Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen
ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng
Triệu Tiến Sang1, Trần Văn Khoa1, Nguyễn Thanh Tùng2
Lê Thị Thu Hiền3, Hoàng Xuân Cường4, Trần Ngọc Thảo My5
BM Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y

1

Viện Mô phôi và lâm sàng Quân đội, Học viện Quân y

2

Bệnh viện Nam học và hiếm muộn Hà Nội

3

Phòng Khoa học Quân sự, Học viện Quân y

4

Khoa Khoa học và Kỹ thuật, Trường Đại học Sorbonne, Pháp

5

TÓM TẮT
Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận
(X-ALD) là một bệnh lí di truyền lặn liên kết giới
tính hiếm gặp làm rối loạn chức năng tuyến thượng
thận, dây thần kinh tủy sống và chất trắng của hệ

thần kinh. Theo các thống kê về dịch tễ học, bệnh
lí này gây ảnh hưởng đến 1 trên 15000 người, tuy
nhiên, tỷ lệ mắc bệnh trong thực tế được ước tính là
cao hơn nhiều nhờ vào việc áp dụng kết hợp các kĩ
thuật hiện đại giúp chẩn đoán sớm bệnh. Khả năng
phát hiện ra bệnh ở thời điểm càng sớm sẽ giúp các
gia đình có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất
trắng xây dựng những phương án sinh con cũng
như chữa trị triệu chứng bệnh một cách chủ động
và an tồn. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tơi
xây dựng quy trình chẩn đốn sớm đột biến gây
bệnh ở giai đoạn tiền làm tổ nhằm giúp đỡ những
gia đình có tiền sử mắc bệnh nhưng mong muốn
sinh con khỏe mạnh. Bằng việc kết hợp sử dụng các
phương pháp giải trình tự, đặc biệt là giải trình tự
theo nguyên lí Sanger với việc thực hiện các phản
ứng PCR đơn cặp mồi, chúng tơi đã có thể xây dựng

được quy trình phát hiện đột biến trên gen ABCD1
liên quan đến bệnh. Sau đó, chúng tơi ứng dụng quy
trình này cho các mẫu tế bào phơi sinh thiết của gia
đình có tiền sử mắc bệnh nhằm sàng lọc các phôi
không mang alen gây bệnh loạn dưỡng não chất
trắng. Kết quả của nghiên cứu cho thấy đã có thể
phát hiện được alen đột biến ở 5/8 phơi (62,5%) và
3 phơi cịn lại (37,5%) không mang alen đột biến
nên 3 phôi này tiếp tục được sử dụng trong các bước
sàng lọc tiền làm tổ tiếp theo trong quá trình thụ
tinh nhân tạo.

ĐẶT VẤN ĐỀ
Loạn dưỡng não chất trắng thượng thận
(X-linked adrenoleukodystrophy, X-ALD (MIM
#300100)), là bệnh di truyền liên kết nhiễm sắc
thể X liên quan tới rối loạn q trình β-oxi hóa tại
peroxisome. Bệnh do đột biến trên gen ABCD1 mã
hóa cho protein xuyên màng của peroxisome gây ra
dẫn tới sự tích tụ quá mức những chuỗi axit béo rất
dài (VLCFA - very long-chain fatty acid; ≥ C22) ở
trong huyết tương và mô, bao gồm phần chất trắng
Ngày nhận bài: 19/10/2020
Ngày phản biện: 20/11/2020
Ngày chấp nhận đăng: 09/12/2020

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210

17


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

ở não, tủy sống và vỏ thượng thận [2, 4]. Cho đến
thời điểm hiện tại, thế giới đã ghi nhận nhiều ca mắc
bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận xuất
hiện với tần suất tương tự giữa các quốc gia. Với tỷ
lệ mắc bệnh là khoảng 1 trên 14,700 trẻ sơ sinh (cả
nam lẫn nữ), đây chính là hội chứng rối loạn liên
quan đến peroxisome phổ biến nhất từng gặp [9].
Tuy nhiên, tỷ lệ thực tế của căn bệnh này chưa được
ước tính chính xác bởi hầu hết các khảo sát liên quan

