Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nghiên cứu tác động của all trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ dày

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

MAI VĂN LINH

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC
ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG
TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ
DẠ DÀY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN – 2019.


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

MAI VĂN LINH

NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA ALL TRANS RETINOIC
ACID LÊN SỰ BIỂU HIỆN CÁC GEN TRONG CON ĐƯỜNG
TÍN HIỆU EGF VÀ JAK/STAT CỦA TẾ BÀO GỐC UNG THƯ
DẠ DÀY

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 84 20 201

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Phú Hùng

THÁI NGUYÊN – 2019.


i
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là
trung thực và chưa được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào. Mọi kết quả
thu được không chỉnh sửa, sao hoặc chép từ các nghiên cứu khác. Mọi trích
dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả

Mai Văn Linh


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu tại Khoa Công
nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, em đã
nhận được sự giúp đỡ, giảng dạy và truyền đạt kiến thức của các thầy cơ trong
khoa, các phịng ban trong nhà trường.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Thầy giáo - TS.
Nguyễn Phú Hùng, Thầy đã định hướng khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình em học tập, tiến hành
nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.
Em xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Công nghệ Sinh học và bộ
phận Đào tạo sau đại học - Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt quá trình em học tập tại
trường.
Đề tài luận văn đã nhận được sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp Bộ, mã số
B2017 - TNA - 48.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và các anh chị
lớp Cao học K11 đã luôn cổ vũ, động viên em hồn thành tốt q trình học
tập và nghiên cứu khoa học.
Thái Nguyên, tháng 10 năm 2019
Tác giả

Mai Văn Linh


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .................................................................. v
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................ vi
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày ................................................... 3
1.1.1. Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư ........................................... 3
1.1.2. Tổng quan về ung thư dạ dày .................................................................. 7
1.2. All-trans retinoic acid (ATRA) ................................................................. 13
1.2.1. Retinoids và all-trans retinoic acid (ATRA) ......................................... 13

1.2.2. Thụ thể của ATRA ................................................................................. 16
1.2.3. Retinoids trong điều trị.......................................................................... 17
1.3. Con đường tín hiệu EGF .......................................................................... 19
1.4. Con đường tín hiệu JAK/STAT ............................................................... 22
1.5. Khái quát về apoptosis ............................................................................. 25
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 26
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 26
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 26
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 27
2.3.1. Phương pháp nuôi cấy tăng sinh tế bào 2D .......................................... 27
2.3.2. Phương pháp ni cấy tế bào 3D và xử lí tế bào với ATRA................. 27
2.3.3. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và tổng hợp cDNA ................... 28


iv
2.3.4. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu
EGF bằng Realtime PCR ................................................................................ 28
2.3.5. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường tín hiệu
JAK/STAT bằng Realtime PCR ..................................................................... 29
2.3.6. Phân tích sự biểu hiện của các gen chủ chốt của con đường apoptosis
bằng Realtime PCR ......................................................................................... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .................... 31
3.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào và nuôi cấy tạo các tumorsphere ....... 31
3.1.1. Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào trong điều kiện 2D .......................... 31
3.1.2. Nuôi cấy tạo các tumorsphere 3D và xử lí tumorsphere với ATRA ..... 31
3.2. Kết quả tách chiết RNA tổng số............................................................... 33
3.3. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu
EGF ................................................................................................................. 34
3.3.1 ATRA ức chế sự biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5 và EGFR
......................................................................................................................... 34

3.3.2. Tác động của ATRA lên sự biểu hiện của các gen CBL, EPS8, BCAR1,
NCK2 và SHC1 ............................................................................................... 38
3.4. Ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện các gen thuộc con đường tín hiệu
JAK/STAT ...................................................................................................... 40
3.4.1. ATRA ức chế biểu hiện của các gen STAT1 và STAT3 ........................ 40
3.4.2. Ảnh hưởng của ATRA đến sự điều hòa biểu hiện của các gen GAB1,
GAB2, SRC và PPP2CA ................................................................................. 41
3.5. Ảnh hưởng ATRA lên sự biểu hiện của các gen củ quá trình apoptosis . 43
3.5.1. ATRA tác động lên sự biểu hiện của các gen ức chế apoptosis ........... 44
3.5.2. ATRA ảnh hưởng đến sự biểu hiện của các gen thúc đẩy apoptosis.. 46
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 48
1. Kết luận ....................................................................................................... 48
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49


v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Từ viết đầy đủ

AML

Acute myeloid leukemia

ATRA

All trans retinoic acid

BMDCs

Bone marrow derived Dendritic cells

CSC

Cancer stem cells

EGF

Epidermal growth factor

EGFR

Epidermal growth factor receptor

ErbB

Erythroblastic Leukemia Viral Oncogene Homolog

GSCs

Gastric stem cells

H. pylori

Helicobacter pylori

JAK

Janus kinases

RA

Retinoic acid

RAR

Retinoic acid receptor

RXR

Retinoid X receptor

STAT

Signal transducer and activator of transcription
(proteins)

