Luận văn Thạc sĩ Sinh học ứng dụng: Nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin từ một số chủng Pseudomonas aeruginosa

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LA THỊ SINH

NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
MÃ HĨA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG
PSEUDOMONAS AERUGINOSA

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Thái Nguyên, 2020


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LA THỊ SINH

NHÂN DỊNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN
MÃ HĨA PROTEIN AZURIN TỪ MỘT SỐ CHỦNG
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số: 8 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Khá

Thái Nguyên, 2020

i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn này, tơi đã
nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các Thầy Cô, bạn bè và người thân. Tơi xin
được bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới:
Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo – QLKH&HTQT, Khoa Công nghệ Sinh học
– Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tơi
trong qua trình học tập.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Đình Khá, người Thầy đã
tận tình chỉ bảo và cung cấp cho tôi những kiến thức quý báu về phương pháp
nghiên cứu cũng như kiến thức chuyên ngành.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội đồng chấm luận văn đã
đóng góp cho tơi nhiều ý kiến q báu, đã đánh giá và ghi nhận sự nỗ lực của tôi
trong học tập.
Tơi xin cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài cấp bộ Giáo dục và Đào tạo
“Nghiên cứu tạo chủng Escherichia coli sản xuất protein Azurin có hoạt tính ức
chế tế bào ung thư vú”, mã số B2019-TNA-16.
Thái nguyên, tháng 10 năm 2020
Học viên

La Thị Sinh


ii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................ i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT............................................................................ iv

DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................................... v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin ................................. 3

1.2.

Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam..................................... 6

1.3.

Khái quát về trực khuẩn mủ xanh (P. aeruginosa) .................................... 7

1.3.1. Các tính chất sinh học chính ....................................................................... 7
1.3.2. Các yếu tố độc lực .................................................................................... 10
1.3.3. Sức đề kháng............................................................................................. 12
1.3.4. Dịch tễ học ................................................................................................ 12
1.4.

Tổng quan về protein azurin ..................................................................... 13

1.4.1. Sơ lược về protein azurin .......................................................................... 13
1.4.2. Cấu trúc của gen azurin ............................................................................ 14
1.4.3. Khả năng chống ung thư ........................................................................... 16
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 21
2.1.

Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ nghiên cứu ............................................. 21

2.1.1. Chủng vi sinh vật và plasmid ................................................................... 21
2.1.2. Thiết bị dụng cụ và hóa chất ..................................................................... 21
2.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu............................................................. 23

2.3.

Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 23

2.3.1. Nuôi cấy vi sinh vật .................................................................................. 23
2.3.2. Tách chiết ADN tổng số của vi khuẩn...................................................... 23
2.3.3. Điện di trên gel argarose ........................................................................... 24


iii
2.3.4. PCR phân lập gen azurin .......................................................................... 24
2.3.5. Phương pháp tạo dịng gen ....................................................................... 25
2.3.6. Phương pháp giải trình tự gen .................................................................. 26
2.3.7. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................ 28
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 29
3.1. Tách chiết DNA tổng số của chủng Pseudomonas ...................................... 29
3.2. Phân lập gen azurin ...................................................................................... 30
3.3. Gắn gen vào vector nhân dịng và chọn dịng .............................................. 30
3.4. Phân tích trình tự gen azurin ........................................................................ 32
3.4.1. Phân tích trình tự gen azurin của chủng VTCC-B-657 ............................ 32
3.4.2. Phân tích trình tự gen azurin của chủng QN1 ........................................... 34
3.4.3. So sánh trình tự amino acid suy diễn ........................................................ 36

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 38
1. Kết luận ........................................................................................................... 38
2. Đề nghị ............................................................................................................ 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 39


iv

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

STT

Chữ viết tắt

Chữ viết đầy đủ

1

DNA

Deoxyribonucleic Acid

2

dNTP

Deoxyribonucleic triphosphate

3

EDTA

Ethylen Diamin Tetraacetic Acid

4

ETA

Exotoxin A

5

HIV

Human Immunodeficiency Virus

6

kDa

Kilo Dalton

7

LB

Luria and Bertani

8

PCR

Polymerase Chain Reaction

9

PTD

Miền tải nạp protein

10

TAE

Tris – Acetic acid - EDTA

11

P. aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa

12

NXB

Nhà xuất bản


v

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ....................................... 21
Bảng 2.2. Các dung dịch và đệm sử dụng ........................................................... 22
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR ................................................................. 24
Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ........................................................ 25


vi

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. 1 Cấu trúc của protein azurin ........................................................ 15
Hình 1.2 Cơ chế azurin gây ra quá trình apoptosis và ức chế sự phát triển của
các tế bào ung thư ở người. ..................................................................... 17
Hình 2.1. Cấu trúc vector tách dịng pTZ57R/T ......................................... 26
Hình 2.2. Hình ảnh mơ tả quá trình giải trình tự thế hệ mới theo nguyên lý
Sanger sử dụng các ddNTP có đánh dấu huỳnh quang........................... 28
Hình 3.1. Hình ảnh điện di DNA tổng số của các chủng nghiên cứu ......... 29
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen azurin ...................... 30
Hình 3.3. Hình ảnh điện di plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc sau biến
nạp ........................................................................................................... 31
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt .................................................... 32
Hình 3.5. Trình tự gen azurin của chủng P. aeruginosa VTCC-B-657...... 33
Hình 3.6. Hình ảnh kết quả so sánh trình tự gen azurin của chủng

P.

aeruginosa VTCC-B-657 trên phần mềm Blast ..................................... 33

Hình 3.7. Trình tự gen azurin của chủng QN1. .......................................... 34
Hình 3.8. Hình ảnh kết quả so sánh trình tự gen azurin của chủng

P.

aeruginosa QN1 trên phần mềm Blast.................................................... 35
Hình 3.9. So sánh trình tự nucleotide của gen azurin chủng VTCC-B-657,
chủng QN1 với trình tự gen azurin của P. aeruginosa mã số M30389 trên
GenBank.................................................................................................. 35
Hình 3.10. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein azurin chủng
VTCC-B-657, chủng QN1 với trình tự amino acid của P. aeruginosa mã
số M30389 trên GenBank ....................................................................... 37


