Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nhân giống cây ba kích morinda officianalis how bằng phương pháp nuôi cấy mô
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.17 MB, 113 trang )
....
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
----------------------------------------------
HỒNG THỊ THẾ
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH
(Morinda officianalis. How) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ
LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số
: 60.62.01
Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
HÀ NỘI - 9/2012
LỜI CAM ðOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Kết quả
nghiên cứu trong luận văn là kết quả lao động của chính tác giả. Các số liệu
và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng
bố trong bất cứ cơng trình nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này
đã được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ
nguồn gốc.
Tác giả luận văn
Hồng Thị Thế
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
i
LỜI CẢM ƠN
ðề tài tốt nghiệp: "Nghiên cứu nhân giống cây Ba kích (Morinda
officianalis. How) bằng phương pháp ni cấy mơ” được thực hiện từ tháng 7
năm 2011 đến tháng 9 năm 2012.
ðề tài hoàn thành nhờ sự cố gắng, nỗ lực của bản thân, sự hướng dẫn tận
tình của TS. Nguyễn Thị Phương Thảo. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả
cũng nhận được những ý kiến chỉ bảo, đóng góp của các thầy cơ giáo Bộ mơn
Sinh lý thực vật - Khoa nơng học, sự tạo điều kiện giúp ñỡ của Trung tâm
Khoa học và sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh và các bè ñồng nghiệp.
Nhân dịp này xin cho phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc ñến TS. Nguyễn Thị
Phương Thảo, các thầy cô giáo, Ban giám đốc và Bộ mơn nghiên cứu ni
cấy mơ Trung tâm Khoa học và sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh cùng
các bè ñồng nghiệp - những người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên
và đóng góp ý kiến quý báu cho ñề tài này. Thiếu những sự ủng hộ đó đề tài
chắc chắn khơng thể đạt được như hiện hữu. Với kinh nghiệm và năng lực của
bản thân, mặc dù ñã cố gắng hết mức, ñề tài chắc khơng thể tránh khỏi những
thiếu sót nhất định. Tác giả rất mong ñược sự chỉ bảo của các thầy cơ giáo,
các bạn bè đồng nghiệp và ln coi đó là sự tạo ñiều kiện, cơ hội ñể tác giả
tiếp thu, học hỏi. Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2012
Tác giả luận văn
Hoàng Thị Thế
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
ii
MỤC LỤC
Lời cam ñoan
i
Lời cảm ơn
ii
Mục lục
iii
Danh mục các từ viết tắt
vi
Danh mục các bảng
vii
danh mục các hình
ix
1
MỞ ðẦU
1
1
ðặt vấn ñề
1
2
Mục ñích, yêu cầu
3
2.1
Mục ñích
3
2.2
Yêu cầu
3
2
TỔNG QUAN VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU
5
2.1
Giới thiệu về cây Ba kích.
5
2.2
Tình hình phát triển nguồn dược liệu và cây ba kích ở Việt Nam
8
2.3
Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào.
2.4
Những nghiên cứu về nhân giống bằng phương pháp ni cấy mơ
cây ba kích
3
11
18
ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
21
3.1
ðối tượng, vật liệu nghiên cứu.
21
3.2
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
21
3.3
ðịa ñiểm và thời gian bố trí thí nghiệm
33
4
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
34
4.1
Giai đoạn vào mẫu
34
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iii
4.1.1
Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian khử trùng trong thuỷ ngân
clorua (HgCl2) 0,1% ñến khả năng khử trùng mẫu cấy.
4.1.2
Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong canxi
hypoclorit Ca(HClO)2 10% ñến khả năng khử trùng mẫu cấy.
4.1.3
34
35
Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng kép (kết hợp
giữa HgCl2 0,1% và Ca(HClO)2 10%) ñến khả năng khử trùng
mẫu cấy.
36
4.2
Giai ñoạn tái sinh chồi
38
4.2.1
Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + BAP ñến khả năng tái sinh chồi từ
mẫu cấy.
38
4.3
Giai ñoạn nhân nhanh
40
4.3.1
Nghiên cứu ảnh hưởng của KIN ñến khả năng nhân nhanh và
chất lượng chồi.
4.3.2
Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ñến khả năng nhân nhanh và
chất lượng chồi.
4.3.3
45
Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA ñến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi.
4.3.6
44
Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp KIN và NAA ñến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi.
4.3.5
41
Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp KIN và IBA ñến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi.
4.3.4
40
46
Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α -NAA ñến khả năng
nhân nhanh chồi
47
4.3.7
Nghiên cứu ảnh hưởng của axit ascorbic ñến chất lượng chồi.
49
4.3.8
Nghiên cứu ảnh hưởng riboflavin (vitamin B2) đến chất lượng
4.4
chồi.
51
Giai đoạn tạo cây hồn chỉnh.
52
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iv
4.4.1
Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng ra rễ
53
4.4.2
Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA ñến khả năng ra rễ của chồi
55
4.4.3
Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính ñến chất lượng bộ rễ.
58
4.5
Giai ñoạn sau in vitro
60
4.5.1
Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi cây mầm ra ngơi đến tỷ lệ sống
của cây con ngoài vườn ươm.
