Luận văn thạc sĩ nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vaccin

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LÊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC, SINH
HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS VIÊM GAN VỊT CƯỜNG
ĐỘC VÀ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM VACCIN

Chuyên ngành:

Thú y

Mã số:

60 64 01 01

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trịnh Đình Thâu

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NƠNG NGHIỆP - 2016


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng, các kết quả nghiên cứu, các số liệu được trình bày
trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được công bố trong bất cứ một
cơng trình khoa học nào cũng như chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được
cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày .…. tháng .…. năm 2016
Tác giả luận văn

Lê Thu Hương

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận
được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của
bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới TS. Trịnh Đình Thâu, trưởng Thú Y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam,
người đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tơi
trong suốt q trình học tập và thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành nhất tới Ban giám đốc, Ban quản lý đào
tạo, Khoa Thú Y - Học viện nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tơi trong q
trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận văn.
Tơi xin chân thành cám ơn TS. Tạ Hoàng Long, giám đốc Trung tâm kiểm
nghiệm thuốc thú y trung ương I, tập thể lãnh đạo, các cán bộ công nhân viên chức
trong trung tâm, đã luôn giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt q trình thực hiện
đề tài.
Tơi cũng xin phép được gửi lời cám ơn chân thành tới gia đình, người thân,
bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động
viên khuyến khích tơi hồn thành luận văn.
Hà Nội, ngày ….. tháng ….năm 2016
Tác giả luận văn

Lê Thu Hương

ii

MỤC LỤC
Lời cam đoan............................................................................................................................... i
Lời cảm ơn.................................................................................................................................. ii
Mục lục....................................................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt........................................................................................................ v
Danh mục bảng......................................................................................................................... vi
Danh mục hình......................................................................................................................... vii
Trích yếu luận văn.................................................................................................................. viii
Thesis extract.............................................................................................................................. x
Phần 1. Mở đầu........................................................................................................................ 1
Phần 2. Tổng quan tài liệu..................................................................................................... 3
2.1.

Lịch sử nghiên cứu bệnh viêm gan vịt..................................................................... 3

2.1.1.

Lịch sử và phân bố bệnh............................................................................................ 3

2.1.2.

Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới......................................... 5

2.1.3.

Tình hình bệnh Viêm gan vịt ở Việt Nam............................................................... 8

2.2.

Virus viêm gan vịt....................................................................................................... 9

2.2.1.

Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt.......................................... 9

2.2.2.

Cấu trúc hệ gen Picornavirus.................................................................................... 9

2.2.3.

Q trình nhân lên của virus................................................................................... 11

2.2.4.

Đặc tính nuôi cấy...................................................................................................... 13

2.2.5.

Đáp ứng miễn dịch................................................................................................... 15

2.2.6.

Sinh học phân tử virus viêm gan vịt type I (DHV-1).......................................... 16

2.2.7.

Sức đề kháng của virus viêm gan vịt..................................................................... 21

2.2.8.

Chẩn đoán.................................................................................................................. 21

2.2.9.

Vắc xin và chế phẩm sinh học phòng bệnh.......................................................... 22

Phần 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu............................................. 25
3.1.

Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................. 25

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu.............................................................................................. 25

3.1.2.

Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu.......................................................................... 25

3.1.3.

Thiết bị, máy móc..................................................................................................... 26

3.1.4.

Địa điểm nghiên cứu................................................................................................ 27

iii

3.2.

Nội dung nghiên cứu................................................................................................ 27

3.2.1.

Xác định đặc tính sinh học của giống virus Viêm gan vịt cường độc ..............27

3.2.2.

Ứng dụng chủng virus Viêm gan vịt cường độc để kiểm nghiệm vắc xin
Viêm gan vịt nhược độc.......................................................................................... 27

3.3.

Phương pháp nghiên cứu......................................................................................... 27

3.3.1.

Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống............................................................ 27

3.3.2.

Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của giống................................................. 28

3.3.3.

Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu, tiếp truyền virus giống .........................28

3.3.4.

Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp............................................... 28

3.3.5.

Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm................................... 29

3.3.6.

Phương pháp giải trình tự gen của virus............................................................... 30

3.3.7.

Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Theo TCVN 8685-2:2011........................32

3.3.8.

Xử lý số liệu trong nghiên cứu............................................................................... 33

Phần 4. Kết quả và thảo luận............................................................................................. 34
4.1.

Kết quả xác định đặc tính sinh học; giải mã gen đặc trưng, xây dựng dữ
liệu sinh học của giống virus viêm gan vịt cường độc....................................... 34

4.1.1.

Kết quả xác định đặc tính sinh học của virus Viêm gan vịt cường độc ...........34

4.1.2.

Kết quả giải mã gen đặc trưng, xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của
giống Viêm gan vịt cường độc............................................................................... 39

4.2.

Ứng dụng giống virus viêm gan vịt cường độc trong công tác kiểm nghiệm . 45

4.2.1.

Kết quả kiểm tra cảm quan...................................................................................... 47

4.2.2.

Kết quả kiểm tra thuần khiết................................................................................... 47

4.2.3.

Kiểm tra tính an tồn của vắc xin (Theo TCVN 8685-2:2011) ......................... 48

4.2.4.

Kết quả kiểm tra hiệu lực bằng phương pháp công cường độc......................... 48

Phần 5. Kết luận và đề nghị................................................................................................ 51
5.1.

Kết luận...................................................................................................................... 51

5.2.

