Đồ án tốt nghiệp: Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

KHẢ NĂNG SỬ DỤNG MỘT SỐ VI KHUẨN LAB PHÂN
LẬP TRONG KHOANG MIỆNG ỨC CHẾ SỰ TẠO
THÀNH MÀNG SINH HỌC CỦA Lactobacillus fermentum

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Hoài Hương
Sinh viên thực hiện:

Nguyễn Đặng Vân Anh

MSSV: 1311100138

Lớp: 13DSH02

TP.Hồ Chí Minh, 2017


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là cơng trình nghiên cứu của tơi dưới sự hướng dẫn của TS.
Nguyễn Hồi Hương Giảng viên Khoa Cơng Nghệ Sinh Học – Thực Phẩm – Môi
trường của trường Đại Học Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh.
Những kết quả này hồn tồn khơng sao chép từ các nghiên cứu khoa học khác
dưới bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án này đều hồn tồn trung
thực. Tơi xin chịu trách nhiệm tồn bộ về đồ án của mình.
Tp.HCM, ngày tháng

năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đặng Vân Anh

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành được đồ án “Khả năng sử dụng một số vi khuẩn LAB phân
lập trong khoang miệng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus
fermentum” trong suốt quá trình học tập, rèn luyện và trau dồi kiến thức em đã gặp
phải khơng ít lần khó khăn nhưng nhờ có sự quan tâm, giúp đỡ và hướng dẫn tận tình
của TS. Nguyễn Hồi Hương, Giảng viên Khoa Cơng nghệ Sinh học - Thực phẩm Môi trường trường Đại học Công nghệ TPHCM, cùng những kiến thức và kỹ năng cần
thiết Cô truyền dạy mà em có thể đạt được thành quả của ngày hôm nay. Em xin chân
thành cảm ơn cô.
Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến các Thầy Cô giảng viên và
Ban lãnh đạo Khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường trường Đại học

Công nghệ TPHCM đã tạo điều kiện giúp em tiếp cận được nhiều nguồn tài liệu để
hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng thời gian quy định.
Dù đồ án đã hồn thành nhưng khơng tránh khỏi những sai sót nhất định do khả
năng hiểu biết hạn hẹp và thông tin tài liệu không mấy khả quan để phục vụ q trình
thực hiện đồ án. Kính mong nhận được sự góp ý và chỉ dạy của các Thầy Cơ để em học
hỏi thêm những kinh nghiệm, tích lũy cho quá trình học tập rèn luyện và chuẩn bị hành
trang bước sang một mơi trường làm việc mới sau này.
Ngồi ra, con xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến ba mẹ, gia đình, những người đã
bên con và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình thực hiện đồ án tốt
nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn!
TP.HCM, ngày tháng

năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Đặng Vân Anh
ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................................i
LỜI CÁM ƠN ..................................................................................................................ii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iii
PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG ................................................................... v
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ...........................................................................................ii
DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ..............................................................................................iv
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1
1.

Tính cấp thiết của đề tài ....................................................................................... 1

2.

Tình hình nghiên cứu ........................................................................................... 2

3.

Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................. 3

4.

Nhiệm vụ nghiên cứu ........................................................................................... 4

5.

Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 4

6.

Các kết quả đạt được ............................................................................................ 5

7.

Kết cấu đồ án ........................................................................................................ 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ............................................................................................ 6
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB) .............................................................. 6
1.2. Tổng quan về Probiotic .................................................................................. 19
1.3. Màng sinh học ................................................................................................ 31
1.4. Sâu răng .......................................................................................................... 37
CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 44
2.1. Địa điểm nghiên cứu ...................................................................................... 44
2.2. Thời gian thực hiện ........................................................................................ 44
2.3. Vật liệu và thiết bị .......................................................................................... 44
2.4. Phương pháp luận........................................................................................... 45
2.5. Phương pháp thí nghiệm ................................................................................ 47
iii


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN................................................................. 64
3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý ............................................................................ 64
3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa ......................................................................... 67
3.3. Kết quả khả năng sinh enzyme ...................................................................... 71
3.4. Kết quả khả năng kháng khuẩn ...................................................................... 75
3.5. Kết quả khả năng kháng kháng sinh .............................................................. 77
3.6. Kết quả khảo sát khả năng ức chế màng sinh học của các vi khuẩn lactic sau
khi qua xử lý nhiệt ................................................................................................... 81
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................... 84
1.

