyl với các nồng độ virus pha lỗng

59

Khóa 2009-2011

iii


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y
BẢNG VIẾT TẮT

APS

Ammonium Persulphate

BSA

Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)

CBB

Coomassie Blue Brillant

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

kDa

Kilodalton

LB

Luria Bertani

PAGE

Điện di gel polyacrylamide (Polyarylamide Gel Electrophoresis)

PBS

Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PMSF

Phenyl Methylsulphonyl Fluoride

PVDF

Polyvinylidere Fluoride

RPLA

Phản ứng ngƣng kết thụ động ngƣợc ( Reverse Passive Latex
Agglutination)

SDS

Sodium Dodecyl Sulphate

TEMED

N, N, N’, N’-Tetramethyl-Ethylenediamine

WSSV

Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)

Khóa 2009-2011

iv


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

MỞ ĐẦU
Bào tử Bacillus subtilis là một trong những đối tƣợng nghiên cứu đƣợc
nhiều nhà khoa học quan tâm nhờ tính chất bền nhiệt, khơng độc hại, đặc biệt
nhấ t là các cơng trình nghiên cứu về hệ thống biểu hiện protein trên bề mặt của

bào tử. Hệ thống biểu hiện này sử dụng một protein của lớp áo bào tử làm yếu tố
dung hơ ̣p, gắ n với mô ̣t protein ngoa ̣i lai nhằ m biể u hiê ̣n protein này trên bề mă ̣ t
bào tử đó. Protein ngoa ̣i lai có thể là một kháng nguyên hay các protein làm đầ u
dò v.v... Nhƣ̃ng ƣ́ng du ̣ng của hê ̣ thố ng này trải rô ̣ng trên nhiề u liñ h vƣ̣c , nổ i bâ ̣t
nhấ t là tiề m năng ta ̣o ra thế hê ̣ vaccine mới có thể sƣ̉ du ̣ng qua đƣờng uố ng hay
đƣờng mũi, hay ta ̣o ra các chấ t hoa ̣t hóa sinh ho ̣c, chấ t bám dính sinh ho ̣c v.v...
Streptavidin tƣ̀ lâu đã đƣơ ̣c con ngƣời biế t đế n trong rấ t nhiề u ƣ́ng du ̣ng
quan tro ̣ng chủ yế u th ̣c liñ h vƣ̣c Hóa sinh học và Sinh y ho ̣c, liên quan đế n khả
năng liên kế t đă ̣c biê ̣t của nó với biotin hoặc với các phân tử đã đƣợc biotinyl
hóa. Bào tử Bacillus subtilis biể u hiê ̣n streptavidin trên bề mă ̣t (gọi tắt là bào tửstrep) hƣ́a he ̣n đem la ̣i nhi ều tiề m năng ƣ́n g du ̣ng. Bào tử-strep có thể đƣợc sử
dụng nhƣ một chất mang “đa dụng” nhờ khả năng gắn với phân tử đƣợc biotinyl
hóa với nhiều ƣu điểm nhƣ bền nhiệt, bền với các tác nhân lý hóa học, kích
thƣớc đồng nhất cỡ micromet, hy vọng sẽ có khả năng “chuyên chở” các kháng
nguyên của vi sinh vật, các enzyme, các kháng thể để phục vụ cho các mục đích
phân tích hay ứng dụng khác nhau.
Virus gây bệnh đốm trắng ở tôm (WSSV) là loại virus gây bệnh nghiêm
trọng và phổ biến ở tôm nuôi, là nguyên nhân chủ yếu gây ra những tổn hại kinh
tế lớn đối với ngành công nghiệp tơm trên tồn thế giới. Hiện nay, chƣa có một
biện pháp chữa trị hữu hiệu nào đối với bệnh bệnh do virus WSSV gây ra. Do
vậy, phát hiện sớm virus gây bệnh đóng vai trị quan trọng và then chốt trong
việc phòng ngừa bệnh do virus đốm trắng gây ra. Rất nhiều phƣơng pháp đã
đƣợcsử dụng để phát hiện sự có mặt của WSSV tơm giống hay ao ni nhƣ
PCR, hóa mơ miễn dịch, que thử nhanh. Tuy nhiên những phƣơng pháp này chỉ
phù hợp trong điều kiện phịng thí nghiệm nên không thuận tiện cho việc xét
nghiệm nhanh trên thực địa (nhƣ đầm, ao nuôi... ) đồng thời giá thành xét
nghiệm cũng cịn rất cao.