Đề nghị....................................................................................................................... 51

Tài liệu tham khảo................................................................................................................... 52
Phụ lục....................................................................................................................................... 55

iv


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

cDNA

complementary DNA

BEI

Binary Ethylenimine

Bp

Base pair (s)

DNA

Acid DeoxyriboNucleic

DVH

Duck Virus Hepatitis

ĐVTH

Đơn vị trung hòa

EID50

50 percent Embryo Infectious Dose

ELD50

50 percent Embryo Lethal Dose

Kb

Kilobase

LD50

50 percent Lethal Dose

Ml

Mililit

Mg

Miligam

Nm

Nanomet

ORF

Open Reading Frame

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Axít Ribonucleic

RT - PCR

Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction

UI

Unit Interval

UTR

Untranslated Region

v


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các chủng viêm gan vịt của Việt Nam và thế giới cung cấp chỉ thị gen
để phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ . . .20
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra vô trùng giống virus Viêm gan vịt cường độc ................... 35
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra thuần khiết giống virus Viêm gan vịt cường độc ..............36
Bảng 4.3. Kết quả xác định LD50 của virus Viêm gan vịt cường độc ở 2 đợt thí nghiệm. 37

Bảng 4.4. Danh sách các mồi dùng cho phản ứng PCR/RT-PCR trong nghiên
cứu virus Viêm gan vịt........................................................................................ 40
Bảng 4.5. Trật tự sắp xếp nucleotide và amino acid trong hệ gen virus Viêm gan
vịt cường độc........................................................................................................ 45
Bảng 4.6. Kết quả kiểm tra vô trùng vắc xin Viêm gan vịt nhược độc .......................... 47
Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra an toàn vắc xin Viêm gan vịt nhược độc ............................ 48
Bảng 4.8. Kết quả công cường độc bằng virus Viêm gan vịt cường độc ....................... 49

vi


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1. Vịt chết thời điểm 48 giờ giống virus Viêm gan vịt cường độc và hình
ảnh Gan xuất huyết hoại tử

38

Hình 4.2. Sơ đồ bố trí mồi thực hiện PCR và quá trình giải mã hệ gen virus viêm
gan vịt cường độc thuộc DHAV-3.

39

Hình 4.3. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR/PCR nhân gen kháng nguyên VP1. .....40
Hình 4.4. Điện di kiểm tra kết quả cắt ADN plasmid tái tổ hợp bằng enzyme
giới hạn EcoRI.

41

Hình 4.5. Trình bày chuỗi gen VP1 chủng virus viêm gan vịt cường độc ...................42
Hình 4.6.

Mối quan hệ nguồn gốc phả hệ giữa chủng viêm gan vịt cường độc DN2 của Việt Nam và thế giới (thuộc DHAV-3) dựa trên cơ sở phân
tích chuỗi gen VP1 về thành phần nucleotide bằng chương trình
MEGA4.0

43

Hình 4.7. Kết quả điện di sản phẩm PCR hệ gen virus viêm gan vịt cường độc ........44
Hình 4.8. Vịt ở lô gây miễn dịch (dấu đầu xanh) khoẻ mạnh và vịt lô đối chứng chết
49

vii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Lê Thu Hương
Tên luận văn: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus
Viêm gan vịt cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin”
Ngành: Thú Y

Mã số: 60 64 01 01

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc; Giải mã
gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống. Ứng dụng chủng cường
độc trong kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt.
Nội dung nghiên cứu
Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc thông
qua các bước cấy truyền, gây nhiễm trên tế bào, xác định độc lực, xác định đặc tính ổn
định, tính kháng nguyên của giống; Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học
phân tử của giống. Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưu giữ.
Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công cường
độc với chủng cường độc viêm gan vịt.
Phương pháp
-

Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp.

-

Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm.

Phương pháp giải trình tự gen của virus: tách chiết ARN tổng số; Phương
pháp RT- PCR.
-

Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Kiểm tra độ thuần khiết; an toàn; hiệu lực.

-

Xử lý số liệu trong nghiên cứu

Kết quả chính và kết luận
Giống virus Viêm gan vịt không bị tạp với các vi khuẩn hay gặp. Về độ tinh
khiết giống không lẫn Mycoplasma và Salmonella.
-

6,31

Xác định liều gây chết 50% vịt (LD 50): 10

Giải mã gen kháng nguyên VP1 của chủng viêm gan vịt cường độc có độ dài
là 720 bp và được xác định thuộc genotype III (DHAV-3). Truy cập Ngân hàng gen sử

viii


dụng chuỗi nucleotide mới thu nhận cho thấy chủng virus phân tích thuộc virus viêm
gan vịt nhóm A (duck hepatitis A), genotype III (DHAV-3).
Đã giải mã toàn bộ hệ gen thu được chuỗi ADN của toàn bộ hệ gen virus
viêm gan vịt cường độc gồm 7777 nucleotide. Dựa vào trật tự các gen trong hệ gen
của các chủng virus viêm gan vịt đã công bố, xác định được trật tự sắp xếp của các
gen trong hệ gen của chủng virus viêm gan vịt cường độc
Kết quả nghiên cứu về sinh học phân tử cho thấy: Vị trí phân loại của chủng
virus cường độc: Group IV:ss RNA positive-strand viruses; Order: Nidovirales;
Family: Picornaviridae; Genus: Avihepatovirus; (Genotype: DHAV-3).
Ứng dụng thành công giống cường độc Viêm gan vịt trong kiểm nghiệm vắc
xin. Qua kết quả này đã chứng tỏ giống cường độc Viêm gan vịt sau thời gian tăng

cường và lưu giữ vẫn giữ được đặc tính sinh vật học, đặc tính kháng nguyên, tính độc
của giống.

ix


THESIS EXTRACT
Author: Le Thu Huong
Thesis title: "Study of some biological characteristics, molecular biology of virulent
Duck Hepatitis Virus and use the virulent Duck Hepatitis Virus in quality control of
the vaccine"
Field: Veterinary

Code: 60 64 01 01

University: Vietnam National University of Agriculture
Research purposes
Determine some of biological characteristics of virulent duck hepatitis virus
(DHV). Determine genes characteristic of virulent DHV. Use the virulent Duck
Hepatitis Virus in control the vaccine.
Research content
Determine the biological characteristics of virulent DHV including the
cultures, the ability to infect cells, virulence, stability, antigenicity of the strain;
Genome decoding features built molecular biological data. Decoding the genome of
the virulent DHV is stored.
Quality control of duck hepatitis vaccine, inactivated by virulent strains of
duck hepatitis virus.
Method
-

Method of culture of chicken embryo fibroblasts a layer

-

Method of determining the 50% lethal dose

Methods of gene sequencing of the virus: the total RNA extraction; RT-PCR
method.
-

Methods of testing vaccines: purity; safe; effect

-

Data processing research

Main results and conclusions
Duck hepatitis virus strain is not contaminated with common bacteria.
Mycoplasma and Salmonella are not appearing.
6.31

