Báo cáo thực tập tốt nghiệp tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử thuộc khoa Xét nghiệm – Truyền máu, bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành tốt đợt thực tập tốt nghiệp, từ ngày 18/01/2016 đến ngày
17/03/2016, em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Bệnh viện Ung bướu Đà
Nẵng đã tạo điều kiện tốt nhất để em được học hỏi, tiếp cận và trao dồi các kỹ
năng, tích lũy kinh nghiệm thực tế tại môi trường làm việc trong đơn vị Di truyền
và Sinh học phân tử thuộc Khoa xét nghiệm - Truyền máu.
Xin chân thành cảm ơn ThS.BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa Xét nghiệm
truyền máu, Kỹ thuật viên Hồ Ngọc Dương – Kỹ thuật viên trưởng, ThS. Lê Thị
Trân Nhi – Cán bộ hướng dẫn, cùng các nhân viên trong đơn vị đã tận tình
hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm thực tế trong suốt quá
trình thực tập tại Bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Sư phạm Đà
Nẵng, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học - Môi trường đã tạo điều kiện cho em có
được chuyến đi thực tập này. Đồng thời, em cũng cảm ơn thầy ThS. Trần Quang
Dần – Giáo viên hướng dẫn đã tận tình hướng dẫn trang bị cho em những kiến
thức quý báu để em hoàn thành tốt cơng việc trong suốt q trình thực tập.
Em hứa sẽ vận dụng tốt những kiến thức đã tiếp thu được vào công việc
sau này!
Đà Nẵng, ngày 17 tháng 3 năm 2016


CHƢƠNG I:

TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP

1.1. Giới thiệu chung về khoa Xét nghiệm – Truyền máu
Khoa Xét nghiệm - Truyền máu được thành lập từ ngày 28/08/2015 theo
quyết định thành lập bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng của UBND TP.Đà Nẵng.
Trên cơ sở sáp nhập nguyên trạng giữa Khoa xét nghiệm tổng hợp, Khu truyền
máu và Trung tâm nghiên cứu ung thư thuộc Bệnh viện Ung thư Đà Nẵng.
Khoa Xét nghiệm – Truyền máu gồm có ba đơn vị chính:

 Đơn vị Xét nghiệm tổng hợp
 Đơn vị Truyền máu
 Đơn vị Di truyền và Sinh học phân tử
1.2. Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử
Đơn vị Di truyền và Sinh học phân tử chuyên xét nghiệm về miễn dịch
ung thư, di truyền và SHPT ung thư cho bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện ung
bướu Đà Nẵng.
1.2.1. Các kỹ thuật xét nghiệm tại đơn vị
Bảng 1: Các kỹ thuật xét nghiệm
STT

1

Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch

Kỹ thuật xét nghiệm Di truyền,

ung thƣ

SHPT ung thƣ

Xét nghiệm dấu ấn tế bào Bạch cầu

Xét nghiệm phát hiện gen

cấp (20CD)
2

Đếm tế bào gốc CD34+ bằng

Xét nghiệm gen bệnh máu ác tính

Flowcytometry
3

4

Đếm số lượng tế bào Lympho T

Xét nghiệm cơng thức NST

CD4/CD8-CD3

(Karyotype)

Phân tích CD

Xét nghiệm sắc thể: kỹ thuật DNA
với protein

5

Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính

Phát hiện gen JAK2 V617F bằng kỹ

(MRD) sau điều trị (24CD)

thuật Allen-specific PCR

6

Phân loại Lymphoma

Định lượng vvirus viêm gan B
(HBV)

7

Xét nghiệm định type HLA (bằng

HCV (RT-PCR)

kỹ thuật sinh học phân tử)
8

Kháng thể kháng nhân

HIV (PCR)

9

Xét nghiệm độ chéo ( bằng

HIV (RT-PCR)

Flowcytometry)
10

Xét nghiệm Đường – Ham

Xác định DNA trong viêm gan B

11

Chuẩn đoán bệnh tiểu huyết sắc tố

Định lượng virus viêm gan B

về đêm (PNH)(5CD)

