Tuyển chọn vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic ứng dụng cho nhân giống khởi động trong lên men sữa chua

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------

Đỗ Thị Thu Thủy

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH
PROBIOTIC ỨNG DỤNG CHO NHÂN GIỐNG KHỞI
ĐỘNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
--------------------

Đỗ Thị Thu Thủy

TUYỂN CHỌN VI KHUẨN LACTIC CÓ ĐẶC TÍNH
PROBIOTIC ỨNG DỤNG CHO NHÂN GIỐNG KHỞI
ĐỘNG TRONG LÊN MEN SỮA CHUA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60420107

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Đào Thị Lƣơng

TS. Phạm Thế Hải

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Đào Thị Lương, cán bộ Viện Vi sinh
vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt
nhiều kinh nghiệm, giúp tôi giải quyết các vấn đề nảy sinh trong q trình làm luận văn
và hồn thành luận văn theo đúng định hướng ban đầu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới :
PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà, TS. Phạm Thế Hải và các quý thầy cô trong bộ môn
Vi sinh vật học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt kiến thức cho tôi
trong khóa học để tơi có nền tảng kiến thức thực hiện nghiên cứu này.
PGS. TS. Dương Văn Hợp, Viện trưởng Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh
học- ĐHQGHN cùng toàn thế các cán bộ tại viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học
đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài tại Viện Vi sinh vật và
Công nghệ sinh học – ĐHQGHN. Luận văn được thực hiện với sự hỗ trợ kinh phí từ đề
tài ― Nghiên cứu cơng nghệ sản xuất chế phẩm vi khuẩn ứng dụng trong công nghiệp
sản xuất sữa chua‖, mã số 05.13/CNSHCB.
Tôi xin cảm ơn tới KS. Hà Thị Hằng, Ths. Trần Thị Lệ Quyên, CN. Nguyễn
Hoàng Tuấn và các bạn trong phịng thí nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ tơi trong q trình
làm thí nghiệm.
Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và người thân đã luôn
ủng hộ, tin tưởng và động viên tơi hồn thành luận văn này.

Học viên

Đỗ Thị Thu Thủy

MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
Chƣơng 1 - TỔNG QUAN ............................................................................................ 3
1.1

Sữa chua và công nghệ sản xuất sữa chua ..................................................... 3

1.1.1

Lịch sử hình thành ....................................................................................... 3

1.1.2

Giá trị dinh dưỡng và vai trò của sữa chua dối với sức khỏe ...................... 4

1.1.3

Thị trường sữa chua trên thế giới và Việt Nam ........................................... 6

1.2

Lên men sữa chua và vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua ..................... 8

1.2.1 Lêm men sữa chua .......................................................................................... 8
1.2.2 Các chủng vi khuẩn lactic dùng trong lên men sữa chua .............................. 12
1.3 Thực trạng nghiên cứu liên quan tại Việt Nam............................................... 20
Chƣơng 2 – NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP........................................ 21
2.1 Nguyên vật liệu, hoá chất và tthiết bị ............................................................... 21
2.1.1 Vi sinh vật ..................................................................................................... 21

2.1.2 Hóa chất, thiết bị ........................................................................................... 21
2.1.3 Mơi trường .................................................................................................... 21
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu................................................................................... 22
2.2.1 Hoạt hóa chủng giống ................................................................................... 22
2.2.2 Đánh giá khả năng lên men sữa .................................................................... 23
2.2.3 Nghiên cứu các đặc tính probiotic của các chủng LAB ................................ 23
2.2.4 Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng .............................................. 27
2.3 Phân loại .............................................................................................................. 27
2.3.1 Phân loại bằng hình thái ................................................................................ 27
2.3.2 Phân loại bằng sinh học phân tử ................................................................... 28
2.4 Lựa chọn tổ hợp cho lên men ............................................................................ 32
2.4.2 Lên men đa chủng ......................................................................................... 33
2.5 Nghiên cứu các điều kiện ni cấy thích hợp. ................................................. 34
2.5.1 Nghiên cứu mơi trường ni cấy thích hợp .................................................. 34


2.5.2 Nghiên cứu điều kiện cung cấp khí thích hợp............................................... 34
2.5.3 Nghiên cứu nhiệt độ ni thích hợp ............................................................. 34
2.5.4 Nghiên cứu pH ni thích hợp ...................................................................... 34
2.5.5 Nghiên cứu nguồn cacbon thích hợp ............................................................ 34
2.5.6 Lựa chọn nguồn N thích hợp......................................................................... 34
2.5.7 Lựa chọn thời gian ni thích hợp ................................................................ 35
2.6 Thử nghiệm lên men quy mơ 5 lít ..................................................................... 37
2.6.1 Nghiên cứu tỉ lệ giống khởi động.................................................................. 37
2.6.2 Nghiên cứu tỉ lệ thành phần chủng trong tổ hợp ........................................... 37
2.6.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ......................... 37
Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................. 38
3.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic mang đặc tính probiotic có khả năng
lên men sữa ............................................................................................................... 38
3.1.1 Khả năng lên men sữa của các chủng vi khuẩn lactic ................................... 38

3.1.2 Các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn lactic ................................... 40
3.2 Phân loại .............................................................................................................. 50
3.2.1 Đặc điểm hình thái của các chủng ................................................................ 50
3.2.2 Kết quả phân loại bằng sinh học phân tử ...................................................... 51
3.3 Lựa chọn tổ hợp cho lên men ............................................................................ 54
3.3.1 Lên men đơn chủng ....................................................................................... 54
3.3.2 Kết quả lên men đa chủng ............................................................................. 55
3.4 Lựa chọn điều kiện nuôi thích hợp ................................................................... 60
3.4.1 Lựa chọn mơi trường ni thích hợp ............................................................ 60
3.4.2 Lựa chọn điệu kiện cung cấp khí thích hợp .................................................. 61
3.4.3 Lựa chọn nhiệt độ ni thích hợp ................................................................. 62
3.4.4 Lựa chọn pH ni thích hợp ......................................................................... 62
3.4.5 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp ................................................................ 63
3.4.7 Lựa chọn nguồn N thích hợp......................................................................... 64
3.4.8 Lựa chọn thời gian ni thích hợp ................................................................ 65