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hiện nay, bệnh ung thư và sức khoẻ cộng đồng là những vấn đề ngày càng
được quan tâm ở hầu hết các quốc gia trên thế giới. Bởi lẽ, ung thư là nguyên nhân
gây tử vong hàng đầu ở các nước kinh tế phát triển và là nguyên nhân gây tử vong
đứng hàng thứ hai ở các nước đang phát triển [27].
Theo WHO, năm 2008 thế giới có 12,6 triệu người mắc ung thư, trong đó có
7,5 triệu người tử vong. Năm 2015, có khoảng 90,5 triệu người bị ung thư. Mỗi
năm có 14,1 triệu ca mắc mới, trong đó tử vong 8,8 triệu ca (15,7%). Ở Mỹ và các
nước phát triển tử vong do ung thư chiếm khoảng 25% và hàng năm có khoảng
0,5% dân số được chẩn đốn ung thư [6], [20]. Tính đến năm 2018, ước tính trên
tồn thế giới có khoảng 18,1 triệu trường hợp ung thư mới (17 triệu không bao
gồm ung thư da khơng phải u ác tính) và 9,6 triệu ca tử vong do ung thư (9,5 triệu
không bao gồm ung thư da không hắc tố) [18].

Việt Nam cũng là một trong số nước có tỉ lệ mắc ung thư cao trên thế giới,
WHO xếp Việt Nam nằm trong 50 nước thuộc top 2 của bản đồ ung thư (50 nước
cao nhất thuộc top 1). Mỗi năm có khoảng 115.000 người chết vì ung thư, tương
ứng 315 người/ngày. Trong đó, ung thư vú với tỷ lệ mắc là 15.000 ca/năm. Tỷ lệ
tử vong 35% và 70% người bệnh đến khám ở giai đoạn muộn [6].
Hiện nay, phương pháp điều trị ung thư chủ yếu sử dụng phương pháp hóa
trị, xạ trị và phẫu thuật. Các liệu pháp điều trị ung thư mới đang được các nhà khoa
học nghiên cứu. Trong đó những hoạt chất sinh học từ thực vật, vi sinh vật đang
được quan tâm nghiên cứu.
Trên thế giới các nghiên cứu được chứng minh hoạt tính chống ung thư giữa
azurin và exotoxin A (ETA) từ Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa),
Pep27anal2 từ Streptococcus pneumoniae, độc tố bạch hầu từ Corynebacterium
diphtheriae, và gần đây đã phát hiện Entap từ Enterococcus sp. [29]. Các chất này
ngăn chặn quá trình tổng hợp protein và gây ra quá trình tự chết ở tế bào ung thư.
Vào năm 2012, các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu đặc tính nhắm mục


2
tiêu khối u của E. coli Nissle 1917 để ức chế khối u ác tính B16 ở chuột và khối u
vú 4T1 thông qua sự biểu hiện của protein azurin. Kết quả của họ đã chứng minh
được rằng sự phát triển khối u ác tính B16 và khối u vú 4T1 trực tiếp được hạn
chế đáng kể và di căn phổi đã được ngăn chặn ở những con chuột có khả năng
miễn dịch [51]. Việc nghiên cứu tách chọn dòng, biểu hiện và tinh sạch protein
azurin sẽ giúp con người có thể tiến đến gần việc nghiên cứu điều trị ung thư một
cách hiệu quả và không gây hại đến các tế bào bình thường khác. Bởi lẽ, sản phẩm
protein azurin từ chủng P. aeruginosa đã được chứng minh là có khả năng đặc biệt
nhắm vào các tế bào ung thư mà khơng gây bất kỳ tác động có hại nào đến các tế
bào bình thường [43].
Ở Việt Nam, những nghiên cứu về azurin và gen mã hóa azurin chưa có cơng
bố. Chính vì vậy, tơi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nhân dịng và phân tích trình

tự gen mã hóa cho protein azurin từ một số chủng P. aeruginosa”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tách dịng gen mã hóa protein azurin từ chủng P. aeruginosa để tiến hành
tạo protein azurin tái tổ hợp ứng dụng trong ức chế tế bào ung thư vú.
3. Nội dung nghiên cứu
 Tuyển chọn chủng P. aeruginosa mang gen mã hóa azurin.
 Tách dịng gen mã hóa protein azurin từ chủng đã tuyển chọn.
 Phân tích trình tự gen mã hóa cho protein azurin.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới về protein azurin
Để giảm thiểu những nguy cơ một cách tối đa cho bệnh nhân, các nhà khoa
học đã nghiên cứu và có những kết quả bước đầu về những phương pháp điều trị
ung thư mới, tuy nhiên những phương pháp này cũng còn nhiều hạn chế. Như liệu
pháp miễn dịch ung thư là một phương pháp điều trị sáng tạo đầy hứa hẹn cho
nhiều dạng ung thư, đặc biệt là u ác tính. Mặc dù liệu pháp miễn dịch đã được
chứng minh là có hiệu quả, tỷ lệ đáp ứng của bệnh nhân khác nhau và chỉ một
nhóm nhỏ bệnh nhân trong một nhóm lớn đáp ứng tốt với điều trị [40]. Hay như
một số cuộc điều tra đã được thiết kế để nghiên cứu tác dụng chống ung thư tiềm
năng của chiết xuất vi tảo, trong đó họ chủ yếu kết luận khả năng gây chết tế bào
ung thư apoptotic thông qua các con đường độc lập hoặc phụ thuộc caspase [9].
Hay Nanomedicine, một công nghệ thay thế đầy hứa hẹn cho phép tích tụ có chọn
lọc các chất hóa trị liệu được quản lý một cách có hệ thống trong các mơ khối u
thơng qua tác dụng tăng cường tính thấm và lưu giữ (EPR) do khối u bị rò rỉ mạch
máu và dẫn lưu bạch huyết kém. Tuy nhiên hiệu quả điều trị bị ảnh hưởng bởi thời
gian lưu thông của các thuốc nano này trong máu, tương tác giữa các hạt nano và
protein sau khi sử dụng và sự tương tác phức tạp tại môi trường vi mô khối u