(HBV) cho các bệnh viêm gan C
mãn tính

12

Xét nghiệm CD64, CD11b trong

Định lượng virus viêm gan C

SEPSIS

(HCV) cho các bệnh viêm gan C
mãn tính

13

PCR chuẩn đốn CMV

14

Đo tải lượng CMV

15

PCR chuẩn đoán lao bằng hệ thống
Cobas TaqMan48


1.2.2. Trang thiết bị tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử
1.2.2.1 Labo Miễn dịch ung thư và ni cấy tế bào

Hình 1: Máy Flowcytometry

Hình 3: Tủ an tồn sinh học cấp 2

Hình 2: Tủ ấm có trao đổi khí

Hình 4: Máy ly tâm lạnh ống nghiệm


1.2.2.2. Labo Di truyền và sinh học phân tử

Hình 5: Tủ hút khí độc

Hình 6: Kính hiển vi gắn camera

Hình 7: Máy ly tâm lạnh Eppendorf

Hình 8: Máy Vortex

Hình 9: Máy Spindown

Hình 10: Máy đo nồng độ Acid
nucleid


Hình 11: Máy PCR

Hình 13: Máy điện di

Hình 18: Máy ủ nhiệt có lắc

Hình 12: Máy Realtime PCR

Hình 14: Máy đọc gel

Hình 16: Tủ lạnh -800C


Hình 15: Tủ lạnh 40C

Hình 17: Tủ lạnh -200C

Hình 19 : Máy ly tâm Eppendorrf

Hình 18 : Micropipete

Hình 20 : Đầu tuýp micropipette

CHƢƠNG II:

KẾT QUẢ THỰC TẬP

2.1. Tổng quan về virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV)
2.1.1. Lịch sử phát triển của virus viêm gan B [1,2]
Trước công nguyên bệnh vàng da nhiễm trùng ở người đã được
Hyppocrate mô tả giống như một số bệnh khác ở thời kỳ này. Bệnh viêm gan là
bạn đồng hành của các cuộc chiến tranh đã được ghi nhận trong lịch sử y học và
y học quân sự, thời kỳ này người ta thừa nhận có sự lây nhiễm giữa người với
người nhưng khơng biết được các tác nhân gây bệnh như hiện nay.
Luerman (1883) mơ tả một trận dịch tại xưởng đóng tàu Bremen ở những
người được chủng ngừa vaccine đậu mùa có bạch cầu người. Cùng năm này, một
trận vàng da sau chủng ngừa khác xảy ra ở Merzig. Do vậy, sự hiện diện của một
thể viêm gan virus lây nhiễm trực tiếp từ máu người hoặc các dẫn xuất từ máu đã
được nghĩ đến.
Lindstedl (Thụy Điển, 1919) đã tiên phong trong việc đặt ra thuật ngữ
Viêm gan cho bệnh vàng da xuất tiết và chuẩn đoán phân biệt hai dạng viêm gan
dịch tễ (viêm gan A) và viêm gan huyết thanh (viêm gan B).
Đến năm 1965 Blumberg và các cộng sự của ơng lần đầu tiên tìm thấy
được thành phần quan trọng của virus viêm gan B trong khi nghiên cứu về các
loại protein trong huyết thanh người. Thành phần này là một loại kháng nguyên
có nguồn gốc từ huyết thanh của một người Úc kết tủa với huyết thanh của bệnh
nhân bị bệnh máu do được truyền máu nhiều lần và ông đặt tên cho kháng
nguyên này là kháng nguyên Australia (Au).
Đến năm 1968, Prince, Okochi và Murakami đã xác định được mối tương
quan giữa kháng nguyên Au với bệnh nhân viêm gan cấp tính và cho rằng đây là
một kháng nguyên của virus viêm gan, cho đến 11 năm sau điều giả định này

mới được xác định đây là kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B.
Năm 1970, Dane phát hiện ra các hạt virus trong huyết thanh bệnh nhân bị
nhiễm virus viêm gan B và ông đã mơ tả hình dạng hồn chỉnh của hạt virus
viêm gan B mà sau này người ta gọi là virion Dane.