TNM

Tumor – Node - Metastasis


vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

Bảng 2.1 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu EGF

29

Mã số cặp mồi của các gen trong con đường tín hiệu
JAK/STAT

29

Bảng 2.2

Bảng 2.3 Mã số cặp mồi của các gen trong con đường apoptosis

30

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

Hình 1.1

Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018

6

Hình 1.2

Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018

6

Hình 1.3

Phân loại ung thư biểu mơ dạ dày theo Lauren

9

Hình 1.4

Cấu tạo một tuyến dạ dày

11

Hình 1.5

Mơ hình nhuộm Lgr5 trong mơ ung thư dạ dày

12

Hình 1.6

Các thế hệ của retinoids

15

Hình 1.7

Sự chuyển hóa của Vitamin A trong cơ thể

15

Hình 1.8

Q trình hoạt động của tín hiệu RA

16

Hình 1.9

Con đường tín hiệu của họ thụ thể EGFR

21

Hình 1.10

Con đường tín hiệu JAK/STAT

23

Hình 1.11

Một con đường JAK/STAT trong ung thư

24

Hình 3.1

Hình ảnh ni cấy tăng sinh tế bào sau 3 ngày ni cấy

31

Hình 3.2

Ni cấy tạo tumorsphere và xử lý với ATRA

32

Hình 3.3

Kết quả xác định hàm lượng RNA tổng số

34

Hình 3.4A

Mức độ biểu hiện các gen GAB2, NUP62, RPS6KA5,
EGFR

35

Hình 3.4B

Mức độ biểu hiện các gen EPS8, BCAR1, CBL, NCK2,
SHC1

38

Hình 3.5A

Mức độ biểu hiện các gen STAT3, STAT1

40

Hình 3.5B

Mức độ biểu hiện các gen GAB1, SRC, GAB2, PPP2CA

42

Hình 3.6A

Mức độ biểu hiện các gen ức chế apoptosis

44

Hình 3.6B

Mức độ biểu hiện các gen thúc đẩy apoptosis

46


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề

Ung thư dạ dày là một trong những dạng ung thư phổ biến nhất. Theo ước
tính của Tổ chức Y tế Thế giới ( trong năm 2018 có
1.033.701 bệnh nhân ung thư dạ dày mới (chiếm 5,7%, trong tổng số các ca
ung thư mới), 782.685 ca tử vong do ung thư dạ dày (chiếm 8,2%, trong tổng
số các ca tử vong do ung thư). Ung thư dạ dày được thống kê là dạng ung thư
phổ biến thứ 5 và là nguyên nhân gây tử vong thứ 3 trong nhóm ung thư. Có
769.728 (74,5%) các ca ung thư dạ dày mới được phát hiện ở các nước châu
Á. Tỉ lệ ung thư dạ dày cao nhất được thống kê là Hàn Quốc, Mông Cổ, Nhật
Bản và Trung Quốc. Việt Nam xếp thứ 10 trong thống kê các nước có tỉ lệ
ung thư dạ dày nhiều nhất thế giới với tỉ lệ 15,9 ca mắc ung thư dạ dày trong
100.000 dân số.
Các tế bào gốc ung thư dạ dày là nguyên nhân gây ra các khối u dạ dày.
Các tế bào gốc ung thư dạ dày, còn được gọi là các “tế bào khởi nguồn” của
ung thư dạ dày, có nguồn gốc chủ yếu từ các tế bào gốc dạ dày hoặc các tế
bào gốc định hướng dạ dày [4], [27]. Các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có
thế có nguồn gốc từ các tế bào sinh dưỡng bị biến đổi [6]. Giống với các tế
bào gốc thông thường, các tế bào gốc ung thư dạ dày cũng có chứa các
marker sinh học đặc trưng như CD44, ALDH,… [4]. Đây là những chỉ thị
phân tử quan trọng để xác định tế bào gốc ung thư dạ dày trong nghiên cứu và
điều trị.
All trans retinoic acid (ATRA) là một chất chuyển hóa từ vitamin A, thuộc
nhóm retinoid, có tác dụng điều hồ sự tăng trưởng, biệt hóa và quá trình
apoptosis của tế bào. ATRA được biết đến như một chất có khả năng ức chế
tế bào gốc của nhiều dạng ung thư khác nhau [53]. Hiện nay, ATRA đã được
sử dụng trong điều trị bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML), cũng như sử dụng
trong nhiều thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư. Tuy nhiên, ảnh hưởng