Khóa 2009-2011

1

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Xuấ t phát tƣ̀ thƣ̣c tế đó , chúng tôi thực hiện đề tài “ Tạo bào tử Bacillus
subtilis biểu hiện streptavidin gắn kháng thể biotinyl hóa kháng virus gây
bệnh đốm trắng ở tơm” với mục đích tạo bào tử-strep và gắn kết bào tử này với
kháng thể kháng VP28 của virus gây bệnh đốm trắng đã đƣợc biotinyl hóa nhằm
phát hiện sự có mặt của virus đốm trắng trong mẫu tôm thông qua phản ứng
ngƣng kết. Cùng với phƣơng pháp sắc ký miễn dịch, đây là phƣơng pháp có
nhiều ƣu điểm nhƣ thao tác đơn giản, dễ dàng, và có thể tiến hành ngay tại ruộng
ni.

Khóa 2009-2011

2


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Chƣơng I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 BÀO TỬ BACILLUS SUBTILIS VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI
TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
1.1.1. Nội bào tử vi khuẩn
Nội bào tử là một dạng sống đặc biệt của vi khuẩn, gặp ở một số vi khuẩn
Gram dƣơng (Bacillus, Clostridium, Sporosarcina...) cũng nhƣ Gram âm

(Sporomusa), đƣợc hình thành khi mơi trƣờng sống trở nên khắc nghiệt nhƣ thiếu
dinh dƣỡng, nhiệt độ cao… Vì mỗi tế bào chỉ sinh ra một bào tử nên đây khơng
phải là loại bào tử có chức năng sinh sản nhƣ ở nấm [1].
Nội bào tử có khả năng đề kháng cao với nhiệt độ (có thể lên tới 900C), với
tia tử ngoại, tia gamma và các hóa chất diệt khuẩn cũng nhƣ với sự khơ hạn. Trong
thời kì nghỉ, bào tử của vi khuẩn không thể hiện bất cứ một hoạt động trao đổi chất
nào. Ngƣời ta gọi đó là trạng thái sống ẩn (cryptobiosis). Tuổi thọ của nội bào tử
gần nhƣ vô hạn. Ngƣời ta đã phân lập đƣợc bào tử sống từ mật ong hóa thạch có
tuổi 25 triệu năm và thậm chí từ một tinh thể muối 250 triệu năm tuổi.
Do tính đề kháng cao nhƣ vậy nên nội bào tử có tầm quan trọng thực tiễn lớn
trong các lĩnh vực vi sinh vật học thực phẩm, công nghiệp và y học. Sử dụng bào tử
trong nghiên cứu có nhiều thuận lợi. Thứ nhất là do tính bền và tính ổn định của nó
nhƣ đã đƣợc đề cập ở trên. Thứ hai, độ an toàn của bào tử đã đƣợc chứng minh bởi
trong thực tế, con ngƣời đã sử dụng rất nhiều loài nhƣ B. subtilis, B. natto làm thành
phần phụ gia hay trong các sản phẩm chữa trị các bệnh liên quan đến hệ tiêu hoá.
Một số sản phẩm làm từ bào tử đƣợc sản xuất rộng rãi ở phạm vi công nghiệp [10].
Hơn nữa, một thực thể phức tạp nhƣ vậy (ở B. subtilis có tới hơn 200 gen tham gia
vào sự hình thành nội bào tử) mà có thể đƣợc tạo ra chỉ trong vài giờ (6-8 giờ ở đa
số trƣờng hợp) theo một phƣơng thức chặt chẽ, sẽ rất thích hợp cho việc nghiên cứu
để thiết kế các cấu trúc sinh học phức tạp.
Hiện nay, bào tử đƣợc nghiên cứu chủ yếu thuộc hai chi Bacillus và
Clostridium. Clostridium sống kị khí và khi sinh bào tử, tế bào bị biến dạng thành
hình thoi trong khi Bacillus sống hiếu khí và tế bào khơng bị biến dạng khi sinh bào
tử [15]. Chính nhờ những ƣu điểm này mà Bacillus (hình 1) trở thành đối tƣợng
nghiên cứu lý tƣởng hơn cả trong phịng thí nghiệm.

Khóa 2009-2011

3

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Hình 1: Hình ảnh hiển vi điện tử quét của bào tử Bacillus subtilis [22]

1.1.2. Bào tử Bacillus subtilis
1.1.2.1. Cấu tạo nội bào tử B.subtilis
Về hình dạng, bào tử trƣởng thành có hình cầu hoặc elip (hình 2), đƣờng
kính khoảng 0.8-1.2 µm.