-

Determination of the lethal dose 50% duck (LD 50): 10

-

Decoding of the VP1 gene virulent duck hepatitis is 720 bp in length and

x

belong to genotype III (DHAV-3). Access the gene bank using the new nucleotide
sequence obtained showed the analysis of duck hepatitis virus A (duck hepatitis A),
genotype III (DHAV-3).
Decoded the DNA sequence obtained by whole virulent duck hepatitis virus
consists of 7777 nucleotides. Follow the duck hepatitis virus was published, we have
arranged to determine the order of genes in the genome of the virulent duck hepatitis
virus.
Results of research on molecular biology shows: Position classification of
virulent strains: Group IV: positive-strand RNA viruses ss; Order: Nidovirales;
Family: Picornaviridae; Genus: Avihepatovirus; (Genotype: DHAV-3).
-

Successful application of the virulent DHV in quality control of the Duck

Hepatitis vaccines, Inactivated. Through this result proved the virulent DHV after
enhancing still retains biological characteristics, antigenic properties, virulence of strain.

xi


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TWI được thành lập năm 1984 theo
quyết định số 58 NN-TCCB/QĐ ngày 28 tháng 3 năm 1984 của Bộ trưởng Bộ
Nơng nghiệp nay là Bộ Nơng nghiệp và PTNT. Ngồi nhiệm vụ kiểm nghiệm
thuốc và nguyên liệu làm thuốc, các chế phẩm sinh học thú y, Trung tâm là nơi lưu
giữ giống vi sinh vật thú y để phục vụ cho kiểm nghiệm, chẩn đoán cũng như chế
tạo vắc xin và các chế phẩm sinh học cho ngành thú y trong cả nước và được nhập
từ nước ngoài.

Hiện nay, Trung tâm lưu trữ và bảo tồn 48 chủng giống vi sinh vật thú y.
Phần lớn các giống vi sinh vật thú y này có xuất xứ từ Trung Quốc, một số khác do
cán bộ thú y mang từ nước ngoài về theo con đường khơng chính thức (hoặc chính
thức) và một số do Viện Thú y, Trung tâm Chẩn đoán thú y quốc gia cung cấp.
Do sự eo hẹp về kinh phí, hàng năm Trung tâm chỉ có thể bảo tồn giống vi
sinh vật bằng các phương pháp truyền thống rồi đông khô, lưu giữ. Gần như tất cả
các giống vi sinh vật hiện có chưa được giám định đầy đủ về kháng nguyên tính,
độc lực, tính ổn định và cấu trúc gen một cách có hệ thống. Những năm gần đây,
do sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học phân tử. Các chủng
vi sinh vật được lưu giữ tại Trung tâm đã và đang được tiêu chuẩn hoá, dần dần
tiệm cận với chuẩn hoá của quốc tế.
Trước đây, nhưng nghiên cứu virus viêm gan vịt chỉ dừng ở mức độ lâm
sàng, bệnh tích, chẩn đốn virus học và sản xuất vắc xin truyền thống để phòng
chống (OIE, 2008). Tuy nhiên, trong vòng 5 năm nay, virus viêm gan vịt được
nghiên cứu sâu sắc ở mức độ sinh học phân tử gen và hệ gen, đặc biệt về ứng dụng
sinh học phân tử trong giám định, nghiên cứu hệ gen, phân loại và tìm hiểu quan
hệ sinh học trong họ Picornaviridae. Theo quan điểm phân loại hiện nay, virus
viêm gan vịt trên thế giới gồm ba genotype khác nhau: Genotype I (DHAV-1),
genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3).
Tại Việt Nam, chủng virus viêm gan vịt đang lưu giữ từ trước tới nay mới
chỉ xác định được virus gây bệnh viêm gan vịt thuộc genotype I (DHAV-1). Việc
xác định chủng virus thuộc genotype I như đã công bố hay đã biến đổi hoặc có
những khác biệt so với các chủng trên thế giới?

1


Xuất phát từ yêu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu một số đặc tính sinh học, sinh học phân tử của virus Viêm gan vịt
cường độc và ứng dụng trong kiểm nghiệm vắc xin". Đề tài được thực hiện với

những mục tiêu và nội dung sau:
Mục tiêu nghiên cứu:
Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc Giải
mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống. Ứng dụng chủng
cường độc trong kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt.
Nội dung nghiên cứu:
1.

Xác định đặc tính sinh học của giống vi rút Viêm gan vịt cường độc

(gồm các bước cấy truyền, khả năng gây nhiễm trên tế bào, độc lực, tính ổn định,
tính kháng nguyên của giống); Giải mã gen đặc trưng xây dựng dữ liệu sinh học
phân tử của giống. Giải mã toàn bộ hệ gen của chủng virus cường độc đang lưu
giữ.
2.
Kiểm nghiệm vắc xin nhược độc viêm gan vịt bằng phương pháp công
cường độc bằng chủng cường độc viêm gan vịt.
Những đóng góp mới của luận văn:
Là nghiên cứu về sinh học phân tử và giải mã hệ gen virus đầy đủ và chi
tiết nhất của chủng virus cường độc viêm gan vịt thuộc nguồn gen quốc gia.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH VIÊM GAN VỊT
2.1.1. Lịch sử và phân bố bệnh
Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck Virus Hepatitis - DVH) là một bệnh
truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con 1- 6 tuần tuổi, mẫn cảm nhất là vịt con dưới
3 tuần tuổi. Bệnh lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao, có khi lên đến 95 – 100%

