Nghiên cứu đặc điểm sinh học và hoạt chất của nấm cordyceps phân lập tại langbiang lâm đồng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ XUYẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
VÀ HOẠT CHẤT CỦA NẤM CORDYCEPS
PHÂN LẬP TẠI LANGBIANG – LÂM ĐỒNG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2018


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

VÕ THỊ XUYẾN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC
VÀ HOẠT CHẤT CỦA NẤM CORDYCEPS
PHÂN LẬP TẠI LANGBIANG - LÂM ĐỒNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số chuyên ngành: 62 42 40 01

Phản biện 1: PGS.TS. Trần Hoàng Dũng
Phản biện 2: TS. Võ Đình Quang
Phản biện 3: TS. Nguyễn Thị Liên Thương
Phản biện độc lập 1: PGS.TS. Trần Hoàng Dũng
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Thị Liên Thương

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
1. PGS. TSKH NGƠ KẾ SƯƠNG
2. TS. TRƯƠNG BÌNH NGUYÊN

TP. Hồ Chí Minh – Năm 2018


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên em xin bày tỏ sự kính trọng và lịng biết ơn sâu sắc nhất đến
PGS.TSKH. NGƠ KẾ SƯƠNG và TS. TRƯƠNG BÌNH NGUYÊN, những
người Thầy đã tận tình hướng dẫn và là chỗ dựa vững chắc về mặt kiến thức lẫn
tinh thần, luôn tạo điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận án của mình.
Tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS. Đinh Minh Hiệp đã truyền đạt những
kiến thức quí báu, đã tận tình giúp đỡ và động viên tơi rất nhiều trong suốt thời gian
thực hiện luận án.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến PGS. TS Phan Thị Phượng
Trang về sự giúp đỡ nhiệt tình, ln tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong
suốt thời gian qua.
Tôi xin gửi lời cám ơn đến PGS.TS. Lê Huyền Ái Thúy đã hỗ trợ và động
viên tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cám ơn đến NCS. Nguyễn
Như Nhứt, NCS. Vương Lợi, NCS. Trần Minh Trang, NCS. Lao Đức Thuận,
NCS. Huỳnh Thư, NCS. Nguyễn Thị Mỹ Nương, Ths. Đỗ Thị Thiên Lý và
Ths.Vũ Thị Ngân đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong những tháng ngày qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các Thầy Cô, anh chị đang công tác tại Viện Sinh
Học Tây Nguyên – Đà Lạt; Công Ty TNHH Nguyên Long – Đà Lạt; PTN Sinh hóa,
PTN Di truyền – Sinh học phân tử – Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi và hết lòng giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Bộ Môn Vi Sinh - Trường Đại
Học Khoa Học Tự Nhiên đã cung cấp cho tơi những kiến thức q báu trong suốt

những năm học qua.
Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến Ban Giám Hiệu, Quý Thầy Cô Trường Đại
Học Văn Lang, đặc biệt PGS. TS. Lê Thị Kim Oanh, PGS.TS. Ngơ Thị Xun đã
hết lịng tạo điều kiện thuận lợi cho tơi trong suốt q trình học tập và nghiên cứu.
Cuối cùng, tơi xin gửi lịng biết ơn vơ hạn đến những người thân yêu trong gia
đình, bạn bè đã động viên và chia sẻ cùng tôi trong những lúc khó khăn nhất.

i


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu này là của riêng tơi. Các số liệu, kết
quả trình bày trong Luận án này là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong
bất kỳ cơng trình nào khác.

Người viết cam đoan

Võ Thị Xuyến

ii


MỤC LỤC
Trang
Mục lục ….. ...................................................................................................... iii
Danh mục các chữ viết tắt ................................................................................ vii
Danh mục các bảng .......................................................................................... ix
Danh mục các hình............................................................................................ x
MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 4

1.1. Về nấm Cordyceps ................................................................................... 4
1.1.1. Vị trí và phân loại .............................................................................. 4
1.1.2. Sự phân bố ......................................................................................... 7
1.1.3. Một số đặc điểm sinh học .................................................................. 9
1.1.3.1. Đặc điểm quả thể ...................................................................... 9
1.1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc và sợi nấm ................................................ 10
1.1.3.3. Ký chủ và quá trình xâm nhiễm của nấm .................................. 11
1.1.3.4. Vòng đời của nấm Cordyceps ................................................... 12
1.1.3.5. Di truyền của nấm Cordyceps ................................................... 13
1.2. Nuôi cấy thu sinh khối Cordyceps ........................................................... 14
1.2.1. Thu sinh khối Cordyceps nuôi cấy trong môi trường lỏng .................. 14
1.2.1.1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường ..................................... 15
1.2.1.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy ...................................... 17
1.2.2. Nuôi cấy thu nhận quả thể nấm Cordyceps ........................................ 24
1.3. Hoạt tính sinh học của nấm Cordyceps .................................................... 25
1.3.1. Hoạt tính kháng oxy hóa. .................................................................... 25
1.3.2. Hoạt tính gây độc tế bào ..................................................................... 26
1.3.3. Hoạt tính điều hịa miễn dịch .............................................................. 27
1.3.4. Hoạt tính kháng khuẩn ........................................................................ 28
1.3.5. Hoạt tính kháng viêm ........................................................................ 29
1.3.6. Hoạt tính bảo vệ thận ......................................................................... 29
1.3.7. Hoạt tính bảo vệ gan và phổi ............................................................. 30
1.3.8. Hoạt tính bảo vệ hoạt động tim mạch ................................................. 31

iii


1.4. Các nhóm hợp chất có hoạt tính sinh học ở Cordyceps........................... 34
1.4.1. Nucleosid ........................................................................................... 34
1.4.2. Polysaccharid . ................................................................................... 36