2

của ATRA lên tế bào gốc ung thư ở cấp độ phân tử vẫn chưa được hiểu rõ. Vì
vậy, chúng tụi ó tin hnh nghiờn cu ti: ăNghiờn cu tác động của all
trans retinoic acid lên sự biểu hiện các gen trong con đường tín hiệu EGF và
JAK/STAT của t bo gc ung th d dyă.
2. Mc tiờu nghiờn cứu
Đánh giá tác động của ATRA lên sự phiên mã của các gen chính trong
con đường tín hiệu phân tử EGF và JAK/STAT của tế bào gốc ung thư dạ
dày, cũng như ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các gen apoptosis.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Ni cấy tế bào trong điều kiện 3D để hình thành nên các
tumorsphere từ các tế bào gốc ung thư dạ dày.
Nội dung 2: Phân tích tác động của ATRA lên sự hình thành và tăng
trưởng của các tumorsphere.
Nội dung 3: Phân tích sự biểu hiện của các gen trong con đường tín
hiệu EGF bằng phương pháp Realtime PCR đối với các tế bào được xử lý
hoặc không xử lý với ATRA.
Nội dung 4: Phân tích ảnh hưởng của ATRA lên sự biểu hiện của các
gen của con đường tín hiệu JAK/STAT bằng phương pháp Realtime PCR.
Nội dung 5: Phân tích sự tác động của ATRA lên sự biểu hiện các gen
apoptosis bằng phương pháp Realtime PCR.


3
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ung thư và ung thư dạ dày
1.1.1. Khái quát về ung thư và tế bào gốc ung thư
1.1.1.1. Lịch sử, khái niệm, phân loại ung thư
Ung thư được miêu tả sớm nhất vào khoảng năm 1.600 TCN (thời Ai
Cập cổ đại) trong các Edwin Smith Papy (một loại giấy cói ghi chép về văn
bản y tế lâu đời nhất). Trong các Edwin Smith Papy có chứa mơ tả về ung thư

vú cũng như thủ thuật để loại bỏ các khối u vú. Hippocrates (khoảng năm 460
TCN- khoảng năm 370 TCN) đã mô tả một số loại ung thư, gọi chúng bằng
thuật ngữ karkinos (carcinos) - tiếng Hy Lạp có nghĩa là ¨cua¨ hoặc ¨tôm
càng¨, dựa trên đặc điểm quan sát được của khối u rắn. Celsus (khoảng năm
25 TCN - 50 SCN) ó dch karkinos thnh ăcanceră - ung th [1].
Hin nay, khái niệm ung thư (cancer) được sử dụng để chỉ một nhóm
bệnh liên quan đến sự phát triển bất thường của tế bào với khả năng xâm lấn
hoặc lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể [34].
Các dấu hiệu của ung thư bao gồm: duy trì các tín hiệu tăng sinh, tránh
khỏi sự ức chế sinh trưởng, chống lại quá trình chết của tế bào, nhân lên số
lượng lớn tế bào, tăng cường hình thành mạch máu, xâm lấn và di căn, tái lập
trình trao đổi chất và tránh sự phá hủy của hệ miễn dịch. Những thay đổi từ tế
bào bình thường thành tế bào khối u chủ yếu do sự mất ổn định bộ gen, sự
biểu hiện bất thường về chức năng của các gen ức chế khối u và gen gây ung
thư [34].
Ung thư có thể xuất hiện ở tất cả các bộ phận khác nhau trong cơ thể.
Ung thư được đặt tên theo cơ quan mà chúng bắt đầu và loại tế bào được tạo
ra ngay cả khi chúng lây lan (di căn) sang các bộ phận khác của cơ thể. Hiện
nay đã thống kê được hơn 100 loại ung thư ảnh hưởng đến con người [34].
Ngoài ra ung thư được phân loại theo loại mô, bao gồm:


4
 Carcinomas: (ung thư biểu mô) là loại ung thư bắt nguồn từ da hoặc các
mơ lót hay phủ các cơ quan bên trong.
 Sarcomas: (ung thư mô liên kết) là loại ung thư bắt nguồn từ xương,
sụn, mỡ, cơ, mạch máu hay các mô liên kết khác.
 Lymphomas và leukemias: hai loại ung thư này phát sinh từ các tế bào
tạo máu và có xu hướng phát triển trong các hạch bạch huyết và máu.
 Germ-cell tumor: là loại ung thư bắt nguồn từ các tế bào đa năng,

thường gặp nhất là seminoma (ung thư tinh hoàn) và dysgerminoma (ung
thư buồng trứng).
 Blastoma: là loại ung thư có nguồn gốc từ các tế bào "tiền thân"
(precursor) chưa trưởng thành hoặc phôi. Dạng ung thư này thường gặp ở
trẻ nhỏ.
Carcinomas (ung thư biểu mô) là loại ung thư thường gặp nhất. Ung thư
phổi, ung thư vú, ung thư đại tràng, ung thư tuyến tiền liệt và ung thư dạ dày
là các bệnh ung thư có số lượng bệnh nhân mắc phải và tử vong nhiều nhất
trong nhóm ung thư (WHO, 2018). Carcinomas và arcomas đa phần sẽ tạo
thành các khối tế bào bất thường gọi là khối u (neoplasia), trong khi
leukemias và lymphomas thường không tạo thành các khối u rắn.
1.1.1.2. Tế bào gốc ung thư
Tế bào gốc (Stem cells) là đơn vị phát triển chức năng tái tạo các mơ và
cơ quan, đóng vai trị trong cân bằng nội môi và sửa chữa sau khi bị tổn
thương. Các tế bào gốc nằm ở những vị trí đặc biệt bảo vệ chúng khỏi sự hoạt
động quá mức [80]. Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng các khối u chứa
các tế bào ung thư không đồng nhất về kiểu hình và chức năng [27]. Các khối
u có thể bắt nguồn từ một quần thể nhỏ tế bào gốc ung thư (Cancer stem cell)
có khả năng duy trì sự phát triển lâu dài của khối u, cũng như khả năng tái
phát, kháng apoptosis, di căn, hóa trị và xạ trị [34].