toàn đàn. Cách đây hơn chục năm, virus viêm gan vịt được xếp vào chi
Enterovirus trong họ Picornaviridae và việc xếp loại được dựa mối quan hệ về
huyết thanh học, bao gồm 3 serotype khác nhau là DHV-1, DHV-2 và DHV-3.
Trong đó, phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt serotype 1 (DHV-1) (Fabricant,
Levine, 1957 ; Levine et al., 1950; Asplin, 1965; 1970 ; Toth, 1969; Haider,
Calnek, 1979). Virus viêm gan vịt serotype 2 và serotype 3 mới được tìm thấy ở
Anh và Mỹ, gây tỷ lệ chết khơng đáng kể (Woolcock, 2003). Virus viêm gan vịt
serotype 1 còn được gọi chung là virus viêm gan vịt.
Ngày nay, nhờ công nghệ sinh học phân tử, đã xác định virus gây bệnh
viêm gan vịt trên thế giới gồm có 3 genotype khác nhau, bao gồm genotype I
(DHAV-1), genotype II (DHAV-2) và genotype III (DHAV-3). Phổ biến nhất là
virus viêm gan vịt genotype I bao gồm khoảng 60 chủng đã được phân lập từ năm
1950 đến nay, virus viêm gan vịt genotype II chỉ gồm có 2 chủng mới phân lập ở
Đài Loan và virus viêm gan vịt genotype III gồm 15 chủng vừa phân lập ở Trung
Quốc và Hàn Quốc.
Bệnh có biểu hiện đặc trưng: Vịt chết nhanh với tỷ lệ chết rất cao và chết
ở trạng thái đặc biệt đầu ngoẹo về một bên, 2 chân duỗi thẳng. Mổ khám thấy gan
sưng to, xuất huyết lốm đốm trên gan, có điểm hoại tử.
Bệnh viêm gan do virus ở vịt (Duck Hepatitis Virus) được phát hiện lần đầu
tiên vào năm 1945 tại Mỹ trên đàn vịt con một tuần tuổi (Levine, Hofstad, 1945),
nhưng chưa phân lập được mầm bệnh. Mùa xuân năm 1949, Levine và Fabricant
theo dõi một bệnh tương tự trên đàn vịt Bắc Kinh trắng tại Long Island (Mỹ) và có
tới 70 trại vịt lớn mắc bệnh gây thiệt hại nặng nề. Ban đầu ở những trại mắc bệnh
nặng tỷ lệ chết lên tới 95%, thời điểm cuối ổ dịch ở một số trại cịn sót lại khi vịt
mắc bệnh tỷ lệ chết giảm dần chỉ còn 15%. Tổng số vịt chết trong ổ dịch lên tới
75.000 con (Levine và Fabricant, 1950).

3

Hình 2.1. Hình ảnh vịt chết khi
nhiễm virus viêm gan vịt

Hình 2.2. Gan vịt xuất huyết khi
mắc bệnh
(Nguồn: Nanovet)

(Nguồn:www.mekovet.com.vn)

Năm 1950, bằng phương pháp nuôi cấy trên phôi gà, Levine và Fabricant
đã phân lập được virus viêm gan vịt type I (Nguyễn Đức Lưu và Vũ Như Quán,
2002).
Năm 1953, bệnh xảy ra trên các ñàn vịt xảy ra ở các vùng khác của nước
Mỹ. Sau đó bệnh cũng được phát hiện ở nhiều nước trên thế giới: Anh, Canada,
Niderland, Ai Cập và Tây Ban Nha, ở Bỉ. Ở Liên Xô cũ bệnh được xác định trên
lãnh thổ Ucraina và nước cộng hoà Nga. Ở Mỹ, Canada, Anh bệnh viêm gan vịt
con thuộc bệnh truyền nhiễm bắt buộc phải đăng ký như bệnh Newcastle (Nguyễn
Xuân Bình, 1995).
Năm 1956, bệnh tiếp tục được phát hiện ở bang Massachuset, Illinois và
Michigan; sau đó bệnh xảy ra trên khắp cả nước Mỹ.
Năm 1965, ở Norfolk (Anh) hiện tượng bệnh viêm gan vịt vẫn xảy ra trên
những đàn vịt con đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc viêm gan vịt serotype 1.
Năm 1969, ở đảo Long (Mỹ), bệnh viêm gan vịt đã xảy ra trên đàn vịt con
đã được tiêm phòng vắc xin nhược độc typ I (Toth, 1969). Bệnh xảy ra nhẹ hơn so
với bệnh viêm gan vịt của virus typ I, tỉ lệ chết của vịt con hiếm khi vượt quá 30%.
Haider và Calnek đã đặt tên virus này là virus viêm gan vịt typ III và cho đến nay
virus viêm gan vịt typ III mới chỉ được công bố ở Mỹ (Haider và Calnek, 1979).
Ở

Trung Quốc, virus viêm gan vịt lần đầu tiên được phân lập và xác nhận

năm 1982 (Guo, Pan, 1984). Theo các báo cáo gần đây nhất, bệnh viêm gan vịt xảy
ra ở khắp nơi trên thế giới, trong đó có cả Trung Quốc và Triều Tiên (OIE, 2003).

4


2.1.2. Tình hình nghiên cứu bệnh Viêm gan vịt trên thế giới
Có nhiều phương pháp được áp dụng trong nghiên cứu xác định virus viêm
gan vịt (Toth, 1969; Rispens, 1969), đặc biệt là sử dụng phản ứng ngưng kết hồng
cầu (hemagglutination test, HA), phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch và phản
ứng miễn dịch đánh dấu enzyme (Enzyme Linked Immunosorbent Assay –
ELISA). Gần đây, khoa học ngày càng phát triển với nhiều phương pháp mới hiện
đại hơn, chính xác hơn trong nghiên cứu sâu về sinh học phân tử virus Viêm gan
vịt. Phổ biến hơn cả là phương pháp RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase
chain reaction) và PCR cho phép xác định chính xác virus gây bệnh cũng như
nghiên cứu sâu về sinh học phân tử của virus.
Đến nay, bệnh Viêm gan vịt do virus serotype 1 (còn được gọi là virus Viêm
gan vịt) đã phân bố rộng rãi trên khắp thế giới trong đó có Việt Nam.
2.1.2.1 Đường xâm nhập và cách lây lan
Virus Viêm gan vịt lây lan rất nhanh từ con bệnh sang con lành, tỷ lệ nhiễm
bệnh rất cao (100%). Virus xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hố, hơ hấp hoặc
qua vết thương (Levine, Fabricant, 1950). Đường lây nhiễm qua khơng khí của
bệnh Viêm gan vịt giống với bệnh dịch tả vịt và bệnh viêm phế quản truyền nhiễm
ở gà con; có sự xâm nhập của virus qua vùng da bị tổn thương, nhưng ít gặp.
Những vịt chưa bị nhiễm virus, nếu cho chúng sống cùng đàn vịt bệnh, chúng sẽ
mắc bệnh và chết sau đó ít ngày.
Bệnh Viêm gan vịt khơng lây truyền qua đường trứng, vịt con nở ra từ trứng
của vịt mẹ bị nhiễm bệnh vẫn phát triển tốt (Asplin, 1958). Ở những vịt khỏi bệnh,
virus được bài xuất ra ngoài theo phân trong 8 tuần. Các loài chim hoang dã mang

