Luận án tiến sĩ nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ dioxin ở biên hòa, đồng nai

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẠM QUANG HUY

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT
NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ
CHỦNG PHÂN LẬP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2021


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

PHẠM QUANG HUY

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT TRONG MẪU ĐẤT
NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Ở BIÊN HÒA, ĐỒNG NAI
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG PHÂN HỦY CỦA MỘT SỐ
CHỦNG PHÂN LẬP

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 9 42 01 07

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà
Viện Công nghệ sinh học
TS. Nguyễn Kim Thoa
Viện Công nghệ sinh học

Hà Nội, 2021


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà và TS.
Nguyễn Kim Thoa, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng
nghệ Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện tốt nhất về cơ sở vật chất
cũng như động viên tơi trong những lúc khó khăn nhất để tơi có thể thực hiện và
hồn thành luận án này.
Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học
đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập, nghiên cứu và hồn thành luận
án. Tơi xin cảm ơn tập thể cán bộ Phịng Cơng nghệ sinh học tái tạo mơi trường đã
tận tình giúp đỡ tơi trong q trình thực hiện luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí từ đề tài độc lập cấp nhà nước:
“Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin
nhằm tìm kiếm các gen, enzyme mới có khả năng phân hủy dioxin” do PGS.
TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ nhiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà, chuyên viên phụ trách đào
tạo, Viện Cơng nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn tơi hồn thành mọi thủ tục
trong suốt q trình học tập làm nghiên cứu sinh tại Viện.
Cuối cùng, tôi xin gửi tới người thân trong gia đình cùng bạn bè sự biết ơn,
đặc biệt là bố mẹ đã dành cho tơi tình u thương sâu sắc và tạo điều kiện tốt nhất
để tơi học tập và hồn thành tốt nội dung luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn!

Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021

NCS. Phạm Quang Huy

i


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực, một phần đã được cơng
bố trên các tạp chí khoa học chun ngành với sự đồng ý và cho phép của các đồng
tác giả.
Các thơng tin trích dẫn trong luận án đã được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày……tháng……năm 2021
Tác giả

NCS. Phạm Quang Huy

ii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................... ii
MỤC LỤC ............................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vi
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ....................................... ix

MỞ ĐẦU .................................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................. 4
1.1.

Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin .......................................................... 4

1.1.1. Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và
con người. ....................................................................................................... 4
1.1.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng.................... 5
1.1.3. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm............................ 7
1.2.

Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin ....................................................................................................... 12

1.2.1. Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ô nhiễm ......................... 12
1.2.2. Đa dạng vi khuẩn kị khí ni cấy được trong đất ô nhiễm dioxin............ 13
1.2.3. Đa dạng gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy
chất diệt cỏ/dioxin ........................................................................................ 18
1.3.

Sử dụng công cụ metagenomic nghiên cứu đa dạng VSV ô
nhiễm POPs ................................................................................................. 19

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 27
2.1.

Vật liệu.......................................................................................................... 27
iii

2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .................................................................................. 27
2.1.2. Các hóa chất và thiết bị máy móc ............................................................... 29
2.1.3. Mơi trường ni cấy .................................................................................... 30
2.1.4. Sơ đồ thí nghiệm .......................................................................................... 30
2.2.

Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 32

2.2.1. Thu thập và bảo quản mẫu đất để nghiên cứu metagenome ..................... 32
2.2.2. Phân tích thành phần cơ giới và nồng độ dioxin trong mẫu nghiên cứu ...... 32
2.2.3. Phân lập, phân loại VSV từ nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ............ 32
2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính laccase và laccase-like ........................... 33
2.2.5. Đánh giá phân hủy 2,3,7,8-TCDD trong đất ô nhiễm bởi hỗn
hợp VSV ...................................................................................................... 34
2.2.6. Phương pháp tách chiết DNA metagenome ............................................... 35
2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch của DNA
metagenome.................................................................................................. 35
2.2.8. Phân tích trình tự DNA metagenome của C và BHR ................................ 36
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ......................................................... 39
3.1.

Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin bởi tổ hợp vi khuẩn, xạ khuẩn
quy mơ phịng thí nghiệm............................................................................ 40

3.1.1. Vi khuẩn từ đất nhiễm dioxin phân lập được, định danh và khả năng
phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn có tiềm năng ..................... 40
3.1.2. Xạ khuẩn từ đất nhiễm dioxin đã được phân lập, định danh và khả
năng phân hủy dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn tiềm năng .................. 42
3.2.

Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C
và BHR ......................................................................................................... 46

3.2.1. Thu nhận DNA metagenome từ mẫu C và BHR ....................................... 46
iv


3.2.2. Trình tự, contig và gene chức năng từ metagenome của mẫu C
và BHR......................................................................................................... 47
3.2.3. Đa dạng VSV của metagenome C và BHR................................................ 49
3.2.4. Mối liên hệ giữa một số chi vi khuẩn với tổng độ độc và các đặc
tính lý hóa của đất ........................................................................................ 69
3.2.5. Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của
metagenome C và BHR ............................................................................... 70
3.2.6. Nhóm gene mã hóa enzyme tham gia phân hủy, chuyển hóa chất
diệt cỏ/dioxin ................................................................................................ 72
3.2.7. Gene tham gia vào phân hủy chuyển hóa xenobiotic từ metagenome
đã được phát hiện ......................................................................................... 76
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................. 79
4.1.

Đa dạng VSV và gene chức năng từ trình tự DNA metagenome C
và BHR thu được. ........................................................................................ 79

4.2.

Đa dạng gene chức năng tham gia phân hủy xenobiotic của
metagenome C và BHR (một trong 4 con đường phân hủy và
khoáng hóa dioxin). ..................................................................................... 92

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................. 95
NHỮNG CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN
QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI ............................................................................................ 97
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH.................................................... 98
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 105
PHỤ LỤC

v


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 3.1.

Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng vi khuẩn ....................................... 42

Bảng 3.2.

Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin bởi chủng XKBHA22 ................................................. 45

Bảng 3.3.

Hiệu suất phân hủy dioxin trong đất ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin bởi tổ hợp 5 chủng xạ khuẩn ...................................... 45

Bảng 3.4.

Trình tự read chất lượng cao ....................................................... 47

Bảng 3.5.

Lắp ráp de novo trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48

Bảng 3.6.

Phân bố gene từ trình tự DNA metagenome C, BHR ................ 48

Bảng 3.7.

Đa dạng ở các mức độ phân loại của metagenome C và BHR ......... 52

Bảng 3.8.

Một số chi có các đại diện đã được chứng minh có khả
năng phân huỷ chất diệt cỏ/ dioxin ............................................. 57

Bảng 3.9.

Đa dạng nấm sợi và nấm đảm trong metegenome của C và
BHR ............................................................................................ 66

Bảng 3.10. Số lượng trình tự tương đồng cao với các gene chức năng
trong tập dữ liệu chuẩn hóa......................................................... 71
Bảng 3.11. Số lượng trình tự liên quan đặc thù tới con đường phân 2,4D và polychlorinated biphenyl (PCB) dựa trên cơ sở dữ
liệu KEEG ................................................................................... 72

vi

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB ................................. 4
Hình 1.2. Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T ....... 5
Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khống hóa hỗn hợp
chất diệt cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương
pháp sinh học. ................................................................................. 8
Hình 1.4. Nghiên cứu theo hướng -Omics trong sinh học ............................ 20
Hình 1.5. Các bước thực hiện phân tích metagenomic ................................. 22
Hình 2.1. Mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin (ký hiệu C) ................... 27
Hình 2.2. Mặt cắt dọc của lơ xử lý................................................................ 28
Hình 2.3. Mẫu đất trong lô xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học
(ký hiệu BHR) ............................................................................... 28
Hình 2.4. Sơ đồ thực hiện nghiên cứu .......................................................... 31
Hình 2.5. Quy trình phân tích dữ liệu DNA metagenome trên hệ thống
MG RAST ..................................................................................... 37
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng vi khuẩn BHBi1, BHBi4,
BHBi5, BHBi7 và BHO9 từ mẫu làm giàu trên mơi trường
MSM chứa dịch chiết đất .............................................................. 40
Hình 3.2. Hình thái tế bào 5 chủng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử quét..... 41
Hình 3.3. Cây phát sinh chủng loại của 5 chủng vi khuẩn ........................... 41
Hình 3.4. Khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp
vi khuẩn A: Đối chứng (khơng có VSV); B: Tổ hợp 5 chủng
vi khuẩn ......................................................................................... 42
Hình 3.5. Hình thái khuẩn lạc 5 chủng xạ khuẩn và sinh trưởng của
chúng trên môi trường Gause M chứa DCĐ................................. 43
vii


Hình 3.6. Cây phát sinh chủng lồi của chủng xạ khuẩn XKBH921 ........... 43

Hình 3.7. Khả năng sinh tổng hợp laccase- like của 5 chủng xạ khuẩn ....... 44
Hình 3.8. Phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong đất bằng tổ hợp xạ khuẩn ..... 45
Hình 3.9. Điện di đồ DNA mẫu nghiên cứu trên gel agarose....................... 47
Hình 3.10. Đa dạng ở các mức độ khác nhau của metagenome C (vịng
ngồi) và BHR (vòng trong) trên cơ sở dữ liệu RefSeq ............... 51
Hình 3.11. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ ngành trong metagenome C và
BHR............................................................................................... 52
Hình 3.12. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ lớp trong metagenome C và BHR ....... 53
Hình 3.13. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ bộ trong metagenome C và BHR ........ 54
Hình 3.14. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ họ trong metagenome C và BHR ........ 55
Hình 3.15. Đa dạng vi khuẩn ở mức độ chi trong metagenome C và BHR ....... 56
Hình 3.16. Đa dạng vi khuẩn cổ mức độ ngành trong metagenome C và
BHR ............................................................................................... 63
Hình 3.17. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ lớp trong metagenome C và
BHR............................................................................................... 63
Hình 3.18. Đa dạng vi khuẩn cổ ở mức độ chi trong metagenome C và
BHR............................................................................................... 63
Hình 3.19. Đa dạng vi khuẩn cổ sinh metan trong metagenome C và BHR ...... 65
Hình 3.20. Đa dạng vi khuẩn cổ ưa mặn trong metagenome C và BHR...... 65
Hình 3.21. Các chi vi khuẩn có tỷ lệ chiếm ưu thế ít chênh lệch trong
metagenome của mẫu C và BHR .................................................. 70
Hình 3.22. Tương quan gene liên quan đến chuyển hóa xenobiotic giữa
metagenome C và BHR. ............................................................... 71

viii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
°C

1,2,3,7,8PeCDD
2,3,7,8TCDD/F

Chú thích
Độ C
1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin

2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin/ furan

2,4,5-T

2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (chất diệt cỏ)

2,4,5-TCP

2,4,5-trichlorophenol

2,4-D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

2,4-DCP

2,4-dichlorophenol

bp

Base pair

BQP

Bộ Quốc phịng

CDS

Coding sequence (Trình tự mã hóa)

COG

Clusters of Orthologous Groups (Cơ sở dữ liệu về gen và
protein)

cs

Cộng sự

CSDL

Cơ sở dữ liệu

DBF

Dibenzofuran

DC

Chất diệt cỏ

DCĐ

Dịch chiết đất

DCP

Dichlorophenol

DD

Dibenzo-p-dioxin

DDD

1-chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene

DDMS

1,1'-(2-chloroethane-1,1-diyl)bis(4-chlorobenzene)

DDNU

1-chloro-4-[1-(4-chloro-phenyl) ethenyl]benzene

DDT

1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane

ix


DGGE

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel
građient biến tính)