3.5 Kết quả thử nghiệm lên men ............................................................................. 67
3.5.1 Lựa chọn tỉ lệ giống bổ sung ......................................................................... 68
3.5.2 Lựa chọn tỉ lệ chủng trong tổ hợp lên men ................................................... 69
3.5.3 Lựa chọn nhiệt độ lên men ............................................................................ 71
3.5.4 Thử nghiệm lên men quy mơ 5 lít ................................................................. 71
KẾT LUẬN ................................................................................................................... 73
HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ...................................................................... 74
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 75


D NH M C CH

VI T T T

CFU

Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit)

CMC

Carboxymethyl Cellulose

DNS

axit 3,5-dinitrosalicilic

EPS

Exopolysaccharide

LAB

Vi khuẩn lactic

MRS

Môi trường Man Rogosa Sharpe

NA

Mơi trường thạch thường

OD

Mật độ quang

ONPG

o-nitrophenyl-β-D-galactoside

QPS

Quy trình xử lý chất lượng

VTCC

Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật Việt Nam


DANH M C BẢNG
Bảng 1.1. Nhu cầu sử dụng sữa của các quốc gia trên thế giới ....................................... 7
Bảng 1.2. Doanh số thị trường sữa chua trong những năm gần đây ................................ 7
Bảng 2.1. Các chỉ tiêu cảm quan sữa chua…………………………………………….33
Bảng 2.2. Mật độ quang phổ (OD575) ở các nồng độ glucose khác nhau....................... 36
Bảng 3.1. Khả năng làm đông sữa của các chủng vi khuẩn lactic ................................. 39
Bảng 3.2. Một số đặc tính probiotic của các chủng lactic ............................................. 40
Bảng 3.3. Khả năng chịu muối mật, chịu pH thấp và tính kị nước của các chủng lactic
................................................................................................................................ 42
Bảng 3.4. Kích thước vịng kháng khuẩn của các chủng lactic ..................................... 44
Bảng 3.5. Khả năng kháng chất kháng sinh của các chủng vi khuẩn lactic................... 47
Bảng 3.6. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn lactic ........................ 50
Bảng 3.7. Kết quả lên men sữa đơn chủng sau 10 giờ ................................................... 54
Bảng 3.8. Thành phần loài trong các tổ hợp lên men .................................................... 55

Bảng 3.9. Kết quả lên men tổ hợp sữa chua ................................................................... 56
Bảng 3.10. Cảm quan sữa chua sau 3 tuần ..................................................................... 58
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng LAB ............................ 63
Bảng 3.12. Chất lượng sữa chua khi thay đổi tỉ lệ giống ban đầu ................................. 69
Bảng 3.13. Chất lượng sữa chua khi thay đổi tỉ lệ thành phần trong tổ hợp ................. 71
Bảng 3.14. Số lượng vi sinh vật trong quá trình lên men. ............................................. 71


DANH M C HÌNH
Hình 3.1. Khả năng lên men đường lactose của các chủng vi khuẩn lactic ................... 38
Hình 3.2. Vòng phân giải cazein của chùng BH và chủng M01 .................................... 41
Hình 3.3.Vịng kháng M. luteus của các chủng vi khuẩn lactic đại diện ....................... 45
Hình 3.4 Vịng kháng L. innocua của chủng 2991......................................................... 45
Hình 3.5. Khả năng sinh trưởng của các chủng LAB .................................................... 49
Hình 3.6. Ảnh khuẩn lạc và tế bào nhuộm gram của các chủng vi khuẩn lactic ........... 51
Hình 3.7. Cây phát sinh chủng loại của các chủng nghiên cứu và một số lồi có quan hệ
họ hàng gần thuộc chi Lactobacillus dựa vào trình tự ADNr 16S ......................... 52
Hình 3.8. Cây phát sinh chủng loại của các chủng nghiên cứu và một số lồi có quan hệ
họ hàng gần thuộc chi Streptococcus dựa vào trình tự ADNr 16S ........................ 53
Hình 3.9. Sản phẩm sữa lên men từ TH1 ....................................................................... 57
Hình 3.10 pH của sữa chua bảo quản tại 4oC sau 1 tuần, 2 tuần và 3 tuần .................... 57
Hình 3.11. Khả năng sinh trưởng của các chủng LAB trên các loại môi trường khác
nhau ........................................................................................................................ 61
Hình 3.12. Sinh trưởng của vi khuẩn LAB ở các điều kiện cung cấp khí khác nhau .... 61
Hình 3.13 Sinh trưởng của các chúng LAB tại các nhiệt độ khác nhau ........................ 62
Hình 3.14. Sinh trưởng của các chủng LAB trên các nguồn Cacbon khác nhau ........... 63
Hình 3.15. Sinh trưởng của các chủng LAB khi bổ sung hàm lượng đường khác nhau 64
Hình 3.16. Sinh trưởng của các chủng LAB trên các nguồn N khác nhau .................... 65
Hình 3.17. Sinh trưởng của L. bulgaricus M01 theo thời gian ...................................... 65
Hình 3.18. Sinh trưởng của L. acidophilus 2991 theo thời gian .................................... 66