virus viêm gan vịt từ vùng này sang vùng khác theo phương thức cơ học, đây
chính là nguyên nhân gây ra các vụ dịch mới ở nơi xa (Asplin, 1961). Chuột cống
nâu có thể là vật chủ dự trữ virus viêm gan vịt type I. Ở loại động vật này virus
được thu nhận vào cơ thể, tồn tại 35 ngày, sau đó được bài tiết ra bênh ngồi trong
khoảng thời gian 18 – 22 ngày sau khi nhiễm. Trong huyết thanh của chuột có
kháng thể và kháng thể tồn tại 12 – 24 ngày.
Priz, 1973 đã gây bệnh cho vịt con bằng đường gây nhiễm qua khơng khí.
Trong các trường hợp này, virus xâm nhập vào cơ thể qua thanh quản và đường hơ
hấp trên (Priz, 1973). Có thể gây bệnh cho vịt bằng cách cho uống (Asplin, 1958).
Virus viêm gan vịt type II xâm nhập vào cơ thể qua đường tiêu hoá và

5


đường lỗ huyệt. Ở những vịt khỏi bệnh, virus được bài xuất theo phân ít nhất 1
tuần sau khi nhiễm bệnh.
2.1.2.2. Cơ chế gây bệnh
Virus xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc đường tiêu hố, hơ hấp hoặc vết
thương rồi vào máu. Theo máu, virus đến các cơ quan phủ tạng đặc biệt là gan, đây
là cơ quan thích hợp nhất đối với virus. Ở giai đoạn đầu, do tác dụng của virus đã
khiến trao đổi chất ở gan bị rối loạn. Kiểm tra tổ chức học cho thấy lượng
glycogen trong gan giảm mạnh nhưng lượng lipid lại tăng cao do quá trình trao đổi
lipid ở gan mà đặc biệt là trao đổi cholesterol bị ức chế. Vì vậy, vịt con ở thời kỳ
mới nở thiếu năng lượng dẫn đến sức đề kháng của chúng bị giảm sút. Giai đoạn
thứ hai, virus trực tiếp phá hoại tế bào gan, tế bào nội mô huyết quản, gây xuất
huyết đặc trưng. Virus nhân lên trong tế bào gan, nhất là tế bào thuộc hệ võng mạc
nội mô như tế bào Kuffer. Khi kiểm tra cho thấy tổ chức gan bị phá hoại, cơ thể
không được giải độc làm con vật chết do ngộ độc (Bùi Thanh Khiết, 2007).
2.1.2.3. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích
Triệu chứng đầu tiên xuất hiện sau 1-2 giờ mắc bệnh, gây chứng xanh tím

niêm mạc, rối loạn vận động, co giật, vịt chỉ ngồi, sau đó nằm la liệt, nghiêng sườn
và nằm ngửa, chân thẳng dọc theo thân, đầu quặt ngửa lên lưng hoặc ngoẹo sang
bên sườn, vịt con chết ở tư thế này.
Vịt chết do nhiễm virus viêm gan vịt có bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan.
(Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi ấn nhẹ. Trong một số trường hợp gan bị
nhũn có hình thái như gelatin. Bề mặt gan loang lổ do có nhiều điểm xuất huyết,
xuất huyết lan rộng khơng có ranh giới, kích thước và hình dạng to nhỏ khác nhau.
Xuất huyết trên bề mặt gan không phải có ở tất cả vịt chết do bệnh viêm gan virus
(Nguyễn Đức Lưu, Vũ Như Quán, 2002; Nguyễn Văn Cảm và cs., 2001).
Thời kỳ nung bệnh từ 1-5 ngày, đôi khi kéo dài 8 ngày thậm chí 13 ngày.
Thời gian nung bệnh phụ thuộc vào độc lực của virus, liều lượng tiêm và phương
pháp gây bệnh cũng như tình trạng cơ thể.
2.1.2.4. Bệnh tích
* Bệnh tích đại thể
Bệnh tích chủ yếu tập trung ở gan. Gan thường bị sưng, nhũn, dễ bị nát khi
ấn nhẹ. Trong một số trường hợp gan bị nhũn có hình thái như gelatin. Bề

6


mặt loang lổ do có nhiều xuất huyết, kích thước và hình dạng khác nhau. Xuất
huyết lan rộng khơng có ranh giới. Sự xuất huyết gan khơng phải có ở tất cả vịt
chết do bệnh viêm gan virus. Sự xuất huyết ở gan rõ rệt nhất khi nhỏ bệnh phẩm
vào niêm mạc mũi. Khi tiêm vào phúc mạc, các cơ quan khác ít bị tổn thương và
càng ít hơn khi gây ra bệnh qua đường miệng. Trong gan có thể gặp các ổ hoại tử
do bệnh viêm gan bị biến chứng sang bệnh phó thương hàn. Lách có thể sưng, thận
tụ máu (Nguyễn Thát, 1975).
* Bệnh tích vi thể
Những biến đổi vi thể trong viêm gan virus ở vịt con chủ yếu thấy ở gan và
đại não. Trong gan có những đám tế bào bị hoại tử, viêm tăng sinh ống mật và