ĐGMT

Đánh giá môi trường

DNA

Deoxyribonucleic Acid

EBI

eggNOG

EPA
Gb
HR-GC/MS

IMG

KEGG
Mb

European Bioinformatics Institute (Ngân hang cơ sở dữ liệu
Châu Âu)
evolutionary genealogy of genes: Non-supervised Orthologous
Groups (Cơ sở dữ liệu về chú thích chức năng gen)
United States Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ

Môi trường Hoa Kỳ)
Gigabyte
High Resolution Gas Chromatography Mass Spectrometry
(Sắc ký khí khối phổ độ phân giải cao)
Integrated Microbial Genome (Hệ thống bộ gen vi sinh vật tích
hợp)
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (Cơ sở dữ liệu về
gen và con đường chuyển hóa giả định)
Megabyte
Metagenomic

MG-RAST

Rapid

Annotations

using

Subsystems

Technology (Hệ thống phân tích tự động metagenome trực
tuyến mã nguồn mở)

MS

Multiple Sampling (Lấy mẫu đa điểm)

ORF

Open reading frame (Khung đọc mở)

ORF

Open reading frame (Khung đọc mở)

PAH

Polycyclic Aromatic Hydrocarbon (Hydrocarbon thơm đa
nhân)

PCB

Polychlorinated biphenyl

PCDD

Polychlorinated dibenzo-p-dioxin

x


PCDF

Polychlorinated dibenzofuran

PCP

Pentachlorophenol

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PFAM

Protein families database (Cơ sở dữ liệu protein)

POPs

Persistent Organic Pollutants (Hợp chất hữu cơ khó phân hủy)

Ppt

Part per trillion (10-12)

QCVN

Tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam

RefSeq

Reference Sequence (Cơ sở dữ liệu trình tự tham chiếu)

RNA

Ribonucleic Acid

RT-PCR

Real time PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp theo thời gian thực)

SSCP

Single Strand Conformation Polymorphism (Đa hình cấu hình
sợi đơn)

TCP

Trichlorophenol

TEF

Toxic Equivalent Factor (Độ độc tương đương)

TGGE
TNT
T-RFLP

USAID

Temperature Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên gel
građient nhiệt)
Trinitrotoluen
Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa
hình chiều dài đoạn cắt cuối)
United States Agency for International Development (Cơ quan
phát triển quốc tế của Hoa Kỳ)

VK

Vi khuẩn

VK KK

Vi khuẩn kị khí

VK KSF

Vi khuẩn khử sulfate

VSV

Vi sinh vật

XK

Xạ khuẩn

xi


1

MỞ ĐẦU
Gần 50 năm sau chiến tranh, hơn 100 triệu lít thuốc diệt cỏ chứa 2,3,7,8tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD là đồng phân dioxin độc nhất với độ
độc tương đương là 1 đã phun rải và hiện vẫn còn tồn lưu ở miền nam Việt Nam
(Cecil, 1986). Hỗn hợp chất độc tại các khu vực ô nhiễm khiến môi trường tự nhiên
bị phá hủy, sức khỏe di truyền của bệnh nhân phơi nhiễm bị ảnh hưởng qua nhiều
thế hệ, quần xã vi sinh vật (VSV) bị thay đổi mà vẫn chưa thể đánh giá chính xác

được. Do đó, ơ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nói riêng và ơ nhiễm các hợp chất hữu cơ
khó phân hủy (POPs) nói chung cần phải được loại bỏ theo cơng ước Stockholm.
Do đó, nghiên cứu đánh giá vai trò thực chất của các quần xã vi sinh vật trong tự
nhiên cũng như trong các vùng đã và đang được xử lý khử độc là rất cấp thiết.
Trong 20 năm trở lại đây, số lượng nghiên cứu liên quan tới khả năng phân
hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi các VSV phân lập được, số lượng enzyme tham gia vào
con đường chuyển hóa cũng như đa dạng VSV khơng thơng qua ni cấy (sử dụng
phương pháp đa hình cấu hình sợi đơn (Single-Strand Conformation Polymorphism
- SSCP, điện di trên gel građient biến tính biến tính (denaturing gradient gel
electrophoresis - DGGE, nhân gene theo thời gian thực (real time Polymerase Chain
Reaction – RT PCR) tăng dần nhằm xây dựng công nghệ xử lý ô nhiễm với hiệu
suất cao và triệt để hơn bởi vi sinh vật.
Ở Việt Nam, quy mô thử nghiệm và triển khai công nghệ xử lý khử độc bằng
phân hủy sinh học (Bioremediation) tăng dần từ pilot 0,5 m3 – 100 m3 ở sân bay Đà
Nẵng tới quy mô hiện trường 3.384 m3 ở sân bay Biên Hòa. Qua các cơng bố mới
được cập nhật, các VSV có khả năng nuôi cấy chiếm tỷ lệ rất thấp chỉ từ 0,001 đến
0,1% cho thấy hạn chế của các phương pháp nghiên cứu truyền thống đã thực hiện
trong nhiều thập niên qua. Do đó, việc áp dụng các cơng cụ nghiên cứu hiện đại trở
nên rất cần thiết để có thể từng bước hiểu rõ sự đa dạng và bản chất cấu trúc quần
xã VSV để từ đó cải tiến quy trình cơng nghệ hiện có nhằm rút ngắn thời gian và