4.5.2
60
Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây con
ngồi vườn ươm.
62
4.6
Sản xuất thử nghiệm, ñánh giá hiệu quả kỹ thuật, hiệu quả kinh tế.
64
4.6.1
Sản xuất thử nghiệm
64
4.6.2
Hiệu quả kỹ thuật
64
4.6.3
Hiệu quả kinh tế
64
5
KẾT LUẬN, ðỀ NGHỊ
67
5.1
Kết luận
67
5.2
ðề nghị
68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
69
PHỤ LỤC
72
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
v
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
MS
Murashige & Skoog, 1962
BAP
6-Bezyl amino purine
KIN
Kinetin (6 -furfurol amino purine)
IBA
Indole -3 -Butyric Acid
α-NAA
1 -Naphthalene Acetic Acid
CT
Công thức
ðC
ðối chứng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
vi
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
4.1
Tên bảng
Trang
Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong HgCl2 0,1% ñến khả
năng khử trùng mẫu cấy
4.2
Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong Ca(HClO)2 10% ñến
khả năng khử trùng mẫu cấy
4.3
37
Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + BAP ñến khả năng tái sinh chồi từ
mẫu cấy
4.5
36
Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng kép (kết hợp giữa HgCl2
0,1% và Ca(HClO)2 10%) ñến khả năng khử trùng mẫu cấy .
4.4
35
39
Ảnh hưởng của KIN ñến khả năng nhân nhanh và chất lượng
chồi
41
4.6
Ảnh hưởng của BAP ñến hệ số nhân chồi
42
4.7
Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + IBA ñến khả năng nhân nhanh và
chất lượng chồi.
4.8
Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + NAA ñến hệ số nhân nhanh và
chất lượng chồi.
4.9
45
Ảnh hưởng của tổ hợp BAP + IBA ñến hệ số nhân nhanh và
chất lượng chồi.
4.10
44
46
Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α -NAA ñến khả năng nhân
nhanh chồi
48
4.11
Ảnh hưởng của axit ascorbic tới chất lượng chồi
50
4.12
Ảnh hưởng của riboflavin (vitamin B2) ñến chất lượng chồi
51
4.13
Ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng ra rễ
54
4.14
Ảnh hưởng của IBA tới khả năng ra rễ
56
4.15
Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng rễ
58
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
vii
4.16
Ảnh hưởng của tuổi cây mầm khi ra ngơi đến khả năng sống sót
và chất lượng của cây khi đưa ra vườn ươm
4.17
Ảnh hưởng của giá thể ñến khă năng sống sót và sinh trưởng của
cây ba kích ngồi vườn ươm sau 60 ngày
4.18
63
Tổng chi phí, giá thành sản phẩm cây nuôi cấy mô trước khi áp
dụng kết quả nghiên cứu
4.19
61
64
Tổng chi phí, giá thành sản phẩm cây ni cấy mô khi áp dụng
kết quả nghiên cứu
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
65
viii
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT
4.1
Tên hình
Trang
Chồi ba kích tái sinh từ mẫu cấy trên môi trường MS + 0,25 mg/l
KIN +1,0 mg/l BAP sau 30 ngày
39
4.2
Cụm chồi ba kích trên mơi trường MS + 3,0 mg/l BAP sau 45 ngày
43
4.3
Chồi trên môi trường MS + 3,0 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA sau 45
ngày ni cấy
4.4
Chồi ba kích trên mơi trường MS + 3,0 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA
+ 10,0 mg/l riboflavin sau 45 ngày.
4.5
47
51
Rễ ba kích trên mơi trường 1/2MS + 0,4 mg/l α-NAA sau 30
ngày cấy
55
4.6
Rễ ba kích trên môi trường 1/2MS + 0,2 mg/l IBA sau 30 ngày cấy
57
4.7
Rễ ba kích trên mơi trường ½ MS + 0,2 mg/l IBA + 0,4 g/l than
4.8
hoạt tính sau 30 ngày cấy
59
Cây ba kích in vitro (35 ngày tuổi) ra ngôi
61
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
ix
1. MỞ ðẦU
1. ðặt vấn ñề
Hiện nay cùng với sự phát triển của xã hội, ñời sống của con người ñược
nâng cao, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu theo đó cũng ngày càng
tăng. Nguồn dược liệu con người đang sử dụng có thể được tổng hợp bằng nhiều
con đường khác nhau như tổng hợp hóa học, tổng hợp từ sinh vật, song nguồn
dược liệu từ thực vật ñã ñược con người sử dụng từ lâu và nhu cầu ngày càng
lớn. Tuy nhiên các loài dược liệu trong tự nhiên ñang bị giảm về số lượng và
chất lượng bởi sự khai thác quá mức, các ñiều kiện ngày càng bất lợi của mơi
trường tự nhiên,... dẫn đến nhiều loài cây dược liệu quý hiếm bị tuyệt chủng, ảnh
hưởng ñến nguồn cung cấp dược liệu bền vững cho con người [15].
