Đồ án tốt nghiệp: Phân lập, định danh, chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay

tên đề tài.txt
Phân lập định danh chọn lọc chủng nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế
giai đoạn lên men chao truyền thống hiện nay
Giảng viên hướng dẫn: TS. Hoàng Quốc Khánh
Lớp: 13DSH06
MSSV: 1311100548

Page 1


LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này
là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, dưới sự hướng
dẫn của TS.Hoàng Quốc Khánh, HVCH.Ngô Đức Duy. Các số liệu và kết quả nghiên
cứu trong đồ án này là trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được
công bố trước đây. Mọi sự tham khảo sử dụng trong đồ án đều được trích dẫn các
nguồn tài liệu trong báo cáo và tài liệu tham khảo.
Mọi sao chép không hợp lệ, không trung thực và vi phạm quy chế nhà trường,
người thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công Nghệ Sinh Học
– Thực Phẩm – Môi Trường, trước ban giám hiệu trường Đại Học Công Nghệ
TP.HCM.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 7 năm 2017
Sinh viên thực hiện
Như

Trương Bích Như


LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành khóa luận này, em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp
đỡ, đóng góp ý kiến và chỉ bảo nhiệt tình của các thầy cơ, gia đình và bạn bè. Em xin

gửi lời cảm ơn chân thành của mình đến:
Các thầy cơ bộ môn trong khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi
Trường cùng các thầy cô trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, đã trực tiếp giảng dạy
và truyền đạt kiến thức cho em khi còn học ở trường, giúp em có được cơ sở lý thuyết
vững vàng và tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập .
Thầy Ngơ Đức Duy, phịng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM, một
người thầy ln tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên em trong suốt quá trình thực
hiện đồ án.
Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Nguyễn Hoàng Dũng, phòng Vi Sinh, Viện
Sinh Học Nhiệt Đới TP.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện để em hoàn thành tốt đồ án
tốt nghiệp.
Chị Lê Quỳnh Loan đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẽ kiến thức, kinh nghiệm
và tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi Sinh, Viện Sinh Học Nhiệt
Đới TP.HCM đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho em nhiều điều trong suốt quá trình
nghiên cứu.
Các bạn lớp 13DSH06, trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM đã sát cánh bên
em trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học .
Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng chăm sóc và tạo mọi điều kiện
cho con ăn học thành người có ích cho xã hội.
Trương Bích Như


Đồ Án Tốt Nghiệp

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ..............................................................................iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................. v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .............................................................................................vi
MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1

1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

2.

Tình hình nghiên cứu .......................................................................................... 1

3.

Mục đích nghiên cứu .......................................................................................... 3

4.

Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................... 3

5.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 3

6.

Các kết quả đạt được của đề tài .......................................................................... 3

7.

Kết cấu của đồ án tốt nghiệp .............................................................................. 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....................................................................... 5
1.1

Cây đậu nành ...................................................................................................... 5

1.1.1

Nguồn gốc .................................................................................................... 5

1.1.2

Gía trị kinh tế của cây đậu nành .................................................................. 6

1.1.3

Thành phần hóa học trong hạt đậu nành [8]. ............................................... 8

1.2

Tổng quan về đậu phụ ...................................................................................... 11

1.3

Tổng quan về chao [8] ...................................................................................... 11

1.4

Nấm mốc thường gặp trong chao ..................................................................... 12

1.5

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ............................................... 13

1.5.1

Các phương pháp ly trích DNA ................................................................. 13

1.5.2

PCR trong định danh vi sinh vật ................................................................ 14

1.5.3

Xây dựng cây phát sinh loài ...................................................................... 16

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 18
i


Đồ Án Tốt Nghiệp

2.1

Thời gian và địa điểm ....................................................................................... 18

2.2

Vật liệu, thiết bị và hóa chất ............................................................................. 18

2.2.1

Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................... 18

2.2.2

Nguồn mẫu ................................................................................................. 18

2.2.3

Hóa chất ..................................................................................................... 19

2.3

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 20

2.3.1

Phân lập chủng nấm ................................................................................... 20

2.3.2

Phương pháp phòng ẩm ............................................................................. 21

2.3.3

Định danh bằng sinh học phân tử .............................................................. 21

2.3.4

Khảo sát khả năng sinh enzym protease .................................................... 26

2.3.5

Khảo sát khả năng sinh enzyme lipase ...................................................... 26

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 28
3.1

Kết quả đặc điểm hình thái khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử ............................... 28