1.4.3. Protein và peptid. ................................................................................ 38
1.4.4. Ergosterol và mannitol ........................................................................ 39
1.4.5. Các thành phần khác .......................................................................... 40
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................ 42
2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 42
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................ 42
2.1.2. Các dòng tế bào dùng trong thử nghiệm ............................................. 42
2.1.3. Các chủng vi khuẩn dùng trong thử nghiệm . ...................................... 42
2.1.4. Hóa chất và thiết bị ............................................................................ 43
2.1.4.1. Hóa chất ............................................................................... 43
2.1.4.2. Thiết bị và dụng cụ .................................................................. 44
2.1.5. Môi trường nuôi cấy ........................................................................... 44
2.1.6. Nơi thực hiện nghiên cứu.................................................................... 44
2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................... 45
2.2.1. Thu và bảo quản mẫu. ......................................................................... 45
2.2.2. Phân lập và làm thuần các chủng nấm................................................. 45
2.2.3. Định danh dòng nấm thuần. ................................................................ 46
2.2.3.1. Phân tích đặc điểm hình thái thể hữu tính ................................. 46
2.2.3.2. Phân tích đặc điểm hình thái thể vơ tính ................................... 46
2.2.4. Phương pháp ni cấy và thu sinh khối............................................... 46
2.2.4.1. Chuẩn bị giống. ......................................................................... 46
2.2.4.2. Nuôi cấy thu sinh khối sợi nấm. ................................................ 47
2.2.5. Tuyển chọn chủng có tiềm năng về hoạt tính sinh học ....................... 47
2.2.5.1. Tìm thời gian ni cấy thích hợp .............................................. 47
2.2.5.2. Chọn chủng có tiềm năng .......................................................... 47
2.2.6. Xác định mơi trường và điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng
được chọn .......................................................................................... 48
2.2.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ. ......................... 48
2.2.6.2. Tối ưu hóa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy bằng

iv


phần mềm BCPharSoft ............................................................. 48
2.2.7. Chiết xuất phân đoạn ......................................................................... 51
2.2.7.1. Phát hiện thành phần hóa học .................................................... 51
2.2.7.2. Thu nhận cao chiết phân đoạn ................................................... 54
2.2.8. Định lượng một số hợp chất sinh học.................................................. 55
2.2.8.1. Định lượng polysaccharid.......................................................... 55
2.2.8.2. Định lượng adenosin và cordycepin........................................... 55
2.2.9. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết ........................................... 56
2.2.9.1. Hoạt tính kháng oxy hóa ........................................................... 56
2.2.9.2. Khả năng gây độc tế bào ........................................................... 59
2.2.9.3. Khả năng kích thích tăng sinh PBMC ........................................ 60
2.2.9.4. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ................................................. 62
2.2.10. Xử lý số liệu ..................................................................................... 62
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN...................................................... 63
3.1. Phân lập, làm thuần và định danh các mẫu nấm thu được .................... 63
3.1.1. Phân lập và làm thuần. ....................................................................... 63
3.1.2. Đặc điểm hình thái, giải phẫu và định danh các mẫu nấm ................... 66
3.1.2.1. Đặc điểm hình thái và giải phẫu ............................................... 66
3.1.2.2. Định danh các mẫu nấm dựa vào đặc điểm hình thái giải phẫu

74

3.2. Tuyển chọn chủng có tiềm năng sử dụng ................................................ 76
3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối khô........................... 76
3.2.2. Định tính thành phần hóa học của sinh khối nấm thu được ................. 78
3.2.3. Thành phần và hàm lượng các hợp chất có HTSH trong sinh khối 8
chủng nấm ni cấy ........................................................................... 81

3.3. Tối ưu hóa mơi trường và điều kiện nuôi cấy chủng DL0015 ................ 84
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn cacbon và nitơ ................................... 84
3.3.1.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon .................................................. 85
3.3.1.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................... 87
3.3.2. Tối ưu hóa thành phần mơi trường ni cấy C. pseudomilitaris
DL0015 ............................................................................................. 89
3.3.2.1. Thiết kế mơ hình thực nghiệm .................................................. 89
3.3.2.2. Tối ưu hóa cơng thức................................................................. 91

v


3.3.2.3. Phân tích ảnh hưởng của các thơng số đầu vào đối với các
thông số đầu ra bằng biểu đồ 3D ............................................... 92
3.3.3. Tối ưu hóa điều kiện ni cấy ............................................................. 97
3.3.3.1. Thiết kế mơ hình thực nghiệm .................................................. 97
3.3.3.2. Tối ưu hóa cơng thức................................................................. 99
3.3.3.3. Phân tích ảnh hưởng của các thông số đầu vào đối với các
thông số đầu ra bằng biểu đồ 3D ............................................... 100
3.4. Khảo sát hoạt tính sinh học của cao chiết ............................................... 106
3.4.1. Trích ly và thu hồi cao chiết ............................................................... 106
3.4.2. Hoạt tính sinh học của cao chiết ........................................................ 107
3.4.2.1. Khả năng bắt gốc tự do DPPH và ABTS .................................. 108
3.4.2.2. Khả năng kháng oxy hóa nội bào .............................................. 110
3.4.2.3. Khả năng gây độc tế bào ........................................................... 113
3.4.2.4. Khảo sát khả năng kích thích tăng sinh PBMC .......................... 116
3.4.2.5. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn ................................................ 119
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 122
4.1. Kết luận ................................................................................................... 122
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 123

Đóng góp mới của luận án ............................................................................. 124
Danh mục cơng trình công bố ........................................................................ 125
Tài liệu tham khảo .......................................................................................... 136
Danh mục phụ lục

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Tiếng Anh

Tiếng Việt

AAPH

2’-azobis (2-amidinopropane)
dihydrochlorid
2,2 – azinobis – (3 –
ethylbenzothiazoline – 6 –
sulphonat)
tiểu phần ATP synthase ty thể

ABTS

ATP6
BU
C
DCF
DCFH
DCFH-DA

2’-azobis (2-amidinopropane)
dihydrochloride
2,2 – azinobis – (3 –
ethylbenzothiazoline – 6 –
sulphonate)
Mitochondrially Encoded ATP
Synthase 6
n – Butanol
Carbon
2’,7’-dichlorofluorescein
Dichlorodihyddrofluorescein
Dichloro-Dihydro- Fluorescein
Diacetate
Dimethylsulfoxide
Deoxyribonucleic acid
2,2 – diphenyl – 1 –
picrylhydrazyl
Exopolysaccharide
Ethylacetate
Ethanol
N-formyl-methionyl-leucyl
phenylalanine/cytochalasin B

n – Butanol
Cacbon
2’,7’-dichlorofluorescein
dichlorodihyddrofluorescein
2’,7’-dichloro-DihydroFluorescein Diacetate
Dimethylsulfoxid

axit Deoxyribonucleic
2,2 – diphenyl – 1 –
picrylhydrazyl
Đối chứng
Polysaccharid ngoại bào
Etylacetat
Cồn etanol
N-formyl-methionyl-leucyl
phenylalanine/cytochalasin B

