Luận văn thạc sĩ nghiên cứu giám định một số loài giổi ăn hạt (michelia spp ) ở việt nam bằng chỉ thị hình thái

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

TRẦN THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ LOÀI GIỔI ĂN HẠT
(Micheliaspp.) Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ HÌNH THÁI
VÀ PHÂN TỬ

CHUN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
M SỐ

42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS. TS VŨ QUANG NAM
2. PGS. TS BÙI VĂN THẮNG

Hà Nội – 2018


i

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi, dưới sự hướng
dẫn khoa học của giảng viên PGS.TS Vũ Quang Nam và PGS.TS Bùi Văn
Thắng – Viện Công nghệ sinh học trường Đại học Lâm nghiệp. Các nội dung

nghiên cứu, kết quả nêu trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài
liệu của các tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.
Nếu nội dung nghiên cứu của tơi trùng lặp với bất kì cơng trình nghiên
cứu nào khác đã được cơng bố, tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm và tuân thủ
kết luận đánh giá luận văn của hội đồng khoa học.
N i g y 6 th g
Người cam đoan

Trần Thị Thu Hiền

8


ii

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Lâm
nghiệp, bản thân tôi đã l nh hội được rất nhiều kiến thức qu báu và nhận
được sự quan tâm, giúp đ từ phía nhà trường, gia đình và bạn b đồng
nghiệp. Tơi xin gửi lời cảm n chân thành nhất đến toàn th qu Thầy Cơ giáo
trong, ngồi nhà trường, đến gia đình, bạn b và đồng nghiệp đã ủng hộ, giúp đ ,
tạo điều kiện về vật chất, tinh thần cho tôi trong suốt thời gian vừa qua.
Luận văn tốt nghiệp này được sự hỗ trợ về mọi phư ng diện từ đề tài
nghiên cứu khoa học c bản, được sự tài trợ của Quỹ Phát tri n khoa học và
công nghệ Quốc gia (NAFOSTED), giai đoạn 2017 – 2020, Mã số: 106.03–
2017.16 do PGS.TS Vũ Quang Nam làm Chủ trì với tên “Nghiên cứu giám
định các loài Giổi
hạt ở Việt Nam (Michelia spp.) bằ g phươ g ph p hì h

thái, phân tử v si h th i”. Tôi xin chân thành cảm n sự giúp đ qu báu đó!
Tơi xin bày tỏ lòng biết n sâu sắc tới các giáo viên hướng dẫn:
PGS.TS Vũ Quang Nam và PGS.TS Bùi Văn Thắng – Viện Công nghệ sinh
học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo
mọi điều kiện thuận lợi giúp đ tơi từ khi hình thành tưởng, trong q trình
thực hiện và hồn thành đề tài nghiên cứu khoa học này. Đặc biệt, tôi xin cảm
n các cô giáo Th.S Nguyễn Thị Hải Hà và cô giáo Th.S Nguyễn Thị Th của
Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp đã trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện thí
nghiệm phân tử, phân tích số liệu đ bản luận văn được hồn thành.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng trong đề tài nghiên cứu khoa học
của tôi chắc h n khơng tránh khỏi nh ng thiếu sót. Kính mong nhận được sự
đóng góp kiến của qu Thầy Cơ giáo, bạn b đồng nghiệp đ đề tài nghiên
cứu khoa học của tơi được hồn thiện h n.
Tơi xin trân trọng cảm n!
N i g y 6 th g
Học vi n

Trần Thị Thu Hiền

8


iii

MỤC LỤC
Trang
TRANG PHỤ BÌA
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. ii
MỤC LỤC ....................................................................................................... iii

DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................. vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................. vii
Đ T VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chƣơng 1 TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU.................................................... 4
1.1. Khái quát về đối tượng nghiên cứu ............................................................ 4
Ng
h

h Ng

(Magnoliaceae) .................................................................. 4
(Magnolioideae)……………………………………5

1.1.3. Chi iổi (Michelia L.)............................................................................. 6
4 Lo i iổi

hạt (Michelia spp.)............................................................. 7

1.2. Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode).......................................... 12
iới thiệu về DNA ã vạ h .................................................................. 12
C