3.2

Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS ................................................. 35

3.2.1

Kết quả ly trích thu nhận bộ gen DNA ...................................................... 36

3.2.2

Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS của nấm mốc ............................. 36

3.3 Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng CM1, CDN và CSG và thiết lập
cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI ........................................... 37
3.3.1

Trình tự vùng gen ITS của các chủng CM1, CDN VÀ CSG .................... 37

3.3.2

Thiết lập cây phát sinh loài ........................................................................ 38

3.3.3

Kết quả khảo sát protease .......................................................................... 40

3.3.4

Kết quả khảo sát lipase .............................................................................. 41

3.3.5

Khả năng lên men chao của 3 chủng nấm CM1,CDN và CSG ................. 42

CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................ 44
4.1

Kết luận............................................................................................................. 44

4.2

Kiến nghị .......................................................................................................... 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 46

ii


Đồ Án Tốt Nghiệp

PHỤ LỤC ........................................................................................................................ 1
PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường ......................................................................... 1

PHỤ LỤC B: Kết quả cấy phân lập nấm ban đầu ....................................................... 2
PHỤ LỤC C: Kết quả vùng gen bảo tồn ITS ............................................................... 3
PHỤ LỤC D: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI ................ 6

iii


Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

EDTA

Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid

ITS

Internal transcribed spacer

PCR

Polymerase Chain Reation

PDA

Potato Dextrose Agar

PDB

Potato Dextrose Broth

TAE

Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae

LB

Luria – Bertani

dNTP

Deoxy Nucleotide Triphosphate

iv


Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành ................................................................. 8
Bảng 1.2 Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ....................................... 9
Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành .................................................... 9
Bảng 1.4 Thành phần khoáng trong đậu nành .............................................................. 10

Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành.............................................................. 10
Bảng 1.6 Thành phần hóa học của chao ....................................................................... 11
Bảng 2.1 Danh sách các mẫu chao được thu tại TP.HCM, Long An và Đồng Nai ..... 18
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR ......................................................................... 25

v


Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Sơ đồ của các gen ribosome nằm trong vùng gen ITS .................................. 16
Hình 3.1 Khuẩn lạc, tế bào của chủng CTP trên mơi trường PDA trong 72 giờ ......... 28
Hình 3.2 Chủng CM2 trên mơi trường PDA ở nhiệt độ phịng trong 72 giờ ............... 29
Hình 3.3 Chủng CVP2 trên mơi trường PDA ở nhiệt độ phịng ở 72 giờ ................... 30
Hình 3.4 Chủng CVP1 trên môi trường PDA ở nhiệt độ phịng trong 72 giờ ............. 31
Hình 3.5 Mẫu CM1 trên mơi trường PDA ở nhiệt độ phịng trong 72 giờ. ................. 32
Hình 3.6 Mẫu CDN trên mơi trường PDA ở nhiệt độ phịng trong 72 giờ .................. 33
Hình 3.7 Mẫu CSG trên mơi trường PDA ở nhiệt độ phịng trong 48 giờ ................... 34
Hình 3.8 Kết quả ly trích bộ gen DNA của 3 chủng CM1,CDN và CSG trên gel
agarose 1,5%. ................................................................................................................ 36
Hình 3.9 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng CM1, CDN và CSG trên gel
agarose 1,5% ................ ................................................................................................ 37
Hình 3.10 Cây phát sinh lồi dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng CM1,
CDN và SGN với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI ....................................... 40
Hình 3.11 Khả năng sinh caseinase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG ............... 41
Hình 3.12 Kết quả sinh enzyme lipase của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG ........... 42
Hình 3.13 Khảo sát khả năng lên mốc chao của 3 chủng nấm CM1, CDN và CSG ... 42