Kết luận .............................................................................................................. 84

2.

Kiến nghị ............................................................................................................ 84

TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................. 85
PHỤ LỤC XỬ LÝ SỐ LIỆU ......................................................................................... 94

iv


Đồ án tốt nghiệp

PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG
 Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe agar (MRS agar):
 Tween 80

1ml

 MgSO4.7H2O

0.2g

 Cao thịt

10g

 MgSO4.4H2O

0.2g

 Pepton

5g

 K2PO4

2g

 Yest Extract

5g

 Nước cất

1000ml

 D-glucose

10g

 Agar

2%

 Diamonium Citrate 2g
 Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.
 Thành phần môi trường de Man, Rogosa, Sharpe broth (MRS broth):
 Tween 80

1ml

 Diamonium Citrate 2g

 Cao thịt

10g

 MgSO4.7H2O

0.2g

 Pepton

5g

 MgSO4.4H2O

0.2g

 Yest Extract

5g

 K2PO4

2g

 D-glucose

10g

 Nước cất

1000ml

 Điều chỉnh pH = 6.5 ± 0.2 tại 25oC.
 Thành phần nước muối sinh lí:
 NaCl

9g

 Nước cất

1000ml

 Thành phần môi trường Glucose Phosphate broth (MR – VP broth):
 Peptone

7g

 Dextrose

5g

 K2HPO4

5g

 Nước cất

1000ml

v


Đồ án tốt nghiệp

 Thành phần môi trường Simmon citrate agar (SCA)
 MgSO4.7H2O

0,2g

 NH4H2PO4

1g

 K2HPO4

1g

 Na3C6H5O7

2g

 NaCl

5g

 Bromothymol blue 0,08g
 Agar

15g

 Nước cất

1000ml

 Điều chỉnh pH = 6.8 ± 0.2 tại 25oC.
 Thành phần môi trường canh tryptone:
 Tryptone

10g

 NaCl

5g

 Nước cất

1000ml

 Điều chỉnh pH = 7.5 ± 0.2 tại 25oC
 Thành phần môi trường Triple sugar iron agar (TSI):
 Cao thịt

3g

 NaCl

5g

 Peptone

20g

 Na2S2O3

0,3g

 Yeast extract

3g

 Phenol red

0,024g

 Lactose

10g

 Agar

15g

 Sucrose

10g

 Nước cất

1000ml

 Dextrose

1g

 Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại

 FeSO4

0,2g

25oC.

ii


Đồ án tốt nghiệp

 Thành phần môi trường Blood agar:
 Beef heart infusion 500g
 Tryptose

10g

 NaCl

5g

 Agar

15g

 Máu cừu

50ml

 Nước cất

950ml

 Điều chỉnh pH = 7.3 ± 0.2 tại 25oC.
 Thành phần môi trường Skim milk agar:
 Bột sữa gầy

28g

 Casein enzymic hydrolysate

5g

 Cao nấm men

2,5g

 Dextrose

1g

 Agar

15g

 Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC.
 Thành phần môi trường Lactobacillus biofilm medium (LBM):
 Peptone

5g

 CH3COONa.H2O

2,5g

 Cao nấm men

2,5g

 MgSO4

0,05g

 K2HPO4

3g

 MnSO4

0,025g

 (NH4)3C6H5O7

1g

 CaCl2

0,1g

 Dextrose

10g

 Nước cất

1000ml

 Cao thịt

5g

 Tween 80

0,5g

 Điều chỉnh pH = 7.0 ± 0.2 tại 25oC.

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
LAB

Lactic acid bacteria /Lactobacillales

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe

SCA

Simmon citrate agar

SAS

Statistical Analysis Systems

TSI

Triple sugar iron

TN

Thí nghiệm

VK

Vi khuẩn

VSV

Vi sinh vật

ii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ
răng miệng ....................................................................................................................... 3
Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic ..................................... 11
Bảng 1.2. Khả năng đối kháng của các sản phẩm biến dưỡng của vi khuẩn LAB ....... 19
Bảng 2.1. Phân loại khả năng kháng kháng sinh dựa vào đường kính vịng kháng ..... 62
Bảng 3.1. Kết quả thử nghiệm sinh lý .......................................................................... 64
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa ........................................................................ 67
Bảng 3.3. Kết quả thử nghiệm lên men carbohydrate .................................................. 69
Bảng 3.4. Kết quả khả năng sinh enzyme của các chủng lactic ................................... 71
Bảng 3.5. Tỉ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic (%) ................................................ 76
Bảng 3.6. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic ........................................... 77
Bảng 3.7. Kết quả ức chế khả năng tạo màng sinh học của vi khuẩn lactic sau khi xử lý
nhiệt ............................................................................................................................... 82

iii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Mơ ̣t số vi khuẩ n lactic điể n hin