HepG2

Liver Hepatocellular Carcinoma

Tế bào ung thư gan

IC50
IgAN
IL

Inhibitory concentration 50%
Immunoglobulin a nephropathy Interleukin

Nồng độ ức chế 50%
Bệnh Berger
Interleukin

IPS

Intra-Polysacharide

Polysaccharid nội bào

ITS
LDL

Internal transcribed spacer
Low-density lipoprotein

Vùng đệm được sao mã
Lipoprotein tỷ trọng thấp

MeOH

Methanol

Metanol

DMSO
DNA
DPPH
ĐC
EPS
EtOAc
EtOH
FMLP/CB

vii

MT

Môi trường

MTT

3–(4,5–dimethylthiazol–2–yl)–2,5
–diphenyltetrazolium bromide

3–(4,5–dimethylthiazol–2–
yl)–2,5 –diphenyltetrazolium
bromid

N

Nitrogen

Nitơ

nrLSU

nuclear large subunit ribosomal
DNA
nuclear small subunit ribosomal
DNA
Optical Density
Peripheral blood mononuclear cell
Phosphate buffer saline
Petroleum ether
Potato glucose agar

Potato glucose

tiểu phần lớn ribosome nhân

nrSSU
OD
PBMC
PBS
PE
PGA
PG
PK
PS
PTN
RPB1
ROS
SKK
SOD
SDS
t-BHP
TEF1
TLTK
TN
TUB

tiểu phần nhỏ ribosome nhân

Elongation factor 1

Độ hấp thu

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi
Đệm PBS
Ete dầu hỏa
Thạch khoai tây glucose
Khoai tây glucose
Khoai tây, khống
Polysaccharid
Phịng thí nghiệm
tiểu phần lớn nhất RNA
polymerase II
Gốc oxy hóa
Sinh khối khơ
Superoxide dismutase
Natri dodecyl sulfate
t-butyl hydroperoxit
nhân tố kéo dài dịch mã 1α

 tubulin

Tài liệu tham khảo
Thí nghiệm
 tubulin

Polysaccharide
Largest subunit of RNA
polymerase II
Reactive oxygen species
Superoxide dismutase
sodium dodecyl sulfate
t-butyl hydroperoxide

viii


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy một số chủng
Cordyceps ....................................................................................... 21
Bảng 1.2. Hoạt tính sinh học của các cao chiết từ một số chủng Cordyceps ..... 32
Bảng 1.3. Hàm lượng (mg/g) các hợp chất hóa học chủ yếu ở Cordyceps ........ 34
Bảng 2.1. Các thành phần môi trường với các mức nghiên cứu ........................ 50
Bảng 2.2. Mức giới hạn các điều kiện ni cấy ................................................ 51
Bảng 2.3. Định tính các nhóm hợp chất trong dịch chiết .................................. 53
Bảng 2.4. Chương trình chạy gradient phân tích adenosine và cordycepin
bằng LC/MS/MS ............................................................................. 56
Bảng 3.1. Vị trí của các mẫu nấm thu được tại vùng núi Langbiang ................. 63
Bảng 3.2. Các mẫu nấm thuộc nhóm Cordyceps .............................................. 64
Bảng 3.3. Kết quả định danh các mẫu nấm thu được ........................................ 75
Bảng 3.4. Kết quả định tính thành phần hóa học của các mẫu sinh khối nấm ... 79
Bảng 3.5. Hàm lượng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong sinh khối 8
chủng nấm ni cấy ........................................................................ 81
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nguồn C lên sự tăng trưởng và tích lũy các hợp chất
có HTSH ở C. pseudomilitaris DL0015 nuôi cấy . ........................... 85
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nguồn N lên tăng trưởng và tích lũy các hợp chất có
HTSH ở C. pseudomilitaris DL0015 ni cấy ................................. 87
Bảng 3.8. Môi trường theo thiết kế và kết quả thực nghiệm ............................. 90
Bảng 3.9. Các thông số tối ưu dự đoán bởi phần mềm BCPharSoft .................. 91
Bảng 3.10. Các thơng số đầu ra theo dự đốn và kiểm chứng ........................... 92
Bảng 3.11. Kết quả phân tích dữ liệu từ phần mềm BCPharSoft ...................... 92
Bảng 3.12. Dữ liệu về điều kiện nuôi cấy theo thiết kế và kết quả thực nghiệm 98

Bảng 3.13. Các thông số tối ưu dự đốn bởi phần mềm BCPharSoft ................ 99
Bảng 3.14. Các thơng số đầu ra theo dự đoán và kiểm chứng ........................... 99
Bảng 3.15. Kết quả phân tích dữ liệu từ phần mềm BCPharSoft ...................... 100
Bảng 3.16. Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ C. pseudomilitaris
DL0015 nuôi cấy .......................................................................... 120

ix


DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Quả thể Cordyceps tự nhiên ............................................................. 10
Hình 1.2. Chu kỳ vịng đời của nấm Cordyceps militaris .................................. 13
Hình 1.3. Quả thể của C. militaris trên mơi trường gạo lứt sau 55 ngày ........... 24
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất cơ lập từ Cordyceps ............... 37
Hình 2.1. Sơ đồ thu nhận dịch chiết từ sinh khối nấm Cordyceps ........................ 52
Hình 2.2. Sơ đồ thu nhận cao chiết phân đoạn từ sinh khối nấm được chọn ...... 54
Hình 3.1. Hình thái giải phẫu mẫu DL0006 ..................................................... 66
Hình 3.2. Hình thái giải phẫu mẫu DL0038A .................................................. 68
Hình 3.3. Hình thái giải phẫu mẫu DL0038B.................................................... 69
Hình 3.4. Hình thái giải phẫu mẫu DL0067 ...................................................... 70
Hình 3.5. Hình thái giải phẫu mẫu DL0069 ...................................................... 71
Hình 3.6. Hình thái giãi phẫu mẫu DL0075 .. ................................................... 73
Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối khơ của 8 chủng
nấm . ............................................................................................... 77
Hình 3.8. Biểu đồ 3D biểu diễn ảnh hưởng của saccharose, pepton lên sự tích
lũy SKK, adenosin và polysaccharid ............................................... 93
Hình 3.9. Biểu đồ 3D biểu diễn ảnh hưởng của pH, nhiệt độ lên sự tích lũy
SKK, adenosin và polysaccharid ..................................................... 101
Hình 3.10. Hàm lượng cao chiết thu được từ sinh khối C. pseudomilitaris