vi

Đồ Án Tốt Nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày nay nhu cầu thực phẩm của con người ngày càng tăng cao, không chỉ
dừng lại việc ăn ngon mà thực phẩm phải an tồn và có giá trị dinh dưỡng. Do vậy tìm
ra các phương pháp sản xuất thực phẩm an tồn và có giá trị dinh dưỡng cao là vấn đề
thiết yếu hiện nay.
Chao truyền thống có vai trò khá quan trọng trong đời sống tâm linh của người
dân Việt Nam. Sản phẩm chao hiện nay sản xuất theo lối thủ công và chất lượng của
sản phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố khách quan và chủ quan trong q trình sản xuất
trong đó đáng kể nhất là chủng nấm mốc.
Chao là sản phẩm được dùng phổ biến như gia vị trong bữa ăn. Chao bổ sung
thêm phần protein và các acid amine quan trọng, cung cấp đáng kể nguồn năng lượng,
khoáng và vitamin,…trong bữa ăn của người dân Châu Á nói chung và người dân Việt
Nam nói riêng. Tuy nhiên ở Việt Nam các cơ sở sản xuất chao hiện nay chủ yếu sử
dụng mốc chao tự nhiên, thời gian bảo quản và chất lượng sản phẩm khó kiểm sốt và
khơng ổn định, làm khả năng nhiễm vi sinh vật và nguy cơ hư hỏng cao làm thay đổi
giá trị dinh dưỡng và hương vị sản phẩm, thậm chí nhiễm cả nấm mốc gây độc như
Aspergillus Flavus và Aspergillus Parasiticus sinh ra độc tố aflatoxin có thể gây ung
thư cho người dùng[4].
Để có thể chọn được chủng nấm thích hợp hạn chế được hư hỏng nhanh của
chao và tăng hương vị chao. Chính vì vậy việc: “ phân lập định danh, chọn lọc chủng
nấm và ứng dụng sản xuất chao nhằm thay thế giai đoạn lên men chao truyền thống
hiện nay ” góp phần đưa chao đến gần với người tiêu dùng hơn cũng như nâng cao chất
lượng và hương vị sản phẩm.
2. Tình hình nghiên cứu
Một số cơng trình nghiên cứu về các chủng nấm mốc ứng dụng sản xuất chao đã

được công bố. Năm 1929, Wai là người đầu tiên đã phân lập một loại mốc thuộc dòng
1


Đồ Án Tốt Nghiệp

Mucor và đặt tên là Mucor sufu (mốc chao)[17]. Năm 2011, Nguyễn Văn Thành và
Trần Nguyễn Ngọc Quỳnh đã nghiên cứu về sản xuất tối ưu bột bào tử nấm
Actinomucor elegans để ứng dụng vào quy trình sản xuất chao. Kết quả cho thấy mật
độ bào tử nấm đạt cao nhất (1010 bào tử /g cơ chất khô) với nghiệm thức 17 sử dụng cơ
chất tấm cám (2:1), chủng 105 bào tử/ gck thu hoạch sau 7 ngày ủ 300C. Sau 5 tháng
bảo quản mật độ bào tử duy trì sức sống cao ở nhiệt độ 40C (trong tủ lạnh). Trong khi
đó các nghiệm thức trong phịng hoặc trong bình hút ẩm 250C duy trì sức sống thấp
hơn và tương đương nhau [11].
Năm 2012, Lê Minh Nguyệt và Phan Thị Phương Thảo đã tiến hành xác định
được các điều kiện ni cấy thích hợp cho sự tạo thành bào tử và sinh tổng hợp
enzyme protease của nấm mốc Mucor elegans để xây dựng quy trình sản xuất giống
khởi động từ loại nấm mốc này phục vụ cho sản xuất chao. Kết quả cho thấy đã xác
định được loại nguyên liệu thích hợp là bột đậu tương, tỷ lệ phối trộn với gạo là
50/50.[10]
Wang và Hesseltine (1975) sản xuất lượng lớn bào tử Rhizopus oligosporus trên
cơ chất tấm gạo và lúa mì kết quả cho thấy đạt sản lượng 109 bào tử/gck dùng sản xuất
tempeh, và khi trữ ở 40C thì có thể bảo quản được trong 6 tháng [38].
Thanh và Nout (2004) đã xác định số lượng bào tử tổng số, số bào tử nấm mốc
Rhizopus oligosporus sống bằng phương pháp đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu.
Xác định số lượng bào tử sống, chết và miên trạng bằng phương pháp nhuộm huỳnh
quang mẫu trước và sau xử lý [36].
Thanh và Nout (2002) đã nghiên cứu bảo quản bào tử của Rhizopus oligosporus
khả năng sống của bào tử đã giảm đi nhiều sau 1 tháng bảo quản ở 250C cũng như 50C
và tiếp tục giảm ít đi sau đó [37].