5
Tế bào gốc ung thư có các đặc điểm tương tự như các tế bào gốc thông
thường bao gồm khả năng tự làm mới không giới hạn, tăng sinh và biệt hóa
thành nhiều dịng. Tế bào gốc ung thư chỉ chiếm một phần nhỏ, tồn tại ở một
vùng trong khối u (CSCs occupy) và thường không hoạt động trong một thời
gian dài. Các tế bào gốc ung thư có khả năng kháng lại các phương pháp điều
trị ung thư thông thường như hóa trị và xạ trị vì chúng có khả năng kích hoạt
các con đường liên quan đến sự phát triển, chống độc tế bào và tăng khả năng

sửa chữa DNA. Hơn nữa, hóa trị và xạ trị cịn có thể làm biến đổi các tế bào
trong khối u, biến các tế bào không phải là tế bào gốc ung thư thành các tế
bào gần giống như tế bào gốc ung thư. Các tế bào này có thể vẫn cịn tồn tại
sau khi điều trị hóa trị và xạ trị, chúng có thể là nguyên nhân tái phát khối u
[11].
Sự tồn tại của tế bào gốc ung thư lần đầu tiên được Bonnet và Dick [10]
chứng minh có ở bệnh Lơ-xê-mi cấp dòng tủy (AML) bằng cách sử dụng
marker bề mặt tế bào CD34+/CD38-. Trong những năm gần đây, các nghiên
cứu đã cho thấy sự có mặt của tế bào gốc ung thư trong nhiều khối u rắn,
trong đó có ung thư não, ung thư vú, ung thư đầu và cổ, ung thư thận, ung thư
ruột kết, ung thư tuyến tụy, ung thư gan, khối u ác tính, ung thư phổi [11].
Những nghiên cứu in vivo gần đây đã chứng minh các khối u có nguồn gốc từ
tế bào gốc ung thư. Hiện nay, các nghiên cứu đang hướng tới việc xác định
các tế bào gốc ung thư bằng các marker sinh học, thơng qua đó sử dụng các
biện pháp điều trị nhắm đích tế bào gốc ung thư [34].
1.1.1.3. Nguyên nhân gây ung thư và tình hình ung thư hiện nay
Phần lớn các bệnh ung thư, khoảng 90% - 95% các trường hợp là do đột
biến gen từ ảnh hưởng của các yếu tố môi trường sống và lối sống, khoảng
5% - 10% còn lại là do yếu tố di truyền. Các yếu tố môi trường phổ biến gây
tử vong do ung thư được thống kê bao gồm: thuốc lá (25%-30%), chế độ ăn


6
uống (30%-35%), nhiễm trùng (15%- 20%), phóng xạ (10%), stress, ít hoạt
động và ô nhiễm [34].
Theo ước tính của WHO trong năm 2018, có 18.078.957 trường hợp mắc
ung thư, trong đó có 7 loại ung thư phổ biến nhất (chiếm 54%), bao gồm: ung
thư phổi, ung thư vú, ung thư đại trực tràng, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư
dạ dày, ung thư gan và ung thư thực quản (Hình 1.1).

Hình 1.1. Ước tính số ca mắc mới ung thư năm 2018 (Nguồn WHO)

Hình 1.2. Ước tính số lượng tử vong do ung thư năm 2018 (Nguồn WHO)


7
Ở các nước châu Á, trong năm 2018, ước tính có 8.750.932 trường hợp
mắc mới ung thư và 5.477.064 ca tử vong do ung thư. Hơn 70% số lượng các
các ca tử vong do ung thư tập trung ở các nước đang phát triển (Hình 1.2).
1.1.2. Tổng quan về ung thư dạ dày
1.1.2.1. Dịch tễ học của ung thư dạ dày
Ung thư dạ dày (gastric cancer hay stomach cancer) là loại ung thư phát
triển đầu tiên ở mô dạ dày và di căn sang các bộ phận khác của cơ thể. Tỉ lệ
mắc ung thư dạ dày đang có xu hướng giảm ở cả hai giới trên phạm vi toàn
cầu. Tuy nhiên, do sự già hóa dân số và sự gia tăng dăn số ở các nước đang
phát triển nên số lượng ung thư dạ dày trên thế giới vẫn tiếp tục tăng [3].
Việt Nam có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày (tính trên 100.000 dân số) là 15,9
(đứng thứ 10 trên thế giới) với tỉ lệ mắc theo độ tuổi ở nam là 23,3 (đứng thứ
11 trên thế giới), ở nữ là 10,2 (đứng thứ 14 trên thế giới).
Ung thư dạ dày là kết quả của các tác động phức tạp giữa vật chủ và các
yếu tố môi trường, trong đó đáng chú ý nhất là nhiễm Helicobacter pylori (H.
pylori). WHO xếp H. pylori vào tác nhân gây ung thư nhóm I. Ước tính H.
pylori là ngun nhân của khoảng 63% các trường hợp ung thư dạ dày khơng
thuộc tâm vị trên tồn thế giới. Một số yếu tố đáng chú ý khác như chế độ ăn
uống và hút thuốc lá cũng ảnh hưởng tới nguy cơ mắc ung thư dạ dày.
Hoocmon nội tiết tố nữ (estrogen) là một yếu tố làm giảm nguy cơ mắc ung
thư dạ dày ở nữ giới, tỉ lệ mắc mới ung thư dạ dày ở phụ nữ thấp hơn nhiều so
với ở nam giới [3].
1.1.2.2. Phân loại ung thư dạ dày và điều trị
Tùy thuộc vào chỉ tiêu phân loại mà ung thư dạ dày có thể được chia

