Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đoán Helicobacter pylori bằng Nested PCR từ dịch dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN
HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR
TỪ DỊCH DẠ DÀY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2019
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ii
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

TRẦN NGỌC ANH

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN
HELICOBACTER PYLORI BẰNG NESTED PCR
TỪ DỊCH DẠ DÀY

Ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN PHÚ HÙNG

THÁI NGUYÊN - 2019

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN




i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung
thực và chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào. Mọi kết quả thu được
không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích dẫn trong
luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Tác giả

Trần Ngọc Anh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




ii
LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản luận văn này em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành
tới: Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo, trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên. Các thầy cô và cán bộ Khoa Cơng nghệ Sinh học đã tận tình dạy dỗ,
truyền dạy kiến thức và kinh nghiệm nghiên cứu khoa học cho chúng em trong
những năm qua.
Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS. Nguyễn Phú Hùng, người thầy
đã định hướng nghiên cứu và tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho em trong suốt
thời gian em thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được rất nhiều sự quan
tâm giúp đỡ từ gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và các anh, chị trong nhóm nghiên
cứu, những người ln động viên, khích lệ em, tạo cho em động lực và niềm
say mê trong nghiên cứu khoa học. Em vô cùng biết ơn tất cả những tình cảm
tốt đẹp mà mọi người đã dành cho em.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019
Tác giả

Trần Ngọc Anh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN




iii

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
MỤC LỤC ....................................................................................................... III

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................. V
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. VI
DANH MỤC CÁC HÌNH ..............................................................................VII
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu gồm ............................................................................. 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3
1.1. Vi khuẩn Helicobacter pylori .................................................................... 3
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu H. pylori .............................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm hình thái học của H. pylori ................................................. 4
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của H. pylori ............................................................ 5
1.2. Gen mã hoá CagA (cytotoxine associated gene A).................................... 6
1.3. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn H. pylori........................................ 8
1.3.1. Các xét nghiệm xâm hại qua nội soi dạ dày tá tràng (invasive test) ........... 9
1.3.2. Các thử nghiệm không xâm lấn ........................................................ 19
1.4. Nested PCR trong chẩn đoán H. pylori.................................................... 23
1.4.1. Khái niệm về Nested PCR ................................................................ 23
1.4.2. Ứng dụng của Nested PCR trong chẩn đoán H. pylori ..................... 24
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 26
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 26
2.1.1. Mẫu bệnh phẩm ................................................................................. 26
2.1.2. Hóa chất, dụng cụ thiết bị ................................................................. 26
2.2. Địa điểm và thời gian ............................................................................... 27
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




iv

2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 27
2.3.1. Phương pháp thu nhận mẫu bệnh phẩm dịch dạ dày ........................ 27
2.3.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm ............... 27
2.3.3. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ mẫu chủng vi khuẩn ........ 28
2.3.4. Phương pháp đo DNA tổng số .......................................................... 29
2.3.5. Phương pháp Nested PCR................................................................. 29
2.3.6. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose ..................................... 33
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu................................................................. 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 35
3.1. Kết quả tách DNA từ chủng vi khuẩn Helicobacter pylori và dịch dạ dày ... 35
3.2. Khuếch đại DNA đặc trưng genome của H. pylori bằng kỹ thuật Nested
PCR ................................................................................................................. 36
3.3. Xác định độ nhạy của kỹ thuật Nested PCR trong phát hiện H. pylori ....... 38
3.3. Xác định gen CagA của vi khuẩn H. pylori bằng Nested PCR................ 39
3.4. Áp dụng kỹ thuật Nested PCR để đánh giá mức độ nhiễm H. pylori và
chủng H. pylori mang gen CagA trong các mẫu bệnh phẩm .......................... 41
3.5. Xây dựng quy trình chẩn đốn ở mức độ phịng thí nghiệm ................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 47

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




v

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Campylobacter Like Organism test

Clotest

Cytotoxine associated gen A

CagA

Deoxyribonucleic acid

DNA

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

ELISA

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

ELISA

Heptose - bisphosphate

HBP

Immuno Globulin A

IgA

Immuno Globulin G

IgG

Immuno Globulin M

IgM

Nuclear factor kappa B

NFkB

Pathogenicity island

PAI

Ribonucleic acid

RNA

Urea Breath Test

UBT

Vacuolating toxin gene A

VacA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR .................. 31
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR vòng 1 ................................................. 31
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cho vòng 2 .................................................. 31
Bảng 2.4. Chu kì nhiệt cho mỗi vịng của phản ứng Nested- PCR ................. 32
Bảng 2.5. Các cặp mồi được sử dụng cho phản ứng Nested PCR phát hiện gen
CagA................................................................................................................ 32
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng PCR cho 2 vòng .......................................... 33
Bảng 2.7. Chu kì nhiệt cho mỗi vịng của phản ứng Nested- PCR ................. 33
Bảng 3.1. Nồng độ DNA tổng số tách chiết từ mẫu bệnh phẩm và chủng H.
pylori đối chứng .............................................................................................. 35
Bảng 3.2. Kết quả phân tích từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ........................... 41