quanh mạch (TME) do sự hiện diện của nhiều các quá trình sinh học [21].
Việc sử dụng một số peptit tổng hợp được thiết kế để tối ưu hóa các đặc tính
kháng sinh và chống khối u cũng như cải thiện khả năng điều trị, chúng có ưu
điểm độc đáo của peptit, chẳng hạn như trọng lượng phân tử thấp, khả năng nhắm
mục tiêu cụ thể vào tế bào khối u và độc tính thấp trong các mơ bình thường. Tuy
nhiên, các peptit trị liệu có một số nhược điểm đáng kể liên quan đến tính ổn định
và thời gian bán hủy ngắn của chúng [34], [47], [45].
Azurin, một protein oxy hóa khử chống ung thư mạnh được tiết ra bởi các
loài P. aeruginosa đã được báo cáo là có hoạt tính chống lại các dòng tế bào ung
thư vú. Azurin là một protein oxy hóa khử trọng lượng phân tử thấp, là một trong
những sản phẩm vi khuẩn tiêu biểu được sử dụng trong điều trị khối u, điều này


4
đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu tìm kiếm các phương pháp mới để tăng cường sản
xuất protein này. Trong một nghiên cứu năm 2010, P. aeruginosa đã được phân
lập từ phổi của bệnh nhân xơ nang ở Ai Cập và được xác định bằng rRNA 16S.
Gen azurin được khuếch đại bằng chương trình PCR thích hợp. Gen được nhân
bản thành vectơ dễ dàng pGEM-T và được giải trình tự. Sau đó được nhân dịng
vào vectơ biểu hiện q mức pET-28a (+) bằng cách sử dụng vi khuẩn E. coli
BL21 làm vi khuẩn biểu hiện. Protein tái tổ hợp được tinh chế bằng cách tinh chế
một bước sử dụng nhựa Ni++. Kết quả cho thấy azurin ức chế mạnh sự tăng sinh
của cả dịng tế bào ung thư biểu mơ ruột kết và dòng tế bào ung thư vú. Đồng thời,
azurin không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào đến tế bào hắc tố bình thường của
con người [38], [35].
Một nghiên cứu khác, tại Bệnh viện Đại học Mansoura đã phân lập 95 chủng
P. aeruginosa từ bệnh nhân nội trú và bệnh nhân ngoại trú đã tham dự các phòng
khám tại Bệnh viện Đại học Mansoura. Kết quả nghiên cứu cho thấy azurin từ các
phân lập địa phương khác nhau của P. aeruginosa đã phát huy tác dụng gây độc
tế bào có thể nhìn thấy trên dịng tế bào MCF-7 của ung thư vú [50]. Năm 2011,

thì một nhóm nhà khoa học đã sử dụng các protein azurin từ các lồi Pseudomonas
khác nhau được phân tích để phân tích cấu trúc sinh lý sơ cấp, thứ cấp và mối quan
hệ phát sinh loài của chúng. Nghiên cứu này chỉ ra rằng thành phần axit amin,
trọng lượng phân tử khác nhau giữa protein azurin. Phân tích phát sinh lồi cho
thấy rằng protein azurin của các lồi Pseudomonas khác nhau có tổ tiên chung, có
quan hệ họ hàng chặt chẽ với nhau và các trình tự được bảo tồn cao [28].
Trong một nghiên cứu khác cũng vào năm 2011, một nhóm nhà khoa học đã
sử dụng các phương pháp tùy chỉnh để tập trung vào việc tổng hợp azurin từ các
chủng P. aeruginosa khác nhau với sự đồng nhất rõ ràng. Họ đã sàng lọc sự phát
triển của các chủng P. aeruginosa khác nhau (1934, 741, 2453 và 1942) để tổng
hợp azurin và tăng cường sản xuất azurin. Và cho thấy các đặc tính của azurin
bằng cách sử dụng giải hấp thụ/ion hóa laser được hỗ trợ bởi ma trận, natri dodecyl
sulfat điện di trên gel polyacrylamide và quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier.
Kết quả cho thấy 2453 là chủng tiết ra nhiều azurin nhất và cho thấy sự chết rụng


5
đáng kể ở các tế bào ung thư biểu mô vú như T-47D và ZR-75-1. Nghiên cứu này
chứng minh các phương pháp tùy chỉnh để tổng hợp azurin từ các chủng P.
aeruginosa khác nhau với tính đồng nhất rõ ràng và tác động tự chết của chúng
trên các tế bào ung thư biểu mô vú với các cơ chế phân tử có thể có và các loại
oxy phản ứng [38].
Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Mỹ và Ý, đã báo cáo về hoạt
động chống khối u của p28 (một đoạn peptid của azurin) phát sinh từ sự ổn định
sau dịch mã của chất ức chế khối u p53 thường được điều chỉnh giảm bởi sự liên
kết của một số ligase ubiquitin. Điều này đòi hỏi p28 phải liên kết đặc biệt với p53
để ức chế các ligase cụ thể bắt đầu phân hủy qua trung gian proteosome. Trong
nghiên cứu này, quang phổ lực nguyên tử, một phương pháp tiếp cận công nghệ
nano, được sử dụng để khảo sát tương tác của p28 với p53 có chiều dài đầy đủ và
các miền cơ lập của nó ở cấp độ phân tử đơn lẻ. Phân tích các lực khơng liên kết

và hằng số tốc độ phân ly cho thấy rằng p28 tạo thành một phức bền vững với
vùng liên kết DNA của p53, ức chế sự liên kết của các ligase ubiquitin khác với
Mdm2 để giảm sự phân hủy protein của p53 [39].
Nghiên cứu khác tại Bồ Đào Nha đã báo cáo rằng, azurin nhắm mục tiêu Pcadherin biểu hiện quá mức của bệnh ung thư vú, chống lại tác dụng xâm lấn của
nó. P-cadherin biểu hiện quá mức xảy ra ở khoảng 30% của ung thư biểu mô tuyến
vú đại diện cho một trong những loại ung thư vú nguy hiểm nhất [11].
Năm 2015, tại Đại học Calicut Ấn Độ đã thực hiện phân lập gen azurin sản
xuất các chủng P. aeruginosa bản địa và xác nhận sự hiện diện của nó bằng kỹ
thuật phân tử. Trong số 10 mẫu được chọn cho nghiên cứu này, 8 mẫu cho thấy sự
hiện diện của gen azurin bằng cách sử dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể trong
PCR gradient, khuếch đại một đoạn DNA 545 bp đơn đặc trưng của gen azurin.
Tổng số protein tế bào chiết xuất được phân tích bằng điện di trên gel SDSPolyacrylamide, có nhiều dải băng bao gồm một dải tương ứng với trọng lượng
phân tử 14 KD trong tất cả 8 mẫu được chọn từ PCR [42]. Gần đây nhất vào năm
2018, Sarwar và Fahim tại Đại học BRAC đã tiến hành với 25 chủng phân lập
trong mơi trường (đất) mục đích là phân lập azurin sản xuất Pseudomonas spp bản