thành nhiều loại khác nhau. Một số hệ thống phân loại đáng chú ý như hệ
thống phân loại theo vị trí (ung thư tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị),
phân loại 4 type của Borrmann [81] và Hiệp hội Ung thư Dạ dày Nhật Bản


8
[47], phân loại vi thể [56], phân loại theo mô bệnh học của Lauren [56] hay
hệ thông phân loại mô bệnh học ung thư dạ dày của Tổ chức Y tế Thế giới
[31].
Hiện nay, ung thư dạ dày có xu hướng được chia làm 2 loại là ung thư
tâm vị và ung thư không thuộc tâm vị. Ung thư tâm vị là ung thư trong
khoảng 1cm trên đến 2 cm dưới đường nối thực quản dạ dày. Ung thư dạ dày
khơng thuộc tâm vị gồm ung thư ở phình vị, thân vị, bờ cong lớn, bờ cong
nhỏ, hang vị và mơn vị. Có sự khác nhau rất rõ trong dịch tễ, nguyên nhân
gây bệnh, mô bệnh học, điều trị và tiên lượng giữa ung thư dạ dày tâm vị và
ung thư dạ dày không thuộc tâm vị [61]. Ung thư dạ dày không thuộc tâm vị
thường gặp hơn ở những khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày cao, ung thư
tâm vị thường gặp ở khu vực có tỉ lệ mắc ung thư dạ dày thấp. Ung thư tâm vị
đã tăng đáng kể trong vòng 50 năm qua ở các nước phát triển và cả một số
nước điều kiện kinh tế phát triển. Ung thư tâm vị thường là hậu quả của trào
ngược dạ dày thực quản mạn tính, trong khi đó ung thư dạ dày khơng thuộc
tâm vị có liên quan chặt chẽ tới tình trạng nhiễm H. pylori mãn tính. Tiên
lượng ung thư tâm vị thường xấu hơn ung thư dạ dày không thuộc tâm vị
[61].
Lauren phân loại ung thư dạ dày thành 2 thể mô bệnh học riêng biệt là
thể ruột (intestinal type) và thể lan tỏa (diffuse type) (Hình 1.3) [56]. Thể ruột
gồm những tế bào u kết dính tạo ra cấu trúc ống tuyến tương tự như tuyến
ruột, đi kèm với thâm nhập tế bào viêm lan tỏa. U này thường xuất phát từ
phần xa dạ dày cùng với nhiễm H. pylori, có đặc điểm teo niêm mạc dạ dày
diện rộng, dị sản ruột và thường được đi trước bằng một giai đoạn tiền ung

thư. Thể lan tỏa gồm những mảng tế bào rải rác trong mơ đệm, khơng tạo
tuyến, khơng có tính kết dính. Ung thư thể lan tỏa có thể gồm các tế bào hình
nhẫn, lan rộng theo lớp dưới niêm mạc, ít thâm nhập tế bào viêm, thường có
mức độ biệt hóa kém. Có xấp xỉ 5-10% các khối u vẫn không thể phân loại


9
được xếp vào thể “khơng xác định” hoặc có đặc điểm của cả hai thể ruột và
lan tỏa được xếp vào thể “hỗn hợp” (mixed type). Trong đánh giá bệnh học
lâm sàng, các khối u thể này thường được xem như là thể lan tỏa [56]. Phân
loại mô bệnh học của Lauren khá đơn giản và được sử dụng rộng rãi trên tồn
thế giới. Hai thể mơ học này có sự khác nhau rõ rệt về dịch tễ, nguyên nhân
gây bệnh và đặc biệt là tiên lượng. Sự khác nhau về hình thái được cho là do
vai trị của các phân tử kết dính liên bào, các phân tử này được bảo toàn ở thể
ruột và khiếm khuyết ở thể lan tỏa [56].

