Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lê Trọng Bằng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC
CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2021


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

Lê Trọng Bằng

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CÁC
CHỦNG VI KHUẨN BIỂN CÓ KHẢ NĂNG
SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh
Hà Nội – 2021


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Huỳnh Hoàng Như Khánh và tham khảo thêm các tài liệu
đã được cơng bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng. Kết quả nghiên cứu này được
thực hiện bởi sự tài trợ kinh phí từ đề tài “Nghiên cứu phân lập và sàng lọc
các chủng vi sinh vật biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin nhằm ứng
dụng trong nuôi trồng thủy hải sản”, mã số: VAST 02.05/20-21. Các số liệu
nêu trong luận văn là kết quả làm việc của tơi trong suốt q trình thực
nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021
Tác giả luận văn

Lê Trọng Bằng

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Huỳnh Hoàng Như
Khánh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt q trình hồn thành luận
văn, tơi xin chân thành cảm ơn TS. Châu Minh Khánh - Phịng Cơng nghệ sinh
học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, người đã giúp
tơi hồn thành tốt phần thực nghiệm của mình, tơi xin chân thành cám ơn TS.
Huỳnh Hồng Như Khánh – Chủ nhiệm đề tài VAST 02.05/20-21 đã cho phép
tơi sử dụng nội dung cơng trình nghiên cứu này vào mục đích nghiên cứu, viết và
bảo vệ luận văn thạc sĩ. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Đào Tấn Học và ThS. Lê
Thị Thu Thảo, Viện Hải dương học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt
Nam đã hỗ trợ định danh đối với các mẫu tôm và cá biển sử dụng làm nguồn
phân lập vi sinh vật biển trong luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công
nghệ, Phịng Đào tạo, Khoa Cơng nghệ Sinh học và Q Thầy Cô giáo đã dạy
dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận văn cũng như hồn
thành mọi thủ tục cần thiết.
Tơi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng
Công nghệ Nha Trang cũng như các anh, chị trong phòng Công nghệ sinh học
biển đã giúp đỡ và tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho tơi trong q trình thực
hiện luận văn.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến lãnh đạo trường THPT
Nguyễn Chí Thanh, Sở Giáo dục và Đạo tạo Khánh Hịa ln quan tâm, động
viên và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2021
Tác giả luận văn

Lê Trọng Bằng

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết t

AHPND
Bac+
BLIS
GDP
LPMA
NTTS
PCR

PTN
rRNA
TCBS
TSA
TSB
VK
VKB
VSV
VSVCT


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm........................ 10
Bảng 1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản............................................... 13
Bảng 1.3. Tác động về kinh tế – xã hội và tác động khác của bệnh liên quan
đến Vibrio trong ngành nuôi trồng thủy sản...................................................................... 15
Bảng 1.4. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram âm...................................................... 19

Bảng 1.5. Một số bacteriocin ở vi khuẩn Gram dương............................................... 20
Bảng 1.6. Một số khác biệt giữa bacteriocin và kháng sinh..................................... 22
Bảng 1.7. Độ bền nhiệt, pH và enzyme thủy phân của một số bacteriocin
sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic............................................................................................ 24
Bảng 1.8. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển..................................................... 25
Bảng 2.1. Danh sách chủng chỉ thị sử dụng trong thí nghiệm sàng lọc
hoạt tính................................................................................................................................................ 36
Bảng 3.1. Thông tin về số lượng chủng VKB được phân lập tương ứng với
từng mẫu và từng môi trường................................................................................................... 46
Bảng 3.2. Kết quả sàng lọc những chủng cho hoạt tính đối kháng
Vibrio spp............................................................................................................................................ 47
Bảng 3.3. Tổng hợp về hình thái khuẩn lạc của 30 chủng biểu hiện hoạt tính đối
kháng với Vibrio spp. ghi nhận trên môi trường thạch Mueller Hinton ... 51

Bảng 3.4. Kết quả xác định phổ kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biểu hiện
hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. xác định bằng phương pháp cấy dọc........54
Bảng 3.5. Tổng hợp khả năng kháng khuẩn của 30 chủng vi khuẩn biển biểu
hiện hoạt tính đối kháng với Vibrio spp. được xác định bằng phương pháp
khuếch tán đĩa thạch...................................................................................................................... 57
Bảng 3.6. Hoạt tính đối kháng V. parahaemolyticus của 15 chủng vi khuẩn biển

sau khi ủ với proteinase E........................................................................................................... 61
Bảng 3.7. Sự biến động mật độ tế bào và hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ

thị của chủng Bacillus spp. 2002NTBD1 theo thời gian............................................ 68