đến bệnh đều được thực hiện ở Mỹ hoặc các nước
châu Âu, rất ít khảo sát được thực hiện tại châu Phi
và châu Á, đặc biệt là vùng Trung Đông [1].
Loạn dưỡng não chất trắng thường được phân
loại thành ba kiểu bệnh chính: X-ALD não, bệnh
lý thượng thận – tủy – rễ thần kinh (AMN), kiểu
chỉ có bệnh Addison [3]. Đây đều là những thể
bệnh với những triệu chứng có ảnh hưởng nặng nề
tới người mắc bệnh, đặc biệt là ở nam giới. Một số
triệu chứng lâm sàng chung giữa ba thể bệnh này
bao gồm thối hóa hệ thần kinh (vận động, thị
giác,…) và suy giảm tuyến thượng thận khiến cho
loạn dưỡng não chất trắng trở thành một căn bệnh
phát triển nhanh chóng, nghiêm trọng và chưa thể
xác định được một phác đồ điều trị dứt điểm thực
sự hiệu quả [2].
Hiện nay có nhiều phương pháp chẩn đoán
bệnh loạn dưỡng não chất trắng thượng thận, bao
gồm phương pháp chẩn đoán trước sinh và chẩn
đoán sau sinh. Đối với phương pháp chẩn đoán
trước sinh, việc chọc dịch ối sau đó thực hiện một
số xét nghiệm di truyền có thể đưa ra chẩn đốn về
tình trạng mắc bệnh của thai nhi, tuy nhiên đây là
phương pháp xâm lấn gây ảnh hưởng tiêu cực đến
sức khỏe người mẹ đồng thời phát hiện bệnh ở giai
đoạn muộn [5, 6]. Ngồi ra, một số phương pháp
chẩn đốn sau sinh bao gồm việc sàng lọc ở trẻ sơ
sinh sử dụng kĩ thuật quang phổ khối kế tiếp (MS/
MS) để đo nồng độ 26:0-lyso-PC hay các kĩ thuật
chẩn đoán lâm sàng và cận lâm sàng như chụp

18

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021

ảnh MRI não, xét nghiệm sinh hóa và phân tích di
truyền đều tồn tại một nhược điểm chung là đều
phát hiện ra người bệnh ở giai đoạn khá muộn [10].
Do vậy, hướng nghiên cứu nhằm xây dựng một quy
trình giúp chẩn đốn bệnh ở giai đoạn sớm, đặc biệt
ở giai đoạn tiền làm tổ, có thể giúp những gia đình
có tiền sử mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng có
cơ hội sinh con khơng mang gen gây bệnh và sinh ra
thế hệ sau một cách chủ động và an toàn.
Tất cả những bệnh nhân mắc chứng ALD đều
mang đột biến trên gen ABCD1 [8]. Đây là bệnh di
truyền do alen lặn trên nhiễm sắc thể X qui định và
cho tới thời điểm này chỉ xác định được khoảng 5%
ca bệnh gây ra bởi các đột biến de novo. Gen ABCD1
nằm ở gần cuối cánh dài của nhiễm sắc thế X: vị trí
Xq2.8 và có độ dài 19.9 kb bao gồm 10 exon. ABCD1
mã hóa cho một loại protein xuyên màng cấu tạo từ
745 amino axit được gọi là adrenoleukodystrophy
protein, hay ALDP (protein ALD). Protein này nằm
xuyên màng peroxisome thực hiện chức năng vận
chuyển VLCFA-CoA từ tế bào chất qua màng vào
bên trong bào quan để tham gia vào q trình β-oxi
hóa. Những đột biến trên gen ABCD1 sẽ gây ảnh
hưởng trực tiếp tới protein ALD khiến cho protein
bị thay đổi về mặt cấu trúc cũng như số lượng khiến

cho nó khơng thể thực hiện chức năng vận chuyển
từ đó gây tích tụ các chuỗi axit béo rất dài trong tế
bào chất. Sự tích tụ này để lại ảnh hưởng tiêu cực tới
tế bào, đặc biệt là các tế bào hệ thần kinh [3]. Chính
vì vậy, nghiên cứu tập trung vào phát hiện đột biến
trên gen ABCD1 nhằm chẩn đốn bệnh loạn dưỡng
não chất trắng. Quy trình được xây dựng nhằm ứng
dụng lên các mẫu phôi sinh thiết của những gia đình
có tiền sử mắc bệnh X-ALD.

ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu máu của một cặp vợ chồng (vợ: N.T.T. –


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

26 tuổi; chồng: V.Đ.H. – 28 tuổi) có tiền sử gia
đình phía vợ có người mắc bệnh loạn dưỡng não
chất trắng. Tám mẫu phôi thụ tinh nhân tạo của
cặp vợ chồng đó được ni cấy rồi sinh thiết,
trong đó 7 mẫu (TR1 – TR7) được sinh thiết vào
ngày 5, 1 mẫu (TR8) được sinh thiết vào ngày 6.
Các mẫu được sinh thiết từ 3 đến 5 tế bào phôi
ngày 5 hoặc ngày 6, rửa phôi bằng dung dịch PBS
1X + 1% PVP, lấy tế bào phôi vào ống PCR 0,2 ml.
Tổng toàn bộ dung dịch cả tế bào và dung dịch
mơi trường là 4 µl.
Các loại mẫu sử dụng trong nghiên cứu đều

được bảo quản ở nhiệt độ âm. Toàn bộ cam kết liên
quan đến mẫu bệnh phẩm và mẫu tế bào phôi sinh
thiết cũng như hồ sơ, mô tả chi tiết về nghiên cứu đã
được xét duyệt và thông qua bởi Hội đồng đạo đức
trong nghiên cứu Y sinh học, Học viện Quân y.
Vật liệu
Hóa chất và trang thiết bị: bộ kit tách chiết
G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON
Biotechnology – Hàn Quốc); bộ kit REPLI-g®
Single Cell (QIAGEN – Đức); GoTaq Green
Mastermix 2X (dNTPs, Taq polymerase, MgCl2,
buffer) (Promega – Hoa Kỳ); Agarose, TBE 1X,
ethidium bromide, thang chuẩn ADN (100 bp –
1000 bp và 100 bp – 1500 bp) (Cleaver Scientific
– Anh); hệ thống trang thiết bị và máy móc đạt u
cầu về kỹ thuật và an tồn phịng thí nghiệm tại
Labo thuộc Bộ mơn Sinh học và Di truyền y học,
Học viện Quân y.
Phương pháp
Giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột biến:
Mẫu bệnh phẩm của người có tiền sử gia đình mắc
bệnh loạn dưỡng não chất trắng (N.T.T.) sẽ được
gửi đi giải trình tự thế hệ mới nhằm khảo sát đột
biến trên gen ABCD1. Sau khi có kết quả, mẫu sẽ
được làm giải trình tự Sanger nhằm xác nhận lại đột
biến đã được xác định bằng phương pháp NGS. Kết
quả giải trình tự thế hệ mới đã phát hiện được đột

biến dị hợp tử c.854G>C (p.Arg285Pro) trên exon
1 của gen ABCD1. Đồng thời, thực hiện quy trình

xác nhận lại đột biến bằng cách khảo sát đột biến
trên exon 1 gen ABCD1 trên hệ thống ABI 3500
Genetic Analyzer và đều cho kết quả giống với giải
trình tự thế hệ mới. Đây là một đột biến lặn nên thể
đồng hợp tử mang 2 alen đột biến sẽ gây bệnh loạn
dưỡng não chất trắng. Ngoài ra, theo thống kê trên
ngân hàng dữ liệu đột biến gen ABCD1, đột biến
c.854G>C chỉ được ghi nhận 2 lần trong quá khứ
nên đột biến được xác định ở bệnh nhân này có thể
được coi là xuất hiện lần thứ 3 trong lịch sử nghiên
cứu về bệnh [7].
Thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR: Dựa vào kết
quả giải trình tự của bệnh nhân N.T.T. cùng với trình
tự gen ABCD1 được tham khảo trên ngân hàng trình
tự gen quốc tế GenBank, chúng tôi tiến hành thiết
kế cặp mồi đặc hiệu sử dụng công cụ NCBI PrimerBLAST và đặt tổng hợp cặp mồi tại hãng Integrated
DNA Technologies (IDT), Hoa Kỳ. Cặp mồi nhận
được ở dạng bột đơng khơ, vì vậy khi sử dụng, mồi
sẽ được pha loãng bằng nước khử ion đến nồng độ
hoạt động là 10 µM.
Tách chiết ADN từ máu tồn phần: ADN
được tách chiết sử dụng bộ kit G-spinTM Total
Extraction của iNtRON Biotechnology: 200 μl
máu toàn phần được cho vào ống ly tâm 1,5 ml;
thêm 200 μl BL Buffer, 20 μl Proteinase K, 5 μl
RNase, trộn đều, ủ ở 56°C trong thời gian 15
phút; thêm 200 μl EtOH 100%, trộn đều; chuyển
800 μl dung dịch từ ống ly tâm 1,5 ml vào cột lọc,
ly tâm 13000 vòng/ phút trong 1 phút ở 25°C, đổ
dịch; chuyển hết toàn bộ dung dịch còn lại trong