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




vii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Vi khuẩn H. pylori............................................................................. 3
Hình 1.2. Mẫu thử Clotest ................................................................................. 9
Hình 1.3. Vi khuẩn H. pylori trên đĩa ni cấy phân lập ................................ 11
Hình 1.4. Viêm dạ dày lympho ....................................................................... 14
Hình 1.5. Viêm dạ dày hạt .............................................................................. 16

Hình 1.6. Nguyên lý test thở 13C và 14C .......................................................... 20
Hình 1.7. Nested PCR ..................................................................................... 24
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ..................................................... 35
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vòng 1 khuếch đại DNA đặc trưng
của vi khuẩn H. pylori. .................................................................................... 37
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR vịng 2 khuếch đại DNA đặc trưng
của vi khuẩn H.pylori. ..................................................................................... 37
Hình 3.4. Độ nhạy của phản ứng Nested PCR khuếch đại đoạn DNA đặc trưng
genome H. pylori. ............................................................................................. 38
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vòng 1. ....................... 39
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen CagA vịng 2.......................40
Hình 3.7. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng của vi
khuẩn H. pylori................................................................................................ 40
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại DNA đặc trưng của vi
khuẩn H. pylori................................................................................................ 40
Hình 3.9. Quy trình chẩn đốn H. pylori bằng phương pháp Nested PCR áp
dụng cho các phịng thí nghiệm ...................................................................... 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Helicobacter pylori (H. pylori) là một trong những vi khuẩn thường gặp
gây nhiễm trùng đường tiêu hóa. Sự phát hiện ra H. pylori bởi Marshall và
Warren năm 1882 đã mở ra một kỉ nguyên mới trong điều trị bệnh lý dạ dày tá
tràng. H. pylori đã được xem là nguyên nhân chính gây viêm, loét dạ dày ở mọi

lứa tuổi. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới, hơn 50% dân số bị nhiễm
loại vi khuẩn này [46]. Tỷ lệ nhiễm H. pylori đang giảm ở vùng châu Á - Thái
Bình Dương, nhưng ở Việt Nam tỷ lệ nhiễm vi khuẩn này còn cao [2]. Tỷ lệ
nhiễm H. pylori ở những trẻ em bị viêm dạ dày là 70% và ở bệnh nhân loét
hành tá tràng là 90% [3]. Ở Việt Nam chưa có những theo dõi quy mơ, tồn
diện, chủ yếu là các số liệu thống kê dựa trên những nghiên cứu rải rác trong
các cộng đồng nhỏ.
Có rất nhiều phương pháp để giúp cho chẩn đoán nhiễm H. pylori dựa theo
điều kiện cụ thể của từng cơ sở y tế. Các phương pháp chẩn đốn có tính xâm
lấn thơng qua nội soi gồm thử nghiệm urease, nuôi cấy vi khuẩn, xác định acid
nhân của vi khuẩn, chẩn đốn mơ bệnh học, phản ứng chuỗi PCR. Các phương
pháp không xâm lấn bao gồm: Nghiệm pháp thở C13 hoặc C14, chẩn đoán huyết
thanh, test nhanh bằng huyết thanh, test huyết thanh phát hiện kháng thể kháng
CagA, tìm kháng thể kháng H. pylori trong nước tiểu, Immunoblot, dùng PCR
chẩn đoán H. pylori trong phân, phát hiện kháng nguyên trong phân. Mỗi
phương pháp đều cho những ưu nhược điểm riêng.
Hiện nay, PCR là một kỹ thuật chẩn đoán tiên tiến nhưng chưa được phổ
biến rộng rãi ở Việt Nam trong chẩn đốn nhiễm H. pylori. Ngồi việc chẩn
đốn nhiễm H. pylori trước điều trị, PCR cịn dùng để theo dõi sau điều trị tiệt
trừ H. pylori.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN




2
Thơng thường, việc chẩn đốn bằng PCR cũng như các xét nghiệm Clotest
đều trải qua việc sinh thiết một mẫu niêm mạc dạ dày, điều này ít nhiều gây tổn
thương cho dạ dày và gây đau đớn cho người bệnh. Trong khi đó, PCR phát
hiện từ mẫu phân và mẫu nước tiểu là những xét nghiệm không xâm lấn nhưng

tỷ lệ âm tính giả cao do sự có khả năng thu nhận được H. pylori từ các mẫu
bệnh phẩm này thấp hơn nhiều so với trong dạ dày. Trong nghiên cứu này chúng
tôi hướng tới việc xây dựng một quy trình chẩn đốn H. pylori bằng Nested
PCR từ dịch dạ dày nhằm giảm tính xâm lấn so với các phương pháp phân tích
từ mơ dạ dày đồng thời có thể phát hiện các chủng có nguy cơ gây ung thư
mang gen CagA mà một số phương pháp không xâm lấn khác không đạt được.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng quy trình chẩn đốn H. pylori từ dịch dạ dày bằng phương pháp
Nested PCR.
3. Nội dung nghiên cứu gồm
Nội dung 1: Thu thập mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân nội soi viêm loét dạ
dày và tách chiết DNA tổng số.
Nội dung 2: Phát hiện DNA đặc trưng genome H. pylori bằng phản ứng
Nested PCR.
Nội dung 3: Phát hiện gen CagA của vi khuẩn H. pylori bằng phản ứng
Nested PCR.
Nội dung 4: Đánh giá tỷ lệ dương tính với vi khuẩn H. pylori và gen CagA từ
các mẫu bệnh phẩm bằng Nested PCR.
Nội dung 5: Xây dựng quy trình chẩn đốn H. pylori bằng Nested PCR

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Vi khuẩn Helicobacter pylori
1.1.1. Lịch sử nghiên cứu H. pylori
Loài xoắn khuẩn này đã được tìm thấy trong niêm mạc dạ dày của người

và động vật từ năm 1875 nhưng mối liên quan giữa vi khuẩn này và các bệnh
lý ở dạ dày tá tràng chưa được xác định [32].