Cây ba kích (Morinda officianalis. How) là cây thuốc quý trong y học
cổ truyền. Theo Quyết ñịnh số 05/2008/Qð-BYT ngày 01/02/2008 của Bộ
trưởng Bộ Y tế về danh mục các vị thuốc y học cổ truyền chủ yếu dùng để khám
chữa bệnh, ba kích đứng đầu trong nhóm các vị thuốc bổ dương khí [14]. Củ của
cây ba kích ñược sử dụng rộng rãi như một loại dược liệu có tác dụng bổ thận
âm, bổ thận dương, tăng cường gân cốt, tăng sức ñề kháng, sức dẻo dai, khử
phong thấp [33]. Dịch chiết từ củ ba kích có tác dụng giảm huyết áp, tác dụng
nhanh với các tuyến cơ năng, bổ trí não, giúp ăn và ngủ ngon [25].
Do nhu cầu sử dụng cây này làm dược liệu ñang gia tăng nên cây ba
kích bị khai thác khai thác ồ ạt nhiều năm dẫn ñến nguồn nguyên liệu ñang trở
nên kiệt quệ, mặt khác vùng phân bố của ba kích bị tàn phá nghiêm trọng
khiến lồi này lâm vào tình trạng gần như tuyệt chủng và được đưa vào sách
ñỏ Việt Nam năm 1996 [1]. Theo Nghị ñịnh số 48/2002/Nð-CP ngày 22
tháng 4 năm 2002 quy ñịnh danh mục thực vật, ñộng vật rừng quý hiếm và
chế ñộ quản lý, bảo vệ thì ba kích thuộc nhóm IIA, thực vật hoang dã, hạn
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
1
chế khai thác, sử dụng [7].
Trước đây người dân có thói quen khai thác củ ba kích trong rừng tự
nhiên, mỗi năm thường khai thác từ vài chục ñến trên một trăm tấn, cung cấp
cho thị trường trong nước và xuất khẩu sang Trung Quốc và Hồng Công [10].
Theo thời gian, người dân ñã thay ñổi nhận thức từ chỗ chỉ biết khai thác cây
ba kích từ rừng tự nhiên đến chỗ có thể gây trồng cây ba kích tại vườn nhà,
vườn ñồi, vườn rừng, ñây ñược coi là “sinh kế” của người dân sống trong và
quanh rừng.
Những năm gần ñây xu hướng trồng và kinh doanh cây ba kích lấy củ
ngày một gia tăng tại các tỉnh phía Bắc do giá trị kinh tế thu ñược hơn hẳn
trồng lúa, ngơ, khoai, sắn [6], nên nhu cầu về giống đặc biệt là cây giống chất
lượng cao ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc nhân giống cung cấp cho nhu cầu
sản xuất hiện nay còn gặp nhiều bất cập.
Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm
hom. Việc nhân giống ba kích bằng phương pháp này tuy có ưu điểm là kỹ
thuật tương đối đơn giản, khơng địi hỏi máy móc thiết bị hiện đại, dễ áp dụng
nhưng cũng có nhiều nhược điểm như: hệ số nhân giống thấp chỉ đạt 0,6
lần/năm [6], địi hỏi nguồn vật liệu cung cấp hom giâm thường xuyên và rất
lớn, cây giống sản xuất ra khơng hồn tồn sạch bệnh, sản xuất phụ thuộc vào
mùa vụ, chất lượng cây giống khơng được ñảm bảo, vì vậy chưa ñáp ứng ñủ
nhu cầu cây giống hiện nay.
Kỹ thuật nuôi cấy mô là một trong số các kỹ thuật nhân giống cây
trồng vơ tính. ðây là một kỹ thuật cao, có nhiều ưu điểm như: hệ số nhân
giống cao, cây giống giữ nguyên ñược các ñặc tính của cây mẹ, ñồng ñều,
sạch bệnh, sức sống cao khi ñưa ra trồng trên ñất, mang lại hiệu quả kinh tế
cao, ... nên hiện nay ñang ñược ứng dụng vào sản xuất thành công trên nhiều
loại cây trồng ñặc biệt là cây lâm nghiệp, nông nghiệp. Kỹ thuật này giúp tạo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
2
ñược số lượng lớn cây giống với phẩm chất tốt, giá thành hạ [12].
Xuất phát từ những cơ sở trên, với mong muốn góp phần bảo vệ, phát
triển cây ba kích - cây dược liệu quý, tiến tới cung cấp cho người dân nguồn
giống chất lượng cao và ổn ñịnh, tơi tiến hành đề tài:
"Nghiên cứu nhân giống cây ba kích (Morinda officianalis. How) bằng
phương pháp ni cấy mơ"
2. Mục ñích, yêu cầu
2.1. Mục ñích
Xác ñịnh ñược một số yếu tố ảnh hưởng đến q trình nhân giống cây
ba kích (Morinda officianalis. How) trên sơ sở đó đề xuất quy trình kỹ thuật
nhân giống in vitro có hệ số nhân cao và chất lượng cây giống tốt.
2.2. Yêu cầu
- Tạo thành cơng nguồn vật liệu khởi đầu thơng qua nghiên cứu xác định
được chế độ khử trùng thích hợp cho tỷ lệ mẫu sạch tái sinh cao.
- Xác ñịnh ñược ảnh hưởng của một số yếu tố trong môi trường ni cấy
gồm: chất điều tiết sinh trưởng, vitamin đến hệ số nhân và chất lượng chồi.
