Khóa luận biểu hiện hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm ứng (iPSC)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THÙY LINH
Tên đề tài:
BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC
TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG
CẢM ỨNG (iPSC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Ngành:

Cơng nghệ Sinh học

Chun ngành:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2015 – 2019

THÁI NGUYÊN, 2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THÙY LINH
Tên đề tài:
BIỂU HIỆN HỆ VECTOR TÁI LẬP TRÌNH TRÊN TẾ BÀO GỐC
TẠO MÁU CỦA NGƯỜI NHẰM TẠO TẾ BÀO GỐC VẠN NĂNG
CẢM ỨNG (iPSC)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo:

Chính quy

Ngành:

Cơng nghệ Sinh học

Lớp:

K47 – CNSH

Chun ngành:

CNSH - CNTP

Khóa học:

2015 – 2019

Giảng viên hướng dẫn: 1. TS Nguyễn Xuân Hưng
2. PGS.TS Dương Văn Cường

THÁI NGUYÊN, 2019


i

LỜI CẢM ƠN
Trước hết tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Xuân Hưng –
Phó viện trưởng kiêm Trưởng phòng Nghiên cứu khoa học Viện Nghiên cứu Tế bào
gốc và công nghệ gen Vinmec và PGS.TS Dương Văn Cường – giảng viên Khoa
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái
Ngun đã tận tình hướng dẫn tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin được bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ths Trần Thị Tuyết Trinh –
kỹ thuật viên Viện Nghiên cứu Tế bào gốc và công nghệ gen Vinmec, người đã trực
tiếp hướng dẫn tôi thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các cán bộ Viện nghiên cứu Tế bào gốc và
Công nghệ gen TS. Nguyễn Hồng Thanh, TS Đào Thị Mai Lan… đã hỗ trợ nhiệt
tình cho tơi trong q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Tơi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ Sinh
học và Công nghệ Thực phẩm, cùng các thầy cô, cán bộ trường Đại học Nông Lâm
Thái Nguyên đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi cũng xin chân thành cám ơn bạn bè, gia đình, những người đã
giúp đỡ, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua.
Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2019
Sinh viên

Nguyễn Thùy Linh

ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng ...................... 10
Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa .......................................... 11
Bảng 3.1: Hóa chất sử dụng trong thí nghiệm.......................................................... 21
Bảng 3.2: Thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ........................................................... 23
Bảng 3.3: Dụng cụ và vật tư dùng trong thí nghiệm ................................................ 24
Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm trong Flow cytometry .............................................. 28
Bảng 3.5: Thành phần của vector tái lập trình pCEB-hUL-G và pCEB-hSK-O ..... 29
Bảng 3.6: Thành phần phản ứng PCR ...................................................................... 35
Bảng 3.7: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .................................................... 35
Bảng 3.8: Trình tự mồi sử dụng trong thí nghiệm ................................................... 37
Bảng 3.9. Thành phần phản ứng Real time PCR ..................................................... 37
Bảng 4.1: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid mini ........................ 39
Bảng 4.2: Kết quả thu độ tinh sạch và nồng độ DNA plasmid maxi ....................... 40
Bảng 4.3: Kết quả đo OD sau mỗi lần tách RNA .................................................... 50


iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc .................................................................................4
Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng ........................................5
Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mơ hình bệnh và khám
phá thuốc ......................................................................................................9
Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4 ..............................................................12

Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2 .......................................................13
Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4 ..............................................................14
Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC ...............................................................15
Hình 2.8: Cấu trúc miền protein của LIN28 .............................................................16
Hình 2.9: Cấu trúc miền protein của GLIS1 .............................................................17
Hình 2.10: Một số loại tế bào được dùng để tạo iPSC ..............................................18
Hình 2.11: So sánh các phương pháp biểu hiện gene trong tái lập trình ..................20
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm trong đề tài ..........................................................25
Hình 3.2: DNA Plasmid dùng để tái lập trình ...........................................................28
Hình 3.3: Chu trình nhiệt PCR cDNA ......................................................................36
Hình 3.4: Chu trình nhiệt cài đặt cho máy Real-time PCR .......................................37
Hình 4.1: Kết quả tách chiết DNA plasmid mini ......................................................39
Hình 4.2: Kết quả tách chiết DNA plasmid maxi .....................................................40
Hình 4.3: Tế bào CD34+ sau khi rã đơng ..................................................................41
Hình 4.4: Tế bào CD34+ sau 6 ngày ni tăng sinh ..................................................42
Hình 4.5: Tế bào CD34+ sau 2 ngày ni tăng sinh ..................................................43
Hình 4.6: Tế bào CD34+ sau 5 ngày ni tăng sinh ..................................................43
Hình 4.7. Sự biểu hiện tế bào CD34 trên bề mặt của quần thể tế bào ni tăng sinh
....................................................................................................................45
Hình 4.8: Tế bào sau 1 ngày xung điện.....................................................................47
Hình 4.9: Quần thể tế bào sau 2 ngày chuyển gen (A), sau 3 ngày chuyển gen (B) và
sau 7 ngày chuyển gen (C) .........................................................................48