Hình 3.19. Sinh trưởng của S. thermophilus theo thời gian ........................................... 66
Hình 3.20. pH theo thời gian lên men với các tỉ lệ giống khác nhau ............................. 68
Hình 3.21. pH theo thời gian lên men khi thay đổi tỉ lệ thành phần chủng trong tổ hợp
................................................................................................................................ 70
Hình 3.22. Biến động thành phần các chủng trong quá trình lên men sữa .................... 72
Hình 3.23. Thành phần tổ hợp khuẩn lạc sau 1 giờ và 4 giờ lên men............................ 72


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

LỜI MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Sữa chua là một trong những loại thực phẩm rất quan trọng và cần thiết cho cơ
thể để tăng cường sức khỏe, ngăn ngừa bệnh tật, giữ một vóc dáng cân đối, gọn gàng.
Rất nhiều bác sĩ, chuyên gia dinh dưỡng trên thế giới đều khuyến khích hình thành thói
quen ăn sữa chua đều đặn mỗi ngày. Sữa chua là nguồn dinh dưỡng quý giá đã được sử
dụng từ mấy ngàn năm nay. Vào năm 1910, nhà bác học người Nga Ilya Metchnikoff
đã đoạt giải Nobel cho những khám phá về vai trò của sữa chua đối với sức khỏe con
người. Ngày 13-3-2009 tại Hà Nội, Viện Dinh dưỡng quốc gia đã tổ chức hội thảo
khoa học về ―Vai trò của sữa chua trong dinh dưỡng và sức khỏe‖. Phó giáo sư - tiến
sĩ, Phó viện trưởng Viện Dinh dưỡng quốc gia (NIN) Lê Thị Bạch Mai cũng cho rằng:
―Người Việt Nam nên hình thành thói quen ăn sữa chua mỗi ngày‖.
Báo cáo của phó giáo sư - tiến sĩ Nguyễn Văn Hoan (trưởng phòng quản lý khoa
học của Viện Dinh dưỡng quốc gia) trong buổi hội thảo cũng đã nêu bật giá trị dinh
dưỡng đó. Cứ 100g sữa chua chứa khoảng 100kcal, có chất đường (15,4g), chất đạm
(3,1g), chất béo (3g), canxi và một số loại vitamin như , D, E… Trong 226g sữa chua
(khoảng 2 hộp) cung cấp hơn 20% protein, 30-40% canxi và một lượng vitamin,
khoáng chất quan trọng khác cơ thể cần mỗi ngày. Ngồi ra, rất nhiều lợi ích khác của
sữa chua đang được tiếp tục tìm ra như giảm hiện tượng không dung nạp lactose, ngăn
ngừa bệnh đường ruột, kích thích đáp ứng miễn dịch, giảm cholesterol trong máu và

hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch [10,39,45,62].... Đặc biệt là các sản phẩm sữa
chua có bổ sung các chủng vi khuẩn probiotic có khả năng kháng chất kháng sinh phối
hợp điều trị kết hợp kháng sinh giúp bệnh nhân tăng cường sức đề kháng.
Là thực phẩm bổ dưỡng và có nhiều lợi ích nhưng tình hình sử dụng sữa chua
hiện nay trong bữa ăn của người Việt Nam vẫn còn khá thấp (<10%). Ở châu Âu sữa
chua chiếm tới 32% khẩu phần ăn. Tỷ lệ sử dụng sữa chua so với sữa tại Pháp là 80:20,
ở Singapore là 70:30 hay Thái Lan đạt 50:50. Trong khi đó, tỷ lệ này ở Việt Nam chỉ
1


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

khoảng 20:80 [85]. Tiềm năng phát triển thị trường sữa chua ở Việt nam rất cao, tuy
nhiên trở ngại kìm hãm sự phát triển này ở Việt Nam là do giá thành sản phẩm còn cao
so với mức thu nhập bình quân người Việt Nam.
Tại Việt Nam hiện nay, có nhiều cơng ty sản xuất và phân phối sữa và các sản
phẩm từ sữa như Vinamilk, Công ty Cổ phần sữa Quốc tế (IDP), TH milk, Công ty sữa
a Vì, Hà Nội Milk. Ngồi ra, cịn có rất nhiều sản phẩm sữa chua của các thương hiệu
khác như: sữa chua uống Yakult (Nhật

ản), FieslandCampina (Hà Lan), sữa chua

uống Yomost, Kinh Đô với sữa chua uống Well-yo, Dalatmilk với Yous cùng nhiều
thương hiệu nhập khẩu khác. Tuy nhiên, tại thời điểm nghiên cứu, nguồn chủng giống
khởi động trong lên men sữa chua phục vụ sản xuất của các công ty này hoàn toàn là
nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao. Chưa có một sản phẩm thương mại giống
khởi động nào được sản xuất trong nước. Việc chủ động giống khởi động cho lên men
sữa chua là nhu cầu cần thiết với ngành sữa Việt Nam hiện nay.
Lên men sữa chua chủ yếu liên quan đến vi khuẩn lactic (Lactobacillus,
Streptococcus và Bifidobacterium). Trong số các đại diện thuộc Lactobacillus thì có 3

lồi được nghiên cứu và sử dụng phổ biến nhất để sản xuất giống khởi động cho lên
men sữa chua là L. bulgaricus, L. acidophilus và L. casei [29,33]. Và để phù hợp với
sự phát triển đa dạng của các sản phẩm sữa chua hiện nay, các sản phẩm sữa chua
không chỉ đáp ứng về hương vị, giá trị dinh dưỡng mà còn phải cung cấp các vi sinh
vật lợi khuẩn cho hệ tiêu hóa, tăng cường miễn dịch.
Từ những lý do trên, với mong muốn người dân Việt Nam có thể được sử dụng
nhiều sữa chua hơn, đặc biệt là sữa chua probiotic, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này
với mục tiêu là:
“Chọn được những tổ hợp chủng vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic nhằm ứng dụng
cho nhân giống khởi động trong lên men sữa chua, giảm giá thành cũng như chủ động
nguồn giống cho sản xuất trong nước”.