Shambuyi et al. (1992) đã nghiên cứu bảo quản bào tử nấm mốc cho kết quả sức
sống bào tử vẫn duy trì ở mức cao sau 30 tuần bảo quản ở 50C, 250C và 370C nhưng tốt
nhất ở 50C [35].
2


Đồ Án Tốt Nghiệp

3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập định danh chủng nấm mốc.
Chọn lọc chủng nấm ứng dụng sản xuất thay thế lên men tự nhiên tránh sự tránh
sự tạp nhiễm gây hư hỏng chao.
Mục đích của đề tài là xác định được chủng nấm trên sản phẩm chao, sau khi
xác định được chủng nấm mốc, sẽ dựa vào đặc điểm và những nghiên cứu về nấm mốc
trên chao để xây dựng quy trình lên men đạt chất lượng cao nhất.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
Phân lập và làm thuần chủng nấm từ các mẫu chao.
Quan sát hình thái học ( khuẩn lạc, khuẩn ty và bào tử).
Định danh bằng sinh học phân tử.
Khảo sát khả năng sinh protease, lipase.
Khảo sát khả năng lên men trên đậu hủ.
5. Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp phân lập và làm thuần chủng nấm.
Phương pháp phòng ẩm (xem khuẩn ty và bào tử).
Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB).
Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1F và ITS4R.
Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (Chromaspro 1.5.0.0, MEGA5
5.0.1.120, seview4 4.32.0.0).
Phương pháp thử hoạt tính protease, lipase(trên môi trường đĩa thạch).
6. Các kết quả đạt được của đề tài

Qua kết quả nghiên cứu, đề tài đã đạt được các kết quả như sau:
Kết quả phân lập và làm thuần chủng nấm trên các sản phẩm chao.
Kết quả thu nhận được bộ gen DNA.
Kết quả nhân bản được vùng gen ITS bằng phương pháp PCR.
Kết quả có hoạt tính protease, phân giải protein tạo vịng trong suốt.

3


Đồ Án Tốt Nghiệp

Kết quả lên mốc tốt.
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Nội dung của đồ án tốt nghiệp này gồm có 4 chương:
Chương I: Tổng quan tài liệu giới thiệu chi tiết về cây và hạt đậu nành, thành
phần hóa học trong hạt đậu nành, giới thiệu về đậu nành, chao và các chủng nấm
mốc thường có trong chao, một số nghiên cứu các chủng nấm mốc ứng dụng sản
xuất các sản phẩm chao truyền thống.
Chương II: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (bao gồm các nguyên vật
liệu và phương pháp nghiên cứu sử dụng trong đề tài).
Chương III: Kết quả và biện luận đưa ra kết quả các thí nghiệm tiến hành
trong đề tài và phân tích các số liệu cụ thể.
Chương IV: Kết luận và kiến nghị đưa ra các kết luận thí nghiệm trong đề tài
đã đạt được và những vấn đề cần phải làm tiếp trong thời gian tới.

4


Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cây đậu nành
1.1.1 Nguồn gốc
Đậu nành hay còn gọi là đậu tương, là một trong những loại cây trồng có lịch sử
sử dụng và trồng trọt từ lâu đời.
Đậu nành thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm
Papilionoideae và Phaseoleae. Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L) Merr.
Là loại cây trồng quan trọng bậc nhất trên thế giới đứng hàng thứ tư sau lúa mì,
lúa nước và ngơ.
Dựa vào sự đa dạng về hình thái, Fukuda (1993) và về sau nhiều nhà khoa học
khác, cũng đã thống nhất rằng, đậu nành có nguồn gốc từ Mãn Châu (Trung Quốc). Từ
Trung Quốc, đậu nành đã lan truyền khắp thế giới. Theo các nhà nghiên cứu Nhật Bản
vào khoảng 200 năm trước công nguyên, đậu nành đã được đưa vào Triều Tiên và sau
đó được chuyển sang Nhật. Đến giữa thế kỷ XVII, đậu nành mới được nhà thực vật học
người Đức Engelbert Caempfer đưa về châu âu và đến năm 1954 đậu nành mới du
nhập vào Mỹ.
Một số tài liệu cho rằng đậu nành được đưa vào nước ta từ thời vua Hùng và xác
định rằng nhân dân ta trồng cây đậu nành trước cây đậu xanh và đậu đen [5]. Mặc dù
được trồng từ rất sớm nhưng chỉ trong vài chục năm gần đây cây mới được quan tâm,
phát triển và ngày nay nó được xem là giống cây trồng có giá trị dinh dưỡng cao,
chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế. Nhưng diện tích trồng và sản lượng vẫn
cịn thấp so với các nước trên thế giới, hiện nay nước ta còn phải nhập khẩu đậu tương
từ Mỹ, Trung Quốc và một số quốc gia khác.
Các nước trồng đậu nành đứng hàng đầu trên thế giới về diện tích gieo trồng và
sản lượng là: Mỹ, Braxin và Trung Quốc.