Hình 1.1. Vi khuẩn H. pylori
(Nguồn: pylori.gif)
Khi mới được phân lập vi khuẩn này được đặt tên là Campylobacter
pyloridis căn cứ vào vị trí khu trú và một số đặc điểm giống Campylobacter
jejuni [35]. Sự khác biệt giữa Campylobacter pyloridis và các chủng
Campylobacter được xác định bởi Goodwin và cộng sự vào năm 1989 từ đó
Campylobacter pyloridis được đổi tên thành Helicobacter. Tên Helicobacter
phản ánh hai đặc điểm hình thái của vi khuẩn dạng hình gậy trên in vitro và
hình xoắn trên in vivo [21]. Năm 1983, Warren và Marshall cùng các cộng sự
tuyên bố có sự liên quan với vi khuẩn này với bệnh lý dạ dày. Tuy nhiên, quan
niệm lúc đó khó chấp nhận sự có mặt cũng như vai trị của vi khuẩn tồn tại
trong môi trường rất axid của dạ dày. Thí nghiệm của Marshall bằng cách uống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




4
một lượng lớn vi khuẩn sống H. pylori vào trong cơ thể, sau đó theo dõi các
triệu chứng của viêm dạ dày cấp tính và thực hiện xác định sự có mặt của H.
pylori bằng phương pháp mơ bệnh học từ bệnh phẩm sinh thiết dạ dày. Song
song với nghiên cứu này cịn có nghiên cứu của Morris cũng tự gây nhiễm trùng
H. pylori cho bản thân. Cuối cùng, với những nỗ lực trong các nghiên cứu nêu trên,
vi khuẩn H. pylori đã được công nhận là tác nhân gây viêm loét dạ dày ở người
[13]. Viện nghiên cứu sức khỏe Hoa Kỳ đã công bố vi khuẩn H. pylori có khả năng
gây viêm loét dạ dày - tá tràng và khuyến cáo dùng kháng sinh để điều trị nhiễm
trùng này và Warren và Marshal đã giành được giải thưởng Nobel Sinh lý học và

Y học vào năm 2005 [16].
1.1.2. Đặc điểm hình thái học của H. pylori
Về hình thể, H. pylori có hình dạng mỏng mảnh, cong xoắn hoặc hình chữ
S, bắt mầu gram âm, dài từ 1,5 đến 5 pm và dày 0,3 -1 pm, với 4 đến 7 lơng có
vỏ bọc ra từ một đầu cực. Nhờ cấu trúc hình xoắn và các lơng này, vi khuẩn di
chuyển dễ dàng trong lớp nhầy của dạ dày. Các lơng roi đều có vỏ là lớp liên
tục với màng ngồi vi khuẩn, chính lớp vỏ này bảo vệ cho các sợi và chất sợi
trong lông không bị môi trường acid khử cực và làm mất chất sợi, đảm bảo cho
hoạt động di chuyển của vi khuẩn [49].
Hình thái điển hình của H. pylori chỉ gặp khi soi tươi hoặc nhuộm mô
bệnh học các mẫu sinh thiết. Trong môi trường ni cấy, H. pylori dài hơn
và có độ xoắn thấp hơn. Ngồi ra, trong mơi trường ni cấy để lâu hoặc
trong mơi trường ngồi, H. pylori thường chuyển thành dạng hình cầu với
nhiều kích thước khác nhau. Dựa vào đặc điểm hình thái học, vi khuẩn H.
pylori có thể được phát hiện theo phương pháp tế bào học bằng cách nhuộm
gram hoặc soi kính hiển vi đối quang phân kỳ (phase contrast microsopy) từ
các mẫu bệnh phẩm sinh thiết dạ dày và theo phương pháp mơ bệnh học [29].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




5
1.1.3. Cơ chế gây bệnh của H. pylori
Sau khi xâm nhập vào dạ dày, nhờ có hình xoắn và các lơng roi ở một đầu,
vi khuẩn có thể xâm nhập vào lớp nhày bao phủ niêm mạc dạ dày. Nhờ có các yếu
tố bám dính, vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu mơ niêm mạc dạ dày, nhờ có khả
năng tiết ra nhiều enzym urease có tác dụng phân hủy ure trong dạ dày thành
amonia gây kiềm hóa mơi trường xung quanh vi khuẩn. Mơi trường này có tác