ống vào cột lọc và lặp lại bước trước đó; thêm 700
μl Buffer WA vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút
trong 1 phút ở 25°C, đổ dịch; thêm 700 μl Buffer
WB vào cột lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1
phút ở 25°C, đổ dịch; ly tâm 13000 vòng/phút
trong 1 phút ở 25°C làm khơ màng lọc, chuyển
TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210

19


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

cột lọc sang một ống ly tâm 1,5 ml mới; thêm 85
μl nước khử ion đã được ủ ở 56°C vào cột lọc, ủ
ở nhiệt độ phòng tối thiểu 5 phút, ly tâm 13000
vòng/phút trong 1 phút ở 25°C, thu ADN ở ống ly
tâm 1,5 ml. ADN được đo nồng độ và giá trị A260/
A280 để kiểm tra chất lượng bằng máy SpectraMax
QuickDrop.
Khuếch đại toàn bộ hệ gen của mẫu tế bào phôi sinh
thiết: Pha dung dịch D2 với tỷ lệ 33 µl Buffer DLB : 3
µl DTT 1M; spin nhẹ các ống chứa tế bào phôi sinh
thiết và nhỏ lên thành mỗi mỗi ống 3 µl dung dịch
D2; ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ 65ºC trong
vịng 10 phút; thêm vào mỗi ống 3 µl Stop Solution;
spin nhẹ các ống và ủ tại nhiệt độ 4ºC trong vịng ít
nhất là 3 phút; chuẩn bị hóa chất khuếch đại hệ gen
theo tỷ lệ thể tích (cho một mẫu) như sau: 9 µl H2O
sc, 29 µl REPLI-g Reaction Buffer, 2 µl REPLI-g sc

DNA Polymerase; thêm vào mỗi ống chứa mẫu tế
bào phơi 40 µl hóa chất khuếch đại hệ gen đã chuẩn
bị rồi spin nhẹ, ủ các ống chứa mẫu tại nhiệt độ
30ºC trong vòng 2 giờ; bất hoạt enzyme REPLI-g
sc DNA Polymerase bằng cách ủ mẫu tại nhiệt độ
65ºC trong vòng 3 phút; mẫu ADN sau khi khuếch
đại sẽ được pha loãng tới nồng độ hoạt động trong
khoảng 2 – 20 ng/µl và kiểm tra nồng độ bằng máy
SpectraMax QuickDrop.
Tối ưu hóa phản ứng PCR: Dựa và nhiệt độ nóng
chảy Tm của cặp mồi đã thiết kế, nghiên cứu thiết lập
phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi với dải nhiệt
độ dao động quanh giá trị Tm ± 5ºC với tổng thể tích
là 25 µl với 12,5 µl GoTaq Green Mastermix 2X, 7,5

µl nước khử ion, 0,5 µl mỗi mồi, 4,0 µl dịch ADN
tách chiết. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR đơn
cặp mồi sẽ được thể hiện ở phần kết quả của quá
trình tối ưu phản ứng.
Phát hiện đột biến gen ABCD1 bằng phương pháp
PCR và giải trình tự theo phương pháp Sanger: Sau khi
xác định được nhiệt độ gắn mồi thích hợp, phản ứng
PCR sẽ được tiến hành với cặp mồi đã được thiết
kế nhằm khuếch đại đoạn gen mang đột biến. Sản
phẩm phản ứng PCR sau đó sẽ được điện di kiểm
tra và tinh sạch nhằm gửi đi giải trình tự Sanger để
khảo sát đột biến trên gen ABCD1. Quá trình này
đầu tiên sẽ được ứng dụng với mẫu ADN của người
mẹ (N.T.T.) đã được làm giải trình tự NGS để so
sánh kết quả, sau đó mới được ứng dụng lên các