6
địa cùng với việc xác nhận sự hiện diện của azurin bằng kỹ thuật phân tử. Họ sử
dụng cặp mồi oligonucleotide cụ thể (AZU-F và AZU-R) trong PCR gradient. Kết
quả là trong số 25 chủng phân lập, 10 chủng cho thấy sự hiện diện của gen azurin
bằng cách khuếch đại một đoạn DNA 545 bp duy nhất trong PCR. Việc phát hiện
ra các chủng vi sinh vật sản xuất azurin có năng suất cao có thể dẫn chúng ta đến
việc phát triển các loại thuốc chống ung thư [41].
1.2. Tình hình nghiên cứu protein azurin tại Việt Nam
Nghiên cứu đầu tiên là của nhóm nghiên cứu vật lý lý thuyết, Đại học Tơn
Đức Thắng thành phố Hồ Chí Minh đã đưa ra giả thuyết rằng vi khuẩn gây bệnh
và vi khuẩn đồng loại cư trú lâu dài trong cơ thể người có thể tạo ra protein giống
azurin như một vũ khí chống lại sự xâm nhập của bệnh ung thư. Trong nghiên
cứu trước đây của họ, các vi khuẩn giả định đã được sàng lọc từ các bộ gen hoàn

chỉnh của 66 loài vi khuẩn ưu thế trong hệ vi sinh vật đường ruột của con người
và sau đó được đặc trưng bằng cách coi chúng như các thuật toán chú thích chức
năng với azurin làm đối chứng. Họ đã dự đốn định tính 14 loại vi khuẩn giả
định sở hữu các đặc tính chức năng rất giống với azurin. Trong cơng việc này,
họ thực hiện một số phân tích định lượng và dựa trên cấu trúc bao gồm tính tốn
tỷ lệ phần trăm kỵ nước, mơ hình cấu trúc, và nghiên cứu gắn kết phân tử về vi
khuẩn quan tâm chống lại protein p53, một mục tiêu ung thư. Cuối cùng, họ đã
xác định được 8 vi khuẩn giả định liên kết p53 theo cách tương tự như p28-azurin
và azurin, trong đó 3 peptit (p1seq16, p2seq20 và p3seq24) được chỉ ra từ nghiên
cứu trước đây của họ và 5 peptit mới (p1seq09, p2seq05, p2seq08, p3seq02 và
p3seq17) được phát hiện lần đầu tiên [36]. Sau đó vào tháng 12 năm 2019, tác
giả Nguyễn Duy cùng một nhóm nhà khoa học khác đã thực hiện một nghiên cứu
khác với mục đích cải thiện quy trình sàng lọc và đánh giá tính đa dạng di truyền
của gen azurin ở P. aeruginosa và gen giống azurin trong hệ vi sinh vật đường
ruột của một quần thể cụ thể ở Việt Nam và quần thể toàn cầu. Kết quả là, nghiên
cứu này đã tối ưu hóa thành cơng nhiệt độ ủ để khuếch đại DNA nhằm sàng lọc
các gen azurin và áp dụng cho các gen giống azurin từ hệ vi sinh vật đường ruột
của con người; là nghiên cứu đầu tiên phân loại gen azurin thành 5 kiểu gen khác


7
nhau ở quy mơ tồn cầu và xác nhận hoạt động chống ung thư tiềm năng của 3
protein tổng hợp giống azurin (Cnazu1, Dlazu11 và Ruazu12). Các kết quả đóng
góp cho sự phát triển thủ tục được áp dụng để sàng lọc các protein chống ung
thư từ microbiome của con người và sự hiểu biết toàn diện về đáp ứng trị liệu
của chúng ở cấp độ di truyền [37].
Các nghiên cứu tại Việt Nam chỉ dừng lại ở việc phân lập sàng lọc và phân
loại. Ngoài ra, đến thời điểm hiện nay chưa có cơng bố nào về nhân dịng và biểu
hiện gen azurin và sử dụng azurin như một phương pháp điều trị ung thư.
1.3. Khái quát về trực khuẩn mủ xanh (P. aeruginosa)

Trực khuẩn mủ xanh được tìm thấy trong đất, nước, hệ vi sinh vật da và hầu
hết các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Nó phát triển mạnh khơng chỉ trong
mơi trường bình thường, mà cả trong khí quyển oxy thấp, do đó đã xâm chiếm
nhiều môi trường tự nhiên và nhân tạo [17].
1.3.1. Các tính chất sinh học chính
1.3.1.1. Hình thái tính chất bắt màu
Là trực khuẩn thẳng hoặc hơi cong (không xoắn), hai đầu trịn, nhỏ, đứng
riêng lẻ, thành đơi và có khi xếp thành chuỗi. Bắt màu Gram âm. Di động nhờ một
lơng duy nhất ở một cực. Có các pili, là nơi tiếp nhận page và giúp vi khuẩn bám
dính vào cơ thể vật chủ. Khơng có khả năng sinh nha bào [7], [1].
1.3.1.2. Về tính chất ni cấy
Là trực khuẩn hiếu khí tuyệt đối. Mọc dễ trên các mơi trường ni cấy thơng
thường. Có thể mọc trong khoảng nhiệt độ 5-420C, tối ưu ở 370C; pH từ 4,5-9,0;
tối ưu ở pH 7,2-7,5.
Trên mơi trường đặc khuẩn lạc có thể dạng S (thường gặp khi nuôi cấy từ
bệnh phẩm lâm sàng), dạng M hoặc R.
Sinh sắc tố là tính chất đặc trưng của trực khuẩn mủ xanh. Có hai loại sắc tố
chính:
- Pyocyanin: khi ni cấy trên mơi trường aka King A sẽ tạo điều kiện thuận lợi
cho vi khuẩn tiết ra sắc tố này, sắc tố có màu xanh lá cây, tan trong nước và chloroform,
sắc tố này làm cho mủ và mơi trường ni cấy có màu xanh.