Hình 2: Hình dạng ngồi của nội bào tử B. subtilis [30]

Về cấu tạo, nội bào tử có các lớp bao bọc sau đây (tính từ ngồi vào): ngoài
cùng là một lớp vỏ ngoài (exosporium) mỏng, là các phần sót lại của tế bào mẹ, có
thể có hoặc khơng. Tiếp đó là đến lớp áo bào tử (spore coat) dày khoảng 3 nm, chứa
3-15 lớp protein (chiếm 50-80% protein tổng số của bào tử), không thấm đối với
nhiều phân tử chất độc, chịu trách nhiệm đối với tính kháng hóa chất của nội bào tử.
Các nghiên cứu cịn cho thấy áo bào tử chứa một số enzyme tham gia vào sự nảy
mầm của bào tử. Nằm dƣới áo bào tử là lớp vỏ (cortex), chiếm 36-60% thể tích của
nội bào tử, đƣợc cấu tạo từ peptidoglican nhƣng chứa ít liên kết chéo hơn so với tế
bào dinh dƣỡng. Áp suất thẩm thấu của lớp vỏ này lên tới 20 atm, lƣợng nƣớc là
70% (lƣợng nƣớc của tế bào dinh dƣỡng là 80%), cao hơn nhiều so với lƣợng nƣớc
trung bình trong bào tử (khoảng 40%). Cuối cùng là thành bào tử (hay thành của
Khóa 2009-2011

4

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

lõi- spore wall) bao quanh thể sinh chất hay lõi (core). Lõi chứa các cấu trúc thông
thƣờng của tế bào nhƣ các ribosome và một thể nhân, nhƣng không hoạt động về
mặt trao đổi chất (hình 3).

Hình 3: Cấu tạo nội bào tử B. subtilis. IC (Inner coat): lớp áo trong. OC (outer
coat): lớp áo ngoài. Cx (cortex): lớp vỏ. gap: khoảng trống giữa lớp áo trong với lớp
vỏ. Cl: khối bắt màu tối chƣa rõ thành phần cấu tạo [8].
Cho đến nay ngƣời ta cịn chƣa biết chính xác tại sao nội bào tử có tính
kháng nhiệt và kháng các tác nhân gây chết khác cao đến nhƣ vậy. 15% trọng lƣợng
khô của nội bào tử là axit dipicolinic đƣợc kết hợp với các ion canxi. Vai trò chính
xác của axit dipicolinic cịn chƣa đƣợc biết rõ, song canxi trợ giúp tính đề kháng với
nhiệt độ, độ ẩm, các tác nhân oxy hóa, và đơi khi, có thể dipicolinat canxi làm bền
các axit nucleic của bào tử. Gần đây ngƣời ta tìm thấy trong nội bào tử một loại
protein hịa tan trong axit có khối lƣợng phân tử thấp liên kết với ADN. Nó bão hịa
ADN của bào tử và bảo vệ ADN chống lại sức nóng, các bức xạ, sự khơ hạn và hóa
chất.
Hàm lƣợng nƣớc thấp (10-30% so với tế bào dinh dƣỡng) của thể sinh chất
(lõi) giữ vai trị quan trọng trong tính đề kháng với nhiệt, trong khi đó chúng ta biết
rằng nhiệt độ phá hủy tế bào bằng cách làm bất hoạt ADN và protein, và q trình
này địi hỏi một lƣợng nƣớc nhất định trong thể sinh chất. Áo bào tử hình nhƣ cũng
bảo vệ chống lại các enzyme và hóa chất nhƣ H2O2. Cuối cùng, bào tử chứa một số
Khóa 2009-2011

5

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

enzyme sửa chữa ADN. ADN sẽ đƣợc sửa chữa trong quá trình nảy mầm và tăng
trƣởng sau khi lõi đã đƣợc hoạt hóa trở lại. Sự hình thành bào tử thƣờng xảy ra khi
trong môi trƣờng thiếu chất dinh dƣỡng, đặc biệt là thiếu nguồn cacbon hay nitơ hay
có sự tích lũy các sản phẩm trao đổi chất có hại. Về mặt hình thái, có thể chia q
trình này thành các giai đoạn [2] (hình 6):
-

Hình thành những búi chất nhiễm sắc.

-

Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo ra một vùng nhỏ gọi là tiền
bào tử.

-

Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ.

-

Lớp áo sơ khai hình thành giữa 2 lớp màng sau khi đã tích lũy nhiều
peptidoglycan và tổng hợp axit dipicolinic và tích lũy canxi.

-

Kết thúc hình thành áo bào tử. Bào nang vỡ ra, bào tử thoát ra ngồi.