DL0015 ni cấy ............................................................................. 107
Hình 3.11. Hoạt tính bắt gốc tự do DPPH và ABTS của các cao chiết từ C.
pseudomilitaris DL0015 ni cấy ................................................... 108
Hình 3.12. Khả năng làm giảm gốc oxy hóa tự do trong tế bào Hep G2 của các
cao chiết từ C. pseudomilitaris DL0015 nuôi cấy ............................ 111
Hình 3.13. Mức độ kháng của cao chiết ở nồng độ 100µg/ml đối với các dịng
tế bào ung thư .................................................................................. 114
Hình 3.14. Tỷ lệ (%) tăng sinh tế bào PBMC ở các nồng độ cao chiết ............. 117

x


MỞ ĐẦU
Cordyceps là nấm ký sinh trên côn trùng, được sử dụng trong y học cổ truyền
Trung Quốc từ rất lâu. Có nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học (HTSH) được tìm
thấy từ Cordyceps như adenosin, cordycepin, polysaccharid, các sterol, các protein,
peptid, axit amin, vitamin, nhiều nguyên tố đa lượng và vi lượng. Trong đó
adenosin được sử dụng như là “marker” chất lượng của C. sinensis và polysaccharid
là yếu tố quan trọng đối với việc phát triển các sản phẩm từ Cordyceps. Cũng đã tìm
thấy cyclosporin, một hợp chất có khả năng chống đào thải được sử dụng trong cấy
ghép cơ quan ở người từ Tolypocladium inflatum (dạng vô tính của Cordyceps
subsessilis) và ở Tolypocladium sp. (với hàm lượng 25µg/g).
Trong số các lồi nấm ký sinh trên cơn trùng thì Ophiocordyceps sinensis
(Cordyceps sinensis - Đơng trùng hạ thảo) và Cordyceps militaris (Nhộng trùng
thảo) được sử dụng như là nguồn dược liệu quý do chứa nhiều chất có HTSH có
lợi cho sức khỏe con người. Ngày càng có nhiều lồi Cordyceps khác cũng được
sử dụng trong y dược như C. sobolifera, C. subssesilus, C. ophioglossoides và C.
takaomontana. Tuy nhiên việc sử dụng Cordyceps nói chung cịn gặp nhiều hạn
chế nếu chỉ thu hái từ tự nhiên. Chính vì vậy, Cordyceps đang rất được quan tâm
nghiên cứu nuôi trồng in vitro, đặc biệt là ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản.

Hiện nay trên thị trường trong và ngoài nước đã xuất hiện khá nhiều dược phẩm
và thực phẩm chức năng có nguồn gốc từ Cordyceps. Giá thành các sản phẩm
thương mại khá đắt trong khi nhu cầu sử dụng ngày càng tăng. Hơn nữa việc phát
triển công nghệ nuôi cấy in vitro cũng khơng đơn giản. Nó phụ thuộc vào nhiều
yếu tố như: chủng giống, điều kiện nuôi cấy phù hợp để tăng cường tích lũy các
hợp chất có hoạt tính sinh học; ni cấy nấm tạo quả thể khơng phải ln thành
cơng ở các lồi Cordyceps. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chủng nấm Cordyceps
mới cũng như tối ưu hóa các điều kiện kỹ thuật trong ni cấy để thu sinh khối sợi
nấm giàu hoạt chất đang nhận được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học.

1


Ở Việt Nam, với khí hậu nhiệt đới gió mùa, lượng mưa hàng năm từ 1.500 –
2.000mm, độ ẩm trong khoảng 80% cũng là điều kiện thích hợp cho nấm Cordyceps
tồn tại và phát triển. Đã phát hiện được Cordyceps ở một số khu vực khác nhau như
Vườn Quốc gia (VQG) Cát Tiên, VQG Ba Vì, VQG Tam Đảo, VQG Pù Mát - Nghệ
An, VQG Hoàng Liên – Lào Cai và một số khu vực khác. Vùng núi Langbiang Lâm Đồng là nơi có điều kiện tự nhiên cũng rất thuận lợi cho sự phát triển các loài
nấm ký sinh cơn trùng nói chung, đặc biệt là nấm Cordyceps. Hiện đã có một số báo
cáo về phát hiện các lồi Cordyceps tại vùng núi này như C. pseudomilitaris HywelJones & Sivichai, Ophiocordyceps langbianensis và C. neovolkiana. Ngồi ra, một
số cơng bố cho thấy cao chiết từ sinh khối sợi nấm của các chủng Cordyceps thu
được tại vùng núi Langbiang có hoạt tính kháng oxy hóa, kháng cholinesterase, hoạt
tính kháng khuẩn và có tác dụng cải thiện suy giảm trí nhớ ở chuột. Qua đó có thể
thấy vùng núi Langbiang – Lâm Đồng là nơi có nhiều khả năng để phát hiện thêm
các chủng nấm ký sinh côn trùng, đặc biệt là Cordyceps có tiềm năng ứng dụng
trong y dược.
Từ những vấn đề nêu trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và hoạt
chất của nấm Cordyceps phân lập tại Langbiang – Lâm Đồng” được đề xuất
thực hiện.
Mục tiêu nghiên cứu:

Phân lập, định danh và nuôi cấy in vitro được một số chủng Cordyceps thu
thập tại vùng núi Langbiang - Lâm Đồng; khảo sát và đánh giá HTSH của cao chiết
từ sinh khối nấm ni cấy in vitro có tiềm năng ứng dụng trong y học và đời sống.
Nội dung nghiên cứu:
Để đạt được mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu sau đây đã được thực hiện:
- Phân lập, làm thuần và định danh một số mẫu nấm Cordyceps thu được từ
vùng núi Langbiang - Lâm Đồng.
- Tuyển chọn chủng Cordyceps có tiềm năng tăng trưởng, tích lũy adenosin
và polysaccharid trong điều kiện nuôi cấy lỏng in vitro, trong số các chủng phân lập
được và một số chủng khác cũng được phân lập từ vùng núi Langbiang.

2


- Xác định nguồn cacbon và nitơ phù hợp cho nuôi cấy thu sinh khối sợi
nấm và các hợp chất có hoạt tính sinh học chủ yếu.
- Tối ưu hóa thành phần mơi trường (nguồn cacbon, nitơ và khống đa lượng)
và điều kiện ni cấy thích hợp (pH, ánh sáng và nhiệt độ).
- Trích ly phân đoạn và thu cao chiết từ sinh khối sợi nấm nuôi cấy lỏng và
thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa, kháng tế bào ung thư, tăng sinh PBMC và
kháng khuẩn in vitro của cao chiết.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn:
Có được một số dòng Cordyceps thuần chủng thu thập từ vùng núi
Langbiang - Lâm Đồng với thông tin về thành phần môi trường và điều kiện ni
cấy thích hợp, về hoạt tính sinh học. Bộ sưu tập này sẽ là nguồn vật liệu sinh học
làm cơ sở cho việc nghiên cứu khai thác và ứng dụng tiếp theo.