2


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN
1.1 Sữa chua và công nghệ sản xuất sữa chua
1.1.1 Lịch sử hình thành
Sữa chua là một trong các loại thực phẩm lên men lâu đời và phổ biến nhất được
biết đến trên thế giới. Sữa chua được phát hiện tình cờ bởi bộ tộc alkan từ hàng ngàn
năm trước và đã trở thành một loại thực phẩm của Đông u. Đến những năm 1900, vai
trò của vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua thật sự được biết đến với những phát
hiện của nhà sinh vật học Nga Metchnikoff (1845 – 1916). Khi làm việc tại Viện
Pasteur (Pháp) ông đã nhận thấy rằng vi khuẩn L. bulgaricus trong sữa chua là nguyên
nhân về tuổi thọ dài bất thường của những người ulgaria [70].
Năm 1919, Isaac Carasso, Tây an Nha thành lập xưởng sản xuất sữa chua đầu
tiên có tên là Dannon. Năm 1930, bác sĩ Minoru Shirota, Nhật

ản lần đầu tiên phân

lập được chủng L. casei Shirota. ng đã sử dụng chủng vi khuẩn này lên men sữa dạng
dịch và đây là bước khởi đầu cho việc thành lập công ty Yakult ở Nhật ản năm 1935 .
Cho đến nay, Yakult đã có 80 năm hoạt động và có đại diện trên 40 quốc gia trên khắp
thế giới [88].
Việc sử dụng sữa chua như là một nguồn cung cấp chất dinh dưỡng đã làm cho
sữa chua trở thành một trong những sản phẩm sữa phát triển nhanh nhất. Sữa chua,
kefir, sữa và các sản phẩm lên men từ sữa đang trong quá trình để trở thành nguồn dinh
dưỡng thiết yếu nhằm mục đích điều trị một loạt các bệnh [40]. Các protein mà sữa
chua cung cấp có giá trị cao bởi các vitamin và khống chất được tìm thấy trong sữa và
các sản phẩm từ sữa. Chúng cung cấp một loạt các chất dinh dưỡng quan trọng như
năng lượng và hàm lượng chất béo với số lượng đáng kể làm cho chúng trở thành một
thực phẩm giàu dinh dưỡng. Ăn các sản phẩm sữa như sữa chua, giúp nâng cao chất
lượng tổng thể của khẩu phần ăn và làm tăng khả năng hấp thu chất dinh dưỡng.
Vitamin và khống chất có thể được bổ sung vào sữa và các sản phẩm từ sữa dành cho
cho trẻ em [86]..
3


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

1.1.2 Giá trị dinh dƣỡng và vai trò của sữa chua dối với sức khỏe
Có thể nhận thấy sữa chua là sản phẩm của sữa nên có giá trị dinh dưỡng khá
cao và cân đối: trong 100g sữa chua chứa khoảng 100 Kcal, chất đạm trung bình từ 3,1
- 5,3g, chất béo khoảng 2,3 - 2,6g, chất bột khoảng 14-15g. Cơ cấu năng lượng trung
bình của sữa chua khá cân đối, với tỷ lệ năng lượng của 3 chất Protein: Lipit: Glucose
là khoảng 17: 23: 60. So với nhu cầu khuyến nghị của Viện Dinh dưỡng quốc gia cho
trẻ em đến 9 tuổi là Protein: Lipit: Glucose =15: 30: 55 thì rõ ràng sữa chua là một sản
phẩm cân đối về năng lượng đáp ứng tốt cho sự phát triển nhanh của trẻ [86]. Ngoài

các giá trị dinh dưỡng trên thì sữa chua probiotic được coi như là một thực phẩm chức
năng với một số đặc tính nổi trội như là:
(i) Tăng hiệu quả sử dụng đường lactose tránh bệnh tiêu chảy do dùng các sản
phẩm sữa:
Trong thành phần của sữa có đường lactose là một disaccharide. Những thiếu
hụt về khả năng sinh enzyme β-galactosidse thường dẫn đến bệnh tiêu chảy. Phần lớn
các vi khuẩn probiotic đặc biệt là vi khuẩn lactic (Lactobacillus, Streptococcus và
Bifidobacterium) có khả năng sinh enzyme β-galactosidse có khả năng thủy phân
đường lactose thành đường đơn là galactose và glucose [70].
(ii) Ức chế vi sinh vật gây bệnh cho vật chủ như E.coli. Salmonella,
Staphylococcus… và các vi sinh vật gây bệnh theo một số cơ chế sau:
 Cơ chế sinh ra các chất bacteriocin (bao gồm cả lantibiotic) như nisin,
enteriocin, subtilisin [45].


Với số lượng lớn vi khuẩn lactic trong sữa chua (hàng trăm triệu đến hàng

tỷ CFU/g sẽ tăng khả năng cạnh tranh các thành phần dinh dưỡng và vị trí bám trên
nhu mơ ruột của vật chủ.
 Vi khuẩn lactic trong sữa chua có thể sinh ra các thành phần hữu cơ có tác
dụng ức chế vi sinh vật gây bệnh. Các vi khuẩn lactic sinh ra các thành phần axít hữu
cơ như lactic, acetic, ethanol có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh
[68].

4


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

(iii) Kích thích và tăng khả năng đáp ứng miễn dịch của vật chủ.