xung quanh mạch, lúc đầu là những bạch cầu hạt sau đó là tế bào lympho và các
tương bào. Ở một nửa số vịt con thấy các bệnh tích viêm tăng sinh quanh mạch và
viêm tăng sinh mơ thần kinh đệm. Sự tổn thương của tế
bào gan ở vịt con mắc bệnh viêm gan virus giống những tổn thương như ở viêm
gan của người. Bệnh tích trong não vịt chết do viêm gan giống viêm não thể thanh
dịch (Fabricant et al., 1957).
Phôi vịt 10 – 14 ngày tuổi ñược tiêm virus viêm gan vịt type I vào xoang
niệu mô, phôi chết trong khoảng 24 – 72 giờ sau khi tiêm và có biểu hiện xuất
huyết dưới da, gan xuất huyết có nhiều điểm hoại tử.
* Bệnh tích siêu vi thể
Lấy gan làm tiêu bản siêu vi thể kiểm tra dưới kính hiển vi điện tử. Kết quả
là sau 1 giờ có hiện tượng vỡ glycogen trong tế bào gan và quan sát thấy những hạt
có đường kính 100 - 300nm, các tế bào hoại tử sau 12 giờ nhiễm. Các hạt virus
được tìm thấy sau 1 giờ và 18 đến 24 giờ gây bệnh (Adamiker, 1969). Sau khi gây
nhiễm virus vào tế bào lách thì tế bào lách bị biến đổi sau 6 giờ, bị hoại tử sau 24
giờ, thối hóa nhân, tương bào, khơng tìm thấy tiểu thể virus, có những biến đổi
nhẹ trong cơ.
Khơng tìm thấy thể bao hàm trong tế bào gan vịt bệnh, đây là điểm khác đối
với bệnh dịch tả vịt. Vịt bị nhiễm virus viêm gan vịt type II bệnh tích vi thể đặc
trưng ở gan: các tế bào gan bị hoại tử lan tràn, tế bào ống dẫn mật tăng sinh trên
một phạm vi rộng.

7


2.1.3. Tình hình bệnh Viêm gan vịt ở Việt Nam
Tại Việt Nam, năm 1978 đã ghi nhận có bệnh Viêm gan vịt, nhưng chưa
phân lập được virus tại thời điểm đó (Trần Minh Châu và Lê Thu Hồng, 1987).
Năm 1979 - 1983, bệnh xảy ra ở nhiều địa phương làm chết nhiều vịt con (Lê
Thanh Hoà và cs, 1984). Năm 1985, Trần Minh Châu và cộng sự đã phân lập được

một chủng virus Viêm gan vịt cường độc ở một trại vịt ở Phú Xuyên - Hà Sơn
Bình cũ. Qua nuôi cấy trên phôi gà, chủng virus này yếu đi, không gây bệnh cho
vịt con mà tạo được đề kháng cho vịt con.
Qua điều tra cho biết từ tháng 1 đến tháng 6 năm 2001 khi điều tra 20 ổ
dịch tại các địa phương: Hưng Yên, Hà Tây, Hà Nam, Hà Nội, Tun Quang kết
luận đó chính là bệnh viêm gan vịt do virus với tỷ lệ nhiễm trong đàn lên tới
100%, lứa tuổi mắc bệnh từ 1 - 21 ngày tuổi, tỷ lệ chết từ 48,57 - 90% (Nguyễn
Văn Cảm và cs 2001). Theo một số nghiên cứu đã công bố, bệnh Viêm gan vịt cho
đến nay vẫn xảy ra ở nước ta, gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi vịt (Nguyễn
Văn Cảm và cs 2001). Đặc biệt, gần đây nhiều giống vịt, ngan cao sản nhập vào
nước ta chưa thích ứng được với điều kiện mơi trường nên bệnh viêm gan vịt càng
xảy ra nhiều hơn, nhất là ở các địa phương là Hà Tây, Hà Nam, Thái Bình và các
tỉnh đồng bằng sơng Cửu Long gây tổn thất rất lớn (Nguyễn Hữu Vũ và cs., 2001;
Nguyễn Đức Lưu và cs., 2002).
Từ cuối năm 2003, đầu năm 2004, khi bệnh cúm gia cầm bùng phát, gây
thiệt hại nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi gia cầm cũng như ảnh hưởng đến sức
khỏe con người khiến bệnh viêm gan vịt cũng như một số bệnh khác của gia cầm ít
được quan tâm chú ý nhiều như trước. Tuy nhiên, trên thực tế bệnh viêm gan vịt
vẫn tồn tại và có nhiều biến đổi phức tạp. Trong những năm gần đây, đặc biệt là từ
năm 2006 - 2007 đến nay, trên thế giới đặc biệt đi sâu nghiên cứu về sinh học phân
tử virus viêm gan vịt và đã đồng loạt đưa ra nhiều công bố khẳng định sự biến đổi
mạnh mẽ và khác nhau trong quần thể và hệ gen của virus, đến mức tạo ra một chi
mới và các genotype mới trong họ Picornaviridae. Tuy nhiên, các loại vắc xin
phòng bệnh viêm gan vịt cho đến nay đều thuộc một loại genotype (DHAV-1). Do
đó, việc sản xuất vắc xin từ chủng virus viêm gan vịt thuộc genotype mới là rất cần
thiết.
Trong các năm gần đây, các cơng trình nghiên cứu về virus viêm gan vịt ở
Việt Nam không có nhiều và các nghiên cứu này chỉ đi sâu vào nghiên cứu bệnh

8

tích đại thể, vi thể của virus gây bệnh, các đặc tính sinh học của virus nhược độc
(Trần Thị Lan Hương, 2007; Nguyễn Bá Hiên, 2007) và một số nghiên cứu về sinh
học phân tử, giải mã hệ gen.
2.2. VIRUS VIÊM GAN VỊT
2.2.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo của virus viêm gan vịt
Bệnh viêm gan vịt do virus (Duck hepatitis virus - DHV) là một bệnh
truyền nhiễm cấp tính xảy ra ở vịt con. Bệnh lây lan nhanh và gây tỷ lệ chết rất
cao, virus gây bệnh viêm gan vịt là một loại ARN virus thuộc họ Picornaviridae,
có 3 type virus gây bệnh khác nhau, bao gồm type I (DHV-1), type II (DHV-2) và
type III (DHV-3), phổ biến hơn cả là virus viêm gan vịt type I (Fabricant and
Levine, 2002). Đây là một Picornavirus nên có hình thái giống với hình thái chung.
Là loại virus có kích thước nhỏ, khoảng 20 - 30nm, khơng có vỏ bọc ngồi, có 32
capxome, hệ gen chứa axit ribonucleic (ARN), sợi đơn dương, có độ dài khoảng
7.690 nucleotide, ở đầu cuối 3’có thêm đuôi poly (A) dài khoảng 18 nucleotide.
Hiện nay, họ Picornaviridae gồm có 23 loại virus và được nhóm vào 9 chi, đó là
Enterovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphthovirus, Hepatovirus, Parechovirus,
Erbovirus, Kobuvirus và Teschovirus (Stanway và cs, 2005). Ngồi ra, đã có giả
thuyết nên nhóm 3 loại virus là Porcine Enterovirus 8 (PEV-8), Simianvirus2 (SV2) và Duck Picornavirus (DPV) để xếp chung vào một chi mới và dự kiến đặt tên
nhóm là “Sapelovirus” (Krumbholz et al., 2002).
2.2.2. Cấu trúc hệ gen Picornavirus
Trong họ Picornaviridae, tất cả virus đều bị thiếu cấu trúc mũ ở đầu 5’ mà
thay vào đó là là một protein nhỏ (khoảng 23 amino acid) gọi là VPg (virion
protein genome-link). VPg này liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ thông qua một gốc
tyrosine. Ở cả hai đầu của hệ gen picornavirus đều có vùng khơng dịch mã (UTR).
Vùng 5’UTR dài hơn, có độ dài khoảng 600 – 1200 bp, trong khi vùng 3’UTR có
độ dài chỉ từ 50 – 100 bp. Vùng 5’UTR có vai trị quan trọng đối với q trình sao
mã và vùng 3’UTR có vai trị trong q trình tổng hợp sợi âm. Tuy nhiên đầu 5’
cũng có thể có vai trị trong việc làm tăng cường độc lực của virus