A. Intestinal type

B. Diffuse type

C. Mixed type

Hình 1.3. Phân loại ung thư biểu mô dạ dày theo Lauren [56]
Để đánh giá giai đoạn của ung thư dạ dày, có hai hệ thống đánh giá được
sử dụng rộng rãi là hệ thống đánh giá của AJCC/UICC [87] và hệ thống đánh
giá của Nhật Bản [47]. Cả hai hệ thống này đều đánh giá giai đoạn của ung
thư dạ dày dựa trên đánh giá mức độ xâm lấn của khối u (Tumor), tình trạng
di căn vùng hạch (Node) và di căn xa (Metastasis) nên còn được gọi là cách
đánh giá giai đoạn TNM (Khối u - Hạch - Di căn). Khối u (Tumor) được đánh
giá dựa vào độ xâm nhập sâu của khối u, giai đoạn hạch bạch huyết (Node)

được đánh giá dựa trên số lượng bạch huyết vùng bị di căn.
Phẫu thuật cắt bỏ là phương pháp điều trị chính và có thể chữa khỏi cho
bệnh nhân bị ung thư dạ dày ở giai đoạn đầu. Tuy nhiên, tỉ lệ sống sót của
bệnh nhân vẫn cịn thấp. Phương pháp xạ trị sử dụng trong điều trị ung thư dạ
dày đem lại hiệu quả thấp [56] do tính kháng xạ trị của các tế bào ung thư dạ


10
dày. Hóa trị liệu là phương pháp điều trị quan trọng nhằm giảm tỉ lệ tái phát
sau phẫu thuật và kéo dài thời gian sống thêm của bệnh nhân. Thời gian sống
thêm của bệnh nhân sử dụng hóa trị có thể kéo dài thêm 9-36 tháng. Độc tính
cao, thời gian đáp ứng ngắn, tỷ lệ đáp ứng thấp là những hạn chế của hóa trị
liệu [70]. Điều trị nhắm đích là phương pháp mới, sử dụng các loại thuốc điều
trị có tác dụng chọn lọc lên tế bào gốc ung thư ở mức độ phân tử mà khơng
hoặc ít làm ảnh hưởng đến các tế bào bình thường, đang được nghiên cứu và
thử nghiệm trong điều trị ung thư dạ dày [70].
1.1.2.3. Tế bào gốc ung thư dạ dày
Tế bào gốc dạ dày (Gastric stem cells) là các tế bào gốc ở dạ dày, được
tìm thấy ở vùng eo của tuyến dạ dày, gồm nhiều loại tế bào gốc khác nhau
(Hình 1.4). Tế bào gốc dạ dày được bao quanh bởi một lớp myofibroblasts
(SMFs) hoạt động như một hốc chứa và tiết ra các yếu tố tăng trưởng và biệt
hóa khác nhau. Tế bào gốc dạ dày giữ vai trò thiết yếu trong việc tự làm mới
và căn bằng nội mơi của tuyến dạ dày; chúng giữ vai trị đặc biệt quan trọng
trong việc sửa chữa biểu mô dạ dày sau chấn thương. Các tế bào gốc tủy
xương (BMDCs) có vai trò quan trọng trong sự tái tạo, phục hồi lại các phần
niêm mạc bị tổn thương do H. pylori. Q trình tự tái tạo và biệt hóa ở niêm
mạc dạ dày được điều chỉnh bởi một số con đường tín hiệu như Wnt, Notch,
Hedgekey và yếu tố phiên mã liên quan đến Runt 3 (Runx3) [40].
Tế bào gốc ung thư dạ dày được Yang và cộng sự mô tả lần đầu tiền vào
năm 2007 [92]. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra ung thư dạ dày có thể bắt nguồn

từ tế bào gốc dạ dày bình thường hoặc các tế bào có nguồn gốc từ tủy xương
[6], [40]. McDonand và cộng sự đã đưa ra bằng chứng về quá trình loạn sản ở
các đơn vị dạ dày do sự biến chất đường ruột và nhận thấy rằng chứng loạn
sản đường ruột là vơ tính, chứa nhiều tế bào gốc và lây lan qua sự phân hạch
[62]. Tuy nhiên, Barker và cộng sự là những người đầu tiên nghiên cứu truy
tìm nguồn gốc của tế bào gốc gây ra ung thư dạ dày [6]. Trong thí nghiệm,


11
Barker đã nhận thấy các tế bào gốc môn vị Lgr5+ có khả năng gây khối u khi
bị tác động [6]. Simon và cộng sự tiếp tục kiểm tra mức độ phổ biến, phân bố
và ý nghĩa sinh học khối u của các tế bào Lgr5 trong dạ dày bằng cách nghiên
cứu biểu hiện khác biệt của Lgr5 ở mức độ phiên mã và dịch mã [79]. Nghiên
cứu đã chỉ ra các mơ ác tính có sự biểu hiện Lgr5+ cao hơn các mơ khơng ác
tính và có sự di chuyển của các tế bào Lgr5+ ở các giai đoạn khác nhau của
ung thư dạ dày. Nghiên cứu cũng chỉ ra ở trong niêm mạc dạ dày bình thường
các tế bào Lgr5+ nằm chủ yếu ở vùng cổ niêm mạc, trong khi ở ung thư dạ
dày các tế bào Lgr5+ xuất hiện ở vùng eo, trung tâm khối u và mặt trước xâm
lấn (Hình 1.5). Các bệnh nhân dương tính với Lgr5+ cũng có tỉ lệ sống trung
bình ngắn hơn các bệnh nhân âm tính với Lgr5+ [79]. Các tế bào gốc ung thư
dạ dày ngoài nguồn gốc từ tế bào gốc dạ dày [6] cịn có thể có nguồn gốc từ
các tế bào gốc tủy xương [85]. Sự viêm nhiễm, tổn thương mãn tính biểu mơ
dạ dày do H. pylori dẫn đến mất tế bào gốc dạ dày thường trú và gây ra sự tái
lập tế bào gốc tủy xương trong dạ dày, sau đó là tăng sản, biến chất, loạn sản
và cuối cùng là tăng sản ung thư dạ dày [85].