Các nghiên cứu cho thấy là sự có mặt của vi khuẩn sữa chua tạo thành mơi
trường có pH thấp với các thành phần bacteriocin, các peptid và sinh các loại axit béo
liên kết thành các mạch ngắn hay việc bám của vi khuẩn vào nhu mơ ruột sẽ kích thích
hệ thống miễn dịch tập nhiễm (innate immune response). Kết quả là kích thích sự hoạt
động của đại thực bào tiết ra protein miễn dịch IgA, thông qua tế bào T để sinh ra các
loại cytokine khác nhau như Interferon (IFN-γ), IL-10, IL-4 [39].
(iv)

Giảm pH của hệ tiêu hóa và tác dụng tích cực đến hệ vi sinh vật đường

ruột theo hướng có lợi cho vật chủ.
Trong hệ tiêu hóa của vật chủ có 1013-1014 tế bào vi sinh vật khác nhau. Chúng
được chia thành 3 nhóm chủ yếu: nhóm có lợi cho vật chủ như lactobacilii,
bifidobacterium và một số nấm men. Nhóm có hại cho vật chủ: như Staphylococcus,
Clostridium, E.coli và nhóm vừa có lợi vừa có hại như Enterococii. Sự có mặt của vi
khuẩn lactic (Lactobacillus và Bifidobacterium) làm giảm pH theo hướng bất lợi cho
nhóm vi sinh vật có hại do đó làm thay đổi cân bằng quần xã vi sinh vật đường ruột có
lợi cho vật chủ [54].
(v)

Giảm cholesterol trong máu và hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch.

Vi khuẩn probiotic được biết có vai trị sinh ra axít hữu cơ, làm giảm axít béo,
thành phần cholesterol trong máu và ức chế quá trình phát triển của các khối u, ung
thư. Các nghiên cứu chỉ ra rằng các vi khuẩn Lactobacilii và Bifidobacterium khơng
chỉ sinh ra các axít hữu cơ mà còn trực tiếp sử dụng lipit và các thành phần cholesterol
trong máu [10].
(vi)

Phục hồi cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột sau khi sử dụng chất kháng

sinh.
Sau khi sử dụng chất kháng sinh, thông thường cơ thể dễ bị tiêu chảy do các chất
độc sinh ra từ sự phát triển của Clostridium. Việc xử lý với probiotic có chứa
lactobacilii và Sacchromycess cerevisiae có tác dụng giải độc tố ammonia và phenol
cũng như ức chế sự phát triển của nhóm Clostridium [60]. Người lớn ăn sữa chua có

5


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

chứa S. thermophilus trong khi được điều trị bằng thuốc kháng sinh có tỷ lệ thấp hơn
của tiêu chảy hơn so với nhóm chứng (12,4% so với 23,7%) [58].
(vii) Bổ sung thêm các thành phần vitamin nhóm B và axit folic cũng như các
hoạt chất khác như GABA… có lợi cho vật chủ
Tuyển chọn chủng probiotic có thể bắt đầu với khả năng chịu muối mật và dich
axit dạ dày. Độ pH của axit hydrochloric bài tiết trong dạ dày là 0,9. Tuy nhiên, sự có
mặt của thực phẩm làm tăng giá trị pH khoảng pH 3. Khả năng tồn tại và sinh trưởng
trong một môi trường pH thấp là đặc trưng của LAB, mặc dù cơ chế chống chịu của
chúng chưa được làm rõ. Mặt khác, muối mật được tiết vào ruột non sau khi ăn thức ăn
nhiều chất béo. Chúng có chất tẩy rửa có chức năng có thể phá vỡ các chất béo và axit
béo của màng tế bào vi khuẩn. Một số vi sinh vật, trong đó có nhiều lồi Lactobacillus,
có thể làm giảm tác dụng chất tẩy rửa này bằng cách thủy phân muối mật với enzyme
hydrolase muối mật.
Các lợi ích khác
Nhiều lợi ích khác cho sức khỏe của các chế phẩm probiotic đã được thơng báo,
như việc phịng vệ chống lại bệnh nhiễm trùng đường niệu sinh dục, sự tăng hấp thụ
canxi từ ruột, sự kích thích các hệ nội tiết, tăng sinh trưởng, kéo dài tuổi trẻ và tuổi thọ.
Một số lợi ích mới chỉ được thông báo và chưa được chứng minh bởi những nghiên

cứu khoa học thực sự.
1.1.3 Thị trƣờng sữa chua trên thế giới và Việt Nam
Trên thế giới:
Theo những phân tích thị trường quốc tế, doanh số các sản phẩm sữa năm 2015
là 500 tỷ USD nhưng riêng sữa chua chiếm tới 67 tỷ USD. Nhu cầu về các sản phẩm
sữa nói chung và sữa chua nói riêng có nhiều khác biệt giữa các quốc gia, nhưng nhìn
chung nhu cầu của người dân các nước phát triển cao hơn nhiều lần so với nhu cầu của
các nước đang phát triển.

6


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

Bảng 1.1. Nhu cầu sử dụng sữa của các quốc gia trên thế giới
Lƣợng sữa lên men
Quốc gia

Lƣợng sữa lên men

tiêu thụ

Quốc gia

(kg/ngƣời.năm)

tiêu thụ
(kg/ngƣời.năm)

Pháp

21,3

Brazil

7

Ireland

13,2

Hoa K

6,7

Canada

12,4

Nga

4,4

Anh

10,2

Trung Quốc

3,4

c

9,9

Ấn Độ

0,4
()

Ở Việt Nam:
Thị trường sữa chua trong nước với doanh số ước tính 12-13.000 tỷ đồng
(tương đương 600-650 triệu USD) do một số công ty sản xuất và phân phối như
VinaMilk, Dutch Lady, Hà Nội Milk, Công ty sữa Quốc tế, Công ty sữa Ba Vì, Mộc
Châu. Cơng ty sữa chua hàng đầu thế giới là Yakult, Tokyo, Japan đã sản xuất và đưa
ra thị trường Việt Nam từ năm 2006. Mặc dù vậy thị phần cao nhất (55%) thuộc về sữa
chua VinaMilk, sau đó là YoMost của Dutch Lady (www.brandsvietnam.com).
Bảng 1.2. Doanh số thị trường sữa chua trong những năm gần đây
Năm
Doanh số
(tỷ đồng)