- Nghiên cứu tạo rễ thành cơng cho chồi in vitro.
- Xác định được tiêu chuẩn cây ra ngơi và giá thể thích hợp cho tỷ lệ cây
sống ngoài vườn ươm cao.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài.
3..1. Ý nghĩa khoa học:
ðề tài nhằm tối ưu hóa hơn nữa các thơng số kỹ thuật đã cơng bố trong
quy trình nhân gống cây ba bích bằng phương pháp ni cấy mơ, đây sẽ là
một thành tựu có giá trị khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng, góp
phần đưa cơng tác nghiên cứu gắn liền với thực tế sản xuất.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
3
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- ðề tài ñề xuất quy trình nhân giống ni cấy mơ cây ba kích cho hệ số
nhân cao và chất lượng cây tốt;
- Là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu cùng lĩnh vực;
- Tạo ra nguồn cây giống chất lượng cao cung cấp cho nhu cầu về cây
giống ba kích - một cây dược liệu quý ñang ñược quan tâm gây trồng
hiện nay.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
4
2. TỔNG QUAN VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Giới thiệu về cây Ba kích.
Tên khoa học: Morinda officinalis. How
Tên khác: Cây ruột gà, chẩu phóng xì (Quảng Ninh), sáy cáy (Thái),
thau tày cáy (Tày), chày kavằng dòi (Dao).
2.1.1. Phân loại thực vật học [2].
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa mơi (Lamiidae)
Bộ: Long đởm (Gentianales)
Họ: Cà phê (Rubiaceae)
Chi: Nhàu (Morinda)
Lồi: Morinda officinalis. How
Tên thường gọi: Ba kích
2.1.2. ðặc điểm sinh vật học, sinh thái học [2].
2.1.2.1. Phân bố ñịa lý
+ Thế giới:
Ba kích có phân bố tự nhiên ở Lào, Trung Quốc và Việt Nam.
+ Việt Nam:
Ba kích mọc hoang, phân bố nhiều ở vùng ñồi núi thấp của miền núi và
trung du ở các tỉnh phía Bắc. Ba kích có nhiều ở Quảng Ninh, Bắc Giang,
Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, Yên
Bái, Hà Giang, Hà Tây, Hịa Bình. Gần đây thấy ở Tây Giang - Quảng Nam.
2.1.2.2.ðặc điểm hình thái
+ Thân: cây thân thảo, leo bằng thân, quấn vào cành cây khác hoặc giàn
giá đỡ, thân cây có thể dài tới hàng mét. Cây sống nhiều năm, thân màu tím
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
5
hoặc xanh. Khi thân, cành cịn non thì có lơng bao phủ. Thân, cành già nhẵn,
màu nâu.
+ Lá: mọc ñối, có cuống ngắn, hình thn hoặc bầu dục, dài 6 - 14 cm,
rộng 2,5 - 6 cm, gốc lá tròn, đầu thn nhọn, mép ngun. Lá non có lơng ở
gân và mép lá, dầy hơn ở mặt dưới, màu xanh lục. Lá già ít lơng hơn và màu
trắng mốc. Lá kèm mỏng, gốc dính thành ống và ơm sát thân.
+ Rễ: dạng rễ củ hình trụ trịn, thắt khúc, vặn vẹo, nhiều ñoạn thắt nghẹt như
ruột gà (nên gọi là cây ruột gà), đường kính 1,5 - 2,0 cm.Vỏ ngồi mầu nâu
nhạt hoặc hồng nhạt, nhám, có vân dọc. Bên trong là lớp thịt củ dầy mầu hồng
hoặc tím, khơng mùi, vị ngọt nhưng hơi chát, trong cùng là lõi củ, thơng
thường khi chế biến, sử dụng phần lõi được loại bỏ.
+ Hoa: Cụm hoa tập trung thành tán tròn ở ñầu cành, dài 0,3 - 1,5 cm, gồm
8 - 10 hoa. Hoa mẫu 4 (4 lá ñài, 4 cánh hoa, 4 nhị), lúc non màu trắng sau hơi
vàng. ðài hoa hình chén hay hình ống gồm những lá đài nhỏ hình tam giác
đều phát triển khơng đều nhau. Tràng hoa 4 cánh màu trắng, hàn liền ở dưới
thành ống ngắn. Nhị đính ở đáy của sống tràng. Bầu hạ, vịi chẻ đơi ở đỉnh.
Mùa hoa vào tháng 5, tháng 6.
+ Quả hình cầu, rời, hoặc dính với nhau đường kính 6 - 11 cm. Khi chín
quả màu đỏ, có ñài tồn tại ở ñỉnh.
+ Hạt: nhỏ, màu vàng nhạt, vỏ hạt nhám.
2.1.2.3. ðặc ñiểm sinh vật học, sinh thái học [8].
Mùa hoa tháng 5 ñến tháng 6, mùa quả vào tháng 7 đến tháng 10, quả
chín tháng 11 đến tháng 12. Cây tái sinh bằng hạt hoặc chồi.