đặ điể

ơ bả

ủ trì h tự DNA ã vạ h……………………..14

3 M t số o us đượ sử dụ g tro g phươ g ph p DNA ã vạ h ở thự vật .. 16

1.3. Một số DNA mã vạch được sử dụng trong nghiên cứu ở thực vật. ......... 19
1.4. Một số thành tựu nghiên cứu về DNA mã vạch ở thực vật ..................... 24
1.5. Một số nghiên cứu về các loài Giổi ăn hạt............................................... 25
5

M t số ghiê

ứu ở go i ướ ……………………………………...25

5

M t số ghiê

ứu tại Việt N

............................................................ 26


iv

Chƣơng 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................ 30
2.1. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 30
2.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 30
2.3. Hóa chất và các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .................................. 31
ó

2.3

hất ................................................................................................ 31

2.3.2. Các thiết bị sử dụ g tro g ghiê

ứu .................................................. 32

2.4. Phư ng pháp nghiên cứu .......................................................................... 33
2.4

hươ g ph p ghiê

ứu hì h th i v vị trí ph

2.4

hươ g ph p ghiê

ứu ph

oại ......................... 33

tử ......................................................... 34

Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 39
3.1. Kết quả nghiên cứu giám định các loài Giổi ăn hạt ................................. 39
3.1.1. Về ph

oại v hệ thố g h

thự vật hi iổi. ………………………39

3.1.2. Đặ trư g ơ bả về hì h th i ủ

3.1.3. Đặ điể hì h th i ơ bả

ủ

o i tro g hi iổi..………… 42
o i iổi

hạt……………………42

3.1.4. Khóa tra phân loại cho m t số loài Giổi ở Việt Nam ........................... 52
3.2. Kết quả nghiên cứu giám định các loài Giổi ăn hạt bằng chỉ thị phân tử 53
3.2.1. Kết quả x
3.2.2. X

đị h đoạ DNA ã vạ h ủ

đị h v ph

3.2.3 X y dự g

o i iổi

hạt

53

tí h trì h tự u eotide ủ đoạ DNA ã vạ h ..... 58

y ph t si h hủ g oại ....................................................... 67

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................... 71
1. Kết luận ....................................................................................................... 71
2. Kiến nghị ..................................................................................................... 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO


v

DANH MỤC BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết đầy đủ

Từ viết tắt
Bp

base pair

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

ITS

Internal Transcribed Spacer

kb

kilobase

NCBI

National Centre for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

PVP

Polyvinyl pyrrolidone

rDNA

ribosome deoxyribonucleic acid

RNA

Ribonucleic acid

Rnase

Ribonuclease

RUBISCO.

Rubilose – 1,5 – bisphosphate cacboxylase/oxygenase

SDS

Sodium dodecyl sulphate

TAE

Tris – Acetic acid – EDTA

TE

Tris – Ethylenediaminetetraacetic acid

UV

Ultra Violet

v/p

vòng/phút

VNTR

Variable number tandem repeat

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphisms

LSC

Large single – copy region

SSC

Small single – copy region


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG
T n bảng

TT

Trang

1.1 Phân bố một số loài thuộc chi Giổi ở Việt Nam

9

2.1 Các mẫu Giổi ăn hạt ở Việt Nam trong nghiên cứu

30

2.2 Thành phần đệm tách A

31

2.3 Thành phần đệm tách B

32

2.4 Thành phần đệm TE (TE Buffer)

32

2.5 Trình tự và thơng tin về các cặp mồi trong nghiên cứu

36

2.6 Thành phần một phản ứng PCR

36

2.7 Chu kỳ phản ứng PCR

37

3.1 Kết quả đo hàm lượng và độ sạch các mẫu DNA tổng số

54

Trình tự nucleotide của gen atpB – rbcL phân lập từ các mẫu Giổi
ăn hạt

59

Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen atpB – rbcL của các
3.3 mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen atpB – rbcL của lồi
Michelia alba với mã số trên Genbank là AB623323.1

61

Trình tự nucleotide của gen trnH – psbA phân lập từ các mẫu Giổi
ăn hạt

62

Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnH – psbA của các
3.5 mẫu Giổi ăn hạt nghiên cứu với trình tự nucoleotide gen trnH –
psbA của lồi Magnolia insignis (KY921716.1)