Hình 1.4. Cấu tạo tuyến dạ dày (Nguồn: Giải phẫu học - Nguyễn Quang Quyền)


12

Hình 1.5. Mơ hình nhuộm Lgr5 trong mơ ung thư dạ dày [79]
(A, E) Niêm mạc dạ dày bình thường
(B, F) Mô dạ dày dị sản ruột
(C, G) Ung thư dạ dày trước xâm lấn
Tế bào gốc ung thư dạ dày được xác định chủ yếu nhờ các marker bề mặt
tế bào. Việc sử dụng các marker bề mặt thuận lợi hơn so với sử dụng các yếu
tố nội sinh trong việc xác định tế bào cũng như nhắm đích trong nghiên cứu
điều trị ung thư dạ dày. Hiện nay, các nghiên cứu sử dụng liệu pháp điều trị
nhắm đích tế bào gốc ung thư dạ dày đang được nghiên cứu và phát triển.
Trong nhiều năm qua, các liệu pháp thơng thường như hóa trị, xạ trị và miễn
dịch đã được sử dụng trong điều trị ung thư dạ dày. Tuy nhiên, các phương
pháp này chỉ tiêu diệt được các tế bào khối u đã biệt hóa, do đó, sau một thời
gian các khối u lại tái phát do hoạt động của các tế bào gốc ung thư dạ dày. Ở


13
ung thư dạ dày có các tế bào gốc ung thư dạ dày hoạt động và khơng hoạt
động, do đó cần có loại thuốc đặc biệt được thiết kế để nhắm đích tế bào gốc
ung thư dạ dày, ức chế sự phân chia của tế bào gốc ung thư dạ dày, thúc đẩy
biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày và điều hịa mơi trường vi mơ trong khối u
[34], [91]. Để nhắm mục tiêu các tế bào gốc ung thư dạ dày, một số chiến
lược đã được đề xuất, bao gồm sự kết hợp apoptosis liên quan đến hóa trị liệu,
nhắm đích phân tử và cảm ứng biệt hóa tế bào gốc ung thư dạ dày; gây ra
apoptosis trong khối u; liệu pháp nhắm đích marker bề mặt tế bào gốc ung thư
dạ dày; phát triển kháng thể đơn dịng; nhắm mục tiêu vào mơi trường vi mơi
tế bào gốc ung thư dạ dày; ức chế các con đường tín hiệu tế bào gốc ung thư
dạ dày [34].
1.2. All-trans retinoic acid (ATRA)
1.2.1. Retinoids và all-trans retinoic acid (ATRA)

Retinoids là những chất có cấu tạo hoặc chức năng tương tự retinol
(Vitamin A). Hiện nay đã có khoảng hơn 4.000 phân tử retinoids tự nhiên và
tổng hợp được công bố. Retinoids là phân tử sinh học thiết yếu cho sự phát
triển của phôi thai và cân bằng nội môi của cơ thể trưởng thành. Động vật hấp
thu retinoids dưới dạng vitamin A, thu được từ 2 nguồn là: vitamin A được
tạo thành từ trước (retinol và retinal ở dạng retinyl ester) và provitamin A
carotenoids (β-carotene, α-carotene, β-cryptoxanthin). Các chất trung gian có
hoạt tính sinh học của vitamin A được xác định là ATRA và 11 – cis retinol.
ATRA là một chất có liên quan đến việc điều chỉnh sự phiên mã của gen,
trong khi đó 11 – cis RA liên quan đến sự cảm nhận màu của thị giác [22].
Retinoids được phân chia thành 3 thế hệ:
 Thế hệ thứ nhất: bao gồm retinol (Vitamin A), tretinoin/retinoic
acid/retin-A (ATRA), isotretinoin (13- cis RA) và alitretinoin (9- cis
RA) (Hình 1.6.A).
 Thế hệ thứ 2: có etretinate, acitretin. (Hình 1.6.B).
 Thế hệ thứ 3: gồm tazarotene, bexarotene, adapalene (Hình 1.6.C).