̀ h .................................................................... 8
Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic ........................... 13
Hình 1.3. Cơ chế tác động của Lactobacillus spp. lên những vi khuẩn trong khoang
miệng ............................................................................................................................. 28
Hình 1.4. Các dạng sản phẩm từ sữa có chứa probiotic ............................................... 29
Hình 1.5. Các giai đoạn hình thành màng sinh học ...................................................... 32
Hình 1.6. Mạng lưới EPS cùng tế bào vi khuẩn trong màng sinh học, hình thành dưới
đáy một chai thủy tinh được chụp dưới kính hiển vi điện tử ........................................ 32
Hình 1.7. Vi sinh vật, bùn đất bám dưới đáy tàu thơng qua sự hình thành màng
sinh học ......................................................................................................................... 35
Hình 1.8. Vi khuẩn chịu nhiệt hình thành màng sinh học dày khoảng 20 mm trong hồ
nước nóng Mickey, Oregon .......................................................................................... 36
Hình 1.9. Đốm trắng – dấu hiệu đầu tiên của sự khử khoáng ở men răng .................... 39
Hình 1.10. Răng bị tổn thương nghiêm trọng do q trình khử khống ....................... 39
Hình 1.11. Giản đồ mơ tả lý thuyết nguyên nhâu gây sâu răng .................................... 40
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................................... 46
Hình 2.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng ức chế màng sinh học sau khi vi khuẩn
lactic bị xử lý nhiệt ........................................................................................................ 63
Hình 3.1. Kết quả nhuộm bào tử bằng Malachite green của các chủng lactic ............. 66
Hình 3.2. Kết quả thử nghiệm sinh dưỡng kỵ khí. Dưới đáy ống nghiệm có xuất hiện
sinh khối, chứng tỏ các chủng đều tăng trưởng bình thường khi khơng có khí O2 ....... 67
Hình 3.3. Kết quả thử nghiệm Citrate (+: Salmonella typhimurium) ........................... 68
Hình 3.4. Kết quả thử nghiệm H2S ............................................................................... 68
Hình 3.5. Kết quả thử nghiệm Indole (+:Escherichia coli) .......................................... 69
Hình 3.6. Kết quả lên men carbohydrate của các chủng lactic .................................... 70
Hình 3.7. Kết quả thử nghiệm tan huyết của các chủng lactic ..................................... 72
iv


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.8. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Casein ........................................ 73
Hình 3.9. Kết quả khả năng sinh enzyme thủy phân Gelatin ....................................... 73
Hình 3.10. Tất cả các chủng đều chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính với
thử nghiệm β- galactosidase ........................................................................................... 74
Hình 3.11. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ kháng khuẩn của các chủng lactic ........................... 75
Hình 3.12. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng lactic ......................................... 80
Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn tỷ lệ ức chế khả năng tạo màng sinh học của các vi khuẩn
lactic sau khi xử lý nhiệt ............................................................................................... 81

v


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Song song với sự phát triển về kinh tế, chính trị và xã hội thì các nghiên cứu khoa
học thuộc lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng ngày càng phát triển. Ngày nay con người
đã ứng dụng các thành tựu khoa học công nghệ vào trong cuộc sống, từ công nghiệp,
nơng nghiệp, an ninh quốc phịng cho đến giải trí, v.v...
Các nhà khoa học cùng với các nhà nghiên cứu đã ứng dụng các kiến thức từ
các tài liệu trên toàn thế giới và áp dụng các biện pháp kỹ thuật mới để cho ra đời các
giống cây trồng, vật ni, vi sinh vật có tính năng ưu việt hơn các giống hiện có. Bên
cạnh đó người ta cịn tạo ra những loại thức ăn mới, nghiên cứu ra các loại thuốc, các
bộ kit xác định bệnh, những nhân tố mới có giá trị phục vụ đời sống, phát triển kinh tế
- xã hội và bảo vệ mơi trường.
Ngồi ra, đã có nhiều kết quả nghiên cứu khoa học áp dụng cho lĩnh vực công
nghệ thực phẩm. Từ những nghiên cứu đó chúng ta cho ra đời các loại vi sinh vật dùng
trong chế biến nhằm làm tăng giá trị dinh dưỡng, cảm quan và bảo quản thực phẩm,