Kaplan (1973) phát hiện DNA polymerase nội sinh bên trong vỏ ngồi của
các hạt Dane. Chính DNA polymerase này giúp Robinson (1979) nhân dòng
HBV và xác định chuỗi mã nucleotide DNA toàn phần, cho rằng HBV là một tác
nhân gây bệnh theo đường máu nhưng không sao chép trong môi trường ni cấy
mơ. Từ đó, bộ gen HBV là bộ gen độc đáo trong thế giới virus do bản chất đậm
đặc của chúng, các khung đọc gối lên nhau và do phụ thuộc vào bước phiên mã
ngược, dù rằng virion chứa chủ yếu DNA. Do phát hiện này, virus viêm gan B
trở thành kiểu nguyên sinh của họ hepadnavirus, Hepadnaviridae.
2.1.2. Phân loại, cấu trúc virus viêm gan B
2.1.2.1. Phân loại
Virus viêm gan B thuộc họ Hepadnaviridae, chi Orthohepadnavirus, loài
Hepatitis B virus . Có khả năng tồn tại cao, HBV bền vững với nhiệt độ: 1000C
virus sống được 30 phút, -200C sống được tới 20 năm [3].
2.1.2.2. Cấu trúc

Hình 21: Cấu trúc cắt ngang của virus HBV
Virus viêm gan B có một cấu trúc hai lần vỏ protein đồng tâm gồm ba lớp.
Lớp ngoài cùng của virus được cấu tạo bởi ba chuỗi polypeptid, chuỗi có kích
thước ngắn nhất có trọng lượng phân tử là 25kDa được gọi là polypeptid chính,
do có nhiều nhất trong thành phần bao ngồi. Lớp ngồi cùng chứa các kháng
nguyên bề mặt HbsAg.


Vỏ capsid được cấu tạo bởi hai chuỗi polypeptid được gọi là polypeptid

lõi và tiền lõi, chuỗi polypeptid lõi ngắn có trọng lượng phân tử 22 kDa chính là
kháng ngun lõi của virus, ký hiệu HbcAg. Chuỗi polypeptid tiền lõi dài hơn có
trọng lượng phân tử 25kDa, có cấu trúc gồm tồn bộ chuỗi ngắn cộng thêm một
peptid đợn có 29 acid amin. Kháng nguyên e của HBV (HbeAg) chính là một sản
phẩm chuyển hóa của lớp vỏ capsid.
Bộ gen của HBV là một sợi vòng DNA chiều dài 3200 cặp base có cấu
trúc mạch kép khơng hồn tồn. Mạch dài là mạch mã hóa cịn gọi là mạch thơng
tin và RNA tiền gen của virus được mã hóa từ vạch này, mạch dương có chiều
dài bằng 50-80% chiều dài mạch âm.
2.1.3. Quá trình sao chép và nhân lên của virus viêm gan B

Hình 22: Quá trình nhân lên của virus trong tế bào gan
Tất cả các virus đều là vật ký sinh tế bào cấu tạo bởi một thể nhiễm sắc là
RNA hay DNA chứa đựng trong một vỏ bọc protein. Muốn nhân lên virus phải đi
vào trong tế bào và sử dụng bộ máy của tế bào để tổng hợp các protein của vỏ
bọc và bộ gen virus, khi bộ gen đã được bao bọc trong vỏ bọc thì các hạt virus
mới được giải phóng ra khỏi tế bào và tiếp tục một chu trình nhân lên mới.


Các virion HBV liên kết với một thụ thể trên bề mặt tế bào gan [6]. Một
số thụ thể đã được xác định, bao gồm thụ thể transferrin, các phân tử thụ thể
asialoglycoprotein và thụ thể endoxin. Vỏ capsid nhập vào tế bào và DNA virus
đi vào đến nhân tế bào gan. Trong nhân tế bào DNA của virus được đóng lại
thành DNA mạch vịng gọi là cccDNA [5,6].
Sau khi bị nhiễm, phần sợi đơn của trình tự được khơi phục, tạo thành một
DNA siêu xoắn kép nhờ DNA polymerase nằm ở đầu 3’ của sợi dương. Đầu tiên,
RNA tiền genom được phiên mã dựa trên khuôn mẫu là sợi âm DNA nhờ RNA
polymerase của tế bào chủ, sau đó sợi âm DNA được phiên mã ngược dựa trên
khuôn mẫu RNA tiền genom nhờ enzyme phiên mã ngược phụ thuộc DNA
polymerase của virus, cuối cùng sợi dương DNA được tổng hợp từ sợi âm DNA

và chuỗi xoắn kép DNA được hoàn thành [6].
Khi DNA của virus được tổng hợp, genom RNA bị giáng hóa trừ một
đoạn nhỏ khoảng 20 cặp base từ đầu 5, sẽ hoạt động như một đoạn mồi để tổng
hợp DNA sợi dương từ sợi âm khuôn mẫu mới được tổng hợp, các hạt virus mới
tổng hợp chứa một phần sợi kép DNA của virus và sẽ nhận các vỏ bọc có chứa
HbsAg bằng cách đâm chồi từ màng bào tương và sẽ trở thành các hạt virus gây
nhiễm. các hạt virion hoàn chỉnh này được giải phóng vào máu tuần hồn và tiếp
tục gây các tế bào chủ tiếp theo[7].
2.1.4. Các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B.
2.1.4.1. Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HbsAg).
Xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần và biến
mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng. Nếu sau 6 tháng mà vẫn cịn HbsAg thì
có nguy cơ chuyển thành người mang HbsAg mạn.
2.1.4.2. Kháng nguyên e (HbeAg).
Là kháng nguyên hịa tan có mặt trong huyết tương thường liên quan đến
HbsAg, phản ảnh mức độ lây nhiễm của viêm gan B. Ở tế bào gan HbeAg hiện
diện trong tế bào chất sẽ được giải phóng khỏi phần lõi của virus khi xử lý với


các chất tẩy mạnh. Kháng nguyên HBeAg xuất hiện sớm trong giai đoạn tiền
vàng da.
2.1.4.3. Kháng nguyên lõi (HBcAg).
Kháng nguyên lõi HBcAg được lớp vỏ HbsAg bao bọc nên không tồn tại
trong máu ở dạng tự do, cho nên các kỹ thuật miễn dịch học thông thường không
phát hiện được, HBcAg chỉ xuất hiện trong tế bào gan và chỉ có thể phát hiện
được khi làm sinh thiết gan.
2.1.4.4. Kháng thể anti-HBs.
Là kháng thể kháng lại HbsAg, xuất hiện muộn 2-16 tuần sau sự thoái lui
của HbsAg. IgM anti-HBs xuất hiện trong giai đoạn cấp còn IgG anti-HBs xuất
hiện muộn và tồn tại lâu dài hơn. Nồng độ kháng thể anti-HBs cao hay thấp còn

phụ thuộc vào một số các yếu tố như: công hiệu vaccine, liều lượng và thời gian.
2.1.4.5. Kháng thể anti-HBe.
Là kháng thể kháng lại HBeAg, thường có ở huyết thanh người mang
HBsAg hiệu giá thấp, chỉ nên xét HBeAg và anti-HBe ở những người có HbsAg
(+). Khi xuất hiện anti-HBe là bệnh nhân đang được hồi phục.
2.1.4.6. Kháng thể anti- HBc.
Là kháng thể kháng lại HBcAg, biểu hiện đã từng mắc HBV. Anti-HBc
IgM xuất hiện sớm ngay thời kỳ ủ bệnh, còn anti-HBc IgG xuất hiện muộn
nhưng tồn tại lâu hơn.
2.1.4.7. HBV-DNA.
HBV-DNA chỉ thấy trong huyết thanh chứ các hạt virus hoàn chỉnh, phát
hiện thấy HBV-DNA là bằng chứng trực tiếp về sự hiện diện HBV trong máu.
Định lượng HBV-DNA cho phép đánh giá mức độ nhiễm virus viêm gan B.
2.1.5. Các triệu chứng lâm sàng [4]
2.1.5.1. Giai đoạn cấp tính


Q trình lây nhiễm cấp tính gây ra các triệu chứng khác nhau. Thời gian
ủ bệnh từ 6 tuần đến 6 tháng. Bệnh có thể khởi phát nhẹ hoặc bùng phát đột ngột,
các triệu chứng nhiễm cấp bao gồm sốt, biếng ăn, buồn nơn, khó chịu, nơn mửa,
vàng da, nước tiểu có màu đen, đau bụng,… Trong viêm gan cấp, số người bệnh
có dấu hiệu viêm gan bộc phát là 1-2% và tỷ lệ chết 63-93%.
2.1.5.2. Giai đoạn mạn tính.
Giai đoạn này xác định thông qua thời gian tồn tại của HbsAg trong huyết
thanh người bệnh tối thiểu 6 tháng hoặc sự hiện diện của HbsAg đi kèm với sự
vắng mặt của kháng thể immunoglobulin M (IgM) kháng HBc. Người mang
viêm gan mạn tính đều có khả năng tiến triển thành bệnh mạn tính về gan bao
gồm xơ gan và ung thư gan.
Viêm gan mạn tính có thể chia thành ba tình trạng bệnh lý khác nhau:
Viêm gan mạn tính kéo dài, viêm gan mạn tính hoạt động và xơ gan. Những

người bị viêm gan mạn tính kéo dài thường không biểu hiện các triệu chứng lâm
sàng cho tới cuối gian đoạn phát triển của bệnh lý. Những bệnh nhân ở gia đoạn
viêm gan mạn tính hoạt động sẽ phát triển thành xơ gan. Xơ gan là một dạng của
quá trình thương tổn gan và chính q trình này có thể dẫn đến tình trạng ung thư
tế bào gan.


2.2. Định lƣợng virus viêm gan B bằng NKHBV TQPCR kit
2.2.1. NKHBV TQPCR kit

Hình 23: Protocol NKHBV TQPCR Kit
Mức phát hiện 50 copies/ml mẫu thử


Bảng 2: Thành phần NKHBV TQPCR kit
Thành phần

Nội dung

Số lượng

Mồi 1&2, MgCl2, Tris
NK

HBV TQPCR Master
Mix

HCl, KCl, taq
polymerase, dNTP,

125µl x 9

UNG, dUTP, TQ probe
(FAM và HEX hay JOE)

Low profile white PCR

Dây 8 tube kèm dây 8

tubes

nắp

1x9

DNA phiên mã từ
NK

HBVDNA-IC

plasmid chèn HBVDNA

300µl x 2

chứng nội tại
Plasmid chèn HBVDNA,
NK

HBVDNA S1

được cung cấp ở nồng độ

300µl x 2

105/5µl để làm chuẩn 1
Plasmid chèn HBVDNA,
NK

HBVDNA S2

được cung cấp ở nồng độ

300µl x 2

104/5µl để làm chuẩn 2
Plasmid chèn HBVDNA,
NK

HBVDNA S3

được cung cấp ở nồng độ

300µl x 2

103/5µl để làm chuẩn 3
Chứng (-)
NK

DNAPREP-BOOM

Huyết tương người bình
thường
Trọn bộ

1000µl x 1
Bộ x 1


2.2.2. Quy trình xét nghiệm định lượng virus HBV
Bước 1: Lấy mẫu bệnh phẩm.
-

Huyết thanh hay huyết tương được tách từ máu tồn phần hay máu kháng
đơng bằng EDTA.

Bước 2: Chuẩn bị mẫu thử và các dụng cụ cần thiết
-

Phải kèm 1 chứng âm với mỗi lần làm xét nghiệm các mẫu thử.

-

Sử dụng 1 tube Eppendorf tinh sạch, ghi trên tube ký hiệu C(-) và cho vào
đó 100µl mẫu chứng âm.

-

Đếm số lượng mẫu thử phải làm xét nghiệm để lấy đủ số tube Eppendorf
tinh sạch, mỗi tube cho 1 mẫu thử, ghi trên tube ký hiệu của các mẫu thử.
Cho 100µl mẫu thử vào Eppendorf tương ứng.

-

Vortex mạnh 3 lần mỗi lần 10 giây ống HBVDNA-IC. Dùng micropipette
cho vào các tube C(-) và các tube mẫu thử đã chuẩn bị ở trên, mỗi tube 5µl
HBVDNA-IC. Sau đó vortex các tube để trộn đều.

Bước 3: Tách chiết DNA các mẫu thử ( theo bộ tách chiết DNAPREP-BOOM
Nam Khoa, Việt Nam)

Hình 24: DNAPREP BOOM


-

Trong 1 tube Eppendorf 1.5ml, cho vào 900µl L6 (phá vỡ màng
phospholipid, ức chế các enzyme) 30µl silica (DNA sẽ liên kết với silica)
và 100µl mẫu thử. Vortex hỗn dịch này và lắc tay úp ngửa trong 10 phút.
Vortex lần nữa trong 5 giây và ly tâm 13000rpm trong 15 giây. Hút bỏ
phần nước nổi,

-

Rửa 2 lần với mỗi lần 1ml L2 ( tiếp tục phá vỡ các protein) cho vào cặn
silica rồi vortex vài giây để hòa tan silica vào dung dịch, sau đó ly tâm
13000rpm trong 15 giây. Hút bỏ phần dịch nổi, chừa lại cặn silica.

-

Tiếp theo rửa 2 lần nữa, mỗi lần với 1ml Ethanol 70% (kết tủa DNA, tăng

cường khả năng liên kết giữa DNA và silica) cho vào cặn silica rồi vortex
vài giây để hịa tan silica vào dung dịch, sau đó ly tâm 13000rpm trong 15
giây. Hút bỏ phần nổi chừa lại cặn silica.

-

Sau đó rửa lại 1 lần nữa với 1ml Acetone (Loại bỏ ethanol và các tạp
chất). Ly tâm 13000rpm trong 15 giây, hút bỏ phần dịch nổi chừa lại cặn
silica.

-

Làm khô silica ở 560C trong 10 phút trong máy ủ nhiệt.

-

Thêm 50µl đệm TE 1x (bảo quản DNA). Vortex cho đến khi silica rã hoàn
toàn. Ủ 560C trong 10 phút.Ly tâm 13000rpm trong 2 phút. Thu lấy dịch
nổi có chứa DNA.

-

Dịch chứa DNA có thể sử dụng ngay hoặc dự trữ ở -200C.

Bước 4: Cho vào TQPCR mix để chuẩn bị chạy realtime PCR.
-

Dùng pipette phân phối TQPCR master mix vào các tube PCR, mỗi tube
nhận 15µl TQPCR master mix.

-

Đối với tách chiết DNA chứng (-) và từ các mẫu thử: Cho 5µl mẫu tách
chiết DNA vào tube TQPCR mix.

-

Đối với NKHBVDNA chuẩn: Vortex mạnh 3 lần, mỗi lần 10 giây các tube
chứa NKHBVDNA chuẩn. Dùng pipette lấy 5µl cho vào tube TQPCR mix.


Bảng 3: Cách cho TQPCR Mix vào các mẫu thử, chứng (-) và mẫu chuẩn
Tube PCR số

1

2

3

4

5

TQPCR master mix

15µl

15µl

15µl

15µl

15µl

Tách chiết DNA C[-]

5µl

Tách chiết DNA M1
NK

HBVDNA S1

5µl
5µl

NK

HBVDNA S2

NK

HBVDNA S3

-

5µl
5µl

Sau khi hồn tất các mẫu thử và chứng vào các tube PCR, tiến hành đậy
nắp các thanh PCR. Spin down cho lắng toàn bộ dung dịch xuống đáy.

Bước 5: Chạy realtime PCR phát hiện và định lượng HBVDNA
-

Nguyên tắc kỹ thuật realtime PCR sử dụng Taqman probe: Trong kỹ thuật
này, real-time PCR mix ngoài các thành phân cơ bản của PCR mix, cịn
chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được
khi có sự hiện hiện của sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích, đó là:
(1) Taqman probe, là những oligonucleotide có trình tự bổ sung với một
trình tự đặc hiệu trên DNA đích, và trình tự này dài khoảng 24 đến 30
base với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi là reporter) cịn đầu 3’
có gắn chất hấp thụ tương ứng (gọi là quencher) để hấp thụ được ánh sáng
huỳnh quang được phát ra từ reporter. (2) Enzyme Taq polymerase vừa có
hoạt tính polymerase tổng hợp sợi bổ sung vừa có hoạt tính 5’-3’
exonuclease để có khả năng thủy giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp
lên sợi khuôn.


Hình 25: Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe

-

Cho tất cả các ống PCR mix đã chuẩn bị ở trên vào buồng ủ nhiệt của máy
realtime PCR. Lau sạch các nắp tube PCR bằng giấy lau không bụi để ánh
sáng kích thích hay tín hiệu huỳnh quang khơng bị nhiễu.

-

Chọn plate set-up và chọn kênh huỳnh quang là FAM và HEX.

-

Chọn thể tích phản ứng là 25µl. Sau đó chạy chương trình ln nhiệt
realtime như sau: 1 chu kỳ 950C trong 15 phút, 40 chu kỳ với 2 bước
nhiệt độ 940C/15 giây và 600C/1 phút và chụp hình tín hiệu huỳnh quang ở
giai đoạn này.


Bước 6: Phân tích kết quả.

Hình 26: Kết quả real-time PCR
-

Phân tích 3 chứng chuẩn, chứng nội tại và mẫu thử bằng kênh FAM cho
thấy:
+ Ba mẫu chuẩn có số lượng copies tăng đều theo hàm số log => Hiệu quả
PCR tốt.
+ Chứng nội tại khơng có tín hiệu huỳnh quang => thử nghiệm không bị
nhiễm.
+ Đường biểu diễn của mẫu thử khơng cắt đường nền =.> mẫu thử có thể
âm tính.


-

Phân tích chứng nội tại bằng kênh HEX, cho thấy:
+ Tín hiệu huỳnh quang tốt, cắt đường nền => thử nghiệm đạt độ nhạy

-

Phân tích các hệ số trong biểu đồ đường chuẩn:
+ Hệ số tương quan R2=1 ( >0,99) => thao tác pipeting của người thực
hiện có độ chính xác cao
+ Hiệu quả PCR E% = 100% => cứ sau 1 chu kỳ thì số lượng copies tăng
gấp đơi.
+ Độ dốc slope = -3.32. Vì các mẫu chuẩn có hệ số pha lỗng là 10 nên
theo cơng thức E% = (10-1/slope – 1) x 100% nên sople = -3.32 là lý tưởng.
 Qua các thơng số trên có thể khẳng định bệnh nhân âm tính với HBV


2.3. Một số bộ kit tách chiết khác tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử
2.3.1. Invisorb Spin Blood Mini Kit (Stratec molecular, Germany) [8]

Hình 28: Invisorb Spin Blood Mini Kit

- Mục đích: Tách chiết DNA trực tiếp từ mẫu máu
người bệnh.
- Thành phần: Lysis Buffer HL, Binding Buffer HL,
Elution Buffer D, Proteinase K, Pre-Wash Buffer,
Wash Buffer, RTA Spin Filter Set, RTA Receiver
Tubes
- Quy trình tách chiết:
+ Dùng pipette hút 200µl máu và 1.5 Receiver
Tube.
+ Thêm 200µl Lysis Buffer HL, trộn 5 lần bằng
pipette. Ủ 560C trong 3 phút kèm theo lắc. Sau đó,
thêm 20µl Proteinase K và vortex nhanh. Ủ 560C trong