63

3.2

3.4

Kết quả so sánh trình tự nucleotide đoạn gen trnL intron của các
mẫu Giổi ăn hạt với trình tự nucoleotide gen trnL intron của các lồi
3.6
Michelia champaca (AY009041.1), Michelia baillonii

64

(AY009042.1), Magnolia laevifolia (MF583748.1)
3.7

So sánh trình tự nucleotide của gen trnL – trnF của các mẫu Giổi ăn
hạt nghiên cứu

66


vii

DANH MỤC CÁC HÌNH
TT
1.1
3.1A

3.1B

Tên hình
Cây Giổi xanh trong rừng tự nhiên ở Kon Hà Nừng Gia Lai
Một phần cây Phylogeny hình thái th hiện mối quan hệ phát sinh
của các loài Michelia
Một phần cây Phylogeny phân tử (ndhF sequences) th hiện
mối quan hệ phát sinh của các loài Michelia

Trang
10

41

41

3.2

Cành mang hoa của loài Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis)

42

3.3

Một số đặc trưng hình thái ở chi Michelia L.

43

3.4A

3.4B

Hình thái lá và lá non trong chồi búp ở các loài thuộc chi
Michelia L.
Một số đặc trưng hình thái của vết sẹo ở các loài thuộc chi
Michelia L.

44

44

3.5

Giản đồ về sự phát sinh chồi cành syllepsis và prolepsis

45

3.6

Hình thái c quan sinh sản ở các lồi thuộc chi Michelia

46

3.7

Hình thái lồi Giổi ăn hạt (Michelia tonkinensis A.Chev)

49

3.8

3.9

3.10

3.11

3.12

Đặc đi m hình thái của bộ nhụy hoa và quả của một số loài
Giổi ăn hạt
DNA tổng số của mẫu Giổi ăn hạt tách chiết được điện di trên

gel agarose 1%
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen atpB – rbcL được điện di trên
gel agarose 1%
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnH – psb A được điện di trên
gel agarose 1%
Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL intron được điện di trên
gel agarose 1%

53

54

55

56

57


viii

3.13

3.14

3.15

3.16

3.17

Sản phẩm PCR nhân đoạn gen trnL – trn F được điện di trên
gel agarose 1%
Cây phân loại dựa trên đoạn gen atpB – rbcL xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)
Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnH – psbA xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)
Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnL intron xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)
Cây phân loại dựa trên đoạn gen trnL – trnF xây dựng bằng
MEGA (phư ng pháp Neighbor – joining)

58

67

68

69

39


1

Đ T VẤN ĐỀ
1. Lí do chọn đề tài
Đất nước Việt Nam nổi tiếng với rất nhiều hệ sinh thái cùng môi trường
sống đa dạng, được thiên nhiên ưu đãi bởi có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm gió
mùa, đất đai màu m , là n i có điều kiện tự nhiên và khí hậu rất thích hợp cho