làm cho thực phẩm không đơn giản chỉ là bổ sung năng lượng mà cịn có thể giúp con
người phịng chống một số bệnh, tăng cường hệ miễn dịch của cơ thể.
Đi đôi với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu sử dụng các chế phẩm,
thực phẩm cũng như việc sinh hoạt lành mạnh để có được sức khỏe tốt luôn là mục tiêu
của rất nhiều người đang hướng tới. Thời gian gần đây, chúng ta thường nghe nhiều về
khái niệm “Probiotics” mà không phải ai cũng hiểu Probiotics là gì. Probiotics trên
thực tế chính là các vi khuẩn sống có lợi đường ruột, khi ăn vào đem lại các lợi ích sức
khoẻ con người nhờ cải thiện hệ vi sinh đường ruột và chức năng của ruột. Hai lồi vi
khuẩn probiotics thơng dụng hiện này Bifidobacteria và Lactobacillus. Vi khuẩn
probiotic giúp tăng cường hệ miễn dịch, ngăn ngừa ung thư... Ngồi ra, việc có thể phát
hiện được một lồi vi khuẩn có khả năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của các vi
khuẩn có hại trong khoang miệng để hạn chế khả năng gây sâu răng đồng thời mang
1


Đồ án tốt nghiệp

tính an tồn như một chủng vi khuẩn Probiotic cũng được khá nhiều nhà khoa học quan
tâm và đó là lý em em chọn thực hiện đề tài này. Em muốn mình có thể tìm hiểu cụ thể
hơn về loại vi khuẩn này cũng như hy vọng rằng có thể vận dụng những điều mình biết
được vào thực tế, cụ thể là khi làm việc sau này.

2. Tình hình nghiên cứu
Trong nhiều năm qua, đã có nhiều nghiên cứu in vivo và in vitro nhằm tìm ra tác
động của vi khuẩn lactic trong khoang miệng. Các nhà khoa học cũng mong muốn khi
vi khuẩn lactic được sử dụng dưới dạng probiotic sẽ có khả năng tồn tại một thời gian
nhất định trong nước bọt. Năm 2006, Haukioja và cộng sự đã tìm được một số chủng
probiotic có khả năng này [43], khiến cho việc sử dụng vi khuẩn lactic nói chung và
probiotic nói riêng để bảo vệ răng miệng trở nên khả quan hơn.
Bussher và cộng sự đã xác định được rằng L. acidophilus và L. casei có trong sữa

chua đã làm giảm tỷ lệ của các Lactobacillus spp. khác và Streptococcus mutans trong
nước bọt và mảng bám răng của các đối tượng nghiên cứu xuống sau một tuần sử dụng
[48]. Ahola và cộng sự cũng khảo sát tương tự nhưng trong sản phẩm lên men pho mát,
LGG và Lactobacillus rhamnosus LC 705 có trong pho mát có thể làm giảm tỷ lệ sâu
răng ở trẻ nhỏ [49].
Hallstrom và cộng sự cũng đã chứng minh được việc sử dụng chủng probiotic
L. reuteri ATCC 55730 và ATCC PTA 5289 khơng góp phần hình thành mảng bám
trong khoang miệng [44].
Hầu hết các nghiên cứu lâm sàng của probiotic trong việc bảo vệ răng miệng đều
thông qua việc định lượng tổng vi khuẩn mutans streptococci (MS) trong khoang
miệng. Các thành quả nghiên cứu trong những năm gần đây được tổng hợp ở bảng 1.

2


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 0. Tổng hợp các nghiên cứu khảo sát một số chủng probiotic trong việc bảo vệ
răng miệng [50].