Hình 4: Chu kỳ sống của bào tử [25]

Sự nảy mầm bào tử sẽ xảy ra khi có mặt nƣớc và một sự kích thích do hóa
chất hoặc do môi trƣờng (nhân tố nảy mầm). Khi đã đƣợc khởi động, q trình nảy
mầm hồn thành rất nhanh (khoảng 90 phút). Nhân tố nảy mầm thay đổi tùy loài,
song thƣờng là một phân tử chất hữu cơ nhỏ nhƣ một axit amin, hoặc một muối vô
cơ. Nhân tố này sẽ kích thích sự tạo thành các enzyme thủy phân bởi màng bào tử.
Các enzyme có vai trò phân gi ải các lớp áo và để cho lõi có cơ hội tiếp xúc với
nƣớc. Khi lõi đã hấp thụ đƣợc nƣớc và các chất dinh dƣỡng, nó sẽ bắt đầu tăng
trƣởng ra phía ngồi vỏ.
1.1.2.2. Một số protein đặc trƣng của lớp áo bào tử B. subtilis
Trong các thành phần cấu tạo của bào tử, đối tƣợng đƣợc quan tâm hơn cả là
lớp áo. Chính nhờ lớp áo này mà bào tử có khả năng chống lại các dung mơi hữu cơ
Khóa 2009-2011

6


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

hay lysozyme có ở mơi trƣờng ngồi. Gần đây, những tài liệu về bào tử đã cho thấy
rằng lớp áo bào tử thực ra rất linh động, có thể co lại hoặc phồng to [14]. Chính nhờ
đặc điểm then chốt đó mà tế bào có thể khử nƣớc trong quá trình hình thành bào tử
và hút nƣớc vào để nảy mầm.
Ở B. subtilis ngƣời ta đã tìm thấy có ít nhất hơn 20 loại polypeptide có mặt ở
lớp áo của bào tử, chia thành hai lớp là lớp áo trong và lớp áo ngoài. Bảng 1 liệt kê
một số loại peptide này [8].

Bảng 1: Một số protein trong lớp áo bào tử vi khuẩn B. subtilis
Loại
KLPT
peptide (kDa)

Vị trí trong bào
Vai trị
tử

cotA

65

Lớp áo ngồi

Chƣa biết rõ

cotB

59

Lớp áo ngồi

Chƣa biết rõ

cotC

12

Lớp áo ngoài

Chƣa biết rõ

cotD

11

Lớp áo ngoài

Chƣa biết rõ

cotE

24

Lớp áo ngoài

Cần cho q trình hình thành lớp áo ngồi

cotG

24

Lớp áo ngồi

Điều khiển quá trình lắp ráp của cotB

cotH

42,8

Lớp áo trong

Điều khiển q trình lắp ráp của các protein ở
lớp áo ngồi

Lớp áo ngoài là nơi tập trung của 4 loại protein chính (hình 5) là cotA (65
kDa), cotB (59 kDa), cotG (37 kDa), cotC (12 kDa). cotB, cotG và cotC đều chứa
những trình tự lặp lại 12-13 axit amin khơng phổ biến giàu lysine và tyrosine [15].
Tuy nhiên, cho đến nay, vai trị vị trí chính xác của nhiều loại protein bề mặt vẫn
chƣa đƣợc tìm hiểu cặn kẽ. Trên thế giới, những nghiên cứu ban đầu để biểu hiện
một protein ngoại lên bề mặt bào tử mới chỉ tập trung chủ yếu vào hai loại protein
của lớp áo là cotB và cotC. Trên thực tế, hai yếu tố này của lớp áo dƣờng nhƣ
khơng đóng vai trị cần thiết cho quá trình sinh nội bào tử cũng nhƣ sự nảy mầm.
Điều đó càng khẳng định ƣu thế và tiềm năng sử dụng cotB hay cotC trong hệ thống
biểu hiện bề mặt. Tuy nhiên, trong khuôn khổ nghiên cứu này, chúng tơi đã lựa
chọn nghiên cứu cotB và sử dụng nó để dung hợp với một protein khác nhằm biểu
hiện protein ngoại lai này trên bề mặt bào tử B. subtilis

Khóa 2009-2011

7


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Hình 5: Ảnh điện di SDS-PAGE một số protein của lớp áo ngoài bào tử [7,12 ].