mẫu tế bào phơi sinh thiết.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trình tự cặp mồi cho phản ứng PCR
Chúng tôi thiết kế cặp mồi có độ dài là 18 base –
độ dài lí tưởng để sử dụng trong nghiên cứu. Đồng
thời chúng tôi áp dụng một số tiêu chí để thiết
kế cặp mồi mong muốn như sau: kích thước sản
phẩm PCR < 500 bp, nhiệt độ nóng chảy (Tm) của
mồi nằm trong khoảng từ 50º - 65ºC, tránh lặp lại
nhiều lần trong trình tự mồi dễ gây bắt cặp nhầm.
Qua đánh giá các thông số, chúng tôi sàng lọc kết
quả trên hệ thống và lựa chọn cặp mồi sao cho hợp
lí. Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen ABCD1
mong muốn là ABCD1F và ABCD1R chúng tôi
thiết kế sẽ được thể hiện ở bảng 1.

Bảng 1. Trình tự cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR dự tính.

20

Mã mồi

Trình tự đoạn mồi
(F – Forward, R – Reverse)

Tm (°C)

ABCD1F

5’ - GTG TTC CTC ACG GCC AAC - 3’

56,6

ABCD1R

5’ - CTC CCT GCC ACA CGC TTC - 3’

59

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021

Kích thước sản phẩm
PCR (bp)
199 bp


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Kết quả tách chiết ADN từ máu toàn phần và kết
quả khuếch đại toàn bộ hệ gen mẫu tế bào phôi
sinh thiết
Mẫu bệnh phẩm của người mẹ mang đột biến
(NTT-ABCD1) sau khi tách chiết ADN và đo OD
đạt nồng độ theo yêu cầu là 10,0 ng/µl với chỉ số
A260/A280 là 2,0. Mẫu ADN này hoàn toàn đạt
chất lượng để được sử dụng trong các bước tiếp theo
của quy trình. Tám mẫu tế bào phơi sau khi được
sinh thiết được tiến hành khuếch đại toàn bộ hệ gen
và pha lỗng với tỷ lệ thể tích 10 µl ADN : 200 µl

nước khử ion. Kết quả nồng độ ADN các mẫu tế
bào phôi sinh thiết sau khi được khuếch đại và pha
loãng được thể hiện ở bảng 2. Dựa vào bảng kết quả,
các mẫu tế bào phôi sinh thiết đã được khuếch đại
hệ gen thành công và nồng độ ADN đã đạt ngưỡng
phù hợp để được sử dụng cho các bước tiếp theo
trong chu trình.

đến 58ºC và từ 59ºC đến 64ºC, sau đó sản phẩm
PCR sẽ được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của phản ứng tối
ưu nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi ABCD1F và
ABCD1R với dải gradient nhiệt độ từ 51ºC đến
64ºC được thể hiện ở hình 1.

Bảng 2. Kết quả nồng độ ADN sau khi khuếch đại toàn
bộ hệ gen các mẫu tế bào phơi sinh thiết.
Nồng độ
STT
(ng/µl)

Mã
mẫu

Nồng độ
(ng/µl)

STT

Mã

mẫu

1

TR1

23,5

5

TR5

18,5

2

TR2

21,0

6

TR6

20,3

3

TR3

21,6

7

TR7

21,2

4

TR4

19,7

8

TR8

19,4

Kết quả phản ứng PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi
Quá trình tối ưu phản ứng PCR sử dụng
mẫu ADN của người mang gen gây bệnh (NTTABCD1) làm khuôn để khuếch đại đoạn gen
ABCD1. Dựa vào nhiệt độ nóng chảy của mồi
xuôi và mồi ngược tương ứng là 56,6ºC và 59ºC,
chúng tôi tiến hành hai phản ứng PCR độc lập với
dải gradient nhiệt độ gắn mồi lần lượt từ 51ºC

Hình 1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của phản
ứng tối ưu với gradient nhiệt độ gắn mồi từ 51ºC đến