dụng giúp cho vi khuẩn tồn tại được trong lớp nhày của dạ dày đồng thời tránh
được sự tấn công của axid HCl, pepsin ln có trong lịng dạ dày [29].
Amonia cùng với nhiều yếu tố có khả năng gây bệnh của H. pylori như các
độc tố tế bào, các enzym tiêu protein, phospholipase... đã phân hủy các thành
phần của chất nhày bao phủ niêm mạc dạ dày giúp cho axid HCl và pepsin tấn
công vào niêm mạc tổn thương viêm. Mặt khác, các yếu tố có khả năng gây bệnh
của H. pylori như urease, chất bám dính, LPS, CagA, VacA, protease, lipase...
gây tổn thương niêm mạc dạ dày, đồng thời giải phóng ra hàng loạt các chất
trung gian hóa học có khả năng phát động q trình viêm như: các Interleukin
(IL1-6-8...), yếu tố gây hoại tử khối u (TNF-α), các leucotriene...
Các yếu tố IL 1,6,8 có tác dụng tăng cường q trình bám dính của bạch
cầu vào thành mạch, tăng cường hoạt động xuyên mạch của bạch cầu và có tác
dụng thu hút bạch cầu tới vùng viêm. Ngoài ra, IL1,8 cịn có tác dụng thu hút
các tế bào lympho T, tăng cường chuyển dạng các tế bào T thành tế bào T giúp
đỡ có khả năng sinh ra các Interleukin, trong đó có IL 1,6,8. Các Interleukin,
các yếu tố gây bệnh của H. pylori cịn có tác dụng hoạt hóa hệ thống bổ thể. Hệ
thống này cùng với Leukotriene có tác dụng góp phần thu hút bạch cầu đặc biệt
là các lympho B có chức năng sản xuất globulin miễn dịch đặc hiệu IgG, IgA.
Quá trình đáp ứng miễn dịch dịch thể sinh ra các kháng thể chống H. pylori
cũng gây ra phản ứng chéo với các thành phần kháng nguyên tương tự trên các
tế bào biểu mô dạ dày [2].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN




6
Viêm dạ dày do nhiễm H. pylori diễn biến qua 2 giai đoạn:
Giai đoạn cấp tính: Q trình nhiễm H. pylori có thể [24] chia làm hai giai
đoạn. Giai đoạn cấp tính, vi khuẩn xâm nhập, nhân lên và gây hiện tượng viêm

niêm mạc, giảm tiết acid và một số triệu chứng dạ dày tá tràng xuất hiện. Sau
vài tuần, giai đoạn viêm mãn tính bắt đầu với hiện tượng giảm các đáp ứng
viêm, pH dạ dày trở về bình thường và người nhiễm trở nên khơng có triệu
chứng. Sự xâm nhập của vi khuẩn H. pylori ở niêm mạc dạ dày dẫn đến sự xâm
nhập các bạch cầu trung tính và mono ở cả hang vị và thân vị, dẫn đến q trình
viêm mãn tính và lt.
Giai đoạn mãn tính: trong giai đoạn viêm cấp, nếu điều trị H. pylori sẽ
được tiệt trừ, tình trạng viêm có thể chấm dứt nhanh chóng. Nhưng phần lớn
các trường hợp chuyển sang viêm mãn tính do H. pylori tồn tại lâu dài ở niêm
mạc dạ dày. Giai đoạn này các triệu chứng lâm sàng có thể giảm đi hoặc mất
nhưng về mơ bệnh học q trình viêm mãn tính biểu hiện rõ với những biến đổi
mơ, có hiện tượng bong tróc niêm mạc và xâm nhập nhiều tế bào viêm.
Nhiễm H. pylori dẫn đến quá trình viêm niêm mạc dạ dày, quá trình này
nếu khơng được điều trị sẽ diễn biến ngày càng nặng. Trên cơ sở niêm mạc
viêm, hàng rào bảo vệ niêm mạc bị phá hủy, kết hợp với sự tấn công của acid
HCl và pepsin dẫn đến trợt rồi loét. Các tổn thương do nhiễm H. pylori làm cho
chức năng của tế bào D bị giảm, dẫn tới giảm tiết somatostatin là chất ức chế
bài tiết gastrin và kiểm soát HCl. Giảm somatostatin sẽ làm tăng tiết gastrin dẫn
tới tăng tiết HCl quá mức ở dạ dày làm cho pH ở hành tá tràng giảm mạnh gây
nên tình trạng dị sản niêm mạc dạ dày ở hành tá tràng, đây là yếu tố tấn công
quan trọng gây viêm, loét [46].