Tác giả

Nase và cs, 2001
Ahola và cs, 2002
Nikawa và cs, 2004
Montalto và cs, 2004
Caglar và cs, 2005
Caglar và cs, 2006
Caglar và cs, 2007
Caglar và cs, 2008

Caglar và cs, 2009
Cildir và cs, 2009
Stecksen-Blicks và cs,
2009
Lexner và cs, 2010
Singh và cs, 2011
Jindal và cs, 2011
Marttinen và cs, 2012
Chuang và cs, 2011
Cildir và cs, 2012
Petersson và cs, 2011
Taipale và cs, 2012

7m
3w
2w
45 d

Độ tuổi –
số đối
tượng
nghiên
cứu
1–6, 594
18–35, 74
20, 40
23–37, 35

2w

21–24, 21



-

2w
3w
10 d

21–25, 120
21–24, 80
20–24, 40





-

10 d

20, 20



-

2w

12–16, 24



-

21 m

1–5, 174





2w

12–15, 20



-

10 d

12–14, 40



-

14 d

7–14, 150



-

2w

20–30, 13



-

2w

20–26, 70



-

25 d

4–12, 19



-

15 m

58–84, 160
2 tháng
tuổi đến 2
tuổi, 106
12-15, 40
10-12, 40












-

Thời
gian
nghiên
cứu

Chủng probiotic

L. rhamnosus GG
Lactobacillus spp.
L. reuteri ATCC 55730
Lactobacillus spp.
Bifidobacterium animalis ssp.
lactis DN-173010
L. reuteri ATCC 55730
L. reuteri ATCC 55730
Bifidobacterium lactis BB-12
L. reuteri ATCC 55730, L. reuteri
ATCC PTA 5289
Bifidobacterium animalis ssp.
lactis DN-173010
L. rhamnosus LB21
L. rhamnosus LB21
L. acidophilus La5
Bifidobacterium lactis Bb-12
L. rhamnosus, Bifidobacterium
longum, Saccharomyces cerevisae
L. rhamnosus GG, L. reuteri
SD2112, L. reuteri PTA 5289
L. paracasei GMNL- 33
L. reuteri ATCC PTA 5289, L.
reuteri DSM 17938
L. rhamnosus LB21
Bifidobacterium animalis BB-12

15 m
Juneja và Kakade, 2012

Sudhir và cs, 2012

L. rhamnosus hct 70
L. acidophilus

9w
3w

Tổng MS
trong
khoang
miệng

Tình
trạng
sâu
răng







-

(d, ngày; w, tuần; m, tháng;, giảm;  , không thay đổi; -, âm tính)

3. Mục tiêu nghiên cứu
Sử dụng các chủng vi khuẩn lactic đã được phân lập từ khoang miệng. Mục tiêu

cuối cùng sau khi thực hiện các thử nghiệm khảo sát là xác định xem chúng có khả

3


Đồ án tốt nghiệp

năng ức chế sự tạo thành màng sinh học của Lactobacillus fermentum khơng và có đủ
an tồn để bổ sung vào các sản phẩm sử dụng cho con người và động vật không.

4. Nhiệm vụ nghiên cứu
_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý, sinh hóa.
_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn.
_ Khảo sát khả năng kháng kháng sinh.
_ Xác định độ an toàn và khả năng ức chế màng sinh học của Lactobacillus fermentum.
5. Phương pháp nghiên cứu
a) Phương pháp luận
_ Tiến hành các thử nghiệm sinh lý: khả năng chịu nhiệt ở 10oC, 45oC, 60oC; khả năng
chịu mặn: 3,5% NaCl và 6,5% NaCl; khả năng sinh bào tử; khả năng sinh dưỡng trong
điều kiện kỵ khí.
_ Tiến hành các thử nghiệm sinh hóa: khả năng lên men carbohydrate; thử nghiệm MR
– VP; thử nghiệm Citrate; Thử nghiệm Indole; khả năng sinh H2S.
_ Khảo sát khả năng sinh enzyme: enzyme thủy phân Gelatin; enzyme thủy phân
Casein; thử nghiệm tan huyết; thử nghiệm 𝛽 – Galactosesidase.
_ Khảo sát khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đo độ đục.
_ Khả năng kháng kháng sinh bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Agar Diffusion
Test).
_ Khả năng ức chế tạo màng sinh học của Lactobacillus fermentum sử dụng các vi
khuẩn lactic sau xử lý nhiệt.
b) Phương pháp xử lý số liệu

-

Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị.