64ºC. M: Thang chuẩn marker (100 bp).
Phân tích kết quả điện di sản phẩm phản ứng
PCR đơn cặp mồi trên gel agarose 2% (hình 1) cho
thấy chỉ có băng sản phẩm với kích thước như tính
tốn xuất hiện tại nhiệt độ gắn mồi từ 59 đến 61ºC
– kích thước khoảng 199 bp. Kết quả điện di thu
được tại nhiệt độ gắn mồi 59ºC cho băng sáng rõ
nhất, khơng có sản phẩm phụ và chính vì vậy, nhiệt
độ 59ºC được lựa chọn làm nhiệt độ gắn mồi để
tiến hành phản ứng PCR cho các bước tiếp theo.
Kết quả phản ứng PCR và giải trình tự kiểm tra
lại đột biến trên mẫu ADN của mẹ
Dựa vào nhiệt độ gắn mồi đã được xác định,
tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên đối tượng
là ADN của người mẹ mang alen đột biến (NTTABCD1) với chu trình nhiệt như sau: 95ºC trong
TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210

21


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

5 phút, 40 chu kỳ với 94ºC – 30s, 59ºC – 30s, 72ºC
– 30s, 72ºC trong 5 phút. Sản phẩm PCR được
điện di trên gel agarose 2% trong 25 phút với cường
độ dòng điện trong khoảng 125V và nhuộm với
Ethidium bromide. Kết quả điện di sản phẩm PCR
của phản ứng này được thể hiện ở hình 2 cùng với
kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger.

quả trình tự đoạn mang đột biến giống hệt với kết
quả giải trình tự bằng phương pháp NGS – nghĩa
là đều có thể phát hiện đột biến c.854G>C. Từ
đây chúng tơi kết luận đã xây dựng được quy trình
phát hiện đột biến trên gen ABCD1 liên quan đến
bệnh loạn dưỡng não chất trắng và sẽ ứng dụng
quy trình này lên tám mẫu tế bào phơi sinh thiết
đã có sẵn.
Kết quả ứng dụng quy trình trên tế bào phơi sinh
thiết
Phản ứng PCR với thành phần và chu trình
nhiệt đã được sử dụng ở bước trước sẽ được áp
dụng cho ADN của 8 mẫu tế bào phôi đã khuếch
đại. Sản phẩm phản ứng PCR được điện di trên gel
agarose 2% và quan sát dưới ánh đèn tia UV như
hình 3.

Hình 3. Kết quả điện di sản phẩm sau phản ứng PCR
với ADN của 8 mẫu tế bào phôi. M: Thang chuẩn
marker (100 bp); (+): ADN mẫu NTT-ABCD1;
TR1 – TR8: sản phẩm ADN sau khuếch đại
Hình 2. Hình ảnh ứng dụng quy trình phát hiện đột
biến lên mẫu ADN NTT-ABCD1. (A): Hình ảnh điện
di sản phẩm phản ứng PCR, M: Thang chuẩn marker
(100 bp); (B): Kết quả giải trình tự Sanger đoạn gen
được khuếch đại bằng cặp mồi ABCD1F và ABCD1R
của mẫu NTT-ABCD1
Qua hình ảnh điện di, sản phẩm ADN được
khuếch đại có kích thước đúng như dự kiến và
không xuất hiện băng sản phẩm phụ. Sau đó, sản

phẩm phản ứng PCR được tinh sạch và gửi đi giải
rình tự Sanger với cặp mồi thiết kế, và cho ra kết

22

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021

Kết quả điện di sản phẩm ADN của 8 mẫu tế bào
phôi sinh thiết nhằm nhân bản đoạn gen ABCD1
cho thấy phản ứng PCR đã khuếch đại thành công
đoạn gen mong muốn. Băng sản phẩm hiện lên sáng
và rõ ràng tại vị trí tương ứng với kích thước thang
chuẩn là khoảng 200 bp, chứng tỏ đoạn nhân lên
có kích thước là 199 bp phù hợp như tính toán ban
đầu. Từ đây, sản phẩm PCR sẽ được tinh sạch và giải
trình tự Sanger nhằm khảo sát đột biến c.854G>C
ở những mẫu phơi sinh thiết. Kết quả giải trình tự
được đọc bằng phần mềm BioEdit và được thể hiện
ở bảng 1.