2

nâng cao hiệu suất xử lý khử độc ô nhiễm hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn tồn
đọng ở Việt Nam và các loại chất hữu cơ khó phân hủy (POPs) khác trên thế giới.
Giải trình tự và phân tích nguyên liệu di truyền bằng cách tách DNA trực tiếp từ
mẫu đất ô nhiễm không thông qua nuôi cấy bằng hệ thống máy công năng cao thế hệ
mới Hiseq Illumina và các phần mềm tin sinh chuyên dụng sẽ khắc phục được hạn chế
của các phương pháp nghiên cứu truyền thống. Bởi vì kết quả thu được cung cấp thơng

tin chi tiết về sự đa dạng VSV từ ngành, lớp, bộ, họ, chi cho đến loài cùng hệ gene
chức năng tồn tại cũng như đa dạng protein giả định và các con đường chuyển hóa
trong metagenome của mẫu nghiên cứu. Vì vậy, tại thời điểm này sử dụng cơng cụ
metagenomic với mẫu đất liên quan tới ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ cung cấp bức
tranh đầy đủ nhất có thể về chủng loài và các mối quan hệ quần xã của vi sinh vật
nhằm nâng cao hiệu suất xử lý khử độc bằng công nghệ phân hủy sinh học không chỉ
áp dụng đối với ơ nhiễm dioxin mà cịn với các POPs khác.
Với các lý do trên, luận án nghiên cứu sinh đã được thực hiện và đây là
nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ nghiên cứu hiện đại với đất ô
nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa thuộc đối tượng đất đặc thù bởi
thành phần hóa học phức tạp để tách và làm sạch được DNA đủ chất lượng đáp ứng
yêu cầu của nghiên cứu. Mẫu ở 2 khu vực đã được chọn để nghiên cứu metagenome
gồm: đất từ khu Tây Nam Biên Hịa bị ơ nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin có độ độc
trung bình 21.605 ng TEQ/kg và đất đã được xử lý làm sạch sau 60 tháng ở khu
chôn lấp Z1 có độ độc trung bình 13,2 ng TEQ/kg. Tên luận án của nghiên cứu sinh
là: ”Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở
Biên Hòa, Đồng Nai và đánh giá khả năng phân hủy của một số chủng phân
lập”. Kết quả về sự đa dạng và các đặc điểm, cấu trúc quần xã và khả năng phân
hủy dioxin của một số đại diện được trình bày trong luận án này là một phần số liệu
thu được từ đề tài độc lập cấp nhà nước “Nghiên cứu metagenome của vi sinh vật
vùng đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin nhằm tìm kiếm các gene, enzyme mới có khả
năng phân hủy dioxin” mã số ĐTĐLCN.13/14 do PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ
nhiệm và đã được nghiệm thu năm 2019.


3

1)

MỤC TIÊU

Đánh giá đa dạng VSV trong (i) mẫu đất nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin và

(ii) mẫu đất đã được xử lý làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học ở các lơ
“Chơn lấp tích cực” sau 60 tháng ở sân bay Biên Hịa, Đồng Nai, Việt Nam bằng
cơng cụ metagenomic;
Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ô nhiễm nặng hỗn hợp
chất diệt cỏ/dioxin bằng tổ hợp vi khuẩn (VK) và tổ hợp xạ khuẩn (XK) được phân
lập và lựa chọn từ các mẫu đất nghiên cứu.
2)

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Thu thập, bảo quản, phân tích thành phần cơ giới của mẫu đất ơ nhiễm
chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa;
- Tách chiết, tinh sạch DNA từ các mẫu nghiên cứu và xác định trình tự
DNA bằng máy giải trình tự cơng năng cao thế hệ mới Illumina Hiseq 2500;
- Phân tích, đánh giá đa dạng VSV, đa dạng gene chức năng giả định từ
dữ liệu metagenome của các mẫu nghiên cứu;
- Đánh giá khả năng phân hủy hiếu khí dioxin trong đất ơ nhiễm nặng
bằng tổ hợp vi khuẩn và xạ khuẩn được phân lập từ đất ơ nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin.
3)

NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA LUẬN ÁN
- Đây là cơng trình đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ metagenomic trong

nghiên cứu đa dạng VSV trong đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin, đất đã được xử
lý khử độc sạch ở sân bay quân sự Biên Hòa và phát hiện được sự rất đa dạng trong
các quần xã vi khuẩn, vi khuẩn cổ ưa mặn, loại halogen với số lượng các gene chức
năng mới như laccase và laccase-like tham gia vào phân hủy hợp chất xenobiotic

cùng sự đa dạng của nấm sợi, nấm men và nấm đảm;
- Bổ sung cơ sở khoa học giải thích sự thành cơng của cơng nghệ phân hủy
sinh học đã thực hiện ở sân bay Biên Hòa và khả năng cải tiến qui trình cơng nghệ,
nâng cao hiệu suất xử lý khử độc hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc rất cao
cũng như một số loại hình ơ nhiễm POPs khác.


4

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin
1.1.1. Đặc điểm và ảnh hưởng của chất diệt cỏ/dioxin tới môi trường và con người.
Dioxin là gọi tắt của nhóm các chất hữu cơ khó phân huỷ với hai vòng thơm
gắn từ 1 đến 8 nguyên tử clo có quan hệ gần gũi với nhau về cấu trúc và tính chất
hóa học. Khi đề cập tới ơ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin là chủ yếu nhắc tới các nhóm
Policlodibenzo-p-dioxin (PCDD) có 75 chất và Polyclodibenzofuran (PCDF) có 135
chất, polyclobiphenyl (PCB) bởi chúng thường tồn tại dạng hỗn hợp của các chất
hóa học bền vững trong mơi trường (Schecter, 2013; Van den Berg và cs., 1998).
Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao nhất là 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin
(2,3,7,8-TCDD) và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (1,2,3,7,8-PeCDD) với
tổng độ độc tương đương TEF (Toxic Equivalency Factor) là 1 (tổ chức Y tế thế
giới - WHO).