-

Sử dụng phần mềm SAS 9.4 để xử lý số liệu.
4


Đồ án tốt nghiệp

6. Các kết quả đạt được
_ Chọn được chủng vi khuẩn lactic an tồn và có thể ứng dụng để ức chế sự hình thành
màng sinh học của Lactocbacillus fermentum.
7. Kết cấu đồ án
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề
tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.
Chương 4: Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề
tài đạt được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.

5


Đồ án tốt nghiệp

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1.

Tổng quan về vi khuẩn Lactic (LAB)

1.1.1. Giới thiệu chung
Vi khuẩn lactic (LAB) có vai trò rất quan trọng trong cuộc sống của chúng ta.
Chúng tạo ra các thực phẩm lên men và bảo quản thực phẩm khỏi bị hư hỏng. Từ đầu
thế kỷ 20, Elie Metchnikoff (1845-1916) đã đề xuất sử dụng các LAB cho mục đích
chữa bệnh. Từ đó, lĩnh vực nghiên cứu probiotic đã ra đời và phát triển. Đến nay,
những nghiên cứu về probiotic đã không ngừng cung cấp những bằng chứng có tính
khoa học về hiệu quả thực sự của probiotic đối với sức khỏe con người.
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại
thực phẩm lên men (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc
để sản xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà
hóa học người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua.
Năm 1875, L. Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động
của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister
đã phân lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là
Streptococcus lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic
đã được hình thành.
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, hiện nay chúng được công nhận là
an toàn sinh học (generally recognized as safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên
trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi sinh vật có ích của con người.
Một đặc tính quan trọng khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra
bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin,
plantacin,... có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển
của các nguồn bệnh trong thực phẩm [2] [3].

6


Đồ án tốt nghiệp

Vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn diện rộng do có khả năng sản xuất ra
các chất ức chế: như một số acid hữu cơ, hydrogen peroxide, diacetyl, các chất có khối
lượng phân tử thấp và bacteriocin là chất có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram (+) và
vi khuẩn gram (-). Các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sản sinh acid hữu cơ, đặc
biệt là acid lactic trong quá trình sinh trưởng và phát triển. Đối với hydroxy peroxide
thì khả năng kháng khuẩn là do việc tạo ra các chất oxy hóa mạnh như oxygen nguyên
tử, các gốc tự do superoxide và các gốc tự do hydroxyl. Đối với bacteriocin, cơ chế
kháng khuẩn do vi khuẩn lactic tổng hợp đã được nghiên cứu đầu tiên ở nisin,
bacteriocin gram (+) [4].
1.1.2. Đă ̣c điểm hình thái của vi khuẩ n lactic.
Các tế bào có hình dáng đa dạng: từ hình que dài, mảnh đến hình que ngắn uốn
cong, thường tạo thành chuỗi. Khơng có khả năng di động (ngoại trừ một số chủng có
tiên mao hoặc lông roi trên bề mặt cơ thể), không sinh bào tử, gram dương. Một số
chủng thể hiện tính lưỡng cực, xuất hiện các chấm nhỏ hoặc các đường kẻ dọc (quan
sát qua kính hiển vi) khi nhuộm vi khuẩn với thuốc nhuộm gram hoặc methylene blue.
[51]
Khuẩn lạc của vi khuẩn lactic trịn nhỏ, trong bề mă ̣t bóng, màu trắng đục hoặc
màu vàng kem, hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn trịn lồi trắng đục. Đặc biệt khuẩn
lạc tỏa ra mùi chua của acid.
Về kích thước tế bào thì đối với các dạng cầu khuẩn là từ 0.5 – 1.5μm. Các tế
bào hình cầu xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Cịn với trực
khuẩn thì từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng lẻ hoặc kết thành chuỗi.
 Đặc điểm hình thái giống vi khuẩ n lactic điể n hin
̀ h:
Trong số các vi khuẩ n lactic, giố ng Lactobacillus đươ ̣c xem là đa ̣i diê ̣n cho chủng

vi khuẩ n này.