14
All-trans retinoic acid (ATRA) hay còn được gọi là Tretinoin, là một một
chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học chính của retinoids. Trong q trình
phát triển phơi thai sớm, ATRA điều chỉnh sự hình thành lớp mầm, hình
thành trục cơ thể, phát sinh thần kinh, phát sinh tim mạch, cũng như sự phát
triển của tuyến tụy, phổi và mắt. Nó cũng là một yếu tố quan trọng cho chức
năng thị giác [22]. Ở cơ thể trưởng thành, ATRA có liên quan đến sự phát
triển của tế bào, quá trình apoptosis, đáp ứng miễn dịch và sự tăng trưởng
biểu mô [30].

A. Thế hệ thứ nhất của retinoids

B. Thế hệ thứ 2 của retinoids


15

C. Thế hệ thứ 3 của retinoids
Hình 1.6. Các thế hệ của retinoids [22]

Hình 1.7. Sự chuyển hóa của Vitamin A trong cơ thể [30]


16
Trong cơ thể, ATRA được tạo thành từ vitamin A. Q trình biến đổi tạo
thành ATRA từ vitamin A có thể bị đảo ngược bởi một số yếu tố. Enzyme
CYP26 thuộc họ cytochrom P450 hydroxylase là enzyme phân hủy ATRA
(Hình 1.7). Một số enzyme thuộc CYP26 gồm CYP26A1, B1, C1 và D1 đều
có khả năng phân giải ATRA thành retinoids ít hoạt tính sinh học hơn [30].
1.2.2. Thụ thể của ATRA
ATRA được đưa vào nhân bằng CRABP-II và tương tác với các RAR,
bản thân ATRA là một yếu tố phiên mã. RAR và RXR (thụ thể X retinoid)
thuộc họ thụ thể retinoid. RAR có khả năng nhận biết cả ATRA và 9-cis
retinoic acid, trong khi RXR chỉ nhận biết được 9-cis retinoic acid. Thụ thể
RAR gồm 3 thành viên là RARα / β / bind [68]. Khi liên kết với các phối tử,
RAR nhị trùng hợp với RXR tạo thành một heterodimer, sau đó khởi động
q trình phiên mã bằng cách gắn vào yếu tố phản ứng acid retinoic (RARE)
ở promotor của các gen mục tiêu (Hình 1.8). Sự biểu hiện của các RAR cũng
nằm dưới sự kiểm soát của ATRA. Trong promotor của RARα và β cũng tìm
thấy sự có mặt của RARE [68].

Hình 1.8. Q trình hoạt động của tín hiệu RA [68]

17
1.2.3. Retinoids trong điều trị
Retinoids (vitamin A cùng các chất tự nhiên và tổng hợp của vitamin A)
được sử dụng rộng rãi để điều trị các bệnh về thị giác và da liễu [22].
Retinoids đã được chứng minh là có thể ức chế sự phát triển của một số dòng
tế bào ung thư [30]. Retinoids có tác dụng ức chế quá trình gây ung thư vì
chúng ức chế sự tăng trưởng, gây ra sự biệt hóa và gây chết tế bào ở nhiều
loại tế bào ung thư khác nhau [30], [69]. Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy
rằng, lượng vitamin A thấp hơn dẫn đến nguy cơ phát triển ung thư cao hơn,
phù hợp với các quan sát về động vật thiếu vitamin A. Thay đổi biểu hiện của
thụ thể RAR cũng liên quan đến sự biến đổi ác tính của các mơ động vật hoặc
tế bào ni cấy. Hơn nữa, retinoids ức chế quá trình gây ung thư trong các mơ
hình động vật ở da, miệng, phổi, vú, bàng quang, buồng trứng và tuyến tiền
liệt [30]. Ở người, retinoids đảo ngược các tổn thương biểu mô ở giai đoạn
tiền ung thư, gây ra sự biệt hóa của các tế bào tủy và ngăn ngừa ung thư phổi,
gan và ung thư vú [30].
ATRA là retinoid tự nhiên đã được nghiên cứu rộng rãi trong nhiều
năm. ATRA hiện đang được thử nghiệm lâm sàng để điều trị ung thư hạch,
ung thư bạch cầu, ung thư da, ung thư phổi, ung thư cổ tử cung, ung thư thận,
u nguyên bào thần kinh và u nguyên bào thần kinh đệm [68]. Tuy nhiên, ở
mức độ phân tử, tác động của ATRA lên các tế bào ung thư chưa được hiểu
rõ. Ở một hướng nghiên cứu khác, tác động của ATRA lên sự biểu hiện của
các gen thông qua điều chỉnh các miRNA cũng được chỉ ra [53].
Tác động của ATRA lên ung thư được nghiên cứu trước tiên ở ung thư
bạch cầu (Acute promyelocytic leukemia- APL). Breitman và cộng sự đã
nhận thấy sự biệt hóa của dịng tế bào APL HL-60 khi sử dụng butyrate,
dimethyl sulfoxide và ATRA [12]. Hiện nay, ATRA được sử dụng trong điều
trị APL.

Việc điều trị kết hợp ATRA với các chất ức chế HDAC SL142 hoặc
SL325 có khả năng chống khối u đáng kể và là một phương pháp trị liệu đầy