1.1.2.3. CotB - yếu tố dung hợp
Nhƣ đã đề cập ở trên, cotB là một protein nằm ở lớp áo ngoài của bào tử.
Gen mã hoá cho cotB chịu sự điều khiển bởi hai yếu tố là σκ và GerE, một loại
protein gắn với ADN. Quá trình sao chép gen cotB chỉ diễn ra trong tế bào mẹ mà
không xảy ra ở trong tế bào đã tạo bào tử. Khi đã đƣợc tổng hợp trong tế bào chất
của tế bào mẹ, cotB đƣợc lắp ráp xung quanh vùng tạo bào tử. Ngƣời ta cũng đã tìm
đƣợc những bằng chứng cho thấy mối quan hệ phụ thuộc giữa cotB với các yếu tố
cotE, cotG và cotH trong quá trình lắp ráp và hình thành dạng cấu trúc cuối cùng
của cotB [14]. Cũng giống nhƣ cotC, cotB và protein ngoại lai đƣợc dung hợp với
nó sẽ không phải trải qua bƣớc chuyển dời qua màng tế bào nhƣ những hệ thống
biểu hiện ở các vi khuẩn khác nhƣ vi khuẩn gram âm, gram dƣơng hay nấm men.
Đây cũng chính là một trong những ƣu điểm nổi bật khi sử dụng bào tử làm hệ
thống biểu hiện bề mặt [6].
CotB có đầu tận cùng C ƣa nƣớc mạnh đƣợc tạo bởi trình tự lặp lại gồm 27
axit amin giàu serine, glutamine và lysine (Hình 6) trong đó serine chiếm tới hơn
50% ở vùng đầu C.

Khóa 2009-2011

8


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Hình 6: Trình tự axit amin của cotB với 3 trình tự lặp lại liên tiếp đƣợc gạch
chân gồm 27 axit amin giàu serine [156

Việc thiết kế một protein dung hợp trong đó sử dụng cotB làm protein

chuyên chở và biểu hiện protein dung hợp này trên bề mặt bào tử đã đƣợc tiến hành
trong nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới, bƣớc đầu thu đƣợc nhiều kết quả khi
đƣa vào thử nghiệm thực tế [13,14]. Những hệ thống này có thể đƣợc miêu tả nhƣ
hình 7 dƣới đây.

Hình7: Hệ thống biểu hiện trên bề mặt bào tử sử dụng protein của lớp áo bào tử.
Protein dung hợp gồm phần màu xanh dƣơng là protein chuyên chở và phần màu
hồng là một protein ngoại lai [14]

Dựa trên nguyên tắc thiết kế protein dung hợp nhƣ trên, nhiều nhà nghiên
cứu đã tiến hành biểu hiện nhiều loại kháng nguyên của vi khuẩn lên bề mặt bào tử
với tiềm năng tạo ra một thế hệ vaccine thứ hai bền, dễ bảo quản và dễ sử dụng.
Khóa 2009-2011

9


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Một trong những kháng nguyên đƣợc biểu hiện thành cơng trên bề mặt bào tử B.
subtilis đó là đoạn peptide 459 axit amin đầu C của độc tố uốn ván (C- terminal
fragment of the tetanus toxin, viết tắt là TTFC) với cotB là thành phần dung hợp.
Ngƣời ta ƣớc tính đƣợc rằng có tới 1,5x103 phân tử TTFC đƣợc biểu hiện trên bề
mặt của mỗi bào tử, đƣợc phát hiện bởi kháng thể đặc hiệu của TTFC. Quá trình thử
nghiệm đƣợc tiến hành trên chuột và cho thấy hàm lƣợng kháng thể đặc hiệu với
TTFC trong huyết thanh đã đạt đƣợc mức đáng kể sau 33 ngày uống, trong khi đó
cơ thể phản ứng lại lớp protein có ở lớp áo bào tử tƣơng đối thấp [13,31]. Rất gần
đây, nhóm nghiên cứu của D. Ning và cộng sự đã sử dụng hai yếu tố dung hợp là