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

Bảng 1. Tổng hợp kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger cho ADN của 8 mẫu tế bào phơi TR1 – TR8.
STT

1

2

3

Mã
mẫu

Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger

Kết quả
chẩn đốn

TR1

Bình thường,
khơng mang gen
gây bệnh

TR2

Bình thường,
mang gen gây
bệnh

TR3

Bình thường,
mang gen gây
bệnh

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210

23


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

TR4

Bình thường,
mang gen gây
bệnh

5

TR5

Bình thường,
khơng mang gen
gây bệnh

6

TR6

Bị bệnh

4

24

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021

NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

7

8

TR7

Bình thường,
khơng mang gen
gây bệnh

TR8

Bình thường,
mang gen gây
bệnh

Kết quả giải trình tự theo phương pháp Sanger
cho thấy, trong tổng số 8 phôi sinh thiết sử dụng
trong nghiên cứu, có 3 phơi (37,5%) khơng mang
alen đột biến gây bệnh, 4 phôi (50%) mang alen
đột biến gây bệnh ở thể dị hợp và 1 phôi (12,5%)
mang alen gây bệnh ở thể bán dị hợp tử. Điều
này đã chứng tỏ, những phơi mang alen gây bệnh
trong q trình giảm phân hình thành giao tử đã
nhận được alen đột biến từ mẹ. Những phôi này
sẽ được đánh giá là không phù hợp để sử dụng

cho q trình chuyển phơi và những phôi không

mang alen đột biến sẽ tiếp tục được làm các xét
nghiệm sàng lọc tiền làm tổ (PGS - Preimplantation Genetic Screening) để đánh giá chất lượng
phôi trước khi tiến hành thụ tinh nhân tạo. Đối
với mẫu ADN của các phơi TR1, TR5 và TR7
đều có kết quả bình thường và khơng có alen gây
bệnh sẽ được thực hiện giải trình tự theo phương
pháp giải trình tự thế hệ mới để sàng lọc các bất
thường về nhiễm sắc thể. Kết quả sàng lọc PGS
cho 3 phôi không mắc bệnh loạn dưỡng não chất
trắng được thể hiện ở hình 4.
TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210

25


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

đó ở phơi TR5 khơng phát hiện bất cứ bất thường
nào trên bộ 24 nhiễm sắc thể. Vì vậy, chúng tơi đưa
ra kết luận phơi TR5 có chất lượng tốt, phù hợp để
tiến hành chuyển phôi vào cơ thể người mẹ trong
quá trình thụ tinh nhân tạo.

Hình 4. Kết quả giải trình tự thế hệ mới của quá trình
sàng lọc tiền làm tổ bộ nhiễm sắc thể của 3 mẫu tế bào
phôi. (A): Kết quả của mẫu TR1; (B): Kết quả của
mẫu TR5; (C): Kết quả của mẫu TR7
Với kết quả giải trình tự như trên, bằng việc sử

dụng các công cụ tin sinh cũng như thống kê sinh
học, có thể nhận thấy rằng cả hai phơi TR1 và TR7
đều có bất thường về bộ nhiễm sắc thể, cụ thể hơn
phơi TR1 có bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể
số 11, cịn phơi TR7 có bất thường về số lượng ở
những nhiễm sắc thể 2, 4, 6, 8, 11, 11, 18, trong khi

KẾT LUẬN
Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen
ABCD1 liên quan đến bệnh loạn dưỡng não chất
trắng và đồng thời ứng dụng được quy trình phát
hiện đột biến gen nhằm chọn được phôi thụ tinh
nhân tạo không mang alen gây bệnh.
Tuy nhiên cần mở rộng thí nghiệm nhằm ứng
dụng quy trình cho các thành viên khác trong đại
gia đình giúp chẩn đốn bệnh cho các phôi của
các cặp vợ chồng khác bởi đột biến này có thể di
truyền cho nhiều thành viên từ đó ln tồn tại khả
năng sinh con mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng
mang đột biến c.854G>C. Cần nghiên cứu mở
rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình cho các
đột biến khác trên gen ABCD1 và có thể nghiên
cứu mở rộng thí nghiệm nhằm ứng dụng quy trình
cho các đột biến liên quan đến các bệnh hiếm di
truyền đơn gen khác.