2010

2011

2012

2013

2014

2015

3 300

4 503

5 737

7 706

9 937

12 465

()
Như vậy thị trường sữa chua trong nước vẫn đang trong thời k tăng trưởng với
tốc độ cao khoảng 20% năm. Nếu tính chi phí khoảng 4% lượng giống vi khuẩn khởi
động (chủ yếu là sinh khối hai chủng vi khuẩn nhập ngoại là S. thermophilus và L.
bulgaricus thì chúng ta đã phải sử dụng khoảng trên dưới 30 triệu USD. Các ước lượng

7


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

này chưa tính đến thị trường thực phẩm chức năng (khoảng 1 tỷ USD) mà với tỷ lệ
không nhỏ có chứa vi khuẩn lactic [87].
1.2 Lên men sữa chua và vi khuẩn lactic trong lên men sữa chua

1.2.1 Lêm men sữa chua
1.2.1.1Cơ chế lên men sữa chua
Quá trình lên men sữa là quá trình lên men lactic đồng hình, trong đó lactic acid
tạo ra chiếm 90% tổng số các sản phẩm lên men cùng với một lượng nhỏ acetic acid,
aceton và diacetyl. Trong điều kiện dư thừa glucose và hàm lượng oxy thấp, các lồi
L

đồng hình chuyển hóa 1 mol glucose theo con đường Embden-Mayerhof-Parnas

thành 2 mol pyruvate và tích lũy 2 mol

TP [67]. Phương trình chung biểu diễn q

trình lên men:
C6H12O6  2CH3CHOHCOOH.
Thành phần chính của sữa là đường lactose và protein là casein. Trong quá trình
lên men, dưới tác dụng của lactase (một dạng của β-galactosidase) đường kép lactose
bị thủy phân thành 2 đường đơn glucose và galactose. Vi khuẩn lactic tiếp tục sử dụng
các đường đơn chuyển hóa theo con đường Embden-Meyerhof thành axit lactic và các
thành phần hữu cơ tạo mùi vị đặc trưng của sữa chua như hợp chất carbonyl: diacetyl,
este, acetaldehit, peptit v.v [67]
Casein trong sữa chiếm một tỷ lệ cao tới 80% tổng protein trong sữa, còn
lại là lactoalbumin và lactoglobulin. Casein là một loại photphoprotein nhưng khơng
đồng nhất mà có các dạng α, β và k. Một đặc trưng là các axit amin của các dạng α, và
β là este hóa thành axit photphoric… Kết quả axit photphoric này liên kết với thành
phần canxi có trong sữa tạo ra liên kết nội và ngoại phân tử. Những phân tử này được
cấu tạo từ hàng trăm và hàng nghìn những phân tử đơn lẻ và hình thành nên dung dịch
keo, tạo nên màu trắng của sữa. Những phức chất này được gọi là các micelle casein.
Quá trình lên men sữa dẫn đến pH giảm xuống 4,3-4,5. Tại đây photphat canxi có trong
micelle casein sẽ hòa tan và tạo ra các ion Ca2+, các ion này sẽ thâm nhập cấu trúc

micelle và tạo nên những liên kết nội bền vững. Sau đó độ pH của sữa sẽ tiến đến điểm
8


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

đẳng điện của từng loại casein. Điểm đẳng điện là điểm mà tại đó khả năng hịa tan của
casein là thấp nhất và thường nằm trong khoảng 4,2 -4,7. Hai q trình này khởi đầu sự
thay đổi trong chính những micelle, bắt đầu là sự tăng về kích thước của micelle thơng
qua qúa trình kết tụ và cuối cùng tạo thành một khối kết tụ đặc.
Cơ chế tạo cấu trúc của sữa chua
Cấu trúc cơ bản của sữa chua là cấu trúc gel tạo nên nhờ casein đông tụ ở pH =
pI =4.4 – 4.5. Sự tạo thành cấu trúc gel này đơn thuần do acid lactic tạo nên làm giảm
pH của sữa. Acid lactic còn tham gia phản ứng với caseinate calcium tạo quện sữa. Các
calcium phosphate keo sẽ làm hoà tan và tạo ra Ca2+. Các ion này làm cho khối đông tụ
bền chặt hơn. Cấu trúc tự nhiên của sữa chua do vi sinh vật khởi động tạo ra đóng vai
trị ngày càng quan trọng, nhằm loại trừ việc sử dụng chất ổn định cấu trúc như gelatin,
alginate, pectin.... Hiện có nhiều nghiên cứu về vai trò của polysaccharide ngoại bào
(EPS) trong việc tạo cấu trúc mịn, đặc sệt và dẻo cho sữa chua (Welman và Maddox,
2003). Số lượng các monomer có trong những EPS từ khoảng 50 đến hơn 5.000. Các

monosaccharides thường xuyên được tìm thấy là glucose và galactose, nhưng
rhamnose, mannose, fructose, arabinose và xylose, và các dẫn xuất đường, Nacetylgalactosamine và N-acetylglucosamine cũng thường gặp.
Quá trình tạo hương vị của sữa chua
Hương vị là một trong những đặc tính quan trọng nhất của các sản phẩm thực
phẩm và là yếu tố quang trọng trong việc xác định khả năng chấp nhận của người tiêu
dùng. Hơn 90 hỗn hợp hương vị khác nhau được tìm thấy trong sữa chua bao gồm rượu
cồn, aldehyde, keton, acid, este, lactones, các hợp chất chứa lưu hu nh và hợp chất dị
vòng ... [17]. Các hợp chất hương vị này bao gồm các chất bay hơi đã có trong sữa và
các hợp chất hương vị đặc biệt được tạo ra từ quá trình lên men sữa. Axit lactic,

acetaldehyde, diacetyl, acetoin, acetone và 2-butanone là những hợp chất quan trọng
đối với hương vị của sữa chua [15].
Hương vị của các sản phẩm sữa có nguồn gốc từ protein, chất béo và
carbohydrate trong sữa. Casein là tiền thân của các hợp chất hương vị khi LAB phát