cotB và cotC để chế tạo thành công bào tử B. subtilis biểu hiện kháng nguyên VP28
của virus gây bệnh đốm trắng WSSV (gọi tắt là bào tử-VP28). Bào tử-VP28 sau đó
đƣợc sử dụng nhƣ là vaccine dạng uống và đƣợc bổ sung vào thức ăn cho tôm càng
xanh. Những số liệu thu đƣợc đã cho thấy, sau khi lây nhiễm virus gây bệnh đốm
trắng, tỷ lệ tử vong của lơ thí nghiệm cho ăn bào tử-VP28 là 53,3-60% trong khi đó
với lơ đối chứng không bổ sung bào tử vào thức ăn thì tỷ lệ tử vong là 96,7%.
Những kết quả ban đầu đã cho thấy bào tử biểu hiện VP28 có khả năng kích thích
khả năng chống lại bệnh đốm trắng ở tôm càng xanh [8]. Những nghiên cứu này đã
gợi ra hƣớng đi mới trong sản xuất vaccine thế hệ mới có thể dùng qua đƣờng uống
hay dạng xịt mũi, phòng chống một số bệnh nguy hiểm hiện nay nhƣ vaccine cho
bệnh lao ở ngƣời, bệnh đốm trăng ở tôm... Nhờ thuộc tính bền và có thể bảo quản
trong một thời gian dài của bào tử, cùng với thao tác đơn giản, dễ dàng, đem lại
hiệu quả kinh tế cao mà bào tử đã trở thành đối tƣợng lý tƣởng cho việc phát triển
vaccine thế hệ mới.
1.2. STREPTAVIDIN
1.2.1. Giới thiệu chung về streptavidin
Kể từ khi đƣợc phát hiện ra vào những năm 1960 bởi Chaiet và cộng sự,
streptavidin đã đƣợc ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y học và sinh học, đặc biệt
trong hoá sinh và sinh học phân tử [5, 17]. Protein này đƣợc sinh ra bởi
Streptomyces avidinii, có khối lƣợng phân tử khoảng 60 kDa, gồm 4 tiểu đơn vị
giống hệt nhau (nên đƣợc gọi là tetraprotein). Gen streptavidin mã hóa cho trình tự
gồm 183 axit amin trong đó 24 vị trí đầu tiên là các trình tự tín hiệu. Streptavidin
trƣởng thành (mature protein) bao gồm 159 axit amin [4]. Streptavidin lõi tạo thành
sau quá trình biến đổi sau dịch mã chỉ còn 125-127 axit amin với vị trí bắt đầu
thƣờng là Ala-13 hoặc Glu-14 (hình 8).
Khóa 2009-2011

10

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Hình 8: Trình tự gồm 183 axit amin của streptavidin (A), protein trƣởng thành của
nó (B) và trình tự lõi gồm 125-127 axit amin (C) [18].

Tính chất đặc trƣng của tetraprotein này liên quan tới khả năng liên kết với
biotin, một nhân tố sinh trƣởng hay còn đƣợc gọi là vitamin H [16]. Với hằng số
phân ly của phức hệ là Kd ~ 4x10-14 mol/L, đây có thể coi là một trong những liên
kết phi hoá trị mạnh nhất đƣợc biết đến từ trƣớc tới nay. Biotin có thể gắn dễ dàng
với nhiều loại phân tử sinh học nhƣ protein, axit nucleic, cacbohydrate, làm cho
những phân tử này có thể liên kết với streptavidin [6]. Chính nhờ đặc tính quý giá
đó mà streptavidin đƣợc ứng dụng khá rộng rãi trong thực tiễn.
1.2.2. Cấu trúc của streptavidin
Mỗi tiểu đơn vị streptavidin gồm 8 chuỗi β chạy song song kề sát nhau, gắn
với nhau bằng liên kết hydro, tạo thành cấu trúc khoang β (β- barrel structure). Mỗi
chuỗi β kéo dài với tận cùng là cấu trúc kẹp tóc (hay thịng lọng), vị trí liên kết với
biotin nằm ở phía trong khoang. Hai tiểu đơn vị liên kết với nhau bằng liên kết
hydro tạo thành dạng dime đối xứng [18]. Cấu trúc đối xứng này đƣợc thấy rõ ở cấu
hình khơng gian ba chiều của nó (hình 9).

Hình 9: Cấu trúc không gian của streptavidin với 4 tiểu phần giống nhau [20].

1.2.3. Cấu tạo của biotin

Khóa 2009-2011

11

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Biotin còn đƣợc biết đến dƣới cái tên vitamin H hay B7, có cơng thức hóa
học là C10H16N2O3S. Đây là một hợp chất không thể thiếu ở mọi cơ thể sinh vật.
Chức năng chính của nó là vận chuyển nhóm cacboxyl và là cofactor cho nhóm
enzyme xúc tác cho phản ứng cacboxyl hố.
Về cấu tạo, biotin gồm hai vịng cyclopentane và axit béo valeric ở chuỗi
bên, nhóm cacboxyl ở đầu tận cùng (hình 10). Khối lƣợng phân tử của nó khoảng
244 Da [18].
Hiện nay trên thị trƣờng, biotin đƣợc nhiều hãng sản xuất dƣới dạng gắn
thêm các nhóm chức nhƣ succimidyl hay maleimide. Dƣới dạng này, biotin có thể
gắn dễ dàng với các protein thông qua liên kết với gốc sulfhydro hay axit amin
lysine của phân tử protein.