ABSTRACT
Establishment of the procedure to detect ABCD1 gene mutations related to X-linked
Adrenoleukodystrophy
Adrenoleukodystrophy (X-ALD) is a rare sex-linked recessive disorder that disrupts adrenal gland

function, the spinal nerves, and the white matter of the nervous system. According to recent epidemiological
statistics, this disease affects 1 in 15,000 people, however, the actual incidence rate is estimated to be much
higher with the combined application of modern genetic techniques used for early diagnosis. The earlier the
diagnose of the disease, the safer and the more active for families with a history of X-ALD to develop plans
for childbirths and treatments of disease's symptoms. Therefore, in this study, we developed an early preimplantation diagnosis process to help families with the background of having the disease but wish to have
healthy children. By combining the use of sequencing methods, especially Next-Generation Sequencing
(NGS) and Sanger sequencing with other molecular techniques such as PCR, we were able to develop a
procedure to detect mutations on the ABCD1 gene which is involved in the disease. We then applied this

26

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/2021


NGHIÊN CỨU LÂM SÀNG

procedure to the family's biopsied embryonic cells with the disease in order to screen for embryos that do
not carry alleles that cause X-ALD. The results of the study showed that we were able to detect mutant alleles
in 5/8 embryos (62.5%) while the remaining 3 embryos (37.5%) did not carry mutant alleles; therefore,
these 3 embryos could further be used in pre-implantation screening tests during in-vitro fertilization.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Ashrafi M. R., M. Amanat, M. Garshasbi, R. Kameli, Y. Nilipour, M. Heidari, Z. Rezaei and A.
R. Tavasoli (2020), “An update on clinical, pathological, diagnostic, and therapeutic perspectives of
childhood leukodystrophies”, Expert Review of Neurotherapeutics, 20(1), pp. 65-84.
2. Engelen M., S. Kemp, M. De Visser, B. M. van Geel, R. J. Wanders and P. Aubourg (2012), “X-linked
adrenoleukodystrophy (X-ALD): clinical presentation and guidelines for diagnosis, follow-up and
management”, Orphanet journal of rare diseases, 7(1), pp. 51.
3. Kemp S. (2014), Molecular Genetics of X-linked Adrenoleukodystrophy, eLS, pp.
4.KempS.,I.C.Huffnagel,G.E.Linthorst,R.J.WandersandM.Engelen(2016),“Adrenoleukodystrophy–

neuroendocrine pathogenesis and redefinition of natural history”, Nature Reviews Endocrinology, 12(10),
pp. 606-615.
5. Lan F., Z. Wang, L. Ke, H. Xie, L. Huang, H. Huang, X. Tu, D. Zheng, J. Zeng and H. Li (2010), “A
rapid and sensitive protocol for prenatal molecular diagnosis of X-linked adrenoleukodystrophy”, Clinica
Chimica Acta, 411(23-24), pp. 1992-1997.
6. Maier E. M., A. A. Roscher, S. Kammerer, K. Mehnert, E. Conzelmann and A. Holzinger (1999),
“Prenatal diagnosis of X‐linked adrenoleukodystrophy combining biochemical, immunocytochemical and
DNA analyses”, Prenatal Diagnosis: Published in Affiliation With the International Society for Prenatal Diagnosis
19(4), pp. 364-368.
7. Moser A. B., N. Kreiter, L. Bezman, S. E. Lu, G. V. Raymond, S. Naidu and H. W. Moser (1999),
“Plasma very long chain fatty acids in 3,000 peroxisome disease patients and 29,000 controls”, Annals of Neurology:
Official Journal of the American Neurological Association the Child Neurology Society, 45(1), pp. 100-110.
8. Mosser J., A.-M. Douart, C.-O. Sarde, P. Kioschisi, R. Feil, H. Moser, A.-M. Poustka, J.-L. Mandel
and P. Aubourgi (1993), “Adrenoleukodystrophy gene shares unexpected homology”, Nature, 361(pp. 25.
9. Turk B. R., C. Theda, A. Fatemi and A. B. Moser (2020), “X‐linked adrenoleukodystrophy: Pathology,
pathophysiology, diagnostic testing, newborn screening and therapies”, International Journal of Developmental
Neuroscience, 80(1), pp. 52-72.
10. Zhu J., F. Eichler, A. Biffi, C. N. Duncan, D. A. Williams and J. A. Majzoub (2020), “The Changing
Face of Adrenoleukodystrophy”, Endocrine Reviews, 41(4), pp. 1-17.

TẠP CHÍ NỘI KHOA VIỆT NAM | SỐ 21/20210

27