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VỀ NẤM CORDYCEPS
1.1.1. Vị trí và phân loại
Cordyceps là một chi lớn trong các loại nấm ký sinh côn trùng [110]. Theo
Sung & cs, chi này có hơn 400 lồi đã được mơ tả, tuy nhiên, số lượng này có thể
chưa phản ánh đúng với sự đa dạng hiện hữu trên phạm vi toàn cầu [163]. Theo hệ
thống phân loại cổ điển thì chi nấm Cordyceps thuộc:
Giới (regnum)

Fungi

Phân giới (subregnum)

Dikarya

Ngành (phylum)

Ascomycota

Phân ngành (subphylum)

Pezizomycotina

Lớp (class)

Sordariomycetes

Phân lớp (subclass)

Hypocreomycetidae

Bộ (ordo)

Hypocreales

Họ (familia)

Clavicipitaceae

Chi (genus)

Cordyceps

Việc xây dựng hệ thống học của nhóm nấm này trước đây chủ yếu dựa vào
các phân tích giải phẫu hình thái. Các chỉ tiêu được dùng trong phương pháp này là
mô tả cấu trúc và hình dạng thể sinh sản như kích thước bào tử túi; hình dạng, màu
sắc, kích thước quả thể túi… Được xếp vào họ Clavicipitaceae do Cordyceps có túi
bào tử hình trụ, đỉnh túi dày và bào tử túi dạng sợi thường tách rời thành nhiều bào
tử thứ cấp [163].
Năm 1982, Kobayasi đã xây dựng được một khóa định loại cho nhóm nấm
Cordyceps và Torrubiella dựa trên bộ mẫu gồm: 282 loài Cordyceps, 59 loài
Torrubiella và 75 loài thuộc các chi khác. Đây được xem là khóa định loại hình
thái hồn chỉnh nhất cho nhóm nấm này. Theo khóa định loại này, chi nấm
Cordyceps có 3 dưới chi gồm: Eucordyceps, Ophiocordyceps và Neocordyceps

4


dựa vào các đặc điểm về sự sắp xếp thể chén, hình thái túi, bào tử túi và bào tử
thứ cấp. Các lồi dưới chi Eucordyceps có thể chén được mơ tả là ẩn hoặc nhơ,

hơi hướng về phía phải bề mặt thể nền, bào tử túi hình trụ có vách ngăn, tách rời
thành bào tử thứ cấp khi trưởng thành. Cịn ở các lồi dưới chi Ophiocordyceps
thể chén ẩn hoặc nhô lên bề mặt vùng sinh sản, bào tử túi dính với nhau, khơng
tách rời thành bào tử thứ cấp. Đặc điểm hình thái của các lồi dưới chi
Neocordyceps là thể chén luôn ẩn sâu trong thể nền và các bào tử túi hình thoi, có
vách ngăn, tách rời thành các bào tử thứ cấp khi trưởng thành. Các dưới chi trên
lại được phân chia thành các section và subsection. Từ các section, khóa định loại
tới lồi lại dựa vào đặc điểm của nắp túi, ký chủ, màu sắc quả thể, kích thước thể
chén, kích thước túi, kích thước bào tử túi... [92] (xem phụ lục 1).
Các loài nấm thuộc nhóm Cordyceps có đặc điểm lưỡng danh, tức là chúng
có thể tồn tại ở thể hữu tính (teleomorph) và thể vơ tính (anamorph) trong khi đa
số các nấm ký sinh cơn trùng chỉ tồn tại ở dạng vơ tính. Thể vơ tính cịn được gọi
là giai đoạn đơn bội. Trong tự nhiên, Cordyceps cũng thường tồn tại ở thể vơ tính
như các nấm sợi khác. Thể hữu tính chỉ được hình thành trong những điều kiện
thời tiết nhất định, trong đó, độ ẩm và nhiệt độ là những yếu tố quan trọng. Chính
vì đặc điểm lưỡng danh này, trước đây, thể vơ tính và hữu tính được xem như hai
loài khác nhau.
Cho đến nay, việc định danh nấm Cordyceps cũng chủ yếu dựa vào các
đặc điểm hình thái giải phẫu. Tuy nhiên, việc định danh dựa trên các đặc điểm
hình thái cũng gặp một số khó khăn nhất định. Trong đó, quan trọng nhất là xác
định các đặc điểm của quả thể. Đôi khi quả thể của các mẫu nấm thu được từ tự
nhiên đang ở giai đoạn còn non, trong khi các đặc điểm của quả thể trưởng
thành lại rất cần cho công tác định danh. Thêm vào đó, nhiều mẫu nấm thu được
trong tự nhiên đang ở giai đoạn thể vơ tính (khơng có sự hiện diện của quả thể túi)
và cũng khơng tiếp tục hình thành quả thể trong các điều kiện nhân tạo (có lẽ là vì
các điều kiện nhân tạo chưa thực sự phù hợp). Ngồi ra, các thay đổi kiểu hình theo
điều kiện ni cấy cũng góp phần khó khăn thêm cho việc định danh Cordyceps

5

dựa trên giải phẫu hình thái [16].
Từ những năm 1995 trở lại đây, sinh học phân tử đã góp phần tích cực trong
việc giải quyết một cách hữu hiệu những tồn tại về mối liên hệ giữa thể vơ tính và
thể hữu tính, hệ thống chủng loại phát sinh của nhóm nấm này. Đặc biệt là việc ứng
dụng kỹ thuật sinh học phân tử và cơ sở dữ liệu được công bố trên GenBank trong
phân loại nấm [16]. Bằng các kỹ thuật sinh học phân tử phân tích các trình tự 5.8S
và ITS của rDNA [110] hay trình tự từ 5 - 7 gen thuộc nhóm gen thường trực house-keeping genes bao gồm: nrSSU (tiểu phần nhỏ của ribosome nhân), nrLSU
(tiểu phần lớn của ribosome nhân), TEF1 (nhân tố kéo dài dịch mã 1α), RPB1 (tiểu
phần lớn nhất RNA polymerase II), TUB (β-tubulin) và ATP6 (tiểu phần ATP
synthase ty thể) [163], mối liên hệ giữa thể vơ tính và thể hữu tính dần được làm
sáng tỏ.
Khi dựa vào trình tự từ 5 - 7 gen thuộc nhóm gen thường trực, các nhà nấm
học Mỹ, Thái Lan và Hàn Quốc đã sắp xếp lại hệ thống của nhóm nấm Cordyceps
[163]. Theo kết quả nghiên cứu của Sung & cs [163] thì tồn bộ các lồi thuộc
nhóm Cordyceps được phân chia lại thành 3 họ: i) họ Clavicipitaceae với 4 chi
Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella; ii) họ Cordycipitaceae với
chi Cordyceps và iii) họ Ophiocordycipitaceae với 2 chi Ophiocordyceps và
Elaphocordyceps. Họ Clavicipitaceae gồm các lồi có thể hữu tính thuộc các chi
Metacordyceps, Hypocrella, Regiocrella và Torrubiella và các lồi có thể vơ tính
có thể thuộc về các chi Aschersonia, Metarhizium, Nomuraea, Paecilomyces,
Pochonia, Rotiferophthora và Verticillium. Họ Cordycipitaceae gồm các lồi có
thể hữu tính thuộc chi Cordyceps và các lồi có thể vơ tính có thể là các chi
Beauveria, Engyodontium, Isaria, Lecanicillium, Mariannaeae, Microhilum và
Simplicillium. Họ Ophiocordycipitaceae gồm các lồi có thể hữu tính thuộc chi
Ophiocordyceps và Elaphocordyceps và các lồi có thể vơ tính có thể là chi
Hirsutella, Haptocillium, Harposporium, Hymenostilbe, Paecilomyces, Paraisaria,
Sorosporella, Syngliocladium, Tolypocladium và Verticillium [163].
Gần đây, ở Việt Nam, Vũ Tiến Luyện & cs [13] và Lao Đức Thuận [29] đã