iv

Hình 4.10: Tế bào sau 1 ngày xung điện .................................................................. 49
Hình 4.11: Quần thể tế bào sau 4 ngày chuyển gen (A), sau 5 ngày chuyển gen (B),
sau 8 ngày chuyển gen (C). ....................................................................... 49
Hình 4.12: (A)Biểu hiện của các gen SOX2-KLF4 và LMYC- LIN28 (B) Cấu trúc

vector pCEB-hSK-O và pCEB-hUL-G ..................................................... 51


v

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT
Từ đầy đủ

Từ viết tắt
BSA

Bovine serum albumin

cDNA

complementary DNA

DMSO

dimethylsulfoxide

DNA

Deoxyribonucleic acid

E. coli

Escherichia coli

ESC

Embryonic stem cell

hiPSC

Human induced pluripotent stem cell

HMG

High mobility group

HSC

Hematopoietic stem cell

ICM

Inner cell mass

iPSC

Induced pluripotent stem cell

LB

Laria Broth

mESC

Mouse embryonic stem cell

PBMC

Peripheral blood mononuclear cell

PCR

Polymerase chain reaction

qRT-PCR

Quantitative polymerase chain reaction

Ref

Reference

RNA

Ribonucleic acid

RT

Reverse transcription

Tg

Target

vi

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. ii
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................. iii
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ................................................................... v
Phần 1. MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 1
1.1.Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2
1.2.1. Mục tiêu tổng quát............................................................................................ 2
1.2.2. Mục tiêu cụ thể ................................................................................................. 2
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................. 2
1.3.1.Ý nghĩa khoa học của đề tài .............................................................................. 2
1.3.2.Ý nghĩa thực tiễn của đề tài ............................................................................... 3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 4
2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu.................................................................... 4
2.1.1 Tế bào gốc ..........................................................................................................4
2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng ............................................. 4
2.1.3. Phân loại tế bào gốc ......................................................................................... 5
2.2. Các nhân tố tái lập trình .................................................................................... 12
2.2.1. OCT4 .............................................................................................................. 12
2.2.2. SOX2 .............................................................................................................. 13
2.2.3. KLF4 .............................................................................................................. 14
2.2.4. MYC ............................................................................................................... 15
2.2.5. LIN28 ............................................................................................................. 16
2.2.6. GLIS1 ............................................................................................................. 17
2.3 Tế bào nguồn dùng để tạo iPSC ......................................................................... 18
Phần 3. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 21
3.1. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu .................................................. 21

3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................... 21


vii

3.1.2. Địa điểm và thời gian ......................................................................................21
3.2. Nội dung nghiên cứu ..........................................................................................21
3.3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................21
3.3.1. Vật liệu ............................................................................................................21
3.3.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................25
Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................................................39
4.1 Kết quả nhân plasmid lần 1 ................................................................................. 39
4.2. Kết quả nhân plasmid lần 2 ...............................................................................40
4.3 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 1 ................................................41
4.4 Kết quả nuôi tăng sinh tế bào gốc tạo máu lần 2 ................................................43
4.5. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 1.........................................46
4.6. Hình thái và chất lượng tế bào sau chuyển gen lần 2.........................................48
4.7. Kết quả kiểm tra biểu hiện gen ..........................................................................50
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................53
5.1. Kết luận ..............................................................................................................53
5.2. Kiến nghị ............................................................................................................53
TÀI LIỆU THAM KHẢO



1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề

Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cell - ESC) là những tế bào vạn năng, có
khả năng tự làm mới và có nguồn gốc từ khối tế bào bên trong (inner cell mass –
ICM) của phôi nang đang phát triển [44]. Tế bào gốc phôi có thể được ni cấy vơ
thời hạn trong khi vẫn duy trì khả năng tạo ra bất kỳ loại tế bào nào trong cơ thể, và
do đó cung cấp một cơng cụ mạnh mẽ để mơ hình hóa bệnh ở người [8] tuy nhiên tế
bào gốc phôi vướng phải nhiều tranh cãi về đạo đức khi sử dụng trực tiếp nguồn
phôi người [3].
Việc Yamanaka khám phá ra rằng các tế bào trưởng thành nguyên vẹn có thể
được tái lập trình để trở thành các tế bào gốc vạn năng ngay lập tức được coi là một
bước đột phá lớn. Các tế bào gốc vạn năng cảm ứng (induced pluripotent stem cell iPSC) là đại diện thay thế cho nguồn tế bào gốc phôi, không gây tranh cãi về đạo
đức và mang đầy đủ các đặc tính của một tế bào gốc phôi. Một lợi thế quan trọng
của iPSC là khả năng tương thích miễn dịch khi sử dụng liệu pháp tế bào tự thân
[30]. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng có thể được tạo ra từ nhiều loại tế bào sinh
dưỡng khác nhau và có sự tương đồng cao với tế bào gốc phôi. Với các nguồn tế
bào sinh dưỡng dễ tiếp cận, iPSC từ người không chỉ loại bỏ các vấn đề về đạo đức
vướng phải khi sử dụng ESC mà còn cho phép tạo ra nguồn tế bào gốc vạn năng
đơn giản hơn, cũng như biệt hóa thành nhiều loại tế bào chuyên biệt cho từng bệnh
nhân. Tương tự như ESC, iPSC của người có khả năng tăng sinh mạnh mẽ trong
ống nghiệm trong khi vẫn giữ được tiềm năng phát triển và biệt hóa thành mọi tế
bào trong cơ thể. Do đó, các tế bào này có thể cung cấp một số lượng khơng giới
hạn nguồn tế bào biệt hóa dành riêng cho bệnh nhân để tạo mơ hình nghiên cứu
bệnh, xét nghiệm độc tính, sàng lọc thuốc và sử dụng cho các liệu pháp cấy
ghép. Việc tạo ra tế bào gốc vạn năng cảm ứng bằng cách đưa các yếu tố tái lập
trình vào tế bào sinh dưỡng là một phương pháp đầy hứa hẹn cho liệu pháp tế
bào trong y học tái tạo.


2

Các dòng iPSC từ người đã bắt đầu được phát triển, quan tâm và nghiên cứu

nhiều trên thế giới, tuy nhiên chủ yếu vẫn là các dòng được phát triển từ tế bào sinh
dưỡng có hệ gen của người da trắng, tính đến nay chưa có dịng iPSC của người
Việt Nam. Hệ gene của người Việt Nam khác với các nước trên thế giới do vị trí địa
lý, khí hậu, phong tục tập qn, chính vì thế chúng tơi tiến hành tạo các dòng iPSC
phù hợp với hệ gene của người Việt Nam, làm cơng cụ hữu ích để nghiên cứu cơ
chế bệnh, khám phá và sàng lọc độc tính các loại thuốc mới và đặc biệt là trở thành
một nguồn tế bào vô hạn sử dụng cho cấy ghép và y học tái tạo. Mặc dù tiến bộ
nhanh chóng, nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam vẫn đang giới hạn
trong việc sử dụng tế bào gốc đa năng với khả năng biệt hoá thành một số hữu hạn
dòng tế bào, các nghiên cứu về iPSC mới chỉ bắt đầu ở chuột từ năm 2016.
Từ các cơ sở khoa học nêu trên, tôi lựa chọn đề tài: “Biểu hiện hệ vector tái
lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người nhằm tạo tế bào gốc vạn năng cảm
ứng (iPSC)”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
1.2.1. Mục tiêu tổng quát
Biểu hiện thành công hệ vector tái lập trình trên tế bào gốc tạo máu của người.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
- Nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc tạo máu của người.
- Điện biến nạp hệ vector tái lập trình mã hóa các protein OCT4, SOX2,
KLF4, L-MYC, LIN28, GLIS1 vào quần thể tế bào gốc tạo máu của người.
- Kiểm tra biểu hiện gen của các yếu tố tái lập trình trong tế bào gốc tạo
máu sau khi điện biến nạp.
1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài
- Là tiền đề để tạo thành cơng dịng tế bào gốc vạn năng cảm ứng đầu tiên từ
tế bào có hệ gen của người Việt Nam, đánh dấu một bước phát triển quan trọng
trong lĩnh vực này tại Việt Nam.


3

- Tạo dòng iPSC đầu tiên của người Việt Nam để cung cấp một khối lượng
lớn tế bào làm mô hình cho nghiên cứu biệt hóa, nghiên cứu sàng lọc thuốc.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài
- Chuyển gen thành công là bước đầu quan trọng và cần thiết trong quy trình
tạo dịng tế bào gốc vạn năng cảm ứng.


4

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 .Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Tế bào gốc
Tế bào gốc là một loại tế bào đặc biệt trong cơ thể. Hai đặc điểm đặc trưng
của tế bào này là khả năng nhân đôi vơ hạn và khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế
bào sinh dưỡng khác [43]. Nhờ thế chúng có khả năng tái tạo, sửa chữa và thay thế
các tế bào chết, tổn thương trong cơ thể. Tên gọi tế bào gốc được hình thành cũng vì
khả năng biệt hóa thành các loại tế bào khác nhau khiến người ta liên tưởng đến
hình ảnh gốc cây phân nhánh, mỗi nhánh hình thành cành, lá, quả.

Hình 2.1: Định nghĩa tế bào gốc
2.1.2. Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng
- Năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành
của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều
này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình [3].
- Năm 1981, Martin Evans và Martin Kaufman, Gail Martin phân lập được tế
bào gốc phôi từ phôi của chuột [3].

5

- Năm 1997, Sir Ian Wilmut và cộng sự đã chuyển nhân vào tế bào sinh
dưỡng để lập trình lại tế bào nhằm nhân bản cừu Dolly, loại động vật có vú đầu tiên
được tạo bằng nhân bản tế bào sinh dưỡng [3].
- Năm 1998, James Thomson phân lập được tế bào gốc phôi người [3].
- Năm 2001, Tada và cộng sự đã dung hợp tế bào sinh dưỡng với tế bào gốc
phơi để tạo ra các tế bào có khả năng biểu hiện gen liên quan đến các tế bào đa năng
cho thấy ESC có chứa một số yếu tố có thể lập trình lại các tế bào sinh dưỡng [3].
- Năm 2006, các nhà khoa học Nhật Bản và Mỹ đã tạo ra tế bào gốc phơi hồn
tồn mới từ tế bào trưởng thành. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này được tạo ra nhờ
chuyển bốn gen kích hoạt tái lập trình để tạo ra tế bào có đặc tính giống tế bào gốc
thu nhận ở phơi [3].

Hình 2.2: Lịch sử ra đời của tế bào gốc vạn năng cảm ứng
2.1.3. Phân loại tế bào gốc
Có thể phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa hoặc phân loại theo
nguồn gốc [48]. Theo tiềm năng biệt hóa (differentiation potency) đa dạng của tế
bào, các nhà nghiên cứu đã chia tế bào gốc thành 4 loại khác nhau [8]: tế bào gốc
toàn năng (Totipotent), tế bào gốc vạn năng (Pluripotent), tế bào gốc đa năng
(Multipotent) và tế bào gốc đơn năng (Unipotent).


6

a. Tế bào gốc toàn năng
Các tế bào thuộc giai đoạn từ bốn đến tám tế bào trong quá trình phát triển
của phôi sau thụ tinh được gọi là tế bào gốc toàn năng, chúng chỉ tồn tại trong giai
đoạn phát triển phơi sớm. Với tế bào gốc tồn năng, mỗi tế bào ban đầu có thể hình

thành một cơ thể hồn chỉnh. Chúng có tiềm năng cao nhất và nhiều nhất để có thể
trở thành tất cả các tế bào của cơ thể. Ở động vật có vú trưởng thành (bao gồm cả
người), có khoảng 200 loại tế bào thuộc các nhóm như tế bào thần kinh, tế bào cơ,
tế bào biểu mô, tế bào máu,…Những tế bào khác, bản chất cũng phát triển từ phôi,
nhưng không hợp nhất tạo cơ thể gồm: mơ ngồi phơi, nhau thai, dây rốn. Các dạng
trên được tạo ra từ một tế bào tồn năng. Những tế bào ở giai đoạn phơi sớm đến
giai đoạn phơi nang cũng có tính tồn năng và cũng có thể tạo ra một cơ thể hoàn
chỉnh [1].
b. Tế bào gốc vạn năng
- Tế bào gốc phôi
Cuối thập niên 20 được đánh dấu bằng sự bùng nổ của một hướng nghiên
cứu non trẻ nhưng đầy tiềm năng, đó là công nghệ tế bào gốc, với khởi điểm là việc
James Thomson phân lập được các tế bào gốc từ phôi người (1998) [18]. Các tế bào
gốc phôi là các tế bào đa năng có thể được phân lập từ khối tế bào bên trong của
tiền phôi. Tế bào gốc phôi đã nổi lên như một ứng cử viên hấp dẫn cho các liệu
pháp dựa trên tế bào có khả năng phục hồi chức năng tế bào và mô bị mất. Những tế
bào độc đáo này có thể tự làm mới vơ thời hạn và có khả năng biệt hóa thành cả ba
lớp mầm phôi (lá trong, lá giữa, lá ngồi). Ba lá mầm phơi này là nguồn gốc của tất
cả các loại tế bào chuyên biệt khác nhau của cơ thể. Thử nghiệm lâm sàng đầu tiên
của tế bào gốc phôi để điều trị chấn thương tủy sống và thoái hóa điểm vàng trong
năm 2010 đánh dấu sự khởi đầu của một kỷ nguyên mới trong y học tái tạo [40].
Tuy nhiên nghiên cứu này châm ngòi cho cuộc tranh luận về vấn đề đạo đức khi
nguồn sử dụng là phôi người.
Tế bào gốc phôi khi tiêm vào vị trí tổn thương có khả năng hình thành nên
khối u quái (teratomas) tại vị trí tiêm. Do đó tế bào gốc cần được định hướng biệt


7

hóa thành các tế bào mong muốn trước khi được tiêm vào vị trí tổn thương. Hiện

nay có một số kỹ thuật được dùng để kiểm sốt sự biệt hóa tế bào gốc trên ni cấy
thực nghiệm, ví dụ: thay đổi thành phần hóa học của mơi trường ni cấy, tác động
vào bề mặt của đĩa nuôi cấy (tạo các giá thể), hay gài các gen đặc hiệu vào những tế
bào này.
- Tế bào gốc vạn năng cảm ứng
Vào năm 1962, John B. Gurdon đã phát hiện DNA trong tế bào trưởng thành
của ếch có lưu mọi thông tin để phát triển thành mọi tế bào trong cơ thể ếch và điều
này có nghĩa là tế bào của người trưởng thành cũng có thể tái lập trình. Gurdon đã
phát hiện rằng có thể đảo ngược sự chun mơn hóa của các tế bào. Trong một thí
nghiệm cổ điển, ơng đã thay thế nhân tế bào chưa trưởng thành trong tế bào trứng
của ếch bằng nhân từ tế bào ruột trưởng thành. Tế bào trứng biến đổi này phát triển
thành một con nịng nọc bình thường. Kết quả thí nghiệm này chứng minh rằng
DNA của tế bào trưởng thành mang thông tin cần thiết để phát triển thành tất cả các
tế bào trong ếch và nguyên sinh chất của tế bào trứng chứa các tác nhân cảm ứng
quá trình phát triển đảo ngược từ tế bào trưởng thành [19].
Phát hiện mang tính bước ngoặt của Gurdon ban đầu bị hồi nghi nhưng đã
được chấp nhận khi các nhà khoa học khác xác nhận, dẫn tới khởi xướng nghiên
cứu mạnh mẽ và kỹ thuật này đã được phát triển hơn nữa, cuối cùng dẫn đến việc
nhân bản của động vật có vú. Nghiên cứu của Gurdon đã cho thấy hạt nhân của một
tế bào trưởng thành, chuyên biệt có thể được đưa trở lại trạng thái đa năng, chưa
trưởng thành. Nhưng thí nghiệm của ông liên quan đến việc loại bỏ nhân tế bào, sau
đó là việc đưa chúng vào các tế bào khác. Liệu có thể biến một tế bào nguyên vẹn
trở lại thành tế bào gốc đa năng không?
Shinya Yamanaka đã trả lời câu hỏi này trong một bước đột phá khoa học 40
năm sau phát hiện của Gurdon. Năm 2006 Shinya Yamanaka đã sử dụng các vector
retrovirus để biểu hiện rất nhiều yếu tố phiên mã, đơn lẻ và kết hợp, trong nguyên
bào sợi (fibroblasts) của chuột trong điều kiện nuôi cấy. Đáng lưu ý là ông đã phát
hiện ra rằng cả tế bào người và chuột có thể được lập trình lại về trạng thái vạn

8

năng, được gọi là tế bào gốc vạn năng cảm ứng, tương tự như tế bào gốc phôi, sau
khi xâm nhiễm (transduction) bằng retrovirus chỉ mã hóa 4 yếu tố : KLF4, SOX2,
OCT4, và c-MYC [13]. Ngoài ra, James Thomson báo cáo rằng tổ hợp các yếu tố
khác (OCT4, SOX2, NANOG và LIN28) có khả năng tái lập trình các tế bào sinh
dưỡng của con người thành iPSC [28].
Các phòng thí nghiệm trên khắp thế giới đã nhanh chóng sử dụng kỹ thuật
mang tính cách mạng này và đến năm 2009, chỉ sau 3 năm khi Yamanaka tạo thành
công iPSC, khoảng 300 bài báo về iPSC được xuất bản [15].
Giải Nobel về Y Sinh học năm 2012 đã vinh danh 2 nhà khoa học Gurdon và
Yamanaka với cơng trình tạo ra iPSC. Đến năm 2007, hai nhóm nghiên cứu độc lập
đã tạo ra iPSC từ nguyên bào sợi của người [28], [32]. Việc phát hiện ra công nghệ
tế bào gốc vạn năng cảm ứng đã mở ra những cơ hội chưa từng có trong y học tái
tạo, mơ hình bệnh và khám phá thuốc [7].
Đối với mơ hình bệnh, tế bào sinh dưỡng sở hữu đặc điểm của các tế bào bị
bệnh từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra iPSC và được tiếp tục sử dụng để nghiên
cứu các bệnh [7]. Các tế bào sinh dưỡng từ bệnh nhân được sử dụng để tạo ra các
iPSC. Tế bào gốc vạn năng cảm ứng này có thể được sửa chữa bằng liệu pháp gen
và tiếp tục được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng khỏe mạnh được cấy ghép
cho bệnh nhân, hoặc chúng có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào sinh dưỡng
chưa được chỉnh sửa để mơ hình hóa bệnh hoặc sàng lọc thuốc [7]. Ví dụ, vào năm
2012, các tế bào gốc thần kinh được tạo ra từ những người mắc bệnh Familial
dysautonomia - một rối loạn di truyền hiếm gặp, ảnh hưởng đến các dòng tế bào
thần kinh, phát triển tế bào thần kinh đã được sử dụng để sàng lọc gần 7000 phân tử
nhỏ và xác định phân tử nhỏ sử dụng mơ hình bệnh dựa trên iPSC có thể xác định
thuốc bổ trợ để can thiệp điều trị bệnh Familial dysautonomia [9]. Các nghiên cứu
phát triển thuốc trong đó gồm sàng lọc các phân tử nhỏ, kiểm tra độc tính để đánh
giá sự an tồn, đã khai thác thành công dựa trên kỹ thuật iPSC [7]. Công nghệ
này đã mở ra một trang sử mới đối với các liệu pháp tế bào gốc sử dụng tế bào

gốc vạn năng cảm ứng trên người (human induced pluripotent stem cell- hiPSC)


9

của chính bệnh nhân do tránh được nguy cơ đào thải miễn dịch cũng như các vấn
đề đạo đức đi kèm với việc sử dụng tế bào gốc phơi [45].