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản và đánh bắt cá trên tồn cầu
trong giai đoạn từ 1950 – 2017................................................................................................ 11

Hình 1.2. Số lượng các ấn phẩm khoa học trong 20 năm qua liên quan đến
từ khóa “marine bacteria” và “antimicrobial activity” phân phối theo mười quốc
gia hàng đầu....................................................................................................................................... 17
Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin..................................................................... 21
Hình 2.1. Quy trình phân lập vi khuẩn biển từ ruột tôm, ruột cá, bọt biển và
rong......................................................................................................................................................... 39
Hình 2.2. Hình ảnh một số nguồn mẫu biển thu nhận cho phân lập
vi khuẩn biển..................................................................................................................................... 40
Hình 2.3. Sơ đồ các nội dung nghiên cứu chính............................................. 44
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn biển được làm thuần........................45
Hình 3.2 Hoạt tính đối kháng của VKB đối với 3 chủng Vibrio spp. được
xác định bằng phương pháp cấy dọc..................................................................................... 50
Hình 3.3. Hình thái của một số đại diện bac+ trên mơi trường Mueller Hinton
agar......................................................................................................................................................... 53
Hình 3.4. Phổ kháng khuẩn của VKB đối với 7 chủng VSVCT được xác định
bằng phương pháp cấy dọc........................................................................................................ 56
Hình 3.5. Khả năng sinh chất kháng khuẩn trong canh trường bằng phương
pháp khuếch tán đĩa thạch.......................................................................................................... 59
Hình 3.6. Ảnh hưởng của enzyme lên hoạt tính kháng Vibrio spp. của dịch
lên men chủng 2002NTBD1..................................................................................................... 62
Hình 3.7. Cây phân loại thể hiện mối liên quan giữa 4 chủng có hoạt tính mạnh

và lồi có trình tự gen 16S rRNA tương đồng................................................................. 63
Hình 3.8. Khảo sát độ bền nhiệt của hợp chất kháng Vibrio spp. sinh bởi
4 chủng vi khuẩn biển................................................................................................................... 67
Hình 3.9. Hoạt tính đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của dịch nuôi cấy vi khuẩn

Bacillus spp. 2002NTBD1 các thời điểm sinh trưởng khác nhau.........................69

1
MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỤC LỤC........................................................................................................
MỞ ĐẦU ..........................................................................................................
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN............................................................
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn ........................................................................
1.1.2. Tác động của vi khuẩn ................................................................
1.1.3. Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản ..........................................
1.1.4. Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có hoạt tính
sinh học ...................................................................................................
1.2. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN...................................................
1.2.1. Định nghĩa về bacteriocin ...........................................................
1.2.2. Phân loại bacteriocin ...................................................................
1.2.3. Cơ chế hoạt động của bacteriocin ...............................................
1.2.4. Điểm khác biệt giữa kháng sinh và bacteriocin ..........................
1.2.5. Đặc tính của bacteriocin .............................................................
1.2.6. Một số bacteriocin có nguồn gốc từ biển ....................................
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BACTERIOCIN TỪ CÁC CHỦNG
VI KHUẨN .................................................................................................


2
1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới .......................................................

1.3.2. Các nghiên cứu trong nước .........................................................
1.4. TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG CỦA BACTERIOCIN ..........................
1.4.1. Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm ......................
1.4.2. Ứng dụng bacteriocin trong bảo vệ sức khỏe
động vật trên cạn .....................................................................................
1.4.3. Ứng dụng bacteriocin trong nuôi trồng thủy sản ........................
CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. 33
2.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU.................................................. 33
2.2. NGUYÊN LIỆU............................................................................................................... 33
2.2.1. Vật liệu thí nghiệm............................................................................................... 33
2.2.2. Mơi trường ni cấy............................................................................................ 33
2.2.3. Chủng vi sinh vật chỉ thị.................................................................................... 36
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................... 37
2.3.1. Phương pháp thu mẫu và phân lập vi khuẩn biển................................. 37
2.3.2. Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng với Vibrio spp. của các
chủng vi khuẩn biển phân lập được............................................................................ 40
2.3.3. Xác định phổ kháng khuẩn của các chủng vi khuẩn biển được
tuyển chọn................................................................................................................................ 41
2.3.4. Xác định khả năng sinh chất kháng khuẩn trong môi trường lỏng .. 41
2.3.5. Xác định bản chất hợp chất kháng khuẩn................................................. 42
2.3.6. Phân tích trình tự nucleotide của gen mã hóa 16S rRNA.................42
2.3.7. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của hợp chất
kháng khuẩn............................................................................................................................ 43
2.3.8. Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn
của vi khuẩn biển.................................................................................................................. 43


3
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................
3.1.

PHÂN LẬP VI KHUẨN BIỂN........

3.2.
TUYỂN CHỌN CHỦNG BIỂU HIỆ
VỚI VIBRIO SPP. .......................................................................................

3.3.
PHỔ KHÁNG KHUẨN VI KHUẨN
DINH DƯỠNG ...........................................................................................

3.4.
XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH CH
DỊCH MÔI TRƯỜNG LỎNG ....................................................................
3.5.

XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT CỦA HỢP

3.6.
PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEO
RRNA..........................................................................................................
3.7.

ĐỘ BỀN NHIỆT CỦA CÁC HỢP C

3.8.
ẢNH HƯỞNG THỜI GIAN LÊN M
CHẤT KHÁNG KHUẨN CỦA VI KHUẨN BIỂN ..................................
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................
4.1.

KẾT LUẬN.......................................

4.2.

KIẾN NGHỊ .....................................

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................
PHỤ LỤC


4
MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Thủy sản là ngành quan trọng của Việt Nam, đóng góp vào nền kinh tế
khoảng 3 – 4 % tổng GDP hằng năm, đem lại công ăn việc làm cho hàng triệu
lao động và là nguồn cung cấp thực phẩm quan trọng cho tiêu dùng [1]. Tuy
nhiên, ngành này đang bị đe dọa bởi tình trạng dịch bệnh ngày càng tăng, chủ
yếu do các tác nhân là vi khuẩn, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Vibrio. Vi khuẩn
Vibrio gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng trên động vật thủy sản, chẳng hạn như
chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh “hoại tử gan tụy cấp” (Acute
Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHPND) với tỷ lệ chết lên đến 100 % trên
tôm hoặc chủng Vibrio harveyi, Vibrio vulnificus là tác nhân gây nhiều bệnh
nghiêm trọng trên nhuyễn thể, cá, cũng như nhiều loài động vật thủy hải sản
khác [2, 3]. Theo nghiên cứu của Trần Thị Hồng Tơ và cộng sự [4],
vi khuẩn V. parahaemolyticus được phát hiện trong 86,2 % sản phẩm thủy hải
sản và 78,1 % mẫu nước nuôi thủy sản được thu thập khắp vùng sông Mê Kơng
– nơi tập trung phần lớn diện tích ni trồng thủy sản ở Việt Nam. Có thể nói,
nguy cơ bùng phát trên diện rộng dịch bệnh do Vibrio có thể xảy ra bất cứ lúc
nào. Do đó, việc cần thiết có một biện pháp phịng chống Vibrio hữu hiệu nên

được ưu tiên, nhằm phát triển ngành nuôi trồng thủy sản bền vững ở Việt Nam.
Trước đây, kháng sinh được sử dụng rộng rãi trong nuôi trồng và điều trị
các bệnh ở thủy sản, đặc biệt là bệnh gây ra bởi Vibrio spp. Tuy nhiên, việc lạm
dụng kháng sinh trong thời gian dài đã đem lại nhiều hệ lụy khó khắc phục, như:
i) tồn dư kháng sinh trong các sản phẩm thủy sản ảnh hưởng lớn đến sức khỏe
người tiêu dùng và giảm giá trị xuất khẩu; ii) phát sinh các dịng vi khuẩn Vibrio
spp. kháng kháng sinh; iii) gây ơ nhiễm vùng nuôi do kháng sinh tiêu diệt các hệ
vi sinh vật có lợi trong ao ni, dẫn đến thất bại triền miên trong nuôi trồng thủy
sản [5, 6]. Trên thực tế, các dòng Vibrio kháng thuốc đã được phát hiện và ảnh
hưởng nghiêm trọng đến nhiều khu vực sản xuất ở Việt Nam, như Sóc Trăng,
Bạc Liêu và Trà Vinh, gây tổn thất to lớn cho ngành công nghiệp nuôi tôm trong
nước. Nguyễn Diễm Thư và cộng sự [7] đã công bố tỷ lệ 12,37 % mẫu tôm, nước
nuôi và bùn đáy ao thu ở khu vực sông Mê Kông


5
mang Vibrio có gen gây bệnh “hoại tử gan tụy”, trong đó 80,85 % và 78,72 %
chủng kháng lại lần lượt 2 kháng sinh là Doxycycline và Enrofloxacin. Đây là
con số đáng báo động, là hệ lụy từ việc sử dụng kháng sinh tràn lan trong nuôi
trồng thủy hải sản ở khu vực này trong thời gian dài. Cùng với xu hướng nuôi
tôm “sạch”, kháng sinh đang dần bị hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản,
thay thế bằng việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong xử lý môi trường nước
nuôi thủy sản, một trong những chế phẩm đang được quan tâm hiện nay đó là
bacteriocin – peptide có phổ kháng khuẩn hẹp, do đó tiêu diệt vi khuẩn mục tiêu
một cách hiệu quả, ít ảnh hưởng đến các vi khuẩn có lợi khác và khơng gây độc
cho động vật. Phương thức này đang gặt hái nhiều ưu điểm, tuy nhiên đa phần
các chế phẩm tích hợp các vi sinh vật có nguồn gốc trên cạn. Do đó, hoạt động
vẫn chưa tối ưu trong mơi trường đặc trưng nuôi tôm nước mặn.

Một vài nghiên cứu trong nước cũng đã công bố tiềm năng sử dụng

vi khuẩn để kiểm soát các bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra, tuy nhiên số
lượng nghiên cứu còn rất hạn chế. Nhìn chung, đa số các vi khuẩn được cơng
bố thuộc chi Bacillus và nhóm xạ khuẩn (Actinobacteria). Theo đó, 2 chủng
B. subtilis HY1 và Lactococcus lactis CC4K đã được nhóm tác giả thuộc Viện
Cơng nghệ Sinh học cơng bố có hoạt tính đối kháng với Vibrio trong nước
ni tơm [8]. Tuy nhiên, hợp chất kháng khuẩn khơng có bản chất protein, mà
là các acid hữu cơ. Các chất acid hữu cơ kháng khuẩn khó áp dụng thực tế, do
tác động diệt khuẩn sẽ giảm hoặc mất đi khi pha loãng trong nước ni hoặc
trong pH kiềm tính của nước ni. Nguyễn Thị Bích Đào và cộng sự [9] đã
phân lập được các chủng Bacillus subtilis B1, Bacillus subtilis B2, Bacillus
amyloliquefaciens B4 từ mẫu nước và bùn đáy ao nuôi ở tỉnh Thừa Thiên
Huế. Nguyễn Xuân Cảnh và cộng sự [10] đã thu nhận 2 chủng xạ khuẩn có
hoạt tính kháng Vibrio. Một nghiên cứu khác đã công bố Vibrio trong ao nuôi
tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) bị ức chế khi bổ sung vi khuẩn B.
subtilis và xạ khuẩn Streptomyces parvulus vào mẫu nước ni [11].
Có thể thấy hầu hết các cơng bố chỉ dừng lại ở việc tìm kiếm và sử dụng
trực tiếp các chủng vi sinh vật có khả năng kháng Vibrio nhằm kiểm soát các
bệnh do vi khuẩn Vibrio spp. gây ra hoặc tìm kiếm các hợp chất có khả năng


6
kháng Vibrio phân lập từ nguồn vi sinh vật trên cạn và ứng dụng trong lĩnh
vực nuôi trồng thủy hải sản. Do đó, các chế phẩm có hiệu quả diệt khuẩn
không cao, chưa được tối ưu trong môi trường nuôi nước mặn. Vì vậy
“Nghiên cứu phân lập và sàng lọc các chủng vi khuẩn biển có khả năng
sinh tổng hợp bacteriocin” là cách tiếp cận hiệu quả, có ý nghĩa khoa học
lẫn thực tiễn nhằm đánh giá tiềm năng và ứng dụng các hợp chất có hoạt tính
từ vi sinh vật (VSV) biển trong môi trường nuôi trồng thủy hải sản.
2. MỤC ĐÍCH CỦA ĐỀ TÀI
Sàng lọc và tuyển chọn được các chủng vi khuẩn biển (VKB) có khả

năng sinh tổng hợp bacteriocin đối kháng với VSV gây bệnh trên các đối
tượng thủy hải sản (chủ yếu đối kháng với Vibrio).
3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: các chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng
hợp bacteriocin.
Phạm vi nghiên cứu: khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh trên thủy, hải
sản của các chủng vi khuẩn biển thu được.
4. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
Tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn từ VSV biển nhằm
ứng dụng trong lĩnh vực nuôi trồng thủy hải sản là cách tiếp cận mới, có ý
nghĩa khoa học.
Thành cơng của đề tài sẽ định hướng khả năng sử dụng VSV biển trong
nghiên cứu thu nhận hợp chất có hoạt tính sinh học, góp phần giảm thiểu
lượng thuốc kháng sinh sử dụng trong nuôi trồng thủy hải sản, nâng cao chất
lượng sản phẩm.
Chế phẩm sinh học có lợi thế thân thiện mơi trường, giảm thiểu ơ
nhiễm mơi trường và góp phần phát triển bền vững.
5. CÁC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHÍNH
Thu nhận mẫu sinh vật biển (tôm, cá, rong biển, bọt biển …) và phân
lập vi khuẩn biển.


7
Khảo sát khả năng đối kháng với vi sinh vật chỉ thị của các chủng vi
khuẩn biển phân lập được.
Xác định phổ kháng khuẩn và bản chất của hợp chất kháng khuẩn.
Tuyển chọn và định danh bằng gene 16s rRNA của một số chủng vi
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.
Nghiên cứu độ bền nhiệt của hợp chất kháng khuẩn và khảo sát ảnh
hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh chất kháng khuẩn của ít nhất

01 chủng vi khuẩn biển có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin.


8
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN
1.1.1. Đặc điểm vi khuẩn
Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật có cấu tạo tế bào nhưng chưa có cấu trúc
nhân hồn chỉnh, vi khuẩn có các đặc điểm đặc trưng: kích thước nhỏ bé, hấp
thụ nhiều và chuyển hóa nhanh, sinh trưởng nhanh và phát triển mạnh, thích
ứng mạnh, dễ phát sinh biến dị, nhiều chủng loại và phân bố rộng [12]. Vi
khuẩn có kích thước rất nhỏ, thay đổi tùy từng lồi, đường kính từ 0,2 – 2,0
µm, chiều dài từ 2 – 10 µm, một số vi khuẩn có kích thước dài đến vài chục
micromet. Vi khuẩn có hình thái riêng, đặc tính sinh vật riêng, chúng có khả
năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật, một số có khả năng tiết chất
kháng khuẩn. Phương thức dinh dưỡng đa dạng, đa số vi khuẩn sống hoại sinh
trong tự nhiên [13]. Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định.
Các hình dạng và kích thước này là do vách tế bào của vi khuẩn quyết định.
Hình thái là một tiêu chuẩn rất quan trọng để xác định vi khuẩn [12].
Về hình thái, có thể chia vi khuẩn thành 3 nhóm lớn sau: i) Cầu khuẩn
(Cocci): Là những vi khuẩn có hình cầu, mặt cắt của chúng có thể là những
hình trịn, nhưng cũng có thể là hình bầu dục hoặc ngọn nến. Đường kính
trung bình khoảng 0,5 – 1 µm. Cầu khuẩn lại được chia làm nhiều loại như:
đơn cầu khuẩn (Micrococcus), song cầu khuẩn (Diplococcus), tứ cầu khuẩn
(Tetracoccus), tụ cầu khuẩn (Staphylococcus), liên cầu khuẩn (Streptococcus).
ii) Trực khuẩn (Bacilli): Là những vi khuẩn hình que, đầu trịn hay vng, kích
thước vi khuẩn gây bệnh thường gặp là 0,5 – 1 x 2 – 5 µm. Các trực khuẩn
khơng gây bệnh thường có kích thước lớn hơn [12]. Một số loại trực khuẩn
thường gặp bao gồm: Trực khuẩn Gram dương, sống hiếu khí sinh nha bào:
Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, v.v...; Trực khuẩn Gram âm, sống hiếu khí,

khơng sinh nha bào, thường có tiên mao ở xung quanh thân vi khuẩn:
Salmonella, Escherichia, Shigella, Proteus, v.v... iii) Xoắn khuẩn (Spirillum,
Spirochete): Là những vi khuẩn có hình sợi lượn sóng và di động. Chiều dài
của các vi khuẩn loại này có thể tới 30 µm. Trong loại này có 3 giống vi
khuẩn gây bệnh quan trọng là Treponema, Leptospira và Borrelia [12].


9
Ngồi những vi khuẩn có hình dạng điển hình như trên cịn có những loại

vi khuẩn có hình thái trung gian: Trung gian giữa cầu khuẩn và trực khuẩn là
cầu – trực khuẩn, như vi khuẩn dịch hạch (Yersinia pestis); Trung gian giữa
trực khuẩn và xoắn khuẩn là phẩy khuẩn mà điển hình là phẩy khuẩn tả
(Vibrio cholerae) [12].
Việc nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn được thực hiện thông
qua sự hỗ trợ của các thiết bị chuyên dụng như kính hiển vi quang học, kính hiển
vi

điện tử. Mỗi loại vi khuẩn đều có cấu trúc tế bào và hình dạng khác nhau. Do

đó để nhận diện được vi khuẩn phải thực hiện qua nhiều phương pháp, kỹ thuật.
Một trong số đó là phương pháp nhuộm Gram [14]. Nhuộm Gram là kỹ thuật
nhuộm sử dụng nhiều loại hóa chất để phân biệt 2 nhóm vi khuẩn là Gram dương
(+) và Gram âm (–) dựa trên cấu tạo vách tế bào của vi khuẩn. Đây là phương
pháp được phát minh bởi nhà khoa học có tên Hans Christian Gram từ năm 1884
và đến nay vẫn được ứng dụng phổ biến [15]. Đặc tính bắt màu của

vi khuẩn trong phương pháp nhuộm Gram là do vách tế bào quyết định, từ đó
dẫn đến sự khác nhau trong kết quả nhuộm, vi khuẩn Gram dương sẽ bắt màu
từ xanh đến tím, vi khuẩn Gram âm sẽ bắt màu từ hồng đến đỏ [14]. Sự khác

nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm được tóm tắt trong Bảng 1.1.


10
Bảng 1.1. Sự khác nhau giữa vi khuẩn Gram dương và Gram âm [14]
Vi khuẩn Gram dương
Cấu tạo bên ngoài có 2 lớp:
- Bên trong là màng nguyên sinh.
- Bên ngoài là lớp peptidoglycan
dày (60 – 100 % peptidoglycan).

Hàm lượng lipid thấp
Khơng có nội độc tố
Khơng có khoảng chu chất
(periplasmic space)
Khơng có kênh porin
Dễ bị tổn thương bởi sự tấn cơng của
lysozyme và penicillin
Lớp peptidoglycan có chứa acid
teichoic
1.1.2. Tác động của vi khuẩn
Vi khuẩn tham gia tích cực vào việc khép kín vịng tuần hồn các vật
chất trong tự nhiên, làm sạch mơi trường. Vi khuẩn đóng vai trị quan trọng
trong chu trình carbon, nitơ… các chu trình vật chất có ý nghĩa quyết định cho
sự sống của sinh vật trên trái đất. Tham gia chuyển hóa, phân hủy các chất
khó tiêu trong đất thành các chất dễ tiêu cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng,
một số loại vi khuẩn làm giàu dinh dưỡng bằng cách cố định nitơ cho đất.
Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm và dược phẩm: ứng dụng quá trình
lên men để sản xuất thực phẩm, sản xuất men vi sinh, sản xuất vaccine, các loại
thuốc, hormon, v.v... mang lại giá trị kinh tế cao. Vi khuẩn là đối tượng để

11
nghiên cứu về di truyền phân tử, hóa sinh học, vì chúng có số lượng gen ít, phát
triển nhanh, kích thước nhỏ, nên dễ dàng cho sự nghiên cứu và thực nghiệm.

Nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho người, động vật, thực vật... Vi khuẩn
là căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng, gây ô nhiễm môi trường, hủy hoại
thức ăn và các sản phẩm sinh học cần bảo quản, là mối đe dọa tiềm tàng trong
tương lai khi tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng [12, 13].
1.1.3. Vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản
Dân số thế giới tính đến năm 2020 là 7,795 tỷ người [16]. Với quy mô
dân số hiện tại và được dự báo có thể đạt đến 10,5 tỷ người vào năm 2050 thì
an ninh lương thực, thực phẩm được xem như một vấn đề cấp bách trên toàn
cầu [17]. Từ nhu cầu trên đã thúc đẩy sự phát triển của các ngành sản xuất
thực phẩm. Ni trồng thủy sản đã có bước phát triển mạnh mẽ trong những
thập kỷ qua và tiếp tục dẫn đầu trong việc sản xuất thực phẩm từ thủy sản tại
châu Á và trên toàn cầu. Hơn 91 % sản lượng nuôi trồng thủy sản được sản
xuất tại châu Á (102,9 triệu tấn trong năm 2017).

Hình 1.1. So sánh sản lượng nuôi trồng thủy sản và đánh bắt cá trên toàn cầu
trong giai đoạn từ 1950 – 2017 [18]
Tổng sản lượng ni trồng thủy sản tồn cầu đã vượt qua sản lượng đánh
bắt cá toàn thế giới 18,32 triệu tấn (Hình 1.1), giá trị của ngành ước tính hơn 250
tỷ USD (tính đến năm 2017) [18]. Hơn 95 % sản lượng của ngành được


12
sản xuất tại các nước đang phát triển, tốc độ tăng trưởng sản lượng trung bình
hằng năm đạt 6,13 %, giúp tạo ra hàng nghìn việc làm và góp phần tăng

trưởng kinh tế ở những quốc gia này [18].
Tuy nhiên, cùng với việc tăng cường hoạt động nuôi trồng thủy sản,
dịch bệnh bùng phát, đặc biệt là các bệnh nhiễm khuẩn, ngày càng trở thành
một thách thức lớn đối với việc mở rộng sản xuất và ảnh hưởng đến sự phát
triển kinh tế của một số quốc gia. Dịch bệnh đã làm nền kinh tế toàn cầu bị
tổn thất hơn 9 tỷ USD mỗi năm (số liệu công bố năm 2010); gây thiệt hại cho
Trung Quốc hơn 120 triệu USD trong giai đoạn từ 1990 – 1992 [19, 20]. Ước
tính có khoảng 15 % thiệt hại do cá chết vì dịch bệnh trong các lồng lưới và
ao nuôi trong tổng số 16.100 trang trại nuôi cá tại Brazil [21, 22]. Tại Việt
Nam, bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (hay cịn gọi là Hội chứng tơm chết sớm)
là bệnh nặng nhất hiện nay ảnh hưởng đến nuôi tôm nước lợ. Căn bệnh này
gây ra thiệt hại lớn cho người nuôi tơm ở Đồng bằng sơng Cửu Long, nơi có
hơn 70 % sản lượng tôm của Việt Nam. Thiệt hại do hội chứng tôm chết sớm
đã được ghi nhận ở khoảng 59.000 ha trang trại ở Đồng bằng sông Cửu Long
khi bệnh mới xuất hiện vào năm 2011, đến năm 2017 bệnh đã lan ra 294 xã
thuộc 86 huyện của 25 tỉnh trong cả nước [23].
Dịch bệnh gia tăng là một trong những hệ quả của việc tăng cường nuôi
trồng thủy sản. Các yếu tố môi trường như chất lượng nước xấu, nhiệt độ
khơng thích hợp, mật độ ni dày, quản lý chăm sóc kém, thức ăn và con
giống khơng đảm bảo chất lượng làm cho động vật thủy sản bị giảm sức đề
kháng, các tác nhân gây bệnh phát triển. Đồng thời, động vật thủy sản sống
trong môi trường nước với mật độ ni cao làm cho bệnh có điều kiện lây lan
nhanh chóng và gây thiệt hại lớn [24]. Một trong những nguyên nhân gây
bệnh phổ biến cho thủy sản là vi khuẩn. Vi khuẩn gây bệnh ở động vật thủy
sản đã phân lập được vài trăm loài thuộc 9 họ, vi khuẩn điển hình là nhóm vi
khuẩn Aeromonas spp., Pseudomonas spp. gây bệnh ở động vật thủy sản nước
ngọt và nhóm Vibrio spp. gây bệnh ở động vật thủy sản nước mặn [24]. Một
số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản được thống kê trong Bảng 1.2.

13
Bảng 1.2. Một số vi khuẩn gây bệnh cho thủy, hải sản [24, 25]
Tên vi khuẩn
Flexibacter columnaris
Flexibacter maritimus
Flavobacterium
branchiophila
Myxococcus piscicolas
Cytophaga spp.
Thiothrix spp.
Leucothrix mucor
Flavobacterium spp.
Hafnia alvei
Proteus rettgeri
Aeromonas spp.
Edwardsiella spp.
Vibrio alginolyticus

Vibrio anguillarum
Vibrio
parahaemolyticus


Vibrio harveyi
Pasteurella piscinida
Pseudomonas spp.


14
Một trong những nguyên nhân gây bệnh phổ biến, gây thiệt hại lớn cho

nuôi trồng thủy sản không thể không kể đến chi Vibrio. Chi Vibrio được mô tả
lần đầu tiên vào năm 1854 bởi một bác sỹ người Ý, Filippo Pacini, khi nghiên
cứu các đợt bùng phát của dịch tả ở Florence [26]. Chi Vibrio bao gồm 142 lồi,
có nguồn gốc từ biển và việc phân loại của chi liên tục được sửa đổi do việc phát
hiện và đưa vào các loài mới [27]. Đặc điểm chung của vi khuẩn thuộc chi
Vibrio: vi khuẩn Gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 –
0,5 x 1,4 – 2,6 µm, khơng sinh nha bào, di động nhờ một lơng ở một đầu, hiếu
khí hoặc yếm khí tùy tiện, tất cả các loài đều cần NaCl để phát triển nhưng nồng
độ tốt ưu cho mỗi lồi khơng giống nhau, trong tự nhiên thường gặp ở môi
trường nước biển và cửa sông [12, 24]. Vibrio lây nhiễm cho bất kỳ sinh vật nào
kể cả động vật và con người. Nhiều lồi trong chi là vơ hại, tuy nhiên một trong
số chúng gây ra nhiều bệnh nghiêm trọng cho người và thủy hải sản. Theo báo
cáo của Batz và cộng sự, một số loài của chi Vibrio đã được xác định và xếp vào
14 mầm bệnh hàng đầu gây ra gần 95 % các ca bệnh do thực phẩm dẫn đến nhập
viện và tử vong ở Mỹ [28]. Đối với cá, Vibrio spp. gây bệnh nhiễm khuẩn máu là
chủ yếu. Đối với tôm, Vibrio spp. gây bệnh phát sáng, đỏ dọc thân, ăn mòn vỏ
kitin [24]. Bệnh gây bởi Vibrio spp. (gọi tắt là bệnh Vibriosis) đã trở thành yếu tố
chính ảnh hưởng tới sản xuất và gây tỷ lệ tử vong cao trong ngành nuôi trồng
thủy sản. Theo báo cáo năm 2007, bệnh Vibrio xảy ra ở hơn 14 quốc gia, ảnh
hưởng đến việc nuôi trồng của khoảng 48 loài cá biển [29]. Ở Đan Mạch, bệnh
Vibrio gây thiệt hại 30 % trong các quần thể nuôi lươn [29]. Bệnh hoại tử gan tụy
cấp tính gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành nuôi tôm ở châu Á và Trung
Mỹ, gây thiệt hại kinh tế hơn 1 tỷ USD [30]. Những thiệt hại đáng kể về kinh tế
và các tác động do Vibrio spp. đối với ngành nuôi trồng thủy sản được tóm tắt
trong Bảng 1.3.