8
- Pyoverdins: khi nuôi cấy trên môi trường aka King B, sắc tố có màu vàng
– lục, là sắc tố huỳnh quang, phát xanh khi chiếu tia cực tím, dễ mất trong mơi
trường ni cấy khơng chuẩn.
Ngồi ra cịn có hai loại sắc tố thứ yếu khác đó là: Pyorubin và Pyomelanin.
- Pyorubrin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng trực khuẩn mủ xanh sinh
ra sắc tố này.

- Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1- 2% số chủng trực khuẩn mủ xanh
sinh sắc tố này.
Có khoảng 5-10% số chủng trực khuẩn mủ xanh khơng sinh sắc tố.
Có vẻ như việc tiếp xúc lâu dài với các tác nhân khác cũng như sulfathiazole
có thể khích thích sự phát triển của các biến thể sắc tố [7], [1], [8], [5], [26].
1.3.1.3. Tính chất sinh hóa
Trực khuẩn mủ xanh có oxydase dương tính, làm lỏng gelatin, khử NO3 thành
N2. Sử dụng carbohydrat bằng hình thức oxy hố có sinh axit như glucose,
mannitol, glycerol, arabinose... Lactose âm tính, Citrat simmon dương tính, ADH
dương tính; Urease âm tính, indol âm tính, H2S âm tính [5].
Mặc dù được phân loại là một sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa cịn được xem
như là sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong mơi trường
thiếu một phần hay tồn phần khí oxy. Nó có thể tăng sinh yếm khí bằng cách sử
dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng, và thậm chí khi thiếu nitrat nó cũng
có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất. Khả năng thích nghi
trong mơi trường vi hiếu khí hay kị khí mang ý nghĩa quan rất quan trọng đối với
cơ chế sinh bệnh của P. aeruginosa, ví dụ ở những bệnh nhân bị viêm phổi do
bệnh xơ nang, khi mà lớp alginate dày bao quanh những tế bào vi khuẩn nhầy có
thể giới hạn sự khuếch tán của oxy vào máu [8].
Sự đa dạng của các cơ chế trao đổi gen, bao gồm biến nạp, tải nạp và tiếp
hợp, giúp P. aeruginosa thích nghi với các điều kiện thay đổi bằng cách thu nhận
thông tin di truyền mới [46].


9
1.3.1.4. Hình thái khuẩn lạc
Trên mơi trường đặc, khuẩn lạc điển hình, thường gặp nhất của P.aeruginosa
khi cấy bệnh phẩm lâm sàng: kích thước lớn,nhẵn, bờ dẹt, giữa lồi lên, có thể gặp
khuẩn lạc xù xì hoặc nhầy [7].
1.3.1.5. Khả năng gây bệnh

Trực khuẩn mủ xanh là một mầm bệnh cơ hội gây nhiễm trùng bệnh viện
thường gặp nhất tấn cơng các bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch. Có thể gây nhiều
bệnh khác nhau như nhiễm trùng vết thương, vết bỏng, hô hấp, tiết nhiệu; nhiễm
trùng huyết và dịch não tủy [7], [8]. Do đó các nhóm bệnh nhân có nguy cơ mắc
phải P. aeruginosa nhiễm trùng bao gồm những người mắc bệnh di truyền như u
nang bệnh nhân xơ hóa, bệnh nhân liệt, bỏng, những người nhập viện trong các
đơn vị chăm sóc đặc biệt và những người phải thở máy, và bệnh nhân bị ức chế
miễn dịch bởi một số bệnh như ung thư và AIDS. P. aeruginosa thường tồn tại
nhiều và dai dẳng trong môi trường bệnh viện. Chúng có mặt ở nền nhà, giường,
chăn, đệm, lavabo, tay nhân viên y tế, nhiều dụng cụ máy móc trong bệnh viện
như ống thơng, máy hơ hấp nhân tạo. Chúng xâm nhập vào cơ thể qua da (nhất là
sau khi bị bỏng) hoặc qua vết thương, do phẫu thuật. Từ đó, vi khuẩn xâm nhập
vào bệnh nhân và gây bệnh. Tại chỗ vi khuẩn gây viêm có mủ, điển hình là mủ có
màu xanh. Nếu cơ thể giảm sức đề kháng hoặc do bệnh toàn thân, vi khuẩn xâm
nhập và gây viêm các cơ quan như viêm bàng quang, viêm tai giữa, viêm màng
não, viêm màng bụng. Có thể vi khuẩn vào máu gây nhiễm khuẩn huyết, viêm nội
tâm mạc. Nhiễm khuẩn do trực khuẩn mủ xanh ngày càng trở nên trầm trọng do
sự kháng kháng sinh rất mạnh của vi khuẩn. Mặc dù liệu pháp kháng sinh đã được
cải thiện đáng kể trong quản lý các bệnh truyền nhiễm nói chung, nhiều P.
aeruginosa nhiễm trùng khơng thể được điều trị đầy đủ hoặc loại bỏ bởi ứng dụng
thuốc chống Pseudomonas và do đó có thể gây nhiễm trùng mãn tính [2], [44],
[1].
Khả năng gây bệnh của P. aeruginosa là đa yếu tố, được biểu hiện bằng
nhiều độc tố, hoặc các yếu tố độc lực, nó tạo ra và nhiều loại bệnh mà nó gây ra.
P. aeruginosa là loài xâm nhập và gây độc. Nhiễm trùng xảy ra theo các giai