7


Đồ án tốt nghiệp

Tùy thuộc vào hình thái tế bào mà người ta chia vi khuẩn lactic thành 2 dạng :
hình cầu và hình que. Kích thước của chúng thay đổi tùy theo từng loài.
_ Giống Lactobacillus
 Giới : Vi khuẩn
 Ngành : Firmicutes
 Lớp: Bacilli
 Bộ: Lactobacillales
 Họ: Lactobacillacea
 Giống: Lactobacillus

a)

c)

d)

b)
Hình 1.1. Mơ ̣t sớ vi kh̉ n lactic điể n hình
a) Lactobacillus casei
b) Latobacillus brevis
c) Lactobacillus bulgaricus

d) Lactobacillus plantarum

8


Đồ án tốt nghiệp

Chi Lactobacillus hiện bao gồm hơn 125 loài như: L. acidophilus, L. brevis, L.
casei, L. fermentum, L. plantarum, L. bulgaricus …
Tế bào có dạng hình que nhưng hình dạng của chúng có thể thay đổi tùy vào điều
kiện của mơi trường sống, có thể là dạng que ngắn hoặc dài, xếp thành chuỗi hay đứng
riêng lẻ hoặc ở dạng que kép. Lactobacillus là vi khuẩn Gram dương, khơng di động,
khơng sinh bào tử, âm tính với catalase, kỵ khí chịu oxy, có khả năng chịu được mơi
trường có pH thấp. Một số lồi có thể phát triển ở môi trường nghèo chất dinh dưỡng,
và chịu được nhiệt độ cao. Ngoại trừ lồi L. plantarum thì những lồi khác khơng có
khả năng chuyển hóa nitrate khi ở điều kiện nhất định.
Các lồi Lactobacillus thường được tìm thấy các sản phẩm lên men từ động vật
và thực vật, đặc biệt là trong các sản phẩm sữa, trong hệ tiêu hóa, hệ bài tiết và hệ sinh
dục người. Các loại thực phẩm lên men như sữa chua và thực phẩm chức năng cũng có
chứa các vi khuẩn này như: Lactobacillus pasterian, Lactobacillus brevis,
Lactobacillus axitophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus
plantarum.
Sự phân chia của vi khuẩn lactic dựa theo các sản phẩm của q trình trao đổi
chất của chúng. Vì vậy có thể chia các lồi Lactobacillus thành 3 nhóm như sau:
-

Nhóm I (Lên men đồng hình bắt buộc): Chúng được gọi là Thermobacterium,
có fructose - 1,6 - diphosphate aldolase (FDP aldolase) nhưng khơng có
phosphoketolase. Chúng lên men được hexose để tạo acid lactic nhưng không
lên men được pentose, thường phát triển ở 45oC.

-

Nhóm II (Lên men dị hình tùy nghi): Chúng được gọi là Streptobacterium (có
FDP aldolase và cảm ứng phosphoketolase). Tuy nhiên, hexose là lên men
đồng hình và pentose được chuyển thành acid lactic và ethanol hoặc acid
acetic.

9


Đồ án tốt nghiệp

-

Nhóm III (Lên men dị hình bắt buộc): Chúng được gọi là Betabacterium (có
phosphoketolase nhưng khơng có FDP aldolase), quá trình trao đổi chất cả
hexose và pentose lên men dị hình.

Trên thực tế, đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Lactobacillus rất hữu ích
trong việc điều trị hoặc ngăn ngừa nhiễm nấm, nhiễm trùng đường ruột, hội chứng
ruột kích thích, tiêu chảy do dùng thuốc kháng sinh, tiêu chảy do nhiễm khuẩn
Clostridium difficile, cơ thể không phân giải được lactose, bệnh về da như: ban đỏ
do sốt, chàm, viêm loét da và ngăn ngừa nhiễm trùng đường hơ hấp.
1.1.3. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa
1.1.3.1.

Đặc điể m sinh lý, sinh trưởng

Sinh dưỡng ở điểu kiện kỵ khí tùy nghi, thường tăng trưởng trên bề mặt mơi
trường rắn kèm theo các điều kiện: kỵ khí, giảm áp suất oxy, 5-10% CO2. Có thể bị ức

chế tăng trưởng trong điều kiện hiếu khí, một số lồi thuộc nhóm sinh vật kỵ khí bắt
buộc.
Có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, dẫn xuất acid
nucleic, vitamin, khoáng, acid béo, ester acid béo và carbohydrate. Các yêu cầu dinh
dưỡng đặc trưng cho từng loài, thường là các chủng đặc biệt. Nhiệt độ tăng trưởng từ
2 – 53oC, nhiệt độ tối ưu khoảng 30 – 40oC.
Tăng trưởng tốt trong điều kiện môi trường acid, pH tối ưu khoảng 5.5 – 6.2,
thường tăng trưởng ở mức pH 5.0 hoặc thấp hơn, tốc độ tăng trưởng giảm trong điều
kiện pH mơi trường trung tính hoặc kiềm.