5


Đồ Án Tốt Nghiệp

Ở nước ta đậu nành được trồng tập trung ở các tỉnh miền núi và trung du: Sơn
La, Cao Bằng,..
1.1.2 Gía trị kinh tế của cây đậu nành
1.1.2.1 Gía trị về mặt thực phẩm
Hạt đậu tương có thành phần dinh dưỡng cao, hàm lượng protein trung bình
khoảng từ (35,5 - 40%). Trong khi đó hàm lượng protein trong gạo chỉ (6,2 - 12%), ngô
(9,8 - 13,2%), thịt bò (21%), thịt gà (20%), cá (17 - 20%) và trứng (13 - 14,8%), lipit từ
(15 - 20%), hydratcacbon từ (15-16%) và nhiều loại sinh tố và muối khoáng quan trọng
cho sự sống [14]. Protein của đậu tương có phẩm chất tốt nhất trong số các protein có
nguồn gốc thực vật. Hàm lượng protein trong hạt đậu tương cao hơn cả hàm lượng
prơtein có trong cá, thịt và cao gấp 2 lần so với các loại đậu đỗ khác.
Hàm lượng axit quan trọng có chứa lưu huỳnh như methionin và sixtin của đậu
tương cao gần bằng hàm lượng các chất này có trong trứng gà. Hàm lượng cazein, đặc
biệt lisin cao gần gấp rưỡi lần chất này có trong trứng. Vì thế mà khi nói về giá trị của
protein trong hạt đậu tương là nói đến hàm lượng protein cao và sự cân đối của các loại
axit amin cần thiết. Protein của đậu tương dễ tiêu hoá hơn thịt và khơng có các thành
phần tạo colesteron. Ngày nay người ta mới biết thêm hạt đậu tương có chứa lexithin,
có tác dụng làm cho cơ thể trẻ lâu, tăng thêm trí nhớ, tái tạo các mô, làm cứng xương
và tăng sức đề kháng của cơ thể. Hạt đậu tương có chứa hàm lượng dầu béo cao hơn
các loại đậu đỗ khác nên được coi là cây cung cấp dầu thực vật quan trọng. Lipit của
đậu tương chứa một tỉ lệ cao các axít béo chưa no (khoảng 60-70%) có hệ số đồng hoá
cao, mùi vị thơm như axit linoleic chiếm (52-65%), oleic từ (25-36%), linolenolic
khoảng (2-3%) [1]. Dùng dầu đậu tương thay mỡ động vật có thể tránh được xơ mỡ
động mạch. Trong hạt đậu tương có khá nhiều loại vitamin, đặc biệt là hàm lượng
vitamin B1 và B2 ngoài ra cịn có các loại vitamin PP, A, E, K, D, C, .... Đặc biệt trong
hạt đậu tương đang nảy mầm hàm lượng vitamin tăng lên nhiều, đặc biệt là vitamin C.
Phân tích thành phần sinh hố cho thấy trong hạt đậu tương đang nảy mầm, ngoài hàm
6

Đồ Án Tốt Nghiệp

lượng vitamin C cao, cịn có các thành phần khác như: vitamin PP, và nhiều chất
khoáng khác như Ca, P, Fe ...Chính vì thành phần dinh dưỡng cao như vậy nên đậu
tương có khả năng cung cấp năng lượng khá cao khoảng 4700 cal/kg [3]. Hiện nay, từ
hạt đậu tương người ta đã chế biến ra được trên 600 sản phẩm khác nhau, trong đó có
hơn 300 loại làm thực phẩm được chế biến bằng cả phương pháp cổ truyền, thủ công
và hiện đại dưới dạng tươi, khô và lên men ... như làm giá, đậu phụ, tương, xì dầu ...
đến các sản phẩm cao cấp khác như cà phê đậu tương, bánh kẹo và thịt nhân tạo ... Đậu
tương còn là vị thuốc để chữa bệnh, đặc biệt là đậu tương hạt đen, có tác dụng tốt cho
tim, gan, thận, dạ dày và ruột. Đậu tương là thức ăn tốt cho những người bị bệnh đái
đường, thấp khớp, thần kinh suy nhược và suy dinh dưỡng.
1.1.2.2 Gía trị về mặt cơng nghiệp
Đậu tương là ngun liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế biến
cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi
trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương được dùng để ép dầu. Hiện
nay trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu
đậu tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật. Đặc điểm của dầu đậu tương: khô
chậm, chỉ số iốt cao : 120 - 127 ; ngưng tụ ở nhiệt độ -(15 – 18)0C. Từ dầu này người ta
chế ra hàng trăm sản phẩm công nghiệp khác như: làm nến, xà phịng, ni long...
1.1.2.3Gía trị về mặt nơng nghiệp
Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg hạt
đậu tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn ni. Tồn cây đậu tương (thân, lá, quả,
hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân lá tươi có thể làm
thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp của gia súc. Sản
phẩm phụ cơng nghiệp như khơ dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao: N(6,2%),
P2O5(0,7%), K2O(2,4%), vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [5].
Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt. 1ha trồng đậu tương nếu
sinh trưởng phát triển tốt để lại trong đất từ 30-60kgN. Trong hệ thống luân canh, nếu