5 phút kèm lắc.
+ Thêm 200µl Binding Buffer HL, trộn 4 lần
bằng pipette và vortex

Hình 29: Quy trình thực
hiện


+ Chuyển tất cả dung dịch vào RTA Spin Filter đã được đặt trong RTA
Receiver Tube. Ly tâm 12000rpm trong 1 phút. Sau đó bỏ dịch và RTA Receiver
Tube.
+ Đặt RTA Spin Filter vào RTA Receiver Tube mới. Thêm 500µl PreWash Buffer. Ly tâm 12000rpm trong 1 phút. Sau đó bỏ dịch và RTA Receiver
Tube.
+ Đặt RTA Spin Filter vào 2.0ml RTA Receiver Tube mới. Thêm 700µl
Wash Buffer. Ly tâm 12000rpm trong 1 phút. Sau đó bỏ dịch và thêm tiếp 700µl
Wash Buffer, lyt tâm 12000rpm trong 4 phút.
+ Đặt RTA Spin Filter vào 1.5ml
RTA Receiver Tube. Thêm 100-200µl
Elution Buffer D. Ủ 1 phút ở nhiệt độ
phòng. Ly tâm 9500rpm trong 1 phút. Sau
đó bỏ RTA Spin Filter và đóng nắp 1.5ml
RTA Receiver Tube. Lưu trữ DNA ở 40C.
2.3.2. RNeasy Mini Kit ( Qiagen, USA) [9]
- Mục đích: Tách chiết RNA từ mẫu tế bào
bạch cầu
- Thành phần: RNeasy Mini Spin Columns,
1.5ml Collection Tube, 2.0ml Colecttion
Tube, Buffer RLT, Buffer RW1, Buffer
RPE, Rnase- Free water.
- Quy trình tách chiết:

+ Tube 1.5 chứa 0,5.106 tế bào.
Thêm 350µl buffer RLT, trộn đều bằng
syringe . Thêm 350µl Ethanol 70%, trộn
đều bằng pipette.

Hình 30: Quy trình thực hiện


+ Chuyển dung dịch qua RNeasy mini spin column đặt trong Collection
tube. Ly tâm 11000rpm trong 15 giây ở nhiệt độ PTN. Bỏ dịch cặn.
+ Thêm 700 µl Buffer RW1, ly tâm 11000rpm trong 15 giây ở nhiệt độ
PTN. Bỏ dịch cặn.
+ Thêm 500 µl Buffer RPE, ly tâm 11000rpm trong 15 giây ở nhiệt độ
PTN. Bỏ dịch cặn. (Lần 1)
+ Thêm 500 µl Buffer RPE, ly tâm 11000rpm trong 2 phút ở nhiệt độ
PTN. Bỏ dịch cặn. (Lần 2)
+ Chuyển RNeasy Mini Spin Column qua 1.5ml Collection Tube mới.
+ Thêm 30-50µl Rnasy-Free water. Giữ ở nhiệt độ PTN 1 phút. Ly tâm
11000rpm trong 1 phút. Bỏ Column.
+ Giữ dung dịch RNA ở -800C.
2.3.3. Isolate II Mini Kit (Bioline, USA) [10]

Hình 31: Isolate II Mini Kit

-

Mục đích: Tách chiết RNA từ tế bào bạch cầu.

-

Thành phần: ISOLATE II Filter, ISOLATE II RNA Mini Column & Collection
Tube, Collection Tube 2.0, Collection Tube 1.5, Lysis Buffer RLY, Wash Buffer


RW1, Wash Buffer RW2, MEM Buffer, Buffer RDN, DNase I, Rnase-free
Water.
-

Quy trình tách chiết:

Hình 32: Quy trình tách chiết
+ Lấy 5.106 tế bào bạch cầu đã được xử lý ban đầu vào Eppendorf 1.5.
+ Thêm 350µl Buffer RLY và 3,5µl β-Mercaptoehthanol. Vortex mạnh.
+ Hút dịch đồng nhất cho vào ISOLATE II Filter (tím) nằm trong 2.0
Tube. Ly tâm 11000rpm/1 phút.