6


ứng dụng các kỹ thuật phân tích đơn gen và đa gen trong định danh Cordyceps. Kết
quả cho thấy phân tích đơn gen khơng hỗ trợ tốt cho việc định danh so với các
phân tích đa gen. Phân tích kết hợp bốn gen (nrSSU, nrLSU, TEF1 và RPB1) có đủ
khả năng phân tích các mẫu nấm tương đương với tổ hợp sáu gen (nrSSU, nrLSU,
TEF1, RPB1, TUB và ATP6) đã hỗ trợ định danh thành cơng đến lồi và một mẫu
đến chi theo quan điểm loài phát sinh chủng loại [29].
Tuy nhiên, phân tích bằng kỹ thuật sinh học phân tử để định danh
Cordyceps cũng gặp khơng ít khó khăn. Kết quả giải trình tự gen giúp định danh
được lồi ở thể hữu tính nhưng đơi khi lại khơng tương đồng với kết quả định danh
bằng phân tích hình thái giải phẫu [29], [174]. Thậm chí kết quả giải trình tự đa gen
trên cũng không thống nhất với kết quả giải trình tự đơn gen trong quá trình định
danh đến loài [29]. Ngoài ra, sự phức tạp trong bộ máy di truyền của Cordyceps
chẳng hạn như gần đây Chen & cs phát hiện ở Ophiocordyceps sinensis, tùy chủng,
có thể có đến hai trình tự nuclear ribosomal DNA (nrDNA) khác nhau đã góp phần
phức tạp cho việc định danh bằng kỹ thuật sinh học phân tử [49].
1.1.2. Sự phân bố
Trừ ở Nam Cực, nấm Cordyceps có mặt ở khắp nơi, đặc biệt là ở những vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới như ở Đông và Đông Nam Á, rất đa dạng về lồi [163].
Thơng thường Cordyceps được tìm thấy ở những vùng có khí hậu nóng, ẩm. Tuy
nhiên, trường hợp ngoại lệ là C. sinensis, lồi này phát triển trong mơi trường sinh
thái rất đặc biệt, thường tìm thấy trong đất ở vùng đồng cỏ có độ cao từ 3.500 đến
5.000m ở cao nguyên Tây Tạng và khu vực xung quanh [45], [101], [121]. Khác với
C. sinensis, C. militaris lại phân bố tương đối rộng rãi, có thể tìm thấy ở Bắc Mỹ,
Nam Mỹ, châu Âu và châu Á, từ cận nhiệt đới tới vùng có khí hậu ơn hịa [150],
[131], có thể ở độ cao từ 0 đến trên 2.000m so với mặt nước biển [154].
Đặc điểm phân bố của Cordyceps chịu ảnh hưởng chủ yếu bởi thảm thực vật,
đất, nhiệt độ và độ ẩm [45]. Quả thể hình thành chủ yếu trong mùa hè khi nhiệt độ

ấm áp và ẩm độ cao trong rừng cây lá rộng, thường được tìm thấy trong lớp lá rụng,
đất, gỗ mục và mặt dưới của lá… Khu vực và thời gian phân bố thay đổi tùy thuộc

7


lồi [161]. Ngồi ra, sự phân bố của Cordyceps cịn chịu ảnh hưởng bởi sự phân bố
của loài và số lượng vật chủ [76], [101], [161].
Có rất nhiều lồi thuộc nấm Cordyceps đã được mơ tả trên tồn thế giới,
trong đó khoảng 90 lồi phân bố tại Trung Quốc [103], hơn 80 loài tại Hàn Quốc
[123]. Nhiều loài cũng đã được phát hiện ở Thái Lan [114], [115], Nhật bản [142],
[161] và Nepal [153]. Ngoài ra, Cordyceps cũng được được phát hiện ở các quốc
gia khác như Mỹ, Canada, Úc, Phần Lan, Đài Loan…[161].
Từ điển nấm học (2008) tái bản lần thứ 10 đã ghi nhận chi Cordyceps có
khoảng 90 loài, chi Ophiocordyceps - 140 loài, chi Metacordyceps - 6 loài và chi
Elaphocordyceps - 21 loài mà trước đây tất cả đều xếp chung vào chi Cordyceps [91].
Ở nước ta, khu vực núi Langbiang – Lâm Đồng, nơi có khí hậu ơn hịa, nhiệt
độ khơng khí trung bình 18oC, nhiệt độ cao nhất có thể lên tới 30°C và thấp nhấtdưới 5°C; độ ẩm thay đổi theo mùa, trong khoảng từ 50 – 80%. Do tính đặc thù của
khí hậu, thời tiết và địa hình nên ở vùng núi Langbiang có khu hệ động, thực vật vơ
cùng phong phú và đa dạng, cũng đồng thời là vùng có điều kiện tự nhiên rất thuận
lợi cho sự phát triển các loài nấm ký sinh cơn trùng nói chung, trong đó có nấm
Cordyceps. Đã có một số lồi Cordyceps được phân lập tại vùng núi này đó là C.
neovolkiana [12], C. pseudomilitaris [5], [16], O. langbianensis [7], các loài thuộc
chi Isaria [14] và một số loài Cordyceps khác [16].
Năm 2010, tại VQG Cát Tiên, Lê Tấn Hưng & cs đã phát hiện một loài
thuộc chi Cordyceps và ba loài thuộc chi Ophiocordyceps [10]. Nhóm tác giả
Phạm Quang Thu & cs cũng đã mơ tả được một số lồi thuộc chi Cordyceps phân
bố tại nhiều khu vực khác nhau như C. gunnii (Berk.) Berk. tại VQG Tam Đảo Vĩnh Phúc [24], C. militaris (L.:Fr.) Link. tại VQG Hoàng Liên - Lào Cai [28]; C.
takaomontana tại VQG Ba Vì và VQG Tam Đảo [25], Isaria tenuipes (Peck.)
Samson tại các VQG Hồng Liên, Ba Vì, Tam Đảo, Khu bảo tồn thiên nhiên