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của PCDD, PCDF và PCB
(Nguồn: Kulkami và cs., 2008)

Các PCDD, PCDF và PCB có tính khơng phân cực cao, độ hịa tan trong
nước rất thấp, có xu hướng tích lũy vào đất mùn, trầm tích, các vật chất kị nước như
mô mỡ động vật (Schreiner và cs., 1997) và rất bền vững trong tự nhiên. Dioxin có

thể di chuyển trên bề mặt đất, theo dòng nước và theo khơng khí gây ra ơ nhiễm
mơi trường trong phạm vi rộng và phức tạp. Thời gian bán huỷ của dioxin là 10-100
năm tùy vị trí và điều kiện tự nhiên. Thời gian bán huỷ của dioxin trong đất là 4.720
ngày (~13 năm), hexaclobenze là 1.530 ngày (4,2 năm), PCBs là 940 ngày (2,6
năm), PAHs là 570 ngày (1,6 năm), pentaclophenol 100 ngày. Trong cặn đáy ao hồ
hay còn gọi là trầm tích dioxin có thể tồn tại hàng trăm năm. Dioxin có nhiệt độ


5

nóng chảy khá cao, ngay cả ở nhiệt độ 1.200oC quá trình phân huỷ dioxin vẫn là quá
trình thuận nghịch, dioxin chỉ bị phân huỷ hoàn toàn ở nhiệt độ lớn hơn 1.2001.400oC.

Hình 1.2. Cơ chế tạo ra 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T
(Nguồn: Schmalenberger và Tebbe, 2003)

Hàng trăm triệu lít chất diệt cỏ chứa dioxin do Mỹ phun rải nhằm phát quang
các cánh rừng tại miền Trung và Nam Việt Nam làm hơn 4 triệu ha rừng đã bị phá
hủy hoàn toàn, sự tồn lưu chất diệt cỏ/dioxin trong đất từ đó phân tán bởi lớp nước
mặt, nước ngầm, tích tụ trong cơ thể sinh vật. Mặt khác, các sân bay đã từng được
sử dụng làm điểm tập kết, súc rửa thùng đựng, máy bay sau khi phun rải nên lượng
lớn chất độc còn tồn lưu làm biến đổi hệ sinh thái, giết chết rất nhiều động, thực vật
cũng như phá hủy hệ VSV đất. EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư
nhóm 1 cho con người ở tất cả các liều lượng khi đã phơi nhiễm (Van den Berg và
cs., 2006). Theo Angelo và cộng sự, PCBs có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột,
máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh và hệ sinh sản (D’Angelo và Nunez, 2010)
nên có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau. Theo thời gian ô nhiễm, hệ VSV sẽ mất
dần là nguyên nhân đất bị sói mịn vì thiếu dưỡng chất.
1.1.2. Ơ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hịa và Đà Nẵng
Ơ nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam phần lớn do tồn dư bởi chiến tranh

hóa học do Mỹ gây ra từ 1961 và tập trung chủ yếu ở các sân bay quân sự cũ như
Biên Hòa, Đà Nẵng với các mức độ khác nhau.


6

Gần đây, cơ quan phát triển quốc tế hoa kỳ (United States Agency for
International Development – USAID) cùng Viện Khoa học và Cơng nghệ Qn sự
thuộc Bộ Quốc phịng (BQP) lấy từ 76 vị trí theo phương pháp lấy mẫu đa điểm
(MS) để điều tra mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa. Tổng
cộng thu thập hơn 1.400 mẫu và phân tích nồng độ dioxin đối chiếu với Tiêu chuẩn
quốc gia Việt Nam (QCVN 45:2012/BTNMT) và ngưỡng dioxin của BQP đối với
từng điểm lấy mẫu cho thấy ô nhiễm nặng nhất tập trung ở khu Tây Nam sân bay
(độ độc lên tới 110.000 ppt ở độ sâu 30 – 60cm).
Thống kê cho thấy khoảng 315.700 – 377.700 m3 và 92.800 – 117.600 m3
trầm tích ơ nhiễm dioxin (42% ở khu Pacer Ivy, 24% ở khu Z1 (bao gồm cả Bãi
chơn lấp Z1 là khu vực có lô xử lý 3.384 m3 đất ô nhiễm bằng phương pháp phân
hủy sinh học được thực hiện bởi PGS. TS. Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự, Viện
Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 15% ở
khu Tây nam, 19% ở các khu ZT, Tây bắc và Đông bắc và khoảng 5% tổng khối
lượng nhiễm dioxin nằm ở ngoài khu vực sân bay). Diện tích ơ nhiễm ước tính là
khoảng 522.400 m2, trong đó có khoảng 369.600 m2 diện tích đất và 152.800 m2
diện tích trầm tích.
Tình trạng ơ nhiễm dioxin ở sân bay Đà Nẵng được thể hiện trong Báo cáo
tổng kết của Văn phịng 33 và cơng ty Hatfield cho thấy khu vực đầu bắc sân bay
(khu pha trộn và đóng nạp) và khu Pacer Ivy (khu vực lưu trữ ở phía nam sân bay)
nồng độ TCDD cao nhất đạt tương ứng 361.000 ppt và 20.600 ppt ở độ sâu từ 0 – 10
cm với đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm 99% và 65%. Viện Công nghệ Sinh học đã
tiến hành xử lý thử nghiệm ở quy mô 10 m3 và 100 m3 bằng biện pháp chơn lấp tích
cực với hiệu quả phân hủy dioxin từ 50-70% ở khu đầu bắc sân bay (Hà và cs., 2005).