- Cây mọc hoang dưới tán rừng thứ sinh, trong các trảng cây bụi và
rừng thưa, ở ven rừng rậm, ưa ẩm.
- Thích hợp vùng nhiệt đới nóng ẩm có 2 mùa mưa và khơ rõ rệt, nhiệt
độ khơng khí mùa khơ từ 8 - 240C và mùa mưa từ 25 - 380C. Lượng mưa năm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
6
từ 1100 - 2000 mm.
- Ưa ñất ẩm mát, thành phần cơ giới trung bình, tầng dày trên 1 m,
nhiều mùn, tơi xốp, khơng chịu được đất bị úng.
- Khi cịn nhỏ cây chịu bóng, thích hợp độ tàn che 0,4 - 0,5, ở nơi ñất
trống cần trồng cây che phủ
Trong tự nhiên có 2 loại: Ba kích tím có lõi củ màu tím. Ba kích trắng
có lá bầu hơn, lõi củ thường có củ màu vàng đến hồng vàng. người sử dụng
thường ưa chuộng ba kích tím hơn ba kích trắng.
2.1.3. Cơng dụng của ba kích
Củ ba kích là loại dược liệu quý dùng trong y học cổ truyền.
+ Tăng sức dẻo dai: Trên thực nghiệm, khi dùng ba kích với liều 510g/kg thể trọng dùng liên tiếp 7 ngày thấy có tác dụng tăng sức dẻo dai cho
súc vật thí nghiệm.
+ Tăng sức đề kháng: Ba kích có tác dụng tăng cường sức ñề kháng của
cơ thể ñối với các yếu tố ñộc hại.
ðối với người già hoặc những bệnh nhân biểu hiện mệt mỏi, ăn kém,
ngủ ít, gầy yếu mà khơng thấy có những yếu tố bệnh lý gây nên và một số
trường hợp có đau mỏi các khớp, ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện
qua những cảm giác chủ quan như giảm mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những
dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. ðối với bệnh nhân đau
mỏi các khớp thì sau khi dùng ba kích dài ngày cho thấy có hiệu quả [35].
+ Chống viêm: Các kết quả nghiên cứu ở chuột cống trắng đã cho thấy
ba kích có tác dụng chống viêm rõ rệt.
+ ðối với hệ thống nội tiết: Các thí nghiệm trên chuột lớn và chuột
nhắt cho thấy ba kích khơng có tác dụng kiểu androgen (là kích thích tố đực)
nhưng có thể có khả năng tăng cường hiệu lực của androgen hoặc tăng cường
quá trình chế tiết hormon androgen [31].
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
7
ðối với nam giới có hoạt động sinh lý yếu ba kích có tác dụng làm tăng
khả năng giao hợp (ñặc biệt ñối với những trường hợp giao hợp yếu, ít). Ba
kích cịn có tác dụng tăng cường sức dẻo dai, mặc dù nó khơng làm tăng nhu
cầu sinh lý, khơng thấy có tác dụng kiểu androgen. Tuy khơng làm thay đổi
tinh dịch đồ nhưng trên thực tế có tác dụng hỗ trợ và cải thiện hoạt ñộng sinh
lý cũng như điều trị vơ sinh cho nam giới có biểu hiện vơ sinh tương đối và
suy nhược cơ thể. ðối với các trường hợp tinh dịch ít, tinh trùng chết nhiều,
khơng có tinh trùng, khơng xuất tinh khi giao hợp thì sử dụng ba kích chưa
thấy có kết quả [32].
Rễ ba kích chiết xuất bằng rượu có tác dụng hạ huyết áp, có tác dụng
nhanh đối với các tuyến cơ năng, tăng cường hoạt ñộng của não, giúp ngủ
ngon [11].
+ Nước sắc ba kích có tác dụng tương tự như ACTH (adreno cortico
trophic hormone cịn được gọi là “corticotropin”. ACTH ñược bài tiết từ
tuyến yên phía trước ñể ñáp ứng với corticotropin-releasing hormone từ vùng
dưới đồi. Nó là một thành phần quan trọng của tuyến yên - thượng thận, trục
dưới ñồi và thường ñược sản xuất ñể ñáp ứng với stress sinh học, ngồi ra
cịn có tác dụng làm hạ huyết áp [35].
2.2. Tình hình phát triển nguồn dược liệu và cây ba kích ở Việt Nam
2.2.1. Tình hình phát triển nguồn dược liệu
Nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm nên Việt Nam có
nguồn tài nguyên thực vật phong phú và ña dạng với khoảng 10.350 loài thực
vật bậc cao, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 lồi tảo. Kết quả điều tra
trong cả nước đã ghi nhận được 3.948 lồi thực vật và nấm lớn có thể sử dụng
làm thuốc, trong đó có hàng chục loại có giá trị chữa bệnh cao. Tổng sản
lượng dược liệu ở Việt Nam hằng năm ước tính khoảng từ ba đến năm nghìn
tấn. Một số dược liệu q được thế giới cơng nhận và có tiềm năng phát triển
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
8
rất lớn như: hồi, trinh nữ hồng cung, quế, ac-ti-sơ, sâm ngọc linh, tràm, thanh
hao hoa vàng, hoa hòe, ba kích... [36].