7


Đồ Án Tốt Nghiệp

bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng
sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho việc bón N.
Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm lượng N trong
thân chiếm (0,05%), trong lá (0,19%) [3].
1.1.3 Thành phần hóa học trong hạt đậu nành [8].
Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau, trong đó đậu nành có màu vàng là loại
tốt nhất nên được trồng và sử dụng nhiều.
Hạt đậu nành có 3 bộ phận.
Vỏ hạt chiếm 8% trọng lượng hạt.
Phơi chiếm 2%.
Tử diệp chiếm 90%.
Hạt đậu nành có thành phần hóa học như sau:
Bảng 1.1 Thành phần hóa học hạt đậu nành.
Thành phần

Tỷ lệ

Protein Dầu (%) Tro (%)

Hydratcacbon

(%)
Hạt đậu nành ngun

100

40

21

4,9

34

Tử diệp

90,3

43

23

5

29

8

8,8

1

4,3

86

2,4

41,1

11

4,4

43

Vỏ hạt
Phơi

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)
Trong thành phần hóa học của đậu nành, thành phần protein chiếm một tỷ lượng
rất lớn. Thành phần acid amin trong protein của đậu nành ngồi hai thành phần
methionin và tryptophan ra cịn có các acid amin khác, có số lượng khá cao tương
đương lượng acid amin có trong thịt .

8


Đồ Án Tốt Nghiệp

Bảng 1.2 Thành phần acid amin trong protein của đậu nành.
Lzolozin

1,1 %

Loxin

7,7 %

Lyzin

5,9 %

Methionin

1,6 %

Xystin

1,3 %

Phenilalanin

5%

Treonin

4,3 %

Triptophan

1,3 %

Valin

5,4 %

Histidin

2,6 %

(Nguồn:Nguyễn Đức Lượng)
Trong protein đậu nành glubolin chiếm (85 – 95)%. Ngồi ra cịn có một lượng
nhỏ anbumin, một lượng không đáng kể prolamin và glutelin.
Hydratcacbon chiếm khoảng 34% hạt đậu nành. Phần hydratcacbon có thể chia
làm 2 loại: loại tan trong nước và loại không tan trong nước. Loại tan trong nước chỉ
chiếm khoảng 10% toàn bộ hydratcacbon.
Bảng 1.3 Thành phần hydratcacbon trong đậu nành.
Xenluloza

4%

Hemixenluloza

15,4 %

Stachyoza

3,8 %

Rafinoza

1,1 %

Saxaroza

5,0 %

Các loại đường khác

5,1 %

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)

9


Đồ Án Tốt Nghiệp

Thành phần khoáng chiếm khoảng 5% trọng lượng khơ của hạt đậu nành. Trong
đó đáng chú ý nhất là canxi, photpho, mangan, kẽm và sắt.
Bảng 1.4 Thành phần khoáng trong đậu nành.
Canxi

0,16 – 0,47 %

Photpho

0,41 – 0,82 %

Mangan

0,22 – 0,24 %

Kẽm

37 mg/kg
90 – 150 mg/kg

Sắt
(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)
Ngồi ra đậu nành cịn chứa nhiều vitamin khác nhau.
Bảng 1.5 Thành phần vitamin trong đậu nành.