10
đoạn: tiếp cận vi khuẩn, xâm chiếm, xâm nhập và phổ biến, và bệnh toàn thân
hoặc nhiễm độc. Yếu tố virus có thể góp phần vào một hoặc một số giai đoạn

bệnh sinh. Các yếu tố bề mặt, bao gồm pili, lipopolysaccharide, và
polysaccharide chất nhờn (alginate), có thể góp phần vào hai giai đoạn đầu tiên.
Chất nhờn polysaccharide và lipopolysaccharide cũng có thể góp phần vào các
q trình khác sau này trong quá trình nhiễm trùng. Độc tố, bao gồm ETA và
phospholipase C (hemolysin) và protease của P. aeruginosa có thể góp phần làm
tổn thương và phổ biến mơ. Chúng cũng có thể hỗ trợ việc thu mua các chất dinh
dưỡng cần thiết cho vi khuẩn trong giai đoạn đầu của nhiễm trùng. Tầm quan
trọng của các yếu tố độc lực khác nhau có thể phụ thuộc vào nhiễm trùng [46].
1.3.2. Các yếu tố độc lực
P. aeruginosa là loài vi khuẩn gây bệnh cơ hội. Độc tố của P. aeruginosa chỉ
có tác động gây chết khi chúng được tạo ra với số lượng lớn. Tuy nhiên, lồi vi
khuẩn này có nhiều yếu tố độc lực tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập,
lan truyền và gây bệnh.
- Nội độc tố (endotoxin): là thành phần của vách tế bào vi khuẩn. Nội độc tố
bao gồm chủ yếu là LPS và một lượng nhỏ protein. Hoạt tính sinh học của nội độc
tố chủ yếu do phức hợp LPS đảm nhiệm. LPS có vai trị quan trọng trong bệnh
sinh nhiễm khuẩn huyết và sốc nhiễm khuẩn huyết.
- Ngoại độc tố (exotoxin A): bản chất là protein có trọng lượng phân tử 66,6
kDa. ETA hoạt động tượng tự như cơ chế hoạt động của độc tố vi khuẩn bạch hầu.
Với khả năng khuếch tán và ức chế sự tổng hợp protein của tế bào, ETA là một
độc tố mạnh nhất của P. aeruginosa. ETA gây rối loạn chức năng huyết động trung
tâm, thay đổi chức năng đơng máu, rối loạn chuyển hố lipit, gây tổn thương nhiều
cơ quan, nhưng biểu hiện rõ rệt nhất là tổn thương gan. 90% số chủng P.
aeruginosa sản xuất ETA nhưng đặc tính của độc tố này rất khác nhau tuỳ từng
chủng.
- Các enzyme ngoại tiết: vi khuẩn có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại tiết,
các enzyme này đóng vai trị quan trọng trong q trình xâm nhập, gây bệnh tại
chỗ:

11
+ Protease: gần 90% các chủng P. aeruginosa có khả năng phân giải protein.
P. aeruginosa tiết ra 2 loại protease quan trọng là alcaline và elastase. Nhiều chủng
tiết ra collagenase. Các protease này thường có tác dụng hiệp đồng. Elastase có
thể phá hủy lớp chun keo thành mạch máu gây tổn thương xuất huyết, tạo nên
những ổ hoại tử trong thành mạch máu. Enzyme này còn gây ức chế hiện tượng
opsonin hoá, làm giảm khả năng thực bào của bạch cầu đa nhân trung tính. Ngồi
tác động trực tiếp, các protease cịn có khả năng làm thay đổi sức đề kháng của
vật chủ thông qua việc bất hoạt bổ thể, phá hủy cấu trúc của các globulin miễn
dịch.
+ Hemolysine có 2 loại:
o Glycolipide (hemolysine chịu nhiệt): khơng có tính enzyme, khơng có tính
kháng ngun và ít độc. Glycolipide đóng vai trị như một chất tẩy hồ tan các
lipid là những chất cần cho hoạt động của phospholipase C.
o Phospholipase C (hemolysine không chịu nhiệt): là một enzyme tan máu
nằm trong một polypeptid đơn. Phospholipase C thường tác động hiệp đồng với
glycolipide và protease alcaline gây xuất huyết, hoại tử tại chỗ tổn thương.
+ Cytotoxine (leucocidin): là một protein rất độc với bạch cầu đa nhân trung
tính và các tế bào lympho.
+ Exoenzyme S: là một protein, có thể có 2 dạng: dạng khơng hoạt động và
khơng có tính enzyme và dạng hoạt động, có tính enzyme.
+ Enterotoxin và yếu tố thấm qua thành mạch: các độc tố này cịn ít được
biết đến. Một số nghiên cứu đã chứng minh, trong thực nghiệm enterotoxin gây
nên tình trạng ứ dịch trong đường ruột; độc tố này có thể là một trong những nguyên
nhân gây viêm ruột non. Khi gây nhiễm qua da, yếu tố này có thể thấm vào trong
lịng mạch, gây ban đỏ kèm theo xuất huyết ra ngồi lịng mạch.
- Glycocalyx - capsule: ngoài chức năng bảo vệ vi khuẩn chống các yếu tố
có hại cho chúng từ vật chủ như thực bào, kháng thể, bổ thể, kháng sinh, giúp cho
q trình nhân lên của vi khuẩn trong các mơ còn thực hiện chức năng bám vào tế
bào.