nhiều lồi cây cối phát tri n. Một quốc gia có hệ thực vật vô cùng phong phú
và mang lại nhiều giá trị kinh tế cao, trong đó có lồi Giổi ăn hạt, một trong
nh ng loài cây mang nhiều giá trị không chỉ trong nghiên cứu khoa học mà cả
trong thực tiễn đời sống.
Loài Giổi ăn hạt đã được đề cập đến trong một số tài liệu về phân loại
thực vật, về cây thuốc, về cây lâm đặc sản,... Trong các tài liệu đó, chúng
được nhắc đến là lồi có phân bố ở các khu vực miền núi phía Bắc như các
tỉnh: Hịa Bình, Phú Thọ, V nh Phúc, Tun Quang, Hà T nh và một số tỉnh
khác ở Việt Nam. Loài Giổi ăn hạt cũng là một trong nh ng loài cây được
một số c quan tổ chức đã và đang nghiên cứu phát tri n bảo tồn như: Vườn
quốc gia Bến En (Thanh Hóa), Vườn quốc gia Xuân S n (Phú Thọ), Vườn
quốc gia Tam Đảo (V nh Phúc) hay Sở Khoa học và Cơng nghệ tỉnh Hịa
Bình, v.v… Từ nh ng nghiên cứu trên, cộng thêm các thông tin từ các tài liệu
liên quan đã chỉ ra rằng Giổi ăn hạt là lồi có giá trị, có th dùng làm thuốc và
gia vị, đã và đang được nghiên cứu, phát tri n. Tuy nhiên, nh ng nghiên cứu
hay sự phát tri n nguồn gen về loài Giổi vẫn dừng lại ở quy mô hẹp, chưa đưa
ra được nh ng khuyến cáo hoặc c sở khoa học cần thiết cho việc bảo tồn và
phát tri n nguồn gen quý của lồi này trên quy mơ rộng. H n thế n a, hầu hết
nguồn hạt Giổi hiện nay xuất phát từ một số hộ gia đình ở một số địa phư ng,
mang tính tự phát, nhỏ lẻ hoặc đến từ sự thu gom lẻ tẻ của một số bà con vùng
núi cao; trong khi đó nhu cầu về hạt Giổi ngày càng lớn.
Trong hầu hết các tài liệu chính thống hoặc khơng chính thống về thực


2

vật hay trong báo cáo của các nghiên cứu về lồi Giổi ăn hạt thì tên khoa học
và vị trí phân loại của chúng vẫn là vấn đề cần phải bàn luận và tiếp tục cần
nghiên cứu. Một câu hỏi đặt ra cần giải quyết là: Ở Việt Nam có bao nhiêu
lồi Giổi mà hạt có th ăn được và làm gia vị được? Tên khoa học chính xác

của chúng ra sao? Vị trí của chúng trong hệ thống phân loại như thế nào? Đáp
án của các câu hỏi đó sẽ là tiền đề rất quan trọng cho khoa học và thực tiễn,
đ từ đó có th đưa ra được nh ng đề xuất hay khuyến nghị cho việc bảo tồn
và phát tri n nguồn gen của loài cây Giổi ăn hạt có giá trị này ở Việt Nam.
Ngày nay, cùng với sự phát tri n vượt bậc của công nghệ sinh học, sự
ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử đã giúp ích rất nhiều trong quá trình
đánh giá mối quan hệ di truyền gi a các cá th , quần th hay các xuất xứ phân
loại một cách nhanh chóng, đặc biệt trong việc giám định các lồi mà dựa trên
nh ng đặc đi m hình thái còn chưa chắc chắn hoặc chưa rõ, nhất là trong
trường hợp các mẫu vật thu được chỉ có cành lá mà khơng có hoa, quả, hạt.
Xuất phát từ lý luận và thực tiễn nói trên, tơi thực hiện đề tài: “Nghiên
cứu giám định một số loài Giổi ăn hạt (Michelia spp.) ở Việt Nam bằng chỉ
thị hình thái và phân tử”. Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp nh ng c sở d
liệu, chính xác về chỉ thị hình thái và phân tử, từ đó góp phần quan trọng
trong việc bảo tồn và phát tri n loài/các loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu
 Mục tiêu tổng quát
Nghiên cứu giám định được một số loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam dựa
trên chỉ thị hình thái và phân tử đ làm c sở khoa học cho việc bảo tồn và
phát tri n các loài cây này ở Việt Nam.
 Mục tiêu cụ thể
- Xác định được nh ng đặc đi m c bản về hình thái và vị trí phân loại
của một số lồi Giổi ăn hạt ở Việt Nam.


3

- Xác định một số chỉ thị DNA mã vạch (DNA barcoding) của số loài
Giổi ăn hạt ở Việt Nam.
- Xây dựng cây phát sinh hình thái và cây phân loại dựa trên nh ng

đoạn gen phân lập từ các mẫu thu thập của loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.
3. Đối tƣợng và phạm vi nghi n cứu
3.1. Đối tƣợng nghi n cứu
Nghiên cứu một số loài Giổi ăn hạt (Michelia spp.) ở Việt Nam
3.2. Phạm vi nghi n cứu
- Phạm vi nội dung
Đề tài tập trung nghiên cứu: Các đặc đi m hