Báo cáo thực hành kỹ thuật vật liệu sinh học

BÀI 1.
I.

TẠO MÀNG CELLULOSE TỪ VI KHUẨN

LÝ THUYẾT

− Sản phẩm sinh học có cấu trúc sợi cellulose do vi khuẩn tạo ra hiện nay đang được quan
tâm nghiên cứu sử dụng trong cấy ghép và làm giá đỡ nuôi cấy tế bào mơ nhờ và các đặc
tính nổi bật về sự tương thích sinh học, độ bền cơ lý, hình dạng và cấu trúc hóa học riêng
biệt.
− Cấu trúc cơ bản của màng cellulose do vi khuẩn tạo thành là các sợi chứa chuỗi
β–1–4 glucan với công thức phân tử là (C6H10O5)n được liên kết với nhau thông qua
các cầu nội và cầu ngoại nối hydro.
− Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc, hóa dị dưỡng, có
dạng hình que, thẳng hay hơi cong, kích thước khoảng 2µm. Vi khuẩn
A. xylinum phát triển tốt ở nhiệt độ 25–35oC, pH 4–6. Vi khuẩn A. xylinum sau khi nuôi
cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện tĩnh sẽ hình thành trên bề mặt mơi trường một lớp
màng BC.
II.

MẪU VẬT, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
1. Mẫu vật

− Chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum.
2. Dụng cụ
− Lọ thủy tinh 100ml

− Đũa thủy tinh

− Becher 1000ml

− Cân phân tích

− Becher 500ml

− Tủ sấy

− Bếp đun

− Nồi hấp

− Cân

− Túi hút chân không


3. Hóa chất
− (NH4)2SO4 (8g)

− Cồn 70o

− (NH4)2HPO4 (2g)

− H2O2

III.

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH

− Tiến hành tạo màng BC:

+

Chuẩn bị dụng cụ: Hấp khử trùng tất cả các dụng cụ thí nghiệm.

+

Chuẩn bị mơi trường ni cấy: Hịa tan 20g đường saccarose và 1 lít nước dừa già,

tiếp tục thêm 8g (NH4)2SO4 vào khuấy đều cho đến khi tan hết, sau đó thêm tiếp 2g
(NH4)2HPO4 và và khuấy đều cho tan hết. Cuối cùng đun sơi hỗn hợp trên trong vịng 30
phút.
+

Nuôi tạo màng: Đổ 50ml môi trường nuôi cấy và các lọ thủy tinh, dùng giấy bạc đậy

kín và để nguội. Sau đó, cho chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum vào môi trường đã
chuẩn bị ở trên (theo tỉ lệ 1:10). Đem ni cấy ở nhiệt độ phịng trong vịng 1 tuần. Quan
sát sự hình thành của màng BC và thu nhận màng BC ở ngày thứ 7 sau khi nuôi cấy.
+

Cân trọng lượng và đo độ dày màng BC.

− Quy trình xử lí màng BC
+

Rửa sạch bằng nước máy nhiều lần

+

Đun với NaOH 0.2M trong thời gian 30 phút

+

Rửa lại với nước cất

+

Ngâm với H 2 O 2 1.5% trong vịng 30 phút

+

Rửa lại với nước cất

+

Đun sơi với nước cất trong vòng 30 phút


+
IV.

Bảo quản ở ngăn mát
KẾT QUẢ

−
− Hình 1: Màng BC được tạo từ vi khuẩn Acetobacter xylinum
V.

TRẢ LỜI CÂU HỎI
1 Hãy kể tên một số loại vi khuẩn có thể tạo màng BC và ứng dụng của màng BC?

− Một số vi khuẩn có thể tạo màng BC là: Aerobacter, Acetobacter, Achromobacter,
Agrobacterium, Alacanigenes, Azotobacter, Pseudomonas, Rhizobium, Sarcina.
− Màng BC được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như mỹ phẩm, thực phẩm, bảo vệ môi
trường, công nghiệp và y học.
− Hãy kể tên phương pháp tạo màng sinh học khác mà anh/ chị biết?
− Quy trình sản xuất cellulose sinh học.
− Chủng vi khuẩn: Komagataeibacter nataicola BC-B0007Vật liệu: môi trường BC
NUTRI, khay BC NUTRI.
− Quy trình:


−
− Kết quả: Sử dụng chủng thuần Komagataeibacter nataicola BC-B0007 trên mơi trường
BC NUTRI 02 giúp màng tạo ra có màu trắng đến hơi vàng, bề mặt láng bóng.
−


− BÀI 2: KIỂM TRA CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MÀNG BC
I

LÝ THUYẾT

− Bỏng hay phỏng là một loại chấn thương đối với da hoặc các mơ khác do nhiệt, điện,
hóa chất, ma sát, hay bức xạ.
− Dựa vào diện tích và độ sâu của tổn thương bỏng mà chia bỏng làm 4 cấp độ:
+

Bỏng độ 1: bỏng chỉ ảnh hưởng đến lớp da bên ngoài.

+

Bỏng độ 2: mức độ tổn thương đi sâu vào một vài lớp bì bên trong.

+

Bỏng độ 3: toàn bộ da bị phá hủy hoặc đi sâu đến mọi lớp bì bên trong.

+

Bỏng độ 4: tổn thương đến những vùng sâu dưới da như mô, cơ hoặc xương.

− Đắp vết thương bằng màng mỏng là một dạng điều trị vết thương nhằm hỗ trợ quá trình
điều trị làm kín vết thương và hỗ trợ làm lành vết thương.
− Các vật liệu đắp vết thương sinh học khơng chỉ hỗ trợ giữ ấm, làm kín vết thương ngăn
ngừa nhiễm khuẩn mà còn được cải tiến để giải phóng các hợp chất hỗ trợ điều trị tổn
thương trên da.
VI.

MẪU VẬT, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
1 Mẫu vật


− Hình 1: Màng BC thu nhận từ bài trước


− Dụng cụ
+
+
+

Cân phân tích
Tủ sấy
Nồi hấp

+
+
+

Đĩa petri
Đèn cồn
Kẹp

+

Ống nghiệm

+

Giấy bạc

+
+

Hóa chất

− Mơi trường: LB agar, LB
− Cồn 700
VII.

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
1 Kiểm tra khả năng giữ nước của màng BC

− Màng BC lúc ướt có khối lượng là 3.16g
− Sấy màng BC ở nhiệt độ 1400C đến trọng lượng khơng đổi có khối lượng là 0.03g
− Tỉ lệ nước tối đa chứa trong màng BC:
− Tỷ lệ nước (%) = (trọng lượng màng lúc ướt – trọng lượng màng sau khi sấy khô) / trọng
lượng màng lúc ướt x 100
+

Tỷ lệ nước (%) = (3.16 – 0.03) / 3.16 x 100 = 99.05%

 Từ kết quả này ta có thể thấy khả năng giữ nước của màng BC rất tốt. Khả năng giữ
nước, duy trì độ ẩm cũng chính là yếu tố quan trong để làm lành vết thương.
+

Khảo sát khả năng cản khuẩn của màng BC

− Pha môi trường, hấp vô trùng và đổ vào 2 đĩa petri và đợi cho môi trường đông lại (30
phút).


+
+
+

Hình 2: Mơi trường LB agar được đổ ra đĩa petri

Đĩa 1: Đặt 1 miếng màng BC lên trên mặt đĩa.

+
+

Hình 3: Màng BC trên mơi trường LB agar


+

Đĩa 2: Đặt 1 miếng gạc y tế lên trên bề mặt đĩa.

+
+

Hình 4: Tấm băng gạc trên mơi trường LB agar.

− Để mở nắp 2 giờ sau đó đậy nắp lật ngược đĩa ủ trong 48 giờ.
VIII.

KẾT QUẢ

+

+

+

Hình 5: Kết quả thu được khi nuôi ủ sau 6 giờ


+

+

Hình 6: Kết quả thu được khi ni ủ sau 12 giờ

+

Hình 7: Kết quả thu được khi ni ủ sau 18 giờ

+

+


+

Hình 8: Kết quả thu được khi ni ủ sau 24 giờ


+
+

Hình 9: Kết quả thu được khi ni ủ sau 32 giờ

+

Hình 10: Kết quả thu được khi ni ủ sau 48 giờ

+

IX.

NHẬN XÉT

− Sau khi nuôi ủ ở nhiệt độ phịng khoảng thời gian 6 giờ thì khơng xảy ra hiện tượng gì,
tuy nhiên sau khoảng thời gian 12 giờ thì xuất hiện một vài khuẩn lạc ở cách xa vị trí đặt
màng. Cho đến sau 48 giờ thì khuẩn lạc xuất hiện ở hầu hết bề mặt môi trường tuy nhiên
phía dưới vị trí đặt màng thì khơng xuất hiện khuẩn lạc điều đó cho thấy màng BC có
khả năng ngăn cản sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Vì màng BC có cấu tạo dạng sợi gần
giống với cấu tạo của cenlulose, cấu tạo có kích thước nhỏ gắn kết chặt chẽ có khả năng
ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vât.
− Sau khi nuôi ủ ở nhiệt độ phòng khoảng thời gian 48 giờ thấy xung quanh miếng băng


gạc khơng xảy ra hiện tượng gì, khơng xuất hiện khuẩn lạc. Tuy nhiên phía dưới miếng
băng gạc sau khoảng thời gian 12 giờ bắt đầu xuất hiện một vài khuẩn lạc cho đến sau
48 giờ những khuẩn lạc đó bắt đầu lan ra khỏi miếng băng gạc. Từ đó cho thấy miếng
băng gạc này khơng có khả năng ngăn cản sự xâm nhiễm của vi khuẩn. Vì khoảng cách
của các sợi vải của gạc y tế có kích lớn nên vi sinh vật vẫn có khả năng xâm nhập và
mọc lên bên dưới nơi đặt băng gạc.
X.

KẾT LUẬN

− Từ các thí nghiệm trên ta thấy màng BC so sánh với miếng băng gạc thì màng BC vừa
có tính giữ nước, giữ ẩm vừa có khả năng ngăn sự xâm nhiễm của vi khuẩn tốt hơn. Khả
năng bám dính tốt hơn và các điều kiện đó phù hợp cho các ứng dụng điều trị các loại
vết thương ngoài da, hỗ trợ làm lành vết thương nhanh hơn.
XI.

CÂU HỎI ÔN TẬP

1 Trình bày các u cầu cần có của một vật liệu dùng để đắp và chữa bỏng?

− Hỗ trợ quá trình điều trị làm kín vết thương và hỗ trợ làm lành vết thương.
− Ngăn ngừa nhiễm khuẩn.
− Có thể giải phóng các hợp chất hỗ trợ điều trị các tổn thương trên da.
+

Liệt kê và miêu tả đặc tính của các loại vi sinh vật thường gặp trên da?

− Những vi sinh vật gặp thường xuyên trên da:
+

+

Các

cầu

khuẩn

gram

dương

như

S.

epidermidis,

Micrococcus

sp,

Peptostreptococcus (kỵ khí), S. epidermidis có ở hầu hết các vùng da trên cơ thể. Chúng
có thể là căn nguyên gây bệnh ở bệnh nhân nằm viện được đặt thông, catheter.
+

+ Một số trực khuẩn gram dương ưa khí hoặc kỵ khí như Propionibaterium (hay có ở

tuyến bã sâu), Corynebacterium, Bacillus (vi khuẩn Gram dương ưa khí sinh nha bào),
Diphteroid. Propionibaterium acnes loại vi khuẩn Gram dương kỵ khí thường có ở trong
các tuyến nơi có mức oxygen thấp.


+

+ BÀI 3: MƠ HÌNH BỎNG TRÊN CHUỘT
I

LÝ THUYẾT

− Thử nghiệm động vật hay thí nghiệm trên động vật , là việc sử dụng các lồi động vật
(khơng phải là con người) trong các thí nghiệm nhằm kiểm sốt các yếu tố ảnh hưởng
đến hành vi hoặc hệ thống sinh học đang được nghiên cứu, những động vật được chọn
thí nghiệm gọi là sinh vật mơ hình. Các loại chuột nhắt, chuột cống, thỏ, cá, lưỡng cư và
bò sát là các lồi động vật thường dùng trong các thí nghiệm động vật.
− Chuột nhắt nhà (Mus musculus) thuộc bộ Rodentia, họ Muridae. Chuột nhắt nhỏ có lơng
ngắn tồn thân, đi dài khơng lơng, tại trịn và dựng đứng, miệng nhọn, chân có 5 ngón.
Chuột có đời sống từ 1-3 năm, trọng lượng vừa (đực 20-30g , cái 18-35g ), trọng lượng

khi sinh dao động từ 1-2g, nhịp đập từ 310-840 nhịp, nhịp thở 80-230 nhịp. Lượng mẩu
chuột trung bình là 7-8 % trọng lượng cơ thể, tức 1.5-2.5 ml, lượng nước tiểu mỗi ngày
từ 0.5-1 mL, nhiệt độ trung bình 36.5-38°C.
− Chuột nhắt nhỏ là một mơ hình phổ biến cho các thí nghiệm thử độc tính, mơ hình bệnh
tiểu đường, mơ hình bỏng ... Trong nghiên cứu về mơ hình bỏng, các kỹ thuật thường sử
dụng là dùng nước nóng, thanh sát nóng, dịng điện, paraffin nóng, hóa chất,...
XII.

MẪU VẬT DỤNG CỤ THIẾT BỊ HÓA CHẤT
1 Mẫu vật

− Chuột thí nghiệm (chuột đực khoảng 8-10 tuần tuần ni) ở Viện Pastuer.
+

Dụng cụ

+
+
+
+
+
+
+
+

Miếng sắt có kích thước 1x1 cm
Lame/lamelle
Kẹp
Đèn cồn
Giấy lọc

Dao cạo + lưỡi lam
Buồng đếm hồng cầu
Ống trộn bạch cầu

+ Kính hiển vi
+ Thước
+ Kim tiêm 1mL


+

Hóa chất

+

Diethyl ether

+

Dầu mù u

+

Dd Povidine 1%

+

Cồn 70%

+

Dd 0.1N HCl

+

Natri citrate 3.8%

XIII.

PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH
1 Đếm số lượng bạch cầu tổng

− Lấy máu đuôi chuột ( Dùng kim tiêm 1ml lấy máu từ tĩnh mạch hoặc cắt chóp đi
chuột. Lưu ý tráng dụng cụ lấy máu bằng dung dịch chống đông Natri citrate 3.8 %
trước khi lấy máu).

+
− Dùng ống trộn bạch cầu hút máu đến vạch 0.5 , tránh bọt khi xuất hiện trong quá trình
hút mẫu . Pha loãng máu bằng cách hút dung dịch 0.1 N HCl đến vạch 11 (pha loãng 20


lần). Trộn nhẹ bằng cách lắc ống trộn bạch cầu .
− Nhỏ máu đã pha loãng vào buồng đếm,quan sát dưới kính hiển vi
− Đếm số bạch cầu trong 4 ô lớn (thể tích mỗi ô lớn là 0.1 NN3). Nếu gọi B là số bạch cầu
đếm được trên 4 ơ lớn ở 4 góc thì số bạch cầu trong 1 mm sẽ là :
+

Số bạch cầu trong 0.1NN3 = B/4 x 20 x 10 = B x 50

+

Trong đó:

+

B: số bạch cầu đếm được trong 4 ô 1/10 – thể tích mỗi ơ lớn

+

20: độ pha lỗng

+

Tính tốn và trình bày kết quả bạch cầu tổng các lơ thí nghiệm ở ngày 1 (trước thí

nghiệm tạo bỏng), 3, 7 và 14.
+

Tạo mơ hình bỏng và đánh giá khả năng hỗ trợ lành vết thương trên chuột

− Cạo lông chuột với diện tích 3 x 3 cm tại vị trí muốn gây bỏng

+
− Gây mê chuột bằng diethyl ether trong 60-90 giây (gây mê 1 phút , theo dõi và gây mê
10 giây / lần).


+

− Nung thanh kim loại (que cấy trải) trên đèn cồn trong vòng 2-3 phút và đặt đầu tròn của
thành kim loại vùng da đã cạo lơng trong vịng 10 giây.

− Chia lơ thí nghiệm:
+

Chuột được phủ dầu mù u : Sau khi gây bỏng , sát trùng vết thương và bôi dầu mù u.

+
+

Chuột đối chứng : Sau khi gây bỏng , sát trùng vết thương và rửa bằng saline 0.9 %

đo diện tích , chụp hình vết bỏng tại thời điểm ngày 1 ( sau khi tạo bỏng) ngày 3, 7 và
ngày 14.
+
+
+
+
+


+

Chuột được phủ bằng băng gạc và màng BC không thực hiện nên tiến hành bỏ mẫu

trong môi trường agar
XIV.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Đếm tế bào bạch cầu:

− Đối chứng: chuột được phủ NaCl:
Ngày 1:
+

Chuột được phủ dầu mù u

+

+
Ngày 5:

+


+

Ngày 7:

+
+ Ngày 14:

+
+ Kết quả:
+

+

Ngày

+

1
+

Chuột phủ mù

Ngày

+

5

Ngà

+

y7

Ngà
y 14

+

1750

+

1650

+

1850

+

2100

+

1850

+

1750

+

1900

+

2000

u
+

Chuột phủ
NaCl

 Màng BC và băng gạc
− Nhóm được phân cơng làm thí nghiệm chuột được phủ dầu mờ u và chuột đối chứng nên
gạc và màng BC được bảo quản trong mơi trường , ở điều kiện phịng
+

Hình 1: Băng gạc và màng BC ban đầu, sau 6h và 8h không thay đổi (a là băng gạc; b là màng BC)

+

a

b

+

Hình 2: Băng gạc và màng BC sau 12h (a là băng gạc; b là màng BC)

+

+

a

b

+

Hình 3: Băng gạc và màng BC sau 18h (a là băng gạc; b là màng BC)

+

a

b


+

Hình 4: Băng gạc và màng BC sau 24h (a là băng gạc; b là màng BC)

+

a

b
Hình 5: Băng gạc và màng BC sau 36h (a là băng gạc; b là màng BC)

+

a

b

+

Hình 6: Băng gạc và màng BC sau 36h (a là băng gạc; b là màng BC)

+

+

a

b

+

a

b
Hình 7: Băng gạc và màng BC sau 72h (a là băng gạc; b là màng BC)


+

Hình 8: Băng gạc và màng BC sau 96h (a là băng gạc; b là màng BC)

+

+
+

a
a

b

b

Hình 9: Băng gạc và màng BC sau 120h (a là băng gạc; b là màng BC)
Hình 10: Băng gạc và màng BC sau 120h (a là băng gạc; b là màng BC)

+

a

 Vết bỏng chuột (dầu mù u)

b