12
- Lơng (flagella): vai trị của flagella trong sinh bệnh học nhiễm P.
aeruginosa còn chưa rõ ràng.
- Pili: giúp cho vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô của vật chủ [1].
1.3.3. Sức đề kháng
Trực khuẩn mủ xanh có sức đề kháng cao so với các vi khuẩn khơng có khả
năng sinh nha bào. Có thể sống hàng tuần trong mơi trường ẩm, thống, khơng có
ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp. Trong mơi trường tối thiểu, ở 50C có thể sống
tới nửa năm. Trực khuẩn mủ xanh bị tiêu diệt ở nhiệt độ 1000C và các thuốc sát
khuẩn thông thường. Trực khuẩn sống ở trong đất, nước. Ở nơi có khơng khí, đủ
độ ẩm và khơng có ánh sáng mặt trời, vi khuẩn sống được hàng tuần. Trong môi
trường có chất dinh dưỡng tối thiểu để trong tủ lạnh, chúng có thể sống được 6
tháng.
Chuyển sang lối sống khơng lành mạnh cùng với độc lực thấp hơn là một lợi
thế sống còn nhờ nhiều loại vi khuẩn gây bệnh như P. aeruginosa trốn tránh căng
thẳng và các điều kiện bất lợi. Chúng mất khả năng vận động và bám vào các bề
mặt và hình thành các tập hợp tế bào hoặc vi khuẩn được nhúng trong các chất đa
bào ngoại bào (EPS) để bảo vệ vi khuẩn khỏi môi trường xung quanh. Những cấu
trúc này được gọi là màng sinh học tạo ra khả năng bền bỉ chống lại thực bào,
stress oxy hóa, hạn chế chất dinh dưỡng / oxy, tích lũy chất thải trao đổi chất, cạnh
tranh giữa các sinh vật và các chất chống vi trùng thông thường [17], [7], [2].
1.3.4. Dịch tễ học
Mô tả đầu tiên về P. aeruginosa như một loài vi khuẩn khác biệt được đưa
ra vào cuối thế kỷ 19, sau khi Pasteur phát triển môi trường nuôi cấy vô trùng.
Việc sàng lọc thuốc nhuộm đã cung cấp kích thích cho nghiên cứu khoa học đầu
tiên về P. aeruginosa do dược sĩ Carle Gessard xuất bản năm 1882 với tựa đề “On
the blue and green coloration of bandages”. Mặc dù khả năng gây nhiễm trùng của
P. aeruginosa đã được chú ý vào năm 1889, khả năng gây bệnh của nó đã bị nghi

ngờ, và P. aeruginosa chủ yếu được coi là nguồn cung cấp các chất kháng khuẩn
mạnh. Trước năm 1947, chỉ có 91 trường hợp nhiễm trùng huyết do P. aeruginosa
được báo cáo trong y văn [32]. Một nghiên cứu năm 2018 đã chỉ ra rằng, tỷ lệ


13
nhiễm trùng bệnh viện và tác nhân gây bệnh của chúng khác nhau đáng kể giữa
các loại ICU khác nhau tương ứng với các cấu trúc nguy cơ khác nhau của bệnh
nhân. P. aeruginosa góp phần vào 11% tổng số ca nhiễm trùng bệnh viện, dẫn đến
tỷ lệ tử vong và bệnh tật cao. Mặc dù tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện ở các nước Châu
Âu khác nhau được báo cáo là từ 3,5 đến 12%, nhưng tỷ lệ nhiễm trùng bệnh viện
ở Kosovo là cao (17,4%). Một nghiên cứu khác cũng đã báo cáo rằng P.
aeruginosa có gánh nặng nhiễm trùng mắc phải cao nhất trong các đơn vị chăm
sóc đặc biệt ở châu Âu. Tại Hoa Kỳ, các ca nhiễm P. aeruginosa liên quan đến
chăm sóc sức khỏe được ước tính đóng góp tới 51.000 trường hợp mỗi năm. Hiệp
hội kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện quốc tế báo cáo rằng nhiễm khuẩn P.
aeruginosa đã trở thành một vấn đề chăm sóc sức khỏe trên tồn thế giới [17],
[22].
1.4. Tổng quan về protein azurin
1.4.1. Sơ lược về protein azurin
Protein oxy hóa khử azurin của vi khuẩn (viết tắt là azurin, hoặc Az) azurin
là một phân tử protein có trọng lượng phân tử thấp (14 kDa, 128 axit amin), màu
xanh lam, chứa đồng. Azurin ngoại chất cần thiết để bảo vệ vi khuẩn khỏi stress
oxy hóa (chất cho điện tử thành nitrat reductase) và độc tính của đồng, hoạt động
trong chuỗi vận chuyển điện tử hô hấp ở một số vi khuẩn là một loại đồng chứa
protein đơn miền với một cấu trúc β- barrel cứng nhắc. Azurin là protein chứa
đồng được gọi là protein cupredoxin. Cupredoxin là các protein ở dạng hồ tan có
chứa đồng, chúng tham gia vào vận chuyển điện tử của sinh vật nhân sơ và sinh
vật nhân chuẩn. Những khả năng này là do azurin có thể tương tác với một số
protein liên quan đến các bệnh lý này bằng ái lực cao. Khả năng này cùng với cấu

trúc, đặc tính hóa lý làm cho azurin như một protein giá đỡ tự nhiên mang đặc
trưng bám dính giống kháng thể (immunoglobulin). Có thể được sử dụng cho các
mục đích khác nhau như chống ký sinh trùng và tác nhân chống HIV, và là một
trong những sản phẩm vi khuẩn tiêu biểu được sử dụng trong điều trị các khối u.
Azurin chứa một điểm kỵ nước [14], [23], [29], [30], [35], [28].


14
Khả năng của azurin để tiêu diệt các tế bào khối u xuất hiện dựa vào sự ổn
định của protein p53 ức chế sự phát triển của bệnh ung thư. Chất ức chế khối u
p53 bị phân hủy bởi hệ thống ubiquitin-proteasome. p53 được polyubiquiti hóa
với sự hiện diện của E1, UbcH5 như E2 và MDM2 oncoprotein. Một phân tử
ubiquitin liên kết MDM2 thông qua liên kết sulfhydroxy, đặc trưng của liên kết
ubiquitin ligase (E3) - ubiquitin. Dư lượng cysteine trong ga cuối carboxyl của
MDM2 là cần thiết cho hoạt động. Những dữ liệu này cho thấy rằng protein
MDM2, được tạo ra bởi p53, có chức năng như một ligase ubiquitin. Trong hạt
nhân azurin tăng cường mức độ nội bào của p53 và Bax, những gì gây nên sự giải
phóng của ti thể cytochrome c vào cytosol. Quá trình này kích hoạt thác caspase
(bao gồm caspase-7 và caspase-9) khởi xướng quá trình chết theo chương trình.
Amino acid từ 50 đến 77 (P28) hoạt động như một miền tải nạp protein (PTD),
bao gồm 28 axit amin, có trọng lượng phân tử 2,8 kDa. P28 có khả năng xâm nhập
ưu tiên vào các tế bào ung thư và ngăn chặn sự tăng sinh của chúng trong ống
nghiệm và in vivo. P28 và các peptide tương tự làm giảm sự suy thoái của p53 có
thể cung cấp một loạt của các tác nhân hóa học trị liệu cytostatic và độc tế bào.
PTD azurin đã được tinh chế từ axit amin 50 đến 67, các peptide kỵ nước P18
trong các axit amin 68 đến 77, hydrophilic peptide P10, là những thành phần chịu
trách nhiệm cho hoạt động kháng sinh của p28 [14], [29], [39], [25].
Azurin có tác dụng chống ký sinh trùng và kháng virus chống lại bệnh sốt rét
Plasmodium falciparum và virus HIV-1. Nó liên kết với ICAMs, hoạt động như
các thụ thể cho các mầm bệnh khác nhau bao gồm Plasmodium falciparum, HIV1 và cũng liên kết với một số protein bề mặt của ký sinh trùng hay virus, nó can