1.2. Gen mã hố CagA (Cytotoxine associated gene A)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




7
CagA là một protein có trọng lượng phân tử 120-140 KDa mã hoá bởi gen

CagA phân bố trong vùng DNA có tên là “đảo sinh bệnh” (PAI, pathogenicity
island) trong hệ gen của H. Pylori. CagA được coi là một oncoprotein, được
chuyển vào các tế bào biểu mô dạ dày bằng hệ thống bài tiết IV của mầm bệnh,
tạo ra nhiều tầng tín hiệu [44], [40]. Các đánh giá khác trong loạt bài này mô tả
chi tiết các phản ứng báo hiệu nội bào biểu mô do CagA gây ra và vai trị của
nó trong sinh bệnh học [7], [53].
Các nghiên cứu gần đây đã báo cáo rằng ngồi việc kích hoạt NOD-1,
heptose-1,7-bisphosphate (HBP) của vi khuẩn, tiền chất chuyển hóa của sinh
tổng hợp lipopolysacarit, cũng được đưa qua hệ thống tiết Cag loại IV vào tế
bào biểu mô [19], [51]. Độc lập với NOD1, HBP kích hoạt yếu tố liên quan đến
thụ thể của yếu tố hoại tử khối u tế bào (TRAF) với protein liên kết với đầu nối
(TIFA), dẫn đến việc kích hoạt sớm các phản ứng chemokine của NFkB và
CXC. Như vậy, sự hoạt hóa của biểu mô NOD-1 và TIFA bởi hai thành phần
độc lập của H. pylori được cung cấp qua các Cag loại IV trigger hệ thống bài
tiết bẩm sinh phản ứng viêm miễn dịch.
Tỷ lệ mắc ung thư dạ dày và sự thay đổi trong tần số của Cag PAI [45] là
những yếu tố quan trọng khi đánh giá nguy cơ nhiễm trùng với các chủng H.
pylori dương tính CagA và ung thư dạ dày. Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng
CagA EPIYA-D ở các chủng Đông Á liên kết với SHP2 phosphatase prooncogen mạnh gấp 100 lần so với CagA EPIYA- C ở các chủng H. pylori
của phương Tây và cũng kích thích hoạt động mạnh mẽ Ras ERK của tế bào
[25], [37]. CagA IgG đã được đánh giá bằng phương pháp ELISA sử dụng
CagA tái tổ hợp trong một số bệnh ung thư dạ dày để xác định xem CagA IgG
huyết thanh dương tính có liên quan đến tỷ lệ CagA huyết thanh âm tính, tỷ
lệ H. pylori dương tính và các đối chứng không bị nhiễm trùng phù hợp với các
lứa tuổi [47].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

8
CagA là một yếu tố quan trọng trong sự phát triển của ung thư dạ dày
ở những người nhiễm H. pylori . Trong mơ hình của gerbil, chủng CagA-dương
tính nhưng không phải là yếu tố gây đột biến CagA dẫn đến phát triển ung thư
dạ dày, hầu hết các bệnh nhân có chủng CagA- dương tính đều có xu hướng
phát triển thành ung thư dạ dày ở phương Tây [41]. Tuy nhiên, ở các nước Đông
Á hầu hết các chủng H. pylori đều biểu hiện có đột biến CagA. Các quan sát
dịch tễ học chỉ ra rằng các bệnh nhân có đột biến CagA có mối liên hệ chặt chẽ
hơn với teo niêm mạc dạ dày và tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao hơn [6], [50],
[54].
H. pylori (mang gen CagA) có khả năng kích thích tiết IL-8, IL-10, IL-12
do hoạt hoá yếu tố NFkB (Nuclear factor kappa B), tiết và vận chuyển protein
CagA vào trong tế bào, và phosphoryl hố CagA. CagA hoạt hố các con đường
tín hiệu ung thư trong tế bào, theo Anthory P. xấp xỉ 60% các chủng H. pylori
phân lập được có gen CagA. Người ta thấy kháng thể CagA có ở 100% bệnh
nhân loét dạ dày tá tràng và 76,5% ở bệnh nhân có biểu hiện bệnh lý dạ dày tá
tràng nhưng khơng có loét. Ở các nước phát triển, bệnh lý về dạ dày tá tràng có
liên quan với chủng H. pylori có CagA (+) hơn các chủng CagA (-). Sau khi
vào tế bào CagA được phosphoryl hóa và kết hợp với SHP-2 tyrosine
phosphatase tạo nên yếu tố đáp ứng phát triển tế bào (growth factor – like
cellular) và sản xuất cytokine của tế bào ký chủ.
1.3. Các phương pháp chẩn đoán vi khuẩn H. pylori
Kể từ khi H. pylori được tìm ra vào năm 1982, đến nay đã có nhiều phương
pháp chẩn đoán nhiễm H. pylori được nghiên cứu và áp dụng. Trong chẩn đốn,
mỗi phương pháp có những ưu, nhược điểm khác nhau và việc chọn lựa phương
pháp còn tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong thực hành,
giá thành của thử nghiệm và cơ sở vật chất, trang thiết bị. Điều quan trọng nhất

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

9
là các thử nghiệm phải có độ nhạy và độ đặc hiệu cao để giúp cho chẩn đoán
trước điều trị và theo dõi sau điều trị đạt hiệu quả tốt nhất.
Các phương pháp chẩn đốn H. pylori có thể chia thành hai nhóm:
- Các thử nghiệm ít xâm hại được thực hiện qua nội soi dạ dày tá tràng.
- Các thử nghiệm không xâm hại.
Nguyên tắc khi chỉ định thử nghiệm là bệnh nhân không được uống các
loại thuốc kháng tiết, các loại kháng sinh... và phải ngưng điều trị ít nhất 4 tuần.
1.3.1. Các xét nghiệm xâm hại qua nội soi dạ dày tá tràng (Invasive test)
1.3.1.1. Thử nghiệm urease
Test này xác định hoạt độ enzym urease của H. pylori bằng việc đặt
mẫu mô dạ dày vào môi trường lỏng (test maison, CU test) hoặc bán đặc
(Clotest, HUT test) hoặc trên một cái màng gọi là Pyloritek có chứa urea
và một chất chỉ thị màu theo pH [12]. Nguyên tắc của thử nghiệm là nhằm
phát hiện enzym urease của H. pylori, H. pylori gần như là loại vi khuẩn
duy nhất trong dạ dày tiết enzym urease với khối lượng lớn (ngoại trừ một
số rất ít bệnh nhân bị nhiễm Helicobacter helmanii). Enzym urase của H.
pylori có trong mẫu mơ dạ dày sẽ làm biến đổi urease thành amoniac (NH 3),
NH3 làm mơi trường thuốc thử có pH kiềm, vì vậy làm thay đổi màu của chất
chỉ thị và theo phản ứng sau:
(NH2)CO + H2O