Đã tiến hành xử lý khử độc đất ơ nhiễm có độ độc cao hơn 43.000 ng TEQ/kg ở 11
công thức khác nhau ở qui mô pilot (2 m3) ngay tại sân bay Đà Nẵng, sau 6 tháng xử
lý 30% tổng độ độc đã bị loại bỏ tính chung cả các cơng thức hiếu khí và kị khí. Đây
là cơng trình hợp tác giữa viện cơng nghệ sinh học với Cục bảo vệ Môi trường Hoa
Kỳ (United States Environmental Protection Agency – EPA) năm 2009 với kinh phí


7

từ quỹ Ford (Hà và cộng sự , 2010). Lần đầu tiên ở Việt Nam và cũng là lần đầu tiên
trên thế giới công nghệ phân hủy sinh học khử dioxin (độ độc chủ yếu từ đồng phân
2,3,7,8 TCDD) sản xuất từ công nghệ cũ của những năm 50 của thế kỷ trước được
tiến hành ở qui mô lớn 3384 m3. Bằng sự kết hợp của thi công cơ giới, bán cơ giới (ở
một số công đoạn nhỏ) do các cán bộ khoa học của 2 cơ quan Viện KH&CN Việt
Nam và Bộ Quốc phịng đã cùng thực hiện cơng nghệ được gọi là: “Chơn lấp tích
cực”. Tháng 3 và 4/2009, Viện Công nghệ Sinh học đã phối hợp với các đơn vị của
Bộ Tư lệnh Hóa học xử lý 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại khu Z1 của sân
bay Biên Hịa. Trong các hố chơn lấp tích cực sự phân hủy sinh học xảy ra ở 3 điều
kiện hiếu khí (có oxy), kỵ khí (khơng có oxy) và kỵ khí khơng bắt buộc (có ít oxy).
Q trình xử lý bao gồm thúc đẩy sự chuyển hóa, phân hủy và giai đoạn cuối cùng tốt
nhất là khống hóa hoàn toàn các hỗn hợp chất độc bao gồm dioxin (độc nhất) là
2,3,7,8-TCDD (chiếm từ 90 - 99,63% tổng độ độc), 2,4,5-T, 2,4-D, TCP, DCP và các
PAH có nhiều vịng thơm v.v.
Năm 2009 Bộ quốc phòng Việt Nam và cụ thể là Bộ Tư lệnh Hóa học đã
chơn lấp hơn 90.000 m3 trong khuôn khổ dự án ở khu vực Z1 và 3.384 m3 đất thuộc
dự án này đã được làm sạch bằng công nghệ phân hủy sinh học như đã đề cập ở trên.
Năm 2011, USAID và BQP Việt Nam cùng phối hợp thực hiện Dự án Xử lý Môi
trường tại Sân bay Đà Nẵng sử dụng phương pháp khử hấp thu nhiệt và lưu chứa.
Đất, bùn nhiễm dioxin được đưa vào mố kín trên mặt đất và nung nóng tới nhiệt độ
tối thiểu 335ºC để tiêu hủy dioxin. Dự án đã xử lý hơn 90.000 m3 đất, trầm tích ơ

nhiễm trầm tích nhiễm dioxin nồng độ thấp và đã bàn giao vào cuối năm 2018. Tuy
nhiên, sản phẩm sau khi sử dụng phương pháp giải hấp phụ nhiệt vẫn gây nhiều tranh
cãi về hiệu quả môi trường và sản phẩm cuối cùng vẫn còn phải xử lý tiếp.
1.1.3. Phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin trong đất ô nhiễm
Do đất bị ô nhiễm ở mức rất nặng, phức tạp và kéo dài nên việc xử lý triệt để
tuân thủ cơng ước Stockholm là rất cần thiết. Hiện có rất nhiều phương pháp hóa
học, lý học, sinh học được đề xuất để xử lý nhưng cần có những nghiên cứu kỹ
trước khi áp dụng. Quá trình phân hủy sinh học có thể xảy ra theo 4 con đường chủ


8

yếu (Báo cáo kết quả nhiệm vụ chơn lấp tích cực thuộc dự án “Xử lý khu đất nhiễm
chất độc hóa học chứa Dioxin tại sân bay Biên Hịa, tỉnh Đồng Nai” do Bộ Tư lệnh
Hóa học - Bộ Quốc phòng làm chủ đầu tư và thực hiện năm 2009). Ba con đường
oxy hóa cắt vịng, loại clo các hợp chất hữu cơ thơm đã được mở vòng và xúc tác
bởi các enzyme ngoại bào hay các chất xúc tác khơng có cấu trúc enzyme nhưng
hoạt động như enzyme đều cần oxy và con đường thứ tư là loại khử clo đối với các
chất hữu cơ đa vịng thơm (Hình 1.3). Tất cả các quá trình nêu trên được thực hiện
bởi tập đoàn vi sinh vật bản địa trong các tầng đất của lơ “Chơn lấp tích cực”.

Hình 1.3: Các con đường chuyển hóa, phân hủy, khống hóa hỗn hợp chất diệt
cỏ/dioxin và các chất trao đổi chất bằng phương pháp sinh học.
Sản phẩm trung gian của con đường khử loại clo là các hợp chất bớt độc hơn
do loại khử bớt clo. Các sản phẩn tạo ra theo các con đường khác rất phong phú ở
mỗi giai đoạn và điều kiện môi trường luôn biến động tạo cơ hội cho các quần xã vi
sinh vật hoạt động phân hủy, chuyển hóa và sản phẩm cuối cùng của 4 con đường
trao đổi chất nói trên là các chất đi vào chu trình Krebs trước khi được khống hóa
tới các axit hữu cơ, nước, CO2 và sinh khối vi sinh vật.
1.1.3.1. Phân hủy sinh học hiếu khí xenobiotic và chất diệt cỏ/dioxin

Chất diệt cỏ/dioxin gồm 2 nhóm là chứa và khơng chứa clo với cơ chế phân
hủy khác nhau bởi VSV trong các điều kiện khác nhau.
Phân hủy sinh học hợp chất dioxin khơng chứa clo
Cấu trúc dạng vịng dễ bị q trình oxy hóa (bởi hệ enzyme được sinh bởi các
vi sinh vật) phá vỡ làm giảm độc tính của dioxin. Q trình hydroxyl hóa vịng thơm
xuất hiện ở vị trí bên các nguyên tử carbon 1,2; 2,3 hoặc 3,4 như Novosphingobium