thiệp vào việc xâm nhập của các tác nhân gây nhiễm vào các tế bào chủ [14].
Trong một nghiên cứu khác thì azurin đã được chứng minh là cho phép thoái triển
các khối u UISO-Mel-2 ở người được cấy ghép trên chuột và có thể được sử dụng
trong điều trị ung thư [48].
1.4.2. Cấu trúc của gen azurin
Azurin là thành viên của họ cupredoxin chứng minh tính năng cấu trúc tương
tự đến các miền biến immunoglobulin [12]. Các cupredoxin có một cấu trúc


15
sandwich bất biến, cấu trúc thơng thường được hình thành bởi hai mặt phẳng β
hình thành bởi bảy hoặc tám sợi song song và phản song song, một vùng R - helix
biến đổi nằm bên ngoài thân, và một vị trí liên kết đồng hạt nhân bảo tồn [14],
[15].
Sự tương đồng của azurin với domain protein miễn dịch glubolin chứng minh
kháng thể giống cấu trúc đơn của nó. Cấu trúc giống như kháng thể này bao gồm
8 sợi phản song song được ổn định thơng qua cầu disunfua hình thành một cấu
trúc nhỏ gọn và cứng nhắc với lõi β-sandwich. Mặc dù azurin và glubolin miễn
dịch đều có bản chất trình tự thấp. Cấu trúc thứ cấp của nó có thể được liên kết
bằng sự chồng chất các cấu trúc, điều này chứng tỏ chúng có cùng một tổ tiên.
Trong phần giữa có vị trí P28, các P28 là một PTD xoắn α dài mang tính đặc hiệu
cho lối vào của azurin trong tế bào ung thư. Azurin có 4 vòng lặp được cho là liên
quan đến việc rằng buộc với các protein khác. Những vòng lặp tiếp xúc này tương
tự như trong tự nhiên ở các kháng thể, thực thi việc sở hữu protein của nó [14].

Hình 1. 1 Cấu trúc của protein azurin
Cấu trúc azurin được biểu diễn dưới dạng sơ đồ cấu trúc liên kết với các sợi β
được đánh số tuần tự, được mô tả là sợi kết nối disulfua 1 và vòng lặp giữa sợi
2b và 3 và các phối tử đồng; Cys112, His117 và Met121 trong vòng kết nối sợi 7

16
đến 8 và His46 và Gly45 trong vòng kết nối sợi 3 đến 4. Góc tyrosine, trong
vịng nối các sợi 7 và 8 và một chuỗi α ngoại vi cũng được mô tả. Các đường đứt
nét biểu thị kiểu liên kết hydro giữa các sợi [33].
1.4.3. Khả năng chống ung thư
Azurin như một nhân tố đa mục tiêu chống ung thư có tác dụng thơng qua ba
con đường: ức chế sự phát triển của chu kỳ tế bào qua ràng buộc để Eph tyrosine
kinase ngoại bào khởi phát cảm ứng apoptosis thông qua ổn định trong tế bào của
p53 và ngăn ngừa sự hình thành mạch thơng qua sự ức chế VEGFA. Từ những
con đường độc lập thì sẽ dẫn đến sự ức chế tế bào ung thư [14]. Cho đến nay, một
số cơ chế khác nhau đã được đề xuất để giải thích cho hoạt động chống ung thư
của azurin: (i) azurin gây ra quá trình tự chết hoặc ức chế sự phát triển của tế bào
ung thư bằng cách tạo phức với protein ức chế khối u p53; (ii) azurin cũng ức chế
sự phát triển của tế bào ung thư bằng cách can thiệp vào quá trình truyền tín hiệu
qua trung gian thụ thể tyrosine kinase EphB2; (iii) hơn nữa, azurin ức chế sự phát
triển của khối u bằng cách ngăn chặn sự hình thành mạch thơng qua việc giảm
hoạt động tyrosine kinase của VEGFR ‐ 2; (vi) bên cạnh đó, azurin can thiệp vào
biểu hiện protein P-cadherin và ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú [19].


17

Hình 1.2 Cơ chế azurin gây ra quá trình apoptosis và ức chế sự phát triển
của các tế bào ung thư ở người.
Azurin xâm nhập vào tế bào ung thư và tạo phức với p53, ức chế sự phân
hủy p53 qua trung gian ubiquitin và làm tăng mức độ của nó. P53 đã ổn định sẽ di
chuyển trở lại nhân và phiên mã tạo ra các gen proapoptotic như Bax và Noxa
hoặc các chất ức chế chu kỳ tế bào như p21 và p27. Azurin cũng liên kết với các
thụ thể trên bề mặt tế bào, bao gồm VEGFR ‐ 2, Integrarin β 1 , P ‐ cadherin

và EphB2, can thiệp vào con đường dẫn truyền tín hiệu hội tụ thành NRTK của
chúng [19].
1.4.3.1. Ức chế sự tiến triển chu kỳ tế bào
Ephrins là một gia đình của các thụ thể tyrosine kinase liên kết với ligand
ephrin tạo ra các tín hiệu tại các điểm tiếp xúc của tế bào - tế bào kiểm sốt hình
thái tế bào, độ bám dính, di chuyển và xâm nhập. Trong nhiều khối u Eph và
Ephrin được biểu hiện quá mức thúc đẩy sự tăng trưởng khối u và anginogeneis.