Hình 2.3: Ứng dụng của iPSC trong các lĩnh vực trị liệu gen, mơ hình bệnh và
khám phá thuốc
Năm 2014, Nhật Bản lần đầu tiên sử dụng các tế bào biểu mơ sắc tố võng
mạc có nguồn gốc iPSC để điều trị thoái hóa điểm vàng [15]. Năm 2019, tại Nhật
Bản đã thử nghiệm liệu pháp iPSC cho chấn thương tủy sống. Liệu pháp này thu tế
bào đã biệt hóa từ bệnh nhân và tái lập trình chúng thành tế bào thần kinh thông qua
tế bào gốc vạn năng cảm ứng, sau đó các bác sĩ lâm sàng sẽ tiêm 2 triệu tế bào vào
vị trí tổn thương của mỗi bệnh nhân [53]. Hiện tại, có một nhu cầu được cơng nhận
để đảm bảo an toàn cho bất kỳ liệu pháp có nguồn gốc iPSC nào và cần phải xác
minh một cách có hệ thống các đặc điểm và sự an tồn của các dịng, bằng cách


10

kiểm tra bộ gen và biểu hiện của gen [54]. Ví dụ, nghiên cứu của Bhutani và cộng
sự năm 2006 lần đầu tiên đánh giá sự an toàn của ba phương pháp tái lập trình phổ
biến (retroviral vector, non-integrating Sendai virus, synthetic mRNAs). Ưu điểm
quan trọng nhất của iPSC so với ESC là khả năng sử dụng tế bào sinh dưỡng trưởng
thành từ những bệnh nhân mắc bệnh do di truyền xác định [23],[6]. So sánh tế bào
gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng được trình bày ở bảng 1.1.
Bảng 1.1: So sánh tế bào gốc phôi và tế bào gốc vạn năng cảm ứng
Tế bào gốc vạn năng

Tế bào gốc phôi

Tế bào gốc vạn năng cảm ứng

Nguồn thu nhận

Phơi thai

Tế bào sinh dưỡng

Vấn đề đạo đức

Có

Khơng

Tốc độ tăng sinh

Cao

Cao

Tính tiện dụng

Cao

Cao

Khả năng tự biệt hóa

Có

Có

Khả năng tạo dòng tế bào khác

Cao

Cao

Khả năng gây đào thải miễn dịch

Có

Khơng

c. Tế bào gốc đa năng
Tế bào gốc đa năng (Multipotent) là những tế bào có khả năng biệt hóa thành
nhiều loại tế bào của cơ thể. Các tế bào được tạo thành nằm trong một hệ tế bào có
liên quan mật thiết. Ví dụ như tế bào gốc trung mơ có thể biệt hóa thành tế bào
xương, sụn, mỡ. Các tế bào gốc đa năng có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau
như mô mỡ, cuống rốn, tủy xương, tủy răng sữa,…
Mặc dù có giới hạn về khả năng biệt hóa, nhưng gần đây, loại tế bào này
cũng đã được y sinh học tập trung khai thác, và qua đó đã được ứng dụng rất thành
công trong nhiều liệu pháp dựa vào tế bào gốc (stem cell therapy). Tế bào gốc
trưởng thành có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào có chức năng khác
như thế bào gan, biểu bì, xương, giác mạc. Những tế bào này có thể rất hữu ích


11

trong việc sửa chữa mô, cơ quan bị tổn thương một cách trực tiếp cho chính bệnh
nhân [1].
Các chức năng chính của tế bào gốc đa năng:
 Có mặt với số lượng nhỏ trong các mô chuyên biệt
 Chức năng chính là bổ sung các tế bào bị hư hỏng
 Vẫn hoạt động cho đến khi chúng nhận thấy tín hiệu để phân biệt thành
các các loại tế bào cụ thể
d. Tế bào gốc đơn năng
Tế bào gốc đơn năng còn được gọi là tế bào gốc định hướng đơn dòng hay tế
bào đầu dòng (progenitor cells) là những tế bào gốc chỉ có khả năng biệt hóa theo
một dịng. Trong điều kiện bình thường, các tế bào gốc trưởng thành trong nhiều tổ
chức đã biệt hóa thành một dịng tế bào. Khả năng biệt hóa theo dịng này cho phép
duy trì trạng thái sẵn sàng tự tái tạo mơ, thay thế các tế bào mơ chết vì già cỗi bằng
các tế bào phơi mới.
Tóm lại, theo tiềm năng biệt hóa, tế bào gốc được phân loại thành 4 loại, và
được tóm tắt tại bảng 2.1.
Bảng 2.1: Phân loại tế bào gốc theo tiềm năng biệt hóa
Tên gọi
Tồn năng
(Totipotent)