CO2 + 2NH3

Hình 1.2. Mẫu thử Clotest
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN

10
Độ nhạy thay đổi theo từng loại test và thời gian đọc kết quả, gia tăng khi
được ủ ở 37-420 C, các test tốt đọc trong vòng 4 giờ cho độ nhạy cảm 85-90%
và độ đặc hiệu từ 95-98%. Trong điều kiện hiện nay người ta thừa nhận ngưỡng
phát hiện vi khuẩn là 104-105 vi khuẩn/ml [46].
Trong các loại test trên ở Việt Nam thường sử dụng Clotest. Clotest là
viết tắt của chữ Campylobacter Like Organism test, Clotest sử dụng mẫu thử
là hỗn hợp gồm: agar gel có chứa urea, chất chỉ thị đỏ phenol, chất kìm hãm
vi khuẩn. Mẫu sinh thiết niêm mạc dạ dày lấy trong nội soi được vùi vào đó.
Thử nghiệm dương tính khi mẫu thử Clotest đổi màu từ vàng sang màu đỏ tía.
Clotest có thể đọc kết quả sau 5 phút, 20 phút, 1 giờ, 3 giờ,và 24 giờ [3]. Nếu
chỉ đọc kết quả trong một giờ, độ nhạy của thử nghiệm sẽ giảm xuống vì phụ
thuộc vào lượng enzym urease hoạt động cũng như số lượng vi khuẩn. Ở một
số trường hợp, kết quả dương tính chỉ sau vài phút và khi mật độ vi khuẩn
thấp kết quả có thể dương tính sau nhiều giờ liền, thậm chí âm tính giả có thể
xảy ra.
Các trường hợp âm tính giả có thể do: mật độ vi khuẩn thấp (như trên),
đang xuất huyết tiêu hóa, teo niêm mạc dạ dày, u MALT, mới vừa dùng kháng
sinh hoặc PPIs [32]. Các trường hợp dương tính giả gặp trong nhiễm H.
heilmanii, vi khuẩn này cũng sinh ra enzym urease và thường gặp trong dạ dày
của chó, mèo, lợn. Khi độ toan dịch vị thấp, dương tính giả cịn có thể gặp ở
những trường hợp nhiễm vi khuẩn khác cũng sinh ra enzym urease như
Enterobacter và Pseudomonas. sp [3].
Áp dụng và giá trị của thử nghiệm Clotest:
- Chẩn đoán nhiễm H. pylori: đây là một thử nghiệm nhanh chóng, rẻ tiền,
đơn giản và hữu hiệu để phát hiện H. pylori. Độ nhạy và độ đặc hiệu trên 90%
và nếu sinh thiết ở cả hai mẫu ở hang vị và thân vị thì độ nhạy sẽ tăng thêm

4,3% so với chỉ lấy một mẫu ở hang vị. Tại Việt Nam, thử nghiệm urease dương
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




11
tính trong loét tá tràng là 64,7% đến 87,3% và trong loét dạ dày là 60% đến
100%.
1.3.1.2. Nuôi cấy vi khuẩn
Lấy mẫu mô niêm mạc dạ dày đem nhuộm Gram để tìm sự hiện diện của
vi khuẩn [32]. Tuy nhiên, độ nhạy khơng cao. Để xác định chính xác nhiễm H.
pylori về mặt phương diện vi khuẩn học cần phải ni cấy vi khuẩn.

Hình 1.3. Vi khuẩn H. pylori trên đĩa ni cấy phân lập
Trong chẩn đốn nhiễm H. pylori, ni cấy là thử nghiệm đặc hiệu nhất
và có thể nói đó là tiêu chuẩn vàng có độ đặc hiệu 100% [3]. Ni cấy cịn cho
biết mật độ của H. pylori, cấu trúc gen của các chủng H. pylori khác nhau. Ni
cấy cịn cho biết dạng hình cầu của H. pylori là hình thái thối hóa của vi khuẩn.
Dù vậy, về mặt thực tiễn lâm sàng ít khi dùng phương pháp này vì có
nhiều phương pháp khác đơn giản hơn, dễ áp dụng rộng rãi hơn. Tuy nhiên,
trong trường hợp điều trị thất bại, nuôi cấy làm kháng sinh đồ vẫn là thử
nghiệm có ích để hướng dẫn điều trị thích hợp và là một trong các phương
pháp để đánh giá tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn đối với kháng sinh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN




12

Cách thực hiện: u cầu dùng mơi trường cấy thích hợp thuộc loại
Portagerm pylori (bioMerieux) cho phép bảo quản mẫu sinh thiết 24 giờ với
nhiệt độ bên ngoài. Đây là mơi trường đặc, chọn lọc có chứa kháng sinh để ức
chế sự phát triển của vi khuẩn hiếu khí đường hô hấp trên. Lấy mẫu mô dạ dày
cấy vào môi trường này. Sau đó mơi trường cấy được ủ ở 37oC trong mơi trường
vi hiếu khí bão hịa trong nước với 5% oxy và 5-10% CO2. Thời gian mọc là 3
-7 ngày.
Định danh vi khuẩn bằng nhuộm Gram phối hợp với sự hiện diện của
enzym catalase, oxydasae và urease. Độ đặc hiệu là 100% và độ nhạy thay đổi
từ 70 - 100% tùy theo nghiên cứu và độ nhạy này phụ thuộc mật độ vi khuẩn,
kỹ thuật cấy, bảo quản bệnh phẩm, sự vận chuyển mẫu sinh thiết, nếu sự vận
chuyển < 4 giờ thì có thể giữ ở nhiệt độ thường, dưới 24 giờ thì nên bảo quản
ở 4oC, nếu > 24 giờ nên bảo quản ở -70oC [29].
Giá trị chẩn đốn: Mặc dù độ đặc hiệu của ni cấy đạt gần 100% nhưng
độ nhạy thì rất khác nhau do ảnh hưởng của các yếu tố đã nêu trên. Tại Việt
Nam kết quả ni cấy chẩn đốn nhiễm H. pylori thấp hơn so với các thử
nghiệm khác, nuôi cấy có kết quả dương tính từ 36,8% đến 68,7% [16], [57].
1.3.1.3. Chẩn đốn mơ bệnh học
Viêm dạ dày và lt dạ dày không phải là các thực thể lâm sàng khác biệt,
mà là các dạng tổn thương hình thái có thể là thứ phát sau nhiều nguyên nhân cơ
bản [9]. Việc xác định mô học của lymphocytosis nội mô và hình thành u hạt là
các tính năng chẩn đốn chính của viêm dạ dày và loét dạ dày. Tuy nhiên, chẩn
đốn hình thái của viêm dạ dày và lt dạ dày gợi ra các nghiên cứu lâm sàng và
xét nghiệm để xác định nguyên nhân cơ bản.
Ở các nước phương Tây, viêm dạ dày và loét dạ dày thường được phân loại
là các dạng viêm dạ dày đặc biệt của H. pylori, góp phần vào sinh bệnh học của
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN

13
cả viêm dạ dày và loét dạ dày, liệu pháp diệt trừ H. pylori có thể là một phương
pháp điều trị hiệu quả [10], [33]. Vai trò của nhiễm H. pylori trong sinh bệnh học
được mô tả cùng với các đặc điểm mô bệnh học của chúng.
Viêm dạ dày, được đặc trưng bởi sự xâm nhập tế bào lympho ở bề mặt và
biểu mô dạ dày hố được gọi là lymphocytosis lympho nội bào [23]. Tuy nhiên,
các hình ảnh nội soi của viêm dạ dày thay đổi tùy theo mức độ nghiêm trọng
của nó, từ bình thường đến phì đại [39]. Về mặt mô học, viêm dạ dày được xác
định bởi sự hiện diện của ≥25 tế bào lympho nội mô (MSN) trên 100 tế bào
biểu mô. Tế bào lympho nội mơ dạ dày có liên quan đến nhiều tình trạng các
bệnh bao gồm bệnh Celiac, nhiễm H. pylori, bệnh Crohn, giang mai, bệnh dạ
dày phì đại, bệnh Ménétrier, virus gây suy giảm miễn dịch ở người và ung thư
hạch. Tuy nhiên, bệnh Celiac và nhiễm H. pylori là nguyên nhân chính của
viêm dạ dày, chiếm lần lượt 38% và 29% trường hợp. Tăng tế bào lympho nội
mô nhẹ với giá trị cắt thấp (≥8 mã hóa / 100 tế bào biểu mô) đã được quan sát
thấy ở 84% bệnh nhân mắc bệnh celiac và viêm dạ dày xảy ra ở 45% bệnh nhân,
với độ phân giải của viêm dạ dày để đáp ứng với chế độ ăn khơng có gluten [8]
.
Các nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng, H. pylori liên kết với viêm dạ
dày thường biểu hiện hoạt động bạch cầu trung tính đáng kể bên cạnh tế bào
lympho nội mô [39], khác biệt với viêm dạ dày liên quan đến bệnh Celiac mà
không biểu hiện tế bào lympho trong tế bào. Trong một nghiên cứu của
Nielsen và cộng sự [39] cho rằng H. pylori, tế bào lymphocytosis nội mô tế bào
kèm theo thâm nhiễm bạch cầu trung tính nên được coi là viêm dạ dày hoạt
động mãn tính.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Cơng nghệ thông tin – ĐHTN

14

Hình 1.4. Viêm dạ dày lympho
(A) Mẫu sinh thiết cho thấy sự gia tăng rõ rệt của các tế bào lympho nội mô
(hơn 25 MSN trên 100 tế bào biểu mô) với sự phân bố nặng hàng đầu. (B)
Hầu hết các MSN đều dương tính với miễn dịch CD3 [30]
Một số lượng đáng kể bệnh nhân mắc viêm dạ dày và huyết thanh H.
pylori dương tính khơng thể hiện bằng chứng mơ học về nhiễm H.
pylori [39]. Ngồi ra, có thể sự phát triển của viêm dạ dày là phản ứng miễn
dịch tại chỗ, thoáng qua hoặc chậm trễ đối với nhiễm H. pylori và không phải
là tác động trực tiếp của nhiễm trùng. Do đó, nếu các nguyên nhân khác có thể
được loại trừ, liệu pháp diệt H. pylori có thể được xem xét ở những bệnh nhân
có triệu chứng với viêm dạ dày có mơ học và huyết thanh dương tính với H.
pylori. Cách tiếp cận này có thể phù hợp hơn ở các quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh
Celiac thấp và tỷ lệ nhiễm H. pylori cao, ngay cả khi không phát hiện mô học
của H. pylori.
Các tế bào lympho nội mô là khác biệt về chức năng và kiểu hình với các
tế bào lympho ngoại vi, và phần lớn các tế bào lympho nội mô trong biểu mơ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