Tuy nhiên, thực tế cho thấy đến nay các vùng phân bố tự nhiên của cây
thuốc bị suy giảm nghiêm trọng do khai thác một cách cạn kiệt. Nhiều vùng
rừng có cây thuốc phong phú nay đã hồn tồn bị phá bỏ, như khu vực núi
Hàm Rồng - Sa Pa, Lào Cai, cao nguyên An Khê thuộc hai tỉnh Gia Lai và
Bình Ðịnh, nhiều loại có nguy cơ tuyệt chủng, có 144 lồi cây thuốc thuộc
diện q hiếm cần ñược bảo tồn: sâm ngọc linh, tam thất, ba kích, bách hợp...
[36].Thực tế, nhiều địa phương có đầy đủ các ñiều kiện ñể trồng trọt dược liệu
có giá trị cao, nhưng do cách làm manh mún, tự phát, thiếu liên kết và thị
trường dược liệu khơng ổn định nên việc phát triển các vùng dược liệu hiện
nay gặp nhiều khó khăn. Chính sách bảo tồn nguồn gen, nhất là các cây q
cịn q ít. Từ một nước xuất khẩu, Việt Nam trở thành một nước nhập khẩu
dược liệu ñể phục vụ thị trường trong nước. Mở rộng diện tích trồng cây
thuốc là con ñường tất yếu bảo ñảm cung cấp ñủ dược liệu cho công nghiệp
dược trong nước và xuất khẩu.
Một khó khăn cơ bản cho các đơn vị sản xuất ñược liệu hiện nay là
nguồn nguyên liệu ñầu vào cho nhà máy khơng ổn định, khơng có khả năng
truy nguyên nguồn gốc xuất xứ. Dược liệu chất lượng kém, dược liệu "rác" từ
biên giới nhập khẩu khơng kiểm sốt ñược, giá rẻ cho nên dược liệu trong
nước có giá cao khơng cạnh tranh được.
Ðã đến lúc cần phải có một chiến lược khai thác, nuôi trồng và chế biến
hợp lý mới có thể phát huy giá trị của nguồn tài nguyên quý báu này trong
chăm sóc sức khỏe nhân dân, đảm bảo tính ổn định cho sản xuất và tạo ñiều
kiện cho 3 nhà “nhà doanh nghiệp - nhà khoa học - nhà nơng” liên kết chặt
chẽ để phát triển hiệu quả.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
9
2.2.2. Tình hình phát triển cây ba kích
Là cây dược liệu có nhiều cơng dụng q, sử dụng lại đơn giản nên nhu
cầu về củ ba kích trên thị trường khá lớn. Ba kích trong các rừng tự nhiên bị
khai thác một cách lạm dụng, tùy tiện mà không chú ý đến khâu ni dưỡng
tái sinh. Số lượng cây ba kích hiện cịn sót lại rất ít, thưa thớt, thậm chí có
vùng hầu như khơng cịn [13].
Trong những năm qua, ñược sự quan tâm của các ngành, việc chuyển
ñổi cơ cấu cây trồng, vật ni rất được chú trọng đặc biệt là các huyện miền
núi thơng qua các chương trình 134, 135, các chương trình hỗ trợ phát triển
kinh tế. Ba kích được xếp trong nhóm lồi cây lâm sản ngồi gỗ. Dự án lâm
sản ngồi gỗ do chính phủ Hà Lan tài trợ (1998-2007) cũng đã tập huấn, giúp
nơng dân triển khai nhiều mơ hình trồng cây ba kích ở một số tỉnh phía Bắc
như: Hà Tĩnh, Quảng Nam, Bắc Giang, Quảng Ninh [4]. Do thấy ñược hiệu
quả từ cây ba kích đem lại, người dân một số địa phương ñược triển khai dự
án ñã tự trồng cây ba kích trên đất được giao khốn. Tuy nhiên, nguồn giống
được mua từ nhiều nơi không rõ nguồn gốc xuất xứ, khơng kiểm sốt được
chất lượng giống.
Hiện nay, ba kích là lồi cây đang được phát triển trong các vườn nhà,
vườn rừng,... bởi đây là lồi cây ít tốn đất, có khả năng sống chịu bóng, sản
phẩm có giá trị, thị trường tiêu thụ khơng chỉ trong nước mà cịn được xuất
khẩu. Ở nước ta ba kích được sử dụng chủ yếu trực tiếp như ngâm rượu, sắc
nước uống. Sản phẩm rượu ngâm củ ba kích được coi là đặc sản của tỉnh
Quảng Ninh [13], giá 1 kg củ ba kích tươi hiện nay giao ñộng từ 200.000 ñến
250.000 ñồng.
ðịnh hướng phát triển ngành nông lâm nghiệp nước ta là chuyển đổi
dần diện tích cây có giá trị kinh tế cao thay thế cây kém hiệu quả. Ba kích
đang là một trong những ñối tượng ñược lựa chọn ñể mở rộng diện tích trồng
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
10
ở các tỉnh miền núi phía Bắc trong những năm tới [13]. Vấn ñề quy hoạch
vùng trồng và ñáp ứng nguồn giống có nguồn gốc, chất lượng hiện nay là việc
làm mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn.