9

aromaticivorans IFO15084, N. stygium IFO 16085, N. sunterraneum IFO 16086,
Porphyribacter sanguineus IAM 12620T, Sphingobacterium yanoikuyae B1,
Burkholderia cepacia F297, B. cepacia ET4, Ralstonia sp. SBUG290, Pseudomonas
sp. HL7b v.v. (Hong và cs., 2007) hoặc các vị trí góc 4,4a như Cycloclasticus pugetti,
Comamonas sp. KD7, Rhodococcus sp. NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO
101 và Rhodococcus sp. HA01 (Chang, 2008). Quá trình này sinh ra các chất trao đổi
trung gian có màu vàng nhạt đến vàng lẫn nâu nhạt (hấp thụ ở bước sóng 460nm)
(Johnson, 2008).
Phân hủy dioxin và các chất tương tự bởi oxy hóa kép vị trí góc như
Sphingomonas sp. HH19k; Sphingomonas sp. HH69; Burkholderia sp. JB1;
Burkholderia sp. LB400; Ralstonia sp. SBUG 290; Pseudomonas sp. F274, v.v.
cũng đã được Fortnagel và cộng sự chứng minh (Fortnagel và cs., 1989). Wittchi và
cộng sự đã cơng bố về oxy hóa vị trí góc bởi enzyme dioxin dioxygenease từ
Sphingomonas wittchi RW1.
Phân hủy sinh học hợp chất dioxin chứa clo
Quá trình xảy ra theo cơ chế đồng trao đổi chất. Theo nghiên cứu của Field và
Sierra-Alvarez, 84% công bố vi khuẩn (VK) thuộc các chi Rhodococcus, Beijerinckia,
Pseudomonas, Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Burkholderia, Klebsiell,
Alcaligenees có khả năng phân hủy các PCDDs và PCDFs chứa 1 hoặc 2 clo (Field và
Sierra-Alvarez, 2008). Các hợp chất PCDD/F chứa 5 nguyên tử clo hoặc nhiều hơn thì

mức độ bị phân hủy sinh học hiếu khí cũng khó hơn. Chủng Sphingomonas wittchii
RW1 có khả năng chuyển hóa chậm 1,2,3,4,7,8-HCDD; 2,7-DCDD; 1,2,3-TriCDD;
1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,4,7,8-HxCDD thành các chlorocatechol tương ứng nhưng lại
khơng thể chuyển hóa 2,3,7-TriCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD. Schreiner và cộng sự khảo
sát quá trình phân hủy sinh học bởi chủng Sphingomonas sp. HH69 cho thấy 31%
2,3,7,8-TCDF và 15% 2,3,7,8-TCDD đã bị loại bỏ trong 84 ngày (Schreiner và cs.,
1997). Chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. PSX cũng phân hủy 64% lượng 2,3,7,8TCDF và 82% lượng 2,3,7,8-TCDD trong cùng thời gian.


10

Phân hủy sinh học hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam
Vi sinh vật trong các công thức xử lý tại sân bay Đà Nẵng năm 2009 (dự án
hợp tác với EPA Hòa Kỳ được Quỹ For tài trợ) cho thấy số lượng dao động trong
khoảng 102-105 CFU/g và thay đổi theo thời gian bổ sung chế phẩm và đảo trộn
đất. Vi khuẩn có số lượng cao nhất rồi đến nấm sợi và xạ khuẩn. Chúng sinh trưởng
trên môi trường chứa chất diệt cỏ/dioxin như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất
hay sử dụng chất độc theo cơ chế đồng trao đổi chất.
Hỗn hợp vi khuẩn của SETDN 20 được làm giàu từ lô đất xử lý tẩy độc bằng
phân hủy sinh học ở Đà Nẵng, loại bỏ 17,9% tổng độ độc trong đó đồng phân
2,3,7,8-TCDD giảm từ 4.299 ppt xuống cịn 3.528 ppt sau 60 ngày ni cấy trên
mơi trường xử lý chứa dịch chiết đất. Một số chủng có khả năng phân hủy dioxin;
2,4,5-T; 2,4-D và các PAHs đa vòng (pyren và fluoranthen) đã được chứng minh
như Streptomyces sp. XKDN11, Streptomyces sp. XKDN19, Streptomyces sp.
XKDNR1, Brevibacillus sp.XKDN3, Brebacillus sp. BDNR10, Bacillus sp. BDN6,
Bacillus sp. BU3, Pseudomonas sp. BDN15, Pseudomonas sp. BDNR1,
Pseudomonas sp. Setdn1, Aspergillus sp. FDN9, Aspergillus sp. FDN20. Chủng
Rhodococcus sp. HDN3 và Terrabacter sp. DMA phân hủy hoàn toàn DBF với
nồng độ 4 mM sau 24 và 48 giờ ni cấy tương ứng.
Ngồi ra, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam phối hợp Bộ Tư lệnh Hóa học - Bộ Quốc phịng tiến
hành khử độc thành công 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hịa.
Số lượng VSV hiếu khí tùy tiện sử dụng dioxin như nguồn cacbon và năng lượng duy
nhất dao động từ 3,3x104 đến 8,7x107. Sau 27 tháng xử lý, tổng độ độc của dioxin
trong các mẫu đất giảm từ 10.000 ng TEQ/kg đất khơ xuống cịn 52 ng TEQ/kg đất
khô, hiệu quả xử lý đạt 99,48%. Ở Đà Nẵng với các công thức gồm 0,5 m3, 1,5 m3, 10
và 100 m3 cũng được thực hiện với độ độc giảm từ 32,84% đến 71,04% sau 1 tháng
và giảm 50-70% sau gần 2 năm xử lý (Hà và cs., 2008).
1.1.3.2. Phân hủy sinh học kị khí chất diệt cỏ/dioxin
Phân hủy sinh học kị khí chất diệt cỏ/dioxin chứa clo
Các vi khuẩn kị khí tham gia vào q trình loại khử clo cũng khá đa dạng,
bao gồm nhóm vi khuẩn khử sulfate như Desulfovibrio, Desulfitobacterium,