9


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

triển trong sữa. Casein bị phân hủy thành các axit amin cấu thành nhờ hệ thống
proteolytic của L

. Sau đó, các axit amin tự do được chuyển thành các hợp chất

hương vị khác nhau, như aldehyde, rượu và este. Các hợp chất hương vị chủ yếu từ các
axit amin chuỗi nhánh, axit amin thơm, và axit amin chứa lưu hu nh [81].
ldehyde được xác định có mặt trong sữa chua khoảng 25 ppm chính là tác nhân
tạo hương chính cho sữa chua. ldehyde tạo nên nhờ hai con đường chính:
Con đường 1: Chuyển hóa trực tiếp từ pyruvate nhờ pyruvate decarboxylase
hoặc qua trung gian acetyl-CoA nhờ aldehyde decarboxylase. Con đường này chỉ xảy
ra đối với vi khuẩn lên men dị hình.
Con đường 2:

ldehyde được tạo thành từ threonine nhờ serine hydroxymethyl

transferase. Threonine chỉ có được khi vi khuẩn khởi động có hoạt tính protease đáng
kể. Cũng cần nói thêm rằng amino acid tự do chính là yếu tố tăng trưởng của vi khuẩn
[70].
Sự thay đổi protein trong sữa trong q trình lên men, lượng acid hữu cơ càng

tích lũy càng làm tăng quá trình phân tách canxi ra khỏi casein, sau đó canxi sẽ tác
dụng với acid lactic tạo lactate canxi, giúp cơ thể dễ dàng hấp thụ canxi hơn và tạo pH
đẳng điện. Do đó, casein bị vón lại làm tăng quá trình lên men tạo peptone và các sản
phẩm khác.
Sự thay đổi đường sữa: Trước khi lên men, hàm lượng lactose của hỗn hợp sữa
chua nói chung là ≈6%. Một ví dụ về sự thay đổi gây ra bởi vi khuẩn xảy ra trong quá
trình lên men là quá trình thủy phân 20-30% lactose disaccharide đến các thành phần
monosaccharide có thể hấp thụ được: glucose và galactose (Bourlioux, P. và Pochart, P.
1988). Ngoài ra, một phần của glucose được chuyển thành axit lactic. Tùy thuộc vào

các thành phần khác được thêm vào, quá trình thủy phân này làm nồng độ lactose trong
sữa chua thấp hơn trong sữa, điều này giải thích tại sao sữa chua được dung nạp tốt hơn
so với sữa bởi những người bị rối loạn hấp thu lactose [59].
Vi khuẩn lactic sử dụng đường lactose nhờ hệ thống enzyme lactase để chuyển
hóa lactose thành glucose và galactose. Lactase là một endoenzyme nên khi lactose

10


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

muốn được chuyển hóa thì phải qua màng vi khuẩn. Lactose sẽ được chuyển hóa theo 2
con đường:
 Vi khuẩn sử dụng enzyme lactase để bẻ gãy liên kết hydro chuyển lactose
thành glucose và galactose.
 Lactose được oxi hóa thơng qua enzyme lactosehydrogenase thành
lactosebionate sau đó phân giải tiếp thành gluconate và galactose qua một giai đoạn
diễn biến phúc tạp, mỗi giai đoạn do một enzyme chuyên biệt phụ trách [46].
1.2.1.2 Quy trình lên men sữa
Bước 1. Chuẩn bị nguyên liệu

Hoàn nguyên: Sữa tươi ( ột sữa) đường, dầu bơ được phối trộn vào nước ở
nhiệt độ 45-50oC. Quá trình này được thực hiện ở hệ thống thiết bị trộn Mixer tuần
hoàn với các bồn trộn.
Làm lạnh: Dịch sữa sau khi hoàn nguyên được làm lạnh nhanh xuống nhiệt độ
4-8oC bởi thiết bị trao đổi nhiệt dạng tấm.
Phối trộn, tiêu chuẩn hóa: Dịch sữa hồn ngun sau khi làm lạnh được đưa vào
bồn chứa đệm và được phối trộn với sữa tươi nếu có, sau đó được tiêu chuẩn hóa đến
độ khơ, độ béo của thành phẩm.
Bước 2. Đồng hóa, thanh trùng Pasteur
Gia nhiệt 1: Nâng nhiệt độ dịch sữa lên 60-65oC để thích hợp q trình đồng hố.
Đồng hoá: Dịch sữa được nén lên áp suất cao khoảng 200 bar bằng hệ thống
bơm piston sau đó đi qua khe hở hẹp và chênh lệch áp suất để phá vỡ các hạt cầu béo,
làm nhỏ chúng tạo điều kiện cho các hạt cầu béo hòa tan và phân tán đều vào trong
dịch sữa tạo thành hỗn hợp đồng nhất.
Gia nhiệt 2: Dịch sữa sau khi đồng hóa tiếp tục được gia nhiệt lên đến 95oC, sau
đó được lưu ở nhiệt độ này trong thời gian 300 giây, nhằm mục đích tiêu diệt vi sinh
vật và thay đổi cấu trúc phân tử casein tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men
đơng tụ casein.