Số tế bào biệt hóa

Tất cả

Ví dụ

Tất cả những tế

được thụ tinh)

bào trong cơ thể

Tất cả, trừ tế bào

Những tế bào thu

(Pluripotent)

màng phơi

nhận từ lớp ICM

(Multipotent)
Đơn năng
(Unipotent)

Nhiều

biệt hóa

Hợp tử (trứng

Vạn năng

Đa năng

Số kiểu tế bào

Tế bào gốc
tạo máu

Những tế bào thu
nhận từ ba lớp
phôi
Tất cả tế bào máu

Tiền thân dưỡng
Một

bào (Mast cell
precursor)

Dưỡng bào


12

2.2. Các nhân tố tái lập trình
2.2.1. OCT4
Miền protein của OCT4 được trình bày ở hình 2.4.

Hình 2.4: Cấu trúc miền của protein OCT4
OCT4 (yếu tố phiên mã gắn với octamer 4) còn được gọi là POU5F1, là một
nhân tố phiên mã thuộc họ POU (POU trancription factor family), lớp 5, yếu tố
phiên mã 1, thuộc họ protein liên kết DNA POU (Pit, Oct, Unc). OCT4 nằm trên
NST số 6 ở người (6p21.33), gene dài 6.4 kbp. OCT4 chứa một trình tự nhận diện
octamer (8bp) được thấy trong promoter và enhancer của nhiều gen chuyên biệt và
biểu hiện thường xuyên [24]. OCT4 dường như chỉ biểu hiện ở các dòng tế bào vạn

năng [50]. OCT4 biểu hiện trong phôi chuột ở các giai đoạn phôi sớm từ 4-8 tế bào,
đến khi “ngoại phơi bì” bắt đầu biệt hóa. Phơi chuột đột biến OCT4 sẽ chết sau khi
làm tổ bởi thiếu khối tế bào bên trong (inner cell mass - ICM) [24] và phơi này chỉ
có duy nhất một tế bào là tế bào túi phôi (trophoblast).
Tế bào gốc phôi ở chuột (mouse embryonic stem cell - mESC) bị giảm biểu
hiện của OCT4 sẽ biệt hóa thành tế bào túi phơi [16] và nếu gia tăng sự biểu hiện
của OCT4 trong mESC có thể làm các tế bào này biệt hóa. Có thể OCT4 ức chế biệt
hóa thành tế bào túi phôi và hoạt động cùng các nhân tố phiên mã khác hay các yếu
tố đồng điều hòa (co-regulator), và tỷ lệ giữa nồng độ của các nhân tố đó sẽ quyết
định số phận của tế bào [1]. Vai trò của OCT4 trong sự duy trì tính đa năng của tế
bào gốc phôi người (human embryonic stem cell - hESC) giống với vai trị của nó
trong mESC. Sự phiên mã OCT4 bị hạn chế ở tế bào gốc phôi và trong tế bào vạn
năng invitro. Sự biểu hiện ở mức độ thấp các marker OCT4 đã được phát hiện trong
nhiều dòng tế bào ngoại bì hay ngoại bì thần kinh (octoderm/neurooctoderm) cả ở
invitro và invivo. Thí nghiệm trên chuột loại bỏ gen OCT4 cho thấy, OCT4 giữ vai
trò quyết định trong sự thiết lập tính đồng nhất của tế bào gốc vạn năng [26].


13

Hai tiểu phần của OCT4 được tổng hợp bằng cách cắt nối thay thế
(alternative splicing) Pou5f1 mRNA. Hai tiểu phần, OCT4-IA và OCT4-IB có kích
thước lần lượt là 360 và 265 axit amin, trong đó có 225 axit amin tại đầu C giống
hệt nhau, khác nhau về trình tự ở đầu N. OCT4-IA phải đạt đến ngưỡng nhất định
để duy trì khả năng tự đổi mới và tồn năng của tế bào gốc, OCT4-IB đã được
chứng minh không liên quan đến việc này. Trong cơ thể, mRNA của OCT4 có măt
trong các giai đoạn phơi sớm, từ nỗn bào chưa được thụ tinh cho đến hình thái
chưa hồn chỉnh (uncompacted morula). OCT4 có vai trị quyết định sự phân cực
của hợp tử bằng cách cùng với yếu tố phiên mã SOX2, KLF4 tạo thành phức hợp ba
trên DNA điều khiển sự biểu hiện của một số gene liên quan đến phát triển phôi như

YES1, FGF4, UTF1 và ZFP [24].
Cách hoạt hóa của các gen mục tiêu OCT4 và duy trì tính đa năng vẫn
chưa rõ. Bằng cách kết hợp với yếu tố đồng điều hịa khác, OCT4 có thể hoạt
động vừa như một nhân tố hoạt hóa phiên mã, vừa như một nhân tố ức chế phiên
mã.
2.2.2. SOX2
Miền protein của SOX2 được trình bày ở hình 2.5.