( Trong hệ gen của picorna-virus có
một vùng nucleotide làm điểm khởi đầu để ribosome dịch mã, gọi là IRES –
Internal Ribosome Entry Site, đó là một cấu trúc di truyền hoạt động phức tạp
dạng cis với cấu trúc bổ sung thứ cấp khởi động cho q trình dịch mã khơng phụ

9


thuộc điểm mũ của hệ gen virus. Nằm giữa hai vùng 5’, 3’ là một khung đọc mở
lớn, mã hoá cho một chuỗi polypeptide chung, có chiều dài khoảng 2100 – 2400
amino acid chứa các protein cấu trúc và protein không cấu trúc. Giống như mRNA
ở tế bào nhân chuẩn, đầu cuối 3’ của virus có gắn thêm đi poly A, dài khoảng 18
nucleotide.

Hình 2.1. Hình ảnh Poliovirus, RNA virus thuộc họ Picornaviridae
Nguồn:

Trong chuỗi polypeptide, phần protein đầu tiên là protein dẫn, ký hiệu là L
(Leader protein), tiếp theo là 4 loại protein cấu trúc bao gồm VP4 (1A), VP2 (1B),
VP3 (1C) và VP1 (1D). Đoạn cuối cùng gồm 7 protein không cấu trúc là protein
2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C và 3D. Tuy nhiên, ở giữa các chi khác nhau thì trật tự này
sẽ có sự thay đổi nhỏ. Chuỗi polypeptid chung của picornavirus thường bị phân
giải bởi một, hai hoặc ba trong số ba enzyme protease là 3Cpro, 2Apro và Lpro
thành 10, 11 hoặc 12 chuỗi polypeptide (thành 10 chuỗi polypeptide đối với
Kobuvirus và Parechovirus, hoặc thành 12 chuỗi polypeptide đối với Aphthovirus,
Cardiovirus, Erbovirus, Tescho virus - Krumbholz et al., 2002). Số lượng chuỗi
protein được tạo thành phụ thuộc vào rất nhiều các yếu tố như sự có mặt hay vắng
mặt protein L; số lượng protein 2A và sự phân cắt hay không phân cắt VP0 thành
VP4 và VP2. Phần lớn ở các virus trong họ Picornaviridae, VP0 là một protein
được myristyl hoá, tức là được gắn thêm acid béo bão hòa gồm 14 cacbon tại vị trí

Glycine theo quy lụât (GxxxS/T) thơng qua mối liên kết amid, từ đó VP0 có thể tự
phân tách thành protein VP4 và VP2. Hầu hết những virus trong họ Picornaviridae
đều có một protein 2A, riêng Ljunganvirus có thể có 2 loại protein 2A (Jonhansson
et al., 2003).

10


Hình 2.2: Cấu trúc khơng gian của picorrnavirus
Các protein VP1, VP2 và VP3 nằm ngay trên bề mặt vỏ kháng nguyên; còn
protein VP4 lặn sâu vào bên trong (Nguồn: Swiss Institute of Bioinformatics,
2008).
2.2.3. Quá trình nhân lên của virus
Virus nhân lên trong tế bào chất. Đầu tiên, virus gắn vào thụ thể nằm trên
màng sinh chất của tế bào chủ, sau đó theo cơ chế nhập bào và tiến hành quá trình
“cởi áo” virus trong endosome hoặc lysosome.
Sau khi được giải phóng khỏi capsid, RNA hệ gen của virus được dịch mã,
sản suất các protein của virus; tiếp theo đó, các phức hợp sao chép của virus được
tập hợp; RNA virus được nhân lên và hệ gen RNA mới sau tổng hợp sẽ được bao
gói tạo thành các thế hệ virus con cháu (Barton, Flanegan, 1995; Molla et al.,
1991).
Trước tiên, RNA ngay lập tức khởi động quá trình dịch mã ở vị trí gần đầu
5’ để tạo thành một polyprotein – tiền thân của các protein chức năng của virus.
Polyprotein này ban đầu được phân cắt thành 3 protein tiền chất là P1, P2 và P3.
Tiếp theo đó, mỗi protein lại tiếp tục tiến hành phân cắt để tạo ra các sản phẩm
protein đặc hiệu có chức năng.
-

P1 được cắt ra tạo thành VP0, VP1 và VP3. Đó là các protein capsid.

P2 được cắt ra tạo thành 2A, P2B – là các kháng nguyên của vật chủ và
2C tham gia vào quá trình tổng hợp RNA.
-

P3 tiến hành tự cắt thành 3A, 3B (VPg), 3C (một protease dùng để phân

cắt hầu hết các protein) và 3D (RNA polymerase làm nhiệm vụ kéo dài chuỗi RNA
mới tổng hợp trên khuôn RNA).