11


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

Làm mát: Dịch sữa được làm xuống nhiệt độ thích hợp q trình lên men của vi
khuẩn lactic (thơng thường 42 - 43C).
Tất cả quá trình gia nhiệt, làm mát dịch sữa được thực hiện bởi thiết bị thanh trùng.
Bước 3. ổ sung men giống
Men được sử dụng là vi khuẩn lactic (Lactobacillus, S. thermophilus,
Bifidobacterium). Men khô, hoặc sinh khối được bổ sung trực tiếp vào dịch sữa đã

được hạ nhiệt xuống nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn lactic phát triển, tùy thuộc vi
khuẩn lactic ưa ấm (37C) hay ưa nhiệt (43C).
Giai đoạn ủ ở 37-43oC. Nhiệt độ ủ cần duy trì ổn định trong suốt thời gian lên
men. Kiểm sốt q trình lên men thơng qua kiểm tra pH và độ axít. Khoảng 8-10 giờ,
khi pH của dịch sữa đạt khoảng 4,4 - 4,5, thì kết thúc lên men. Ủ nhằm mục đích tạo đủ
thời gian, tạo điều kiện thích hợp cho q trình lên men chuyển hố đường lactose
thành axit lactic.
Bước 4. Làm lạnh và đóng gói
1.2.2 Các chủng vi khuẩn lactic dùng trong lên men sữa chua
Đến đầu thế kỷ 20 thì những nghiên cứu về vai trò của vi khuẩn lactic trong lên
men sữa mới được thực hiện. Nhật Bản là nước đi tiên phong về cơng nghệ lên men nói
chung và lên men sữa quy mơ cơng nghiệp nói riêng. Việc phân lập và tuyển chọn vi
khuẩn lactic cho lên men sữa được đánh dấu bằng nghiên cứu của bác sĩ Minoru
Shirota tìm ra vi khuẩn Lactobacillus casei cho lên men sữa vào năm 1930. Sau đó 5
năm, Cơng ty Yakult Honsha được thành lập (năm 1935) đã sản xuất các lọ sữa chua
thương mại đầu tiên trên thế giới ở Nhật và cho đến nay Yakult Honsha trở thành công
ty sản xuất và tiêu thụ sữa lên men hàng đầu thế giới, có phạm vi hoạt động trên 32
nước. Ở châu

u, mãi đến năm 1963 vấn đề chuẩn bị giống vi khuẩn lactic khởi động

(starter) mới được ôi được ghi lại trong bảng 3.12.
Như vậy nuôi cấy các chủng LAB với môi trường có pH6 –pH7 sẽ thu được sinh khối
cao nhất.

62


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của các chủng LAB
pH ban đầu
4
STT Chủng

5
pH

OD600

sau

pH
OD600

nuôi
1

M01

2

2991

3

3492

6

sau

7
pH

OD600

nuôi

sau

8
pH

OD600

nuôi

sau

pH
OD600

nuôi

sau
nuôi

0,16

4,03

1,83

4,06

2,76

4,39

2,85

4,03

1,47

5,26

0,56

4,01

1,52

4,15

2,66

3,95

2,65

4,14

1,45

5,02

1,05

3,93

2,31

4,76

2,89

3,93

2,77

4,05

1,75

5,09

3.4.5 Lựa chọn nguồn cacbon thích hợp

Hình 3.14. Sinh trưởng của các chủng LAB trên các nguồn Cacbon khác nhau
Nguồn C tốt nhất cho M01 và 2991 là saccharose còn lactose là nguồn C cho
kết quả sinh khối 3492 tốt nhất. Saccharose được lựa chọn cho mơi trường ni cấy
M01 và 2991, cịn lactose là nguồn cacbon nuôi cấy 3492.

63


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

3.4.6 Lựa chọn hàm lƣợng cacbon thích hợp

Hình 3.15. Sinh trưởng của các chủng LAB khi bổ sung hàm lượng đường khác nhau
Khi thay đổi hàm lượng đường từ 0-70 g l trong môi trường MRS để nuôi 3
chủng nghiên cứu, số lượng tế bào thu được có khác nhau nhiều, tăng khi hàm lượng
đường tăng từ 0-20 g/l, có xu thế giảm khi hàm lượng đường lớn hơn 40 g l môi
trường. Số lượng tế bào cao nhất cho cả 3 chủng ở nồng độ đường 20g l. Từ đó, tỷ lệ
đường lactose đối với chủng 3492; đường saccharose với 2 chủng M01 và 2991 là
20g l môi trường.
3.4.7 Lựa chọn nguồn N thích hợp
Tiến hành thay thế các nguồn N khác nhau trong môi trường với hàm lượng
tương đương môi trường MRS. Kết quả sinh khối xác định bằng OD600 cho thấy nguồn
N ban đầu trong môi trường MRS là phù hợp nhất với 3 chủng M01, 2991 và 3492.

64


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

Hình 3.16. Sinh trưởng của các chủng LAB trên các nguồn N khác nhau

3.4.8 Lựa chọn thời gian nuôi thích hợp
Ni cấy tĩnh các chủng M01, 2991 và 3492 trên môi trường MRS thay thế
nguồn C với các điều kiện pH 6,5, nhiệt độ 37oC, với nguồn N, C thích hợp trong bình
tam giác. Theo dõi khả năng sinh trưởng (OD600), số lượng tế bào, hàm lượng Dglucose của các chủng vi khuẩn sau các thời gian nuôi cấy 0, 8, 16, 24, 32, 40, 48 và 60
giờ.

Hình 3.17. Sinh trưởng của L. bulgaricus M01 theo thời gian

65


Luận văn thạc sĩ khoa học – Đỗ Thị Thu Thuỷ (2017)

Hình 3.18. Sinh trưởng của L. acidophilus 2991 theo thời gian

Hình 3.19. Sinh trưởng của S. thermophilus theo thời gian
Từ các biểu đồ trên ta thấy khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn nghiên
cứu tốt nhất từ khoảng 24 giờ. Khi nuôi tĩnh các chủng vi khuẩn trong 60 giờ, tế bào

66