Copia… [26]. Nhóm tác giả này cũng ghi nhận được ba loài thuộc chi Cordyceps là
C. takaomontana, C. crinalis và C. fomicarum tại VQG Pù Mát - Nghệ An [27].
Năm 2010, Phạm Thị Thùy đã phát hiện C. nutans tại VQG Tam Đảo - Vĩnh Phúc,

8


C. militaris tại VQG Vũ Quang - Hà Tĩnh, Cordyceps sp1 tại VQG Cúc Phương Ninh Bình, Cordyceps sp2 tại VQG Tây Yên Tử - Bắc Giang và Cordyceps sp3 tại
núi Ngọc Tiên, Bà Rịa – Vũng Tàu [30]. Hoàng Tiến Cơng phát hiện mới bảy lồi
nấm thuộc nhóm Cordyceps tại khu bảo tồn Tây Yên Tử gồm C. sphecocephala, C.
stylophora,

C.

myrmecophila,

Akanthomyces

novoguineensis,

Torrubiella

minutissima, Gibellula sp. và Isaria takamizusanensis [1]. Tô Quang Huyên và Lê
Thị Xuân phát hiện sáu loài thuộc chi Cordyceps và một lồi thuộc chi Beauveria
tại khu rừng di tích lịch sử và cảnh quan môi trường Mường Phăng huyện Điện
Biên - Điện Biên [9]. Nguyễn Thị Thúy & cs đã phân lập và định danh được mười
tám chủng nấm Isaria javanica tại VQG Pù Mát [31]. Năm 2016, Nguyễn Phương
Đại Nguyên phát hiện mười loài nấm thuộc ba chi: Cordyceps, Ophiocordyceps và
Isaria ở VQG Chư Yang Sin - Đắk Lắk [17]. Như vậy, có thể thấy nấm Cordyceps
phân bố rộng rãi tại nhiều khu vực khác nhau ở nước ta.

1.1.3. Một số đặc điểm sinh học
1.1.3.1. Đặc điểm quả thể
Quả thể của Cordyceps thường được tìm thấy trên xác nhộng hoặc ấu trùng
sau một thời gian bị nhiễm nấm, thường mọc thẳng, thn dài có thể có dạng hình
trụ hoặc hình dạng phức tạp, mọc đơn lẻ hoặc thành cụm, có thể phân nhánh. Quả
thể có kích thước và màu sắc khác nhau đặc trưng cho mỗi lồi, có thể là từ màu
cam sáng đến đỏ cam, thậm chí từ màu đỏ tươi đến đỏ sậm, hoặc từ nâu sậm, nâu
đen đến đen. Quả thể thường có cuống để nâng phần sinh sản để không chạm vật
chủ, phần sinh sản phình to hơn phần cuống và thường nằm ở phần đầu của quả thể,
có dạng chùy với kích thước thay đổi tùy theo lồi (Hình 1.1) [90], [92], [114],
[115], [150], [153], [163], [164].
Bào tử túi hay là bào tử hữu tính được sinh ra từ những tế bào đặc biệt nằm ở
phần sinh sản gọi là thể túi. Các thể túi này được đựng trong một cấu trúc gọi là thể
sinh sản hay thể chén. Thể chén, thể túi và bào tử túi có hình dạng và kích thước đặc
trưng cho mỗi lồi. Bào tử túi có dạng hình thoi hoặc hình trụ, có vách ngăn, tách
hoặc khơng tách thành bào tử thứ cấp [114], [115], [150], [153], [163], [164].

9


Hình 1.1. Quả thể Cordyceps tự nhiên. (Nguồn: Shrestha & Sung (2005)),
(a): C. gracilis, (b): C. ishikariensis, (c): C. liangshanensis, (d): C. martialis, (e): C.
militaris, (f): C. nutans, (g): C. pruinosa, (h): C. sinensis, (i): C. sphecocephala, (j):
C. tricentri.
1.1.3.2. Đặc điểm khuẩn lạc và sợi nấm
Các môi trường thạch dùng để nuôi cấy vi sinh vật như môi trường PDA
(Potato Dextrose Agar), SDAY (Sabouraud Dextrose Agar), YEA (Yeast Extract
Agar), MEA (Malt Extract Agar), CDA (Czapek-Dox Agar)... đều có thể sử dụng
để nuôi cấy Cordyceps [39], [97], [114], [115], [152], [164], [166]. Sợi nấm
Cordyceps thường được thu nhận bằng cách nuôi cấy bào tử túi. Tỷ lệ nẩy mầm và

tốc độ tăng trưởng tùy thuộc vào lồi và điều kiện ni cấy [164].
Khi phát triển trên bề mặt môi trường PDA xuất hiện sợi nấm màu trắng
mịn và sau 14 ngày nuôi cấy ở 20 – 25oC, sợi nấm lan tỏa trên toàn bộ bề mặt đĩa
thạch, màu sắc khuẩn lạc thay đổi từ trắng mịn sang màu nâu sáng, một số chuyển
từ hơi vàng sang nâu, hoặc số khác thì phát triển từ hồng nhạt sang da cam… và
cuối cùng, khi trong môi trường hết chất dinh dưỡng (khoảng sau hơn 30 ngày

10


nuôi cấy) màu sắc sợi nấm sậm hơn giống như màu bùn [68]. Màu sắc sợi nấm của
các loài Cordyceps trong nuôi cấy cũng khác nhau do sự khác nhau về sắc tố được
hình thành, ví dụ: ở C. militaris có màu từ trắng vàng đến da cam, ở C. pruinosa
có màu đỏ với các vùng trắng, trong khi C. bassiana thì lại khơng hình thành sắc
tố [164]. Sợi nấm Cordyceps thường phân nhánh và có vách ngăn. Bào tử vơ tính
hay bào tử đính của Cordyceps có hình dạng và kích thước khác nhau tùy theo lồi
[109], [114], [115], [164].
1.1.3.3. Ký chủ và quá trình xâm nhiễm của nấm
- Ký chủ: Cordyceps thường ký sinh trên côn trùng và các động vật chân đốt,
phát triển và hình thành quả thể [144]. Chi nấm này là chi có mức độ đa dạng nhất
trong họ Clavicipitaceae cả về số loài lẫn số vật chủ [163].
Theo Kobayasi, nấm thuộc chi Cordyceps có thể tấn cơng vào các lồi cơn
trùng thuộc mười bộ của ngành động vật chân đốt như bộ cánh vẩy (Lepidoptera),
bộ cánh cứng (Coleoptera), bộ cánh thẳng (Orthoptera), bộ nhện (Araneae), bộ cánh
màng (Hymenoptera), bộ hai cánh (Diptera), bộ cánh nửa (Hemiptera)... Thơng
thường, mỗi lồi trong chi Cordyceps thường ký sinh trên một lồi vật chủ duy nhất
hoặc một nhóm các vật chủ thân thuộc và gây bệnh vào giai đoạn ký chủ chưa
trưởng thành (ấu trùng và nhộng) của các loài vật chủ thuộc bộ cánh cứng và bộ
cánh vẩy hoặc vào giai đoạn trưởng thành ở các loài thuộc bộ cánh nửa và bộ cánh
màng [92], [163]. Ký chủ cũng là một trong những đặc điểm được dùng để nhận