11

Desulfomonile, nhóm Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas v.v. được
xếp vào ba ngành chính là Chloroflexi, Firmicute và Proteobacteria (Hiraishi, 2008;
Maphosa và cs., 2010).
Chủng Dehalococcoides ethenogenes 195 có khả năng loại khử clo của 1,2,3,4TCDD thành 1,2,4-TrCDD; 1,3-DiCDD; loại clo của hexachlorobenzene thành 1,2,3,5tetrachlorobenzene; loại clo của

2,3,4,5,6-petachlorobiphenyl

thành 2,3,4,6-

tetrachlorobenzene; 1,3,5-trichlorobenzene; loại clo của 1,2,3,4-tetrachloronaphthalene
tạo ra các đồng phân dichloronaphthalene chưa xác định (Fennell và cs., 2004). Việc bổ
sung 1,2,3,4-TCB và 2,3,4,5-tetrachloroanisole đã tăng cường quá trình loại clo của
1,2,3,4-TCDD và TCDF của VSV trong các trầm tích (Hiraishi, 2008). Các vi khuẩn
thuộc chi Dehalococcoides có thể loại khử clo của hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo

thành các hợp chất có độ độc giảm và chứa ít clo để các VSV hiếu khí phân hủy tiếp
bằng cách oxy hóa mở vịng (Bunge và Lechner, 2009).
Phân hủy sinh học hiếu khí-kị khí chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam
Nguyễn Bá Hữu trong nghiên cứu luận án tiến sỹ của mình đã sử dụng các
phương pháp nghiên cứu như Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (Điện di trên
gel građient biến tính – DGGE), Single Strand Conformation Polymorphism (Đa
hình cấu hình sợi đơn – SSCP) để nghiên cứu cấu trúc tập đồn VSV, tập đồn vi
khuẩn hiếu khí, vi khuẩn kị khí tùy tiện và nhóm Dehalococcoides trong các mẫu
bùn hồ, mẫu đất và trầm tích ở một số lơ xử lý tại sân bay Đà Nẵng (Hữu và cs.,
2006; 2007). Một số dòng vi khuẩn ở bùn hồ thuộc các lớp α-proteobacteria,
Chlorobi, Chloroflexi, Sulfuricurvum, Fusobacteria, Nitrospiraceae, vi khuẩn chưa
xác định và vi khuẩn Dehalococcoides bước đầu đã được phát hiện sự có mặt trong
lơ xử lý 10 m3 ở Đà Nẵng. Số lượng VSV ban đầu trong các công thức xử lý kị khí
rất thấp (từ 1 tế bào đến 5,1x102 MPN/g ) và đạt từ 2,95x102 đến 3,02x107 sau 6
tháng xử lý mặc dù tổng độ độc ban đầu rất cao 43.000 ng TEQ/kg. Bên cạnh đó,
biến động về tập đoàn vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn sử dụng chất diệt cỏ/dioxin làm
nguồn cacbon và năng lượng duy nhất và cơ chế đồng trao đổi chất cũng được thực
hiện trong báo cáo (Hà và cs., 2010). Nếu tính tốc độ khử độc trung bình trên ngày


12

thì ở các cơng thức xử lý hiếu khí lên tới 100 ng TEQ/kg/ngày và 50 ng
TEQ/kg/ngày ở các công thức xử lý kị khí.
Nguyễn Thị Tâm Thư cũng đã thực hiện đề tài nghiên cứu sinh của mình và đã
phát hiện được cả 3 nhóm vi khuẩn hơ hấp loại khử clo bao gồm loại khử clo bắt buộc
(Dehalococcoides, Dehalogenimonas), loại khử clo không bắt buộc (Desulfovibrio,
Desulfitobacterium, Desulfuromonas) và loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas,
Shewanella, Clostridium) và đa dạng vi khuẩn khử sulfate (VK KSF) trong các lô xử lý
bằng phương pháp DGGE với mẫu từ các lơ xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hịa (Thư, 2013).

1.2. Đa dạng VSV và gene chức năng trong đất ô nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin
1.2.1. Đa dạng VSV hiếu khí nuôi cấy được trong đất ơ nhiễm
Tập đồn VSV hiếu khí có khả năng phân hủy chất độc khá phong phú trong
các loại hình đất ơ nhiễm POPs và các chất tương tự gồm nấm sợi, vi khuẩn và xạ
khuẩn đã được ghi nhận ở Việt Nam (Hà và cs, 2005).
Hong và cộng sự đã chứng minh chủng vi khuẩn Pseudomonas veronii PH03 có thể phân hủy được một số đồng loại dioxin và furan: dibenzo-p-dioxin (DD);
dibenzofuran (DBF); 1-MCDD và 2-CDD (Hong và cs., 2004). Chủng
Hydrocarboniphaga effusa strain AP103 phân lập từ đất nhiễm dầu máy ở New
Jersey. Một số vi khuẩn thuộc chi Microbacterium đã được công bố về sự có mặt
trong mẫu đất ơ nhiễm dioxin tại Nhật Bản (Hiraishi, 2003) và đất nhiễm chất diệt
cỏ dioxin tại sân bay quân sự Đà Nẵng (Hữu, 2007).
Hiện nay, công bố về khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD bởi các chủng VSV
thuần khiết trên thế giới có rất ít. Các nghiên cứu tập trung chủ yếu vào khả năng
phân hủy các đồng phân ít độc của dioxin bởi các chủng nấm có khả năng sinh
enzyme ngoại bào như Acremonium sp. 622, Cordyceps sinensis A, Phanerochaete
chrysosporium IFO31249, Phanerochaete sordida YK-624 v.v. (Nakamiya và cs.,
2002; Ishii và cs., 2004) và một số chủng vi khuẩn thuộc các chi Rhodococcus,
Beijerinckia, Pseudomonas, Bacillus, Sphingomonas, Terrabacter, Burkholderia,
Klebsiella, Alcaligenes, Erwinia, Nocardioides, Ralstonia, Novosphingobium,