Hình 2.5: Cấu trúc miền của protein của SOX2
SOX2 là thành viên họ gen SOX (box HMG liên quan đến SRY), mã hóa
nhân tố phiên mã với một miền gắn DNA HMG đơn (singer high mobility group
DNA-binding domain), có vị trí 3q26.33 trên nhiễm sắc thể số 3 cánh q băng 26.33,
nằm ở sợi dương, kích thước gene 2513 bp và 317 axit amin [17], [30].
Giống với OCT4, SOX2 biểu hiện trong các tế bào đa năng của phôi chuột
trong giai đoạn phôi sớm, ICM, ngoại phơi bì và tế bào mầm sinh dục. Nhưng khác
với OCT4, SOX2 cũng biểu hiện trong nhiều tế bào ngoại bì và phơi, và trong các tế
bào tiền thân thần kinh, và quan trọng cho sự duy trì tính đồng nhất của chúng. Sự


14

biểu hiện giảm của SOX2 liên quan đến quá trình biệt hóa. Phơi chuột loại bỏ gen
SOX2 sống bình thường ở giai đoạn phôi nang, nhưng chết nhanh sau khi phôi làm
tổ. Các phôi này thiếu cấu trúc xi lanh trứng (egg cylinder) và thiếu các tế bào biểu
mô. Khi ni cấy in vitro để thiết lập dịng gốc phơi, phơi nang loại bỏ gen SOX2
phát triển bình thường vào ngày đầu, nhưng sau đó biệt hóa thành tế bào tế bào túi
phôi (trophectoderm) và tế bào nội mô vách. Vai trị in vitro của SOX2 là duy trì
quần thể tế bào đa năng ở giai đoạn sớm của phôi [1].
Các phôi sớm biểu hiện ở mức cao các protein SOX2 có nguồn gốc từ mẹ.
Ngay trong chuột loại bỏ gen SOX2, các protein SOX2 từ mẹ vẫn được duy trì cho

đến giai đoạn phơi nang. Do đó, ngun nhân mà các phôi đột biến vẫn sống sót đến
khi làm tổ có thể là do mức biểu hiện hiệu quả của SOX2 có nguồn gốc từ bố mẹ
đến giai đoạn đó.
Do vậy, có thể SOX2 khơng cần thiết cho sự duy trì hay tạo ra tính đa năng
trong các giai đoạn phôi sớm, nhưng không thể được phát hiện trong chuột bị loại
bỏ bởi vì sự hiện diện của SOX2 có nguồn gốc từ mẹ. Hơn nữa, SOX2 có vai trị
trong sự suy trì của các tế bào tế bào túi phơi [1].
2.2.3. KLF4
Miền protein KLF4 được trình bày ở hình 2.6.

Hình 2.6: Cấu trúc miền của protein KLF4


15

KLF4 mã hóa một loại protein thuộc họ yếu tố phiên mã Kruppel. Protein
ngón tay kẽm (zinc finger protein) được mã hóa là cần thiết cho sự phát triển
bình thường của chức năng bảo vệ cơ học của da, có vị trí 9q31.2, nhiễm sắc thể
số 9 cánh q băng số 31.2, có kích thước gene 5,631 bp, 513 axit amin và nằm ở
sợi âm.
Protein KLF4 kiểm sốt q trình chuyển đổi từ pha G1 sang pha S của chu
trình tế bào sau tổn thương DNA bằng cách làm trung gian gen ức chế khối u
p53. Chuột thiếu gen này có ngoại hình bình thường nhưng giảm cân nhanh chóng
và chết ngay sau khi sinh do bốc hơi chất lỏng do chức năng hàng rào biểu bì bị tổn
thương [29].
KLF4 có miền kích hoạt phiên mã đầu N, tiếp theo là miền ức chế phiên mã,
chứa hai gốc lysine K225 và K229. Các gốc này được acetyl hóa bởi p300/CBP,
tương tác với miền kích hoạt. Có một chuỗi PEST tiềm năng giữa các miền kích
hoạt. Đầu C có một miền liên kết DNA chứa ba ngón tay kẽm, nhận biết và liên kết
với các chuỗi mục tiêu của GC/CACCC trong nhân. Tín hiệu hướng nhân (Nuclear

Localization Signal - NLS) (6 aa) nằm giữa các miền liên kết và ức chế DNA, tạo
điều kiện cho việc vận chuyển KLF4 vào hạt nhân [14].
2.2.4. MYC
Cấu trúc miền protein của gen MYC được trình bày ở hình 2.7.

Hình 2.7: Cấu trúc miền protein của MYC
Họ MYC của các yếu tố sao chép dây kéo xoắn ốc xoắn ốc cơ bản bao gồm
MYC, MYCN và MYCL [21]. MYC (homelocytomatosis virus oncogene homolog)
đại diện cho một trong những mục tiêu thuốc được tìm kiếm nhiều nhất trong ung