15
đường tiêu hóa là các tế bào T CD3 + / CD8 + có tiềm năng gây độc tế bào
[43]. Những khúc mắc này được cho là có vai trị quan trọng trong khả năng
miễn dịch niêm mạc và cũng có liên quan đến sự thay đổi tế bào biểu mô bằng
cách khơi gợi apoptosis thông qua tế bào lympho T tế bào lympho (CTL) [27].

Han và cộng sự [22] đã nghiên cứu các quần thể lồi và độc tính tế bào của
chúng ở H. pylori. Niêm mạc dạ dày bị nhiễm trùng bằng cách sử dụng kháng
nguyên nội bào T bị hạn chế-1 (TIA-1; một dấu hiệu để nghỉ ngơi và kích hoạt
CTL) và granzyme B (GrB; một dấu ấn cho CTL hoạt hóa). Họ phát hiện ra
rằng IELs bao gồm một hỗn hợp của TIA-1 + / GrB- CTL, TIA-1 + /
GRB + CTL, và CD4 + tế bào T trong niêm mạc, cũng có sự gia tăng song song
trong apoptosis biểu mơ. Trong khi đó, trong một nghiên cứu của Oberhuber và
cộng sự [42], tỷ lệ GrB + CTL trong H. pylori mật associated viêm dạ dày
(10,8%) thấp hơn so với viêm dạ dày vô căn (12%) hoặc bệnh Celiac liên quan
đến viêm dạ dày (18,9%).
- Loét dạ dày có thể được gây ra bởi một số yếu tố, bao gồm bệnh tồn
thân (ví dụ, bệnh Crohn, sarcoidosis, hoặc viêm mạch máu), nhiễm trùng (ví
dụ, bệnh lao, histoplasmosis, hoặc giang mai), bệnh ác tính tiềm ẩn, hoặc dị vật
[15]. Bệnh Crohn và sarcoidosis dạ dày là hai nguyên nhân hàng đầu của loét
dạ dày, chiếm 20% - 50% các trường hợp ở các nước phương Tây. Dhillon và
Sawyerr lần đầu tiên báo cáo về mối liên quan giữa nhiễm loét dạ dày và H.
pylori vào năm 1989. Kể từ đó, một số báo cáo đã được cơng bố hỗ trợ cho phát
hiện của họ [56]. Các báo cáo này đã chứng minh rằng niêm mạc xung quanh
u hạt trong loét dạ dày biểu hiện các đặc điểm mơ học điển hình của viêm dạ
dày nhiễm H. pylori, và liệu pháp diệt trừ H. pylori có thể dẫn đến việc loét dạ
dày. Mặc dù một số tác giả đã báo cáo sự hiện diện của H. pylori trong 92% và
89% trường hợp loét dạ dày, tương ứng tỷ lệ loét dạ dày lần lượt chỉ ra là 0,27%
và 0,08%. Trong trường hợp loét dạ dày bị nhiễm H. pylori, u hạt thường tồn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN




16
tại trong 3 tháng 17 ngày sau khi điều trị tiệt trừ H. pylori [31], khiến cho hiệu

quả của nó trong loét dạ dày bị nghi ngờ.

Hình 1.5. Viêm dạ dày hạt
(A) Mẫu sinh thiết cho thấy viêm dạ dày hoạt động mạn tính lan tỏa với các
khối u hạt hợp lưu bao gồm các tế bào khổng lồ đa nhân. (B) Một u hạt được
xác định rõ được ghi nhận ngay bên dưới biểu mô bề mặt. Một số sinh vật
Helicobacter pylori được nhìn thấy (mũi tên) [30].
Về mặt mô học, H. pylori do loét dạ dày biểu hiện các khối u biểu mô không
hoại tử nhỏ với các tế bào khổng lồ Langhans, tương tự như các bệnh liên quan
đến bệnh sarcoidosis hoặc bệnh Crohn. Các u hạt này có xu hướng hình thành
ở các vị trí đặc biệt, chẳng hạn như foveolar isthmi. Maeng và cộng sự báo cáo
rằng phần lớn (66,7%) u hạt đã được tìm thấy ở đó, chúng cũng thường tiếp xúc
với một hố bị hư hỏng (nơi thường thấy H. pylori) và thường đi kèm với thâm
nhiễm bạch cầu trung tính nổi bật, phân biệt chúng với các u hạt được quan sát
thấy trong bệnh Crohn hoặc sarcoidosis. Tuy nhiên, hình thái đặc trưng đã
không được báo cáo nhất quán trong các nghiên cứu tiếp theo [18]. Do đó,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu và Công nghệ thông tin – ĐHTN