Hình10: Cơng thức cấu tạo và cấu hình khơng gian của biotin [24]

1.2.4. Tƣơng tác streptavidin-biotin
Giải thích về liên kết bền giữa streptavidin và biotin, năm 1989, hai nhóm
nghiên cứu của Weber và Hendrickson đã đƣa ra ba nguyên nhân chính: Thứ nhất là
do tƣơng tác kị nƣớc và lực Van der Waals giữa Trp-79, Trp-92, Trp-108 của một
tiểu đơn vị và Trp-120 của tiểu đơn vị đối xứng kề nó với biotin [28] (hình 11).

Hình 11: Tƣơng tác giữa 4 phân tử trytophan (màu xanh) với biotin (màu vàng) [28]

Khóa 2009-2011

12

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Thứ hai là do mạng lƣới liên kết hyđro giữa phân tử biotin với các axit amin của
streptavidin (hình 12).

Hình 12: Mạng lƣới liên kết hydro trong vùng tƣơng tác giữa streptavidin với biotin [26]

Cuối cùng là nhờ cấu trúc thịng lọng (loop) ở cuối chuỗi β (hình 12)

Hình 13: Cấu trúc thòng lọng (loop) của streptavidin [27]

Hiểu rõ về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của hệ thống ái lực cao
này đem lại nhiều lợi ích cho việc thiết kế thuốc mới hay những chất gắn (ligand)
cho protein và axit nucleic.
1.2.5. Thiết kế trạng thái đơn hóa trị của streptavidin với một vị trí gắn biotin
duy nhất
Ở trạng thái chỉ có một tiểu đơn vị duy nhất, ái lực giữa streptavidin và
biotin sẽ giảm ít nhất 104 lần vì vị trí gắn biotin của streptavidin đều có sự tham gia
của tiểu phần bên cạnh. Tuy nhiên, đây vẫn là một hằng số lý tƣởng để các nhà
nghiên cứu hƣớng đến việc thiết kế và tạo ra streptavidin đơn tiểu phần với nhiều
tiềm năng ứng dụng [10].
Khóa 2009-2011

13

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

Phƣơng pháp chủ yếu hiện nay để tạo ra streptavidin trạng thái đơn hóa trị là
gây đột biến dẫn tới thay đổi axit amin ở một số vị trí. Tuy nhiên, không phải sự
thay thế nào cũng đem lại kết quả. Tạo đột biến thay thế đồng thời asparagine 23
thành alanine (N23A) và serine 27 (S27D) thành aspartate đã làm giảm ái lực giữa
streptavidin với biotin nhiều lần, giá trị Kd chỉ còn khoảng 7x10-5. Trong một
nghiên cứu khác, ngƣời ta đã tiến hành gây đột biến thay thế Asn 23 và Ser 45
thành alanine, Ser 27 đổi thành aspartate. Dạng đột biến thu đƣợc sẽ đƣợc trộn với
dạng nguyên thủy ban đầu đã đƣợc gắn thêm đuôi gồm 6 Histidin (6Histag) theo tỷ
lệ 3:1. Quá trình tái cuộn gập đƣợc tiến hành ngay sau đó trong đệm muối
phosphate PBS (phosphate buffered saline). Cuối cùng hỗn hợp sẽ đƣợc tinh sạch
nhờ cột Nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA). Bằng cách này ngƣời ta đã thiết kế
đƣợc streptavidin ở dạng tetramer trong đó có ba tiểu phần đã bị bất hoạt và chỉ có
một tiểu phần duy nhất có thể gắn với biotin với ái lực gần nhƣ bằng dạng nguyên
thủy ban đầu (hình 14A và 14B) với hằng số phân ly của streptavidin dạng đơn hóa
trị lên tới Kd ~ 4,8x10-14 ± 0,5x10-14 [20].

A

B

Hình 14: Streptavidin dạng đơn hóa trị
Khóa 2009-2011

14

Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

A: Dạng tetramer ban đầu với 4 vị trí gắn với biotin đƣợc thiết kế thành dạng đơn
hóa trị với 3 tiểu phần bị bất hoạt (màu xám) và chỉ một tiểu phần có thể gắn với
biotin [10].
B: Ba axit amin bị gây đột biến (ảnh trái) và streptavidin dạng đơn hóa trị (ảnh phải)