2.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào.
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi
nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi
cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ ñược tách khỏi cây [19] ñang ñược dùng phổ
biến ñể nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được
dùng để ni cấy có thể là chồi đỉnh, chồi bên, chồi bất định, bao phấn, phấn
hoa, phơi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) v.v.
Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định là những phương pháp chính
được dùng trong nhân giống cây rừng [12].
Ưu điểm chính của ni cấy mơ là cây mơ được trẻ hố cao độ và có rễ
giống như cây mọc từ hạt, thậm chí khơng có sự khác biệt ñáng kể so với cây
mọc từ hạt. Một ưu điểm khác của nhân giống bằng ni cấy mơ là có hệ số
nhân cao hơn nhân giống hom, từ một cụm chồi sau một năm nuôi cấy mô
liên tục có thể sản xuất hàng triệu cây con. Hơn nữa, nuôi cấy mô cũng là một
trong những biện pháp làm sạch bệnh. Vì thế mặc dầu ni cấy mơ ñòi hỏi kỹ
thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn ñược nhiều nơi áp dụng, ñặc biệt là
phối hợp với giâm hom, tạo thành cơng nghệ mơ-hom đang được sử dụng khá
phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp [12].
2.3.1. Cơ sở của khoa học của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật
Khái niệm: Nuôi cấy mô, tế bào thực vật là lĩnh vực nuôi cấy các nguyên
liệu thực vật hồn tồn sạch các vi sinh vật trên mơi trường nhân tạo, trong điều
kiện vơ trùng [17].
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật dựa trên
học thuyết về tính tồn năng của tế bào của nhà sinh lý thực vật người ðức
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
11
Haberlandt vào cuối thế kỷ 19 ñầu thế kỷ 20: “Mọi tế bào bất kỳ của cơ thể
sinh vật cũng đều mang tồn bộ lượng thơng tin di truyền (ADN) cần thiết và
đủ của sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp mỗi tế bào đều có thể phát
triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Ngày nay các nhà khoa học ñã chứng
minh ñược khả năng tái sinh cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ.
Trong ni cấy in vitro, q trình phát sinh hình thái thực chất là kết
quả của q trình phân hố và phản phân hố tế bào. Kỹ thuật ni cấy mơ, tế
bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào
thực vật (khi ni cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vơ trùng) một cách
định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính
tồn năng của tế bào thực vật. ðể điều khiển sự phát sinh hình thái của mơ
ni cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất
điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai
nhóm chất này trong mơi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái
khác nhau. Khi trong mơi trường ni cấy có tỷ lệ nồng ñộ auxin (ñại diện là
IAA)/cytokinin (ñại diện là kinetin) thấp thì sự phát sinh hình thái của mơ
ni cấy theo hướng tạo chồi, khi tỷ lệ này cao mơ ni cấy sẽ phát sinh hình
thái theo hướng tạo rễ cịn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo
(callus) [16].
2.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật
2.3.2.1.Giai ñoạn chuẩn bị
ðây là bước ñầu tiên của quy trình nhân giống. Giai ñoạn này gồm các
khâu như: chọn lọc cây mẹ ñể lấy mẫu, chọn cơ quan ñể lấy mẫu. Mơ chọn để
ni cấy thường là các mơ có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch
bệnh, giữ được các đặc tính q của cây mẹ. Sau đó chọn chế độ khử trùng
thích hợp làm sao để mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, ñồng thời khả năng sinh
trưởng và phát triển vẫn tốt. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
12
là dùng các tác nhân hố học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl2,
NaOCl, Ca(ClO3)2, H2O2,... ñể khử trùng mẫu. Nồng ñộ chất khử trùng ñược
chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo ngun tắc mơ non nồng độ thấp,
mơ già nồng độ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất
khử trùng với nhau. Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào
môi trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng. Thời gian khử trùng ñược xác ñịnh
bằng thực nghiệm đối với từng lồi cây hoặc mơ ni cấy. Nhìn chung, mô
non khử trùng trong thời gian ngắn, mô già trong thời gian dài hơn.
2.3.2.2. Giai đoạn ni cấy khởi ñộng
Sau khi khử trùng, ta ñưa mẫu vào nuôi cấy in vitro trên mơi trường
dinh dưỡng nhân tạo thích hợp ñể tái sinh mô cấy. Môi trường này ñược xác
lập cho từng loại cây, loại mô nuôi cấy. Các mẫu nuôi cấy nếu không bị
nhiễm khuẩn, nấm hoặc virus sẽ được lưu giữ ở phịng ni cấy với điều kiện
nhiệt ñộ, ánh sáng phù hợp. Sau một thời gian nhất ñịnh, từ mẫu nuôi cấy ban
ñầu sẽ xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các
phơi vơ tính có đặc tính gần như phơi hữu tính. ðây sẽ là những vật liệu khởi
đầu để cho q trình nhân nhanh tiếp sau đó.