10


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 1.1. Đặc điểm sinh lý của một số chủng vi khuẩn lactic
Nhiệt

Chi

Hình

Lên

độ tăng

thái tế

men

trưởng,

bào

lactic

o

C

Khả năng
chịu
muối,%

pH tăng
trưởng

10

45

6,5

18

4,4

9,6

Lactic aicd

isomer

Lactobacillus

que

đh/dh

±

±

±

-

±

-

D,L,DL

Lactococcus

Cầu

đh

+

-

-

-

±

-

L

Leuconostoc

Cầu

dh

+

-

±

-

±

-

D

Oenococcus

Cầu

dh

+

+

±

-

±

-

D

Pediococcus

Tứ cầu

đh

±

±

±

-

+

-

D,L,DL

Streptococcus

Cầu

đh

-

+

-

-

-

-

L

Tetragenococcu

Tứ cầu

đh

+

-

+

+

-

+

L

Aerococcus

Tứ cầu

đh

+

-

+

-

-

+

L

Carnobacterium

Que

dh

+

-

-

-

-

-

L

Enterococcus

Cầu

đh

+

+

+

-

+

+

L

Vagococcus

Cầu

đh

+

-

-

-

±

-

L

Weissella

Cầu

dh

+

-

±

-

±

-

D,L,DL

s

(đh: đồng hình ; dh: dị hình)

1.1.3.2.

Đặc điể m sinh hoá

Vi khuẩ n lactic là vi khuẩ n gram (+), oxidase âm tính, không có khả năng di đô ̣ng
đồ ng thời không sinh bào tử, có khả năng lên men carbonhydrate.
Hiếm khi khử nitrate, chỉ khi pH cuối cùng từ 6.0 trở lên hoặc có bổ sung vào môi
trường tăng trưởng. Không thủy phân gelatine (làm gelatine hóa lỏng), khơng phân giải

11


Đồ án tốt nghiệp

casein nhưng một lượng nhỏ nitơ hòa tan được sản xuất ra bởi hầu hết các chủng. Thử
nghiệm Indole âm tính và khơng sản xuất H2S.
Catalase và cytochrome âm tính (khơng có prophyrin), tuy nhiên, một vài chủng
của một số loài phân hủy H2O2 bằng pseudocatalase hoặc bằng chính catalase của
heme có mặt trong mơi trường. Phản ứng Benzidine âm tính. Hiếm có trường hợp hình
thành sắc tố, nếu có sẽ xuất hiện màu cam, vàng, đỏ gạch. [51]

1.1.3.3.

Quá trình trao đổi chất

Quá trình trao đổi chất và năng lượng của vi khuẩn lactic thực hiện thông qua
việc lên men lactic. LAB có khả năng lên men các loại đường hexose (glucose,
mannose, galactose, fructose…), disaccharide (lactose, saccharose…); pentose
(arabinose, xylose, ribose…) và các hợp chất liên quan. Chúng chỉ sử dụng được các
loại đường ở dạng đồng phân D. Tuy nhiên, LAB có thể thích ứng với nhiều điều kiện
khác nhau làm thay đổi cách thức trao đổi chất và dẫn đến các sản phẩm cuối cùng tạo
ra cũng khác nhau.
Q trình lên men lactic có thể đồng hình hoặc dị hình. Lên men đồng hình gồm
con đường EMP chuyển hóa đường thành pyruvate, sau đó pyruvate bị khử thành
lactic acid 90% đường được chuyển hóa thành acid lactic. Trong khi đó ở lên men
lactic dị hình chỉ 50% đường được chuyển hóa thành acid lactic, cịn lại là CO 2,
acetaldehyde, ethanol.

12


Đồ án tốt nghiệp

Hình 1.2. Sơ đồ các con đường lên men lactose của vi khuẩn lactic
A) Lên men đồng hình . B) Lên men dị hình
13