15
Bảng 1.3. Tác động về kinh tế – xã hội và tác động khác của bệnh liên quan
đến Vibrio trong ngành nuôi trồng thủy sản

Quốc gia
bị ảnh
hưởng
Trung
Quốc

Ai Cập

Tunisia

Mexico
Thái Lan
Ecuador
Nhật Bản

Ấn Độ

Ấn Độ


Ý


16
1.1.4. Vi khuẩn biển – nguồn cung cấp các hợp chất tự nhiên có
hoạt tính sinh học
Sự sống – từ hơn 3,5 tỷ năm trước, đã xuất hiện trong các đại dương
[39]. Q trình tiến hóa đã cung cấp cho các sinh vật biển cơ chế thích hợp để
tồn tại trong môi trường khắc nghiệt, nhiều thù địch như sự tấn công của các
vi khuẩn, virus gây bệnh [40]. Các đại dương bao phủ khoảng 70 % bề mặt

Trái Đất, sở hữu sự đa dạng khổng lồ về sinh thái, hóa học và sinh học [41].
Sinh quyển biển bao gồm các nhóm vi sinh vật đa dạng về đặc tính trao đổi
chất, chức năng và cấu trúc độc đáo [42, 43]. Hệ vi sinh vật biển đang được
nghiên cứu, mặc dù có hơn 1,2 triệu lồi đã được liệt kê, nhưng ước tính có
tới 91 % các lồi trong đại dương chưa được biết đến [44].
Sự sản xuất các chất có hoạt tính ở những sinh vật trên cạn được biết đến
từ lâu. Môi trường biển với những sinh vật thích nghi với điều kiện sống khắc
nghiệt dẫn đến việc sản sinh ra nhiều phân tử có hoạt tính độc đáo hơn [45].
Trong nhiều thập kỷ qua, các nhà nghiên cứu đã chuyển mối quan tâm sang việc
tìm kiếm các vi sinh vật biển mới và chất chuyển hóa của chúng. Theo hướng
này, một phần của những nghiên cứu công nghệ sinh học và dược phẩm đã tập
trung vào môi trường biển như một nguồn tài nguyên đầy hứa hẹn cho các hoạt
chất sinh học mới [46]. Sự quan tâm của thế giới trong việc tìm kiếm các thuốc
kháng sinh mới để chống lại tình trạng đa kháng thuốc đang đe dọa sức khỏe
cộng đồng đã thúc đẩy việc tìm kiếm các hoạt chất mới để đối phó với các mầm
bệnh này [47, 48]. Các vi sinh vật biển tiếp xúc, tồn tại trong nhiều điều kiện môi
trường phức tạp, chúng đã trải qua các q trình tiến hóa sâu rộng nhằm thích
nghi với mơi trường sống khắc nghiệt, vì vậy vi sinh vật biển nói chung và vi
khuẩn biển nói riêng là nguồn dự trữ, nguồn cung cấp đa dạng các hoạt chất sinh
học đáp ứng cho nhu cầu tìm kiếm thuốc mới, liệu pháp điều trị bệnh mới của
con người [49, 50]. Vi sinh vật biển đã phát triển vô số các con đường trao đổi
chất, cho ra nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính mà khơng thể tìm thấy ở
những sinh vật trên cạn [51]. Các hoạt chất cho hoạt tính bao gồm alkaloid,
steroid, terpenoid, peptide và polyketide [52]. Các nhà nghiên cứu tin rằng ít nhất
10 – 20 % vi khuẩn phân lập từ mơi trường biển có các ứng dụng