11,0 – 17,5 mg/lg

Thiamin

3,4 – 3,6

Riboflavin

21,4 – 23,0

Niaxin

7,1 – 12,0

Pyridoxin
Biotin

0,8
13,0 – 21,5

Acid tantothenic

Acid folic

1,9

Inoxiton

2300

Vitamin A

0,18 – 2,43

Vitamin E

1,4

Vitamin K

1,9

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)
Đậu nành là một loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipit, gluxit, muối
khống và vitamin. Chính vì thế, đậu nành là một nguồn thực phẩm quan trọng. Trong
công nghiệp thực phẩm đậu nành được coi là một nguyên liệu quan trọng để sản xuất
dầu thực phẩm và các sản phẩm lên men.
10


Đồ Án Tốt Nghiệp

1.2 Tổng quan về đậu phụ
Đậu phụ là một sản phẩm được sản xuất từ đậu nành. Đậu phụ không chỉ được
sản xuất ở Việt Nam mà còn được sản xuất nhiều ở Trung Quốc, Nhật Bản, các nước
Đông Nam Á và cả các nước Châu Âu như Hà Lan, Pháp,…[8].
Đậu phụ là thực phẩm phổ biến ở các nước Đơng Nam Á, có hàm lượng protein
rất cao [34]. Đậu phụ chứa khoảng (6,0 – 8,4) % protein và (79 – 87)% nước, pH trung
tính (5,2 – 6,2).
1.3 Tổng quan về chao [8]
Chao là sản phẩm lên men được sản xuất từ đậu nành. Vì qua quá trình lên men
chao có hệ số tiêu hóa cao hơn nhiều so với đậu phụ.
Chao có nhiều sản phẩm khác nhau như chao nước, chao bánh, chao đặc và chao
bột .
Bảng 1.6 Thành phần hóa học của chao
Thành phần

Các loại sản phẩm chao
Chao nước
Phần cái (%)

Chao bánh (%)

Phần nước (%)

Hàm ẩm

73 – 75

-

65 – 70

Đạm toàn phần

2 – 2,9

12,5 – 13

2,3 – 2,6

Đạm phocmon

0,7 – 0,85

7,5 – 7,8

0,8 – 0,9

Đạm ammoniac

0,3 – 0,4

2,5 – 3,0

0,3 – 0,4

Muối ăn

4,5 – 5,0

6,0 – 6,2

6,0 – 6,5

Chất béo

8,0 – 8,5

-

9,0 – 10

Độ chua

110,0 – 120

mg NaOH

0,1 N/100

Các acid amin không thay thế (g/kg)

Lizin

2,84 – 2,9

11

5,3 – 5,5

Đồ Án Tốt Nghiệp

Treonin

3,3 – 3,5

2,8 – 2,9

Valin

1,7 – 1,75

1,5 – 1,6

Triptophan

0,15 – 0,2

Fenilalanin

1,55 – 1,60

2,5 – 2,70

Lozin

1,8 – 1,9

0,8 – 0,9

Metionin

0,4 – 0,5

0,4 – 0,5

0,4 – 0,45

Lzolozin

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng)
Do quá trình lên men các enzyme của vi sinh vật tham gia thủy phân protein
thành các acid amin, lipit thành các este thơm nên chao có giá trị dinh dưỡng cao và có
mùi vị rất đặc trưng.
1.4 Nấm mốc thường gặp trong chao
Để sản xuất chao thường sử dụng giống khởi động từ giống nấm mốc: Mucor
spp, Rhizopus spp, Actinomucor spp.
Đây là các giống nấm có màu trắng đục, trắng ngà không làm ảnh hưởng tới
màu sắc của sản phẩm, hệ sợi nấm mảnh nhưng dài có khả năng tạo thành một lớp
màng mỏng xung quanh miếng chao, có tác dụng giữ hình dáng cho chao được ổn định
[9].
Tuy nhiên, hầu hết các chủng nấm Actinomucor spp chỉ thích hợp với nhiệt độ
mơi trường tương đối thấp 18-200C đó chỉ sử dụng được các loài nấm mốc này ở
những khoảng thời gian nhất định trong năm.
Rhizopus spp rất nhanh hình thành bào tử, bào tử lại có màu đen đậm do đó ít
nhiều ảnh hưởng tới màu sắc sản phẩm, do đó có ngưỡng nhiệt độ thích hợp rất rộng
20-350C người ta chỉ sử dụng các loài nấm mốc Rhizopus spp vào mùa hè.
Giống nấm mốc Mucor spp thường được lựa chọn hơn cả vì nó khắc phục được
nhược điểm của cả hai giống trên. Các loài nấm mốc Mucor spp thường sử dụng trong

12


Đồ Án Tốt Nghiệp

sản xuất chao là Mucor elegans, Mucor sivaticus, Mucor subtilis, trong đó Mucor
elegans thường được sử dụng nhất [18].
1.5 Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
1.5.1