diện Cordyceps. Ví dụ như C. pseudomilitaris có đặc điểm hình thái rất giống C.
militaris nên dễ gây ra sự nhằm lẫn nhưng Mains đã lưu ý rằng C. militaris thường
chỉ được tìm thấy trên nhộng (pupae) nhiều hơn là trên ấu trùng (larvae) của bộ
Lepidoptera trong khi C. pseudomilitaris chỉ được tìm thấy trên ấu trùng của bộ
Lepidoptera [76].
- Quá trình xâm nhiễm vào vật chủ: Quá trình xâm nhiễm của các lồi
nấm ký sinh cơn trùng nói chung và của Cordyceps nói riêng được bắt đầu từ sự phát
tán của bào tử nấm lên bề mặt côn trùng, sau đó bào tử nẩy mầm trong vịng vài giờ ở
điều kiện thích hợp. Bào tử nấm tiết ra các enzym thủy phân như protease, chitinase

11


và lipase giúp sợi nấm thâm nhập vào bên trong cơ thể vật chủ [168]. Sau đó sợi nấm
bắt đầu phát triển, phân nhánh và sản xuất ra nhiều loại chất chuyển hóa thứ cấp ức
chế hệ miễn dịch làm cho hành vi của côn trùng bị thay đổi hoặc hoạt động như các
kháng sinh tự nhiên chống lại vi sinh vật khác xâm nhiễm cạnh tranh vào cơ thể côn
trùng [79]. Vào thời điểm vật chủ chết hay một thời gian ngắn sau đó, sợi nấm phá
hủy tồn bộ cấu trúc nội quan của vật chủ, tạo thành một khối sợi nấm được gọi là
hạch nấm và lớp da ngoài của đa số vật chủ hầu như vẫn nguyên vẹn. Khi gặp điều
kiện thuận lợi, từ hạch nấm sẽ hình thành một hay một vài quả thể và chọc thủng lớp
da của vật chủ ở bất kỳ vị trí nào để nhơ ra ngồi [168]. Nghiên cứu trên C. militaris
khi xâm nhiễm vào Dendrolimus pini L. cho thấy thời gian phát triển của hệ sợi trong
giai đoạn còn non tương tự nhau giữa in vitro và tự nhiên trong 5 - 10 ngày đầu. Tuy
nhiên, thời gian để sợi nấm trưởng thành và hình thành quả thể, thể chén và bào tử túi
in vitro ngắn hơn nhiều so với trong tự nhiên. Báo cáo đã cho thấy quả thể in vitro
hình thành chỉ sau 30 – 65 ngày trong khi trong tự nhiên phải mất 300 – 335 ngày để
hình thành quả thể [63].
1.1.3.4. Vịng đời của nấm Cordyceps
Giống như các loài khác thuộc ngành nấm túi, các loài thuộc chi Cordyceps

đều đa hình thái. Đó là, vịng đời của chúng có sự đan xen giữa dạng vơ tính và
dạng hữu tính. Khi bào tử túi được phóng thích từ quả thể, rơi trên mặt đất hoặc là
nhiễm vào vật chủ, gặp điều kiện thuận lợi sẽ nảy mầm và hình thành sợi nấm sơ
cấp, đơn nhân, đơn bội, có vách ngăn ngang, phân nhánh và phát triển mạnh. Hệ
sợi này có thể sinh sản vơ tính nhiều lần để tạo nên vơ số bào tử vơ tính. Trong
khi đó, thể hữu tính là dạng tạo thành quả thể từ tế bào đa bội nhờ sự kết hợp giữa
các tế bào đơn bội của thể vơ tính. Tại những khu vực nhất định trên hệ sợi, trong
những điều kiện thuận lợi, sẽ hình thành cơ quan sinh sản đực và cái, thường hình
thành từng cặp gần nhau để khi tiếp xúc sẽ diễn ra sự giao phối sinh chất, tiếp
theo là sự phối hợp nhân. Kết thúc các quá trình này là sự hình thành túi chứa bào
tử, thêm vào đó, là sự hình thành quả thể sinh bào tử [2]. Phần lớn bào tử túi phát
tán vào không khí và hồn thiện chu trình bằng cách xâm nhiễm vào vật chủ mới.

12


Thể vơ tính của Cordyceps có chu kỳ đời sống ngắn hơn thể hữu tính. Tất cả các
lồi Cordyceps có chu kỳ vòng đời tương tự nhau. Điểm khác biệt chính trong
chu kỳ đời sống của chúng là nơi chúng phát triển và ký chủ. Trong số đó, C.
militaris là lồi được dùng làm mơ hình trong các nghiên cứu vịng đời của
Cordyceps (Hình 1.2) [154].
Cuống sinh bào tử
vơ tính

Quả thể

Sợi nấm
Bào tử vơ tính

Chu kỳ hữu tính của

Cordyceps militaris

Chu kỳ vơ tính của
Lecanicillium
Nhiễm vào
vật chủ

Bào tử túi
nẩy mầm

Bào tử vơ tính
nẩy mầm

Túi
Bào tử túi
Hình. 1.2. Chu kỳ vịng đời của nấm Cordyceps militaris.
1.1.3.5. Di truyền của nấm Cordyceps
Cordyceps có tính đa dạng di truyền cao về các đặc điểm hình thái và hóa
sinh học. Trong tự nhiên, Cordyceps hiện diện với nhiều kiểu quả thể có hình dạng
và màu sắc khác nhau. Hàm lượng của các hoạt chất trong quả thể thu từ tự nhiên
của chúng cũng thay đổi lớn. Thêm vào đó, mức độ biến dị di truyền của
Cordyceps trong tự nhiên có thể khơng giống với khi được nuôi cấy in vitro.
Nghiên cứu trên 18 quần thể C. sinensis ở cao nguyên Tây Tạng (Trung Quốc) cho
thấy ít có sự biến dị di truyền xảy ra trong các quần thể và ít có sự trao đổi gen
giữa các quần thể [104]. Ngoài ra, mức độ đa dạng di truyền của các quần thể C.

13