1.3. VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
1.3.1. Giới thiệu chung về bệnh đốm trắng ở tôm và virus gây bệnh đốm trắng
Hội chứng đốm trắng ở tôm (White Spot Syndrome) thƣờng gặp ở tôm sú, do
virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) gây nên, đƣợc gọi tắt là
WSSV đã đƣợc phát hiện từ năm 1993 tại khu vực Đông Nam Á [20]. Tôm nhiễm
virus WSSV thƣờng phát bệnh và chết vào khoảng 45-60 ngày sau khi thả nuôi.
Tôm bệnh do virus WSSV mang những dấu hiệu đặc trƣng nhƣ bỏ ăn, lờ dờ, cặp mé
ao, xuất hiện các đốm trắng nhỏ trên lớp vỏ kết hợp với hiện tƣợng đỏ thân. Khi
xâm nhập vào tôm, virus sẽ cƣ trú ở nhiều bộ phận của tôm nhƣ mô dạ dày, mang,
trứng, mắt, chân bơi… Các virus này sẽ sinh sản rất nhanh làm tơm nhiễm bệnh
nặng và sau đó tiếp tục phát tán ra mơi trƣờng bên ngồi gây bệnh cho cả đàn tơm
có trong ao [19].

Hình 15: Tơm bị bệnh đốm trắng với các đốm trắng xuất hiện ở đầu [31]

Về các đƣờng truyền bệnh, bệnh có thể lây lan theo nhiều phƣơng thức khác
nhau. Thứ nhất, bệnh có thể truyền từ tôm bố mẹ sang tôm con. Thứ hai, bệnh đi từ
các lồi giáp xác hoang dại nhƣ cua, cịng, tơm, tép… sang tôm nuôi. Thứ ba, nguồn
nƣớc cấp vào ao ni bị nhiễm virus gây bệnh đốm trắng. Vì virus đốm trắng có khả
năng tồn tại trong khoảng dao động của các yếu tố môi trƣờng lớn nhƣ độ mặn từ 540 phần nghìn, độ pH từ 4-10, có khả năng chịu đựng ở nhiệt độ 0oC và chỉ chết khi
nhiệt độ lên đến 80oC. Do đó, khả năng tồn tại của virus gây bệnh đốm trắng trong

môi trƣờng nƣớc rất cao. Thứ tư, bệnh đi từ các dụng cụ dùng chung nhƣ vó, chài,
Khóa 2009-2011

15


Luậ n văn Thạ c sĩ Khoa họ c

Bùi Thu Thủ y

lƣới, ống bơm nƣớc… Thứ năm, trong quá trình lột xác, tôm khỏe ăn tôm bệnh cũng
dẫn tới tôm khỏe mắc bệnh.
Virus gây bệnh đốm trắng ở tôm là loại virus gây bệnh nghiêm trọng và phổ
biến ở tôm nuôi, là nguyên nhân chủ yếu gây ra những tổn hại kinh tế lớn đối với
ngành công nghiệp tôm trên toàn thế giới. Một khi lây nhiễm, virus sẽ lây lan rất
nhanh và gây ra những bệnh cảnh nghiêm trọng với tôm cũng nhƣ các thủy sinh
khác nhƣ cua, cá, v.v…Trƣớc đây, WSSV đƣợc xếp vào họ Baculoviridae bởi vỏ
virus có hình que. Virion có chứa 1 nucleocapsit với hình dạng xoắn điển hình, 5
protein chính và ít nhất 13 protein thứ yếu. Đến khi bộ gen của WSSV gồm 305 kb
đƣợc giải mã vào năm 2001, các kết quả phân tích đã chỉ ra rằng bộ gen của tơm
chứa 181 vùng mã đọc mở (open reading frame, ORF) bao gồm 39 protein cấu trúc
với 9 protein vỏ, 6 protein vỏ trong số đó có các kích thƣớc đƣợc dự đoán gồm
15kDa (VP15), 19kDa (VP19), 24kDa (VP24), 26kDa (VP26) và 28kDa (VP28).
VP15, VP24 và VP26 đƣợc định vị trên nucleocapsit còn VP28 và VP19 định vị
trong lớp vỏ virion, trong đó một vài vùng có trình tự giống với trình tự của các gen
virus hoặc của các loài nhân thực đã biết trƣớc đây. WSSV hiện nay đƣợc xếp vào
họ virus mới có tên Nimaviridae thuộc chi Whispovirus [19, 21].

Hình 16: Virus gây bệnh đốm trắng ở tôm [29]

Cho đến nay, các nghiên cứu bƣớc đầu đã khẳng định bƣớc quan trọng nhất
trong quá trình nhiễm virus WSSV là virus bám vào tế bào chủ, do vậy các protein
trên vỏ của virus đƣợc tập trung nghiên cứu vì nó liên quan trực tiếp đến quá trình
này. Phổ tế bào chủ rộng và cơ chế lây nhiễm phức tạp cũng nhƣ tính cực độc khiến
WSSV trở nên vơ cùng khó khăn để xử lý.

Khóa 2009-2011

16