Các phương pháp ly trích DNA

1.5.1.1 Nguyên tắc
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận
một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các
phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học
(phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải bởi các enzyme
nội bào giải phóng ra mơi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic acid cần được tách
chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào
(desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase).
1.5.1.2 Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay đổi
theo từng mơi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn hoặc là
những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh vật được
đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt của những bộ
gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách chiết DNA vi
sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Q trình ly trích
DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc để có thể thực
hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp ly trích DNA tổng

số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương pháp ly trích DNA
tổng số cho phù hợp.
Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên
thường được sử dụng:

13


Đồ Án Tốt Nghiệp

-

Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp
thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với
hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử
dụng nồng độ muối cao 11 (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự
hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K.

-

Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương
pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung
mơi có khả năng hịa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với
vai trị là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có
cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết.

-

Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối
hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến

650C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại
kết quả khá cao.

-

Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật
đóng băng và tan băng ở - 65oC trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế
bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho
việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên.

1.5.2 PCR trong định danh vi sinh vật
1.5.2.1 Kỹ thuật PCR
Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại
nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật sống.
Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi trong các
phịng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo ra các đột
biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen.
PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa trên
mạch khn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của
14


Đồ Án Tốt Nghiệp

khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp
mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả
năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA
polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới. Kỹ thuật PCR
được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai
primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau

khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đích
khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự
base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm
một mồi xuôi và một mồi ngược .
1.5.2.2 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS - rDNA
Gen rDNA (ribosomal DNA) là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosome, có
nhiều bản sao và vùng khơng mã hóa cho bất kì protein nào. Đây là vùng gene bảo tồn
nên được xem là cơ sở chính xác để tìm ra sự tương đồng và khác biệt của các sinh vật
cùng lồi hay khác lồi, đóng vai trị quan trọng trong các nghiên cứu q trình tiến
hóa, phát sinh lồi, phân loại nấm và xác định tính đa dạng di truyền của vi sinh vật
cũng như các dòng nấm do việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao
đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein có kết quả phân loại thường khơng
chính xác và cần khoảng thời gian dài[16].
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, khuếch
đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt phương
pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên
cứu liên quan đến rDNA. Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân loại nấm trên cơ
sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm được quan hệ di
truyền của nhiều loài nấm sợi. Vùng ITS (Internal Transcribed Spacer) – rDNA là vùng
có rất nhiều biến đổi, mặc dù chúng thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa
15


Đồ Án Tốt Nghiệp

của vi sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này thường để xác định các
biệt hóa trong cùng lồi để lập phổ hệ di truyền [18]. Cặp mồi được sử dụng trong đề
tài này là mồi xuôi ITS1-F (CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A) [40] . Và mồi
ngược ITS4-R (TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)[40].

ITS86F

ITS1-F

18S

ITS1

5.8S

ITS2

ITS86R

28S
ITS4

Hình 1.1. Sơ đồ của các gen ribosome nằm trong vùng ITS
Vùng ITS cũng có một số ứng dụng như: tính tốn các đột biến điểm trong q
trình hình thành lồi, đo lường sự giống nhau bên trong trình tự DNA, dùng các phần
mềm chuyên dụng tạo ra cây tiến hóa lồi khơng chỉ bao gồm các lồi giống nhau mà
cịn phân biệt sự khác nhau giữa các loài. Cụ thể, người ta đã dựa vào vùng gene ITS
của các loài nấm rễ ngoài Tricholoma matsutake và một số lồi có quan hệ. Hay mơ tả
sự phong phú và đa dạng của nấm trong hỗn hợp mẫu, các nhà nghiên cứu đã dùng kỹ
thuật qPCR sử dụng các đoạn mồi ITS, ITS1F và ITS4R[14].
1.5.3 Xây dựng cây phát sinh lồi
Các phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S - rDNA và việc xây dựng cây phát
sinh loài hiện nay đã trở nên khá phổ biến và được xây dựng trên cơ sở dữ liệu của sinh
học và tin học (sinh tin học). Những trình tự mới này sẽ được so sánh với những trình

tự trong ngân hàng dữ liệu gen bằng cách sử dụng chương trình BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) cho kết quả những loài nào có số trình tự tương đồng cao nhất
với chủng đang khảo sát. Sau đó sử dụng các phần mềm sinh tin học như ChromasPro
1.5.0.0, MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0 để xây dựng cây phát sinh loài, tập hợp

16