2.3.2.3. Giai đoạn nhân nhanh
Một khi mẫu cấy sạch ñã ñược tạo ra và từ đó nhận được các cụm chồi,
các phơi vơ tính sinh trưởng tốt, q trình ni cấy sẽ bước vào giai ñoạn
nhân nhanh. Người ta cần thu ñược tốc ñộ nhân nhanh cao nhất trong ñiều
kiện nuôi cấy và thành phần mơi trường đã được tối ưu hóa nhằm ñạt ñược
mục tiêu này. Quy trình cấy chuyển ñể nhân nhanh chồi thường kéo dài trong
khoảng 1-2 tháng tùy mỗi loại cây và nhìn chung cho cả giai đoạn nhân nhanh
là vào khoảng 10-36 tháng.
2.3.2.4. Giai đoạn tạo cây hồn chỉnh
Các chồi hình thành trong q trình ni cấy có thể phát rễ tự sinh,
nhưng thông thường các chồi này phải được cấy sang một mơi trường khác để
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
13
kích thích tạo rễ, ở giai đoạn này phải tạo cây trong ống nghiệm phát triển cân
ñối về thân, lá, rễ ñể ñạt tiêu chuẩn của một cây giống.
2.3.2.5. Giai ñoạn vườn ươm.
ðây là giai ñoạn ñánh giá tính hiện thực của quá trình nhân giống in
vitro khi chuyển cây từ điều kiện vơ trùng của phịng thí nghiệm ra ngồi tự
nhiên. Khi đưa cây từ ống nghiệm ra ngồi vườn ươm, nhằm giảm ñi hiện
tượng “sốc” do thay ñổi về điều kiện mơi trường cần có giai đoạn thích nghi.
Q trình thích nghi với điều kiện bên ngồi của cây u cầu sự chăm sóc đặc
biệt, do đó ở giai ñoạn này cần chủ ñộng ñể ñiều khiển ñược quá trình chiếu
sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và
trong điều kiện cách ly bệnh ñể các cây con ñạt tỷ lệ sống cao.
2.3.3. Các nhân tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ [19].
Các nhân tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy mơ bao gồm: Nền mơi
trường ni cấy, mẫu cấy, thời tiết, mùa vụ, kiểu gen của cây, chế ñộ nhiệt,
chế ñộ chiếu sáng, số lần cấy chuyển, thể khí trong bình, cực tính của cây...
Trong đó, nền mơi trường ni cấy là điều kiện tối cần thiết, là yếu tố
quyết định cho sự phân hóa tế bào và cơ quan ni cấy. ðồng thời, đây cũng
là giá ñỡ ñể cố ñịnh cây và là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng ñể cho cây
phát triển. Do vậy, sự sinh trưởng, phát triển của cây nuôi cấy mô phụ thuộc
mạnh mẽ vào thành phần của môi trường nuôi cấy. Nền ni cấy bao gồm 8
yếu tố, đó là:
- Các nguyên tố ña lượng;
- Các nguyên tố vi lượng;
- Các vitamin;
- Các chất điều hồ sinh trưởng;
- Nguồn các bon hữu cơ;
- Các chất phụ gia;
- Chất đơng cứng mơi trường;
- pH môi trường;
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
14
Một trong 8 nhân tố này thay ñổi sẽ kéo theo sự thay đổi trong q trình
sinh trưởng và phát triển của cây invitro [27].
2.3.3.1. Các nguyên tố ña lượng
Sáu nguyên tố ña lượng N, P, K, S, Mg, Ca là cần thiết và thay đổi theo
đối tượng ni cấy. Nói chung, nồng độ của các ngun tố nói trên trong
môi trường khoảng trên 30mg/l. Môi trường giàu nitơ và kali thích hợp cho
việc hình thành chồi.
- Nitơ (N): được sử dụng ở 2 dạng NO3- và NH4+ riêng rẽ hoặc phối hợp
với nhau. ðiều ñáng lưu ý là nếu chỉ dùng NH4+, thì sinh trưởng của tế bào
giảm, thậm chí ngừng hồn tồn. Ngun nhân chính là do q trình trao
đổi ion của tế bào xảy ra lệch dẫn đến tình trạng thay đổi pH của mơi
trường. Cụ thể, khi chỉ dùng NO3- độ pH của mơi trường tăng dần và khi
chỉ dùng NH4+ độ pH của mơi trường giảm dần do tế bào hấp thụ chúng và
thải ra mơi trường loại ion có hóa trị tương đương.
- Lưu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là dùng dạng muối SO4-2, còn các
dạng khác thường kém tác dụng thậm chí cịn độc.
- Phốt pho (P): Mơ và tế bào thực vật ni cấy có nhu cầu phốt pho rất
cao. Nó khơng chỉ là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử axit
nucleic mà khi phospho ở dạng H2PO4 và HPO4 cịn có tác dụng như một
hệ thống ñệm làm ổn ñịnh pH của môi trường trong quá trình ni cấy.
2.3.3.2. Các ngun tố vi lượng
Fe, Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường được dùng
trong mơi trường ni cấy invitro. Nó đóng vai trị quan trọng trong các
hoạt động của enzym. Chúng ñược dùng với nồng ñộ thấp hơn nhiều so với
các nguyên tố ña lượng (<30mg/l). Riêng sắt sử dụng ở dạng phức: FeNaEDTA.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
15