11


Để lắp ráp, trước hết virus phân cắt P1 tạo thành một đơn phân gốc
(protome) 5S chưa hoàn thiện chứa VP0, VP1 và VP3. Các protome này sẽ liên kết
với genome RNA để tạo thành tiền virion (provirion). Trong quá trình hồn thiện,
phần lớn hoặc tất cả các phân tử VP0 đều bị phân cắt tạo thành VP2 và VP4. Sau
lắp ráp, virion trưởng thành thoát ra khỏi tế bào nhờ sự tan bào (cell lysis). Một số
picornavirus, ví dụ virus viêm gan A (Hepatitis A Virus, HAV) có thể gây nhiễm
nhưng không gây ra sự tan bào.
Đồng thời với quá trình dịch mã để tổng hợp các protein, RNA của hệ
gen virus cũng được nhân lên để tạo thành vật liệu di truyền cho các hạt virus mới.
Các virus thuộc nhóm picornavirus đều có chung một cơ chế sao chép, tuy nhiên,
chỉ có Poliovirus – một virus gây bệnh bại liệt trên người, là được nghiên cứu kỹ
nhất cho đến nay.
Hệ gen RNA của picornavirus là các RNA thông tin, chúng có chức năng
như là các khn mẫu cho quá trình sao chép RNA của virus. Các RNA sợi dương
– hệ gen của picornavirus nhân lên thông qua các RNA sợi âm trung gian được
tổng hợp ngay bên trong các phức hợp sao chép gắn trên màng lipid trong bào
tương của các tế bào nhân thật của vật chủ. Điều đặc biệt là trong quá trình nhân
lên của các picornavirus, có sự bất đối xứng giữa số lượng RNA sợi âm trung gian

và RNA sợi dương – hệ gen của virus được tổng hợp trong các phức hợp sao chép
của virus. Nhiều cơng trình nghiên cứu đã cho thấy, có rất nhiều yếu tố liên quan
đến q trình sao chép RNA, trong đó, đặc biệt đã phát hiện các phân đoạn RNA
hoạt hóa có cấu trúc khơng gian dạng cis, gọi tắt là cis-RNA hoạt hóa (CREs – cis
active RNA elements), nằm trong hệ gen của các picornavirus. Sự góp mặt của các
tiểu phần cis-RNA hoạt hóa tham gia vào sự ổn định của các RNA thông tin cũng
như q trình dịch mã RNA thơng tin của virus. Các trình tự cis-RNA (CREs) này
tương tác mạnh mẽ với các protein sao chép của virus, gián tiếp tác động lên sự
sao chép RNA của virus (Steil, Barton, 2009). Có 4 loại CREs, mà một trong số đó
có vai trị trong việc chuyển hoá VPg thành VPgpUpUOH (dạng uridyl hoá của
VPg) (Richards et al., 2006). Hai loại protein này có vai trị vơ cùng quan trọng,
làm mồi cho q trình sao chép RNA. Trong đó, VPg khởi động cho q trình tổng
hợp RNA sợi âm, và VPgpUpUOH khởi động cho quá trình tổng hợp RNA sợi
dương. Sự tổng hợp bất đối xứng giữa số lượng RNA sợi âm và RNA sợi dương
trong quá trình nhân lên của virus, là do sự quyết định về số lượng bản sao RNA
của các mồi VPg và VPgUpUOH.

12


Mỗi RNA sợi dương của virus đều được sao chép thành một RNA sợi âm bổ sung
và sau đó RNA sợi âm được sao chép thành 40 đến 70 phân tử RNA sợi dương thế
hệ con cháu. Một phân tử VPg có một liên kết đồng hóa trị gắn với đầu tận 5’ của
mỗi phân tử RNA cả sợi dương và sợi âm (Pettersson et al., 1978). Bên cạnh đó,
có hàng trăm phân tử VPgpUpUOH được tích hợp với mỗi phân tử RNA sợi âm
trung gian (Lyons et al., 2001). Do đó, mỗi phức hợp sao chép RNA của màng tế
bào có sự tích lũy nhiều bản sao tiền VPg trước khi bắt đầu quá trình sao chép
(Novak, Kirkegaard, 1991).
Cuối cùng, các RNA sợi dương – hệ gen virus được kết hợp với các protein
và bao gói thành các hạt virus mới, phá vỡ tế bào (tan bào), thoát ra ngồi tiếp tục

xâm nhiễm trên các tế bào thích ứng của vật chủ, khởi động một chu trình mới,
giúp cho virus tồn tại và gây ra bệnh lí trên vật chủ của chúng.
2.2.4. Đặc tính ni cấy
Virus viêm gan vịt là loại kí sinh nội bào tuyệt đối (Nguyễn Đường, 1990).
Để gây bệnh, cần sử dụng huyễn dịch các cơ quan của vịt con chết do bệnh viêm
gan vịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lí bằng kháng sinh. Có thể cấy chuyển virus
viêm gan vịt trên động vật cảm thụ, trên phôi trứng và trên môi trường tế bào.
2.2.4.1. Ni cấy trên phơi trứng
Virus viêm gan vịt có thể phát triển được trên cả phôi gà và phôi vịt. Để gây
bệnh, người ta dùng huyễn dịch các cơ quan của vịt con đã chết do bệnh viêm gan
vịt (gan, phổi, thận…) đã được xử lý bằng kháng sinh rồi gây bệnh chủ yếu vào
màng nhung niệu. Tiêm bệnh phẩm vào màng nhung niệu, vào túi nỗn hồng
cũng có hiệu quả như tiêm vào niệu nang (Reuss U, 1959).
- Trên phôi vịt:
Tiêm virus viêm gan vịt vào xoang niệu mô của phôi vịt 10 - 14 ngày tuổi,
24 - 72 giờ sau khi gây nhiễm phơi chết với bệnh tích: phơi cịi cọc, xuất huyết
dưới da đặc biệt ở vùng đầu, bụng, chân, phơi phù, gan sưng có màu đỏ hoặc hơi
vàng, có thể có điểm hoại tử. Ở những phơi chết muộn nước xoang niệu mơ có mà
xanh nhạt, bệnh tích rõ hơn. Ở phơi vịt bị nhiễm virus viêm gan thường thấy nước
ối có màu xanh và gan bị xanh - đen, những bệnh tích này ít thấy ở phôi gà
(Nguyễn Đức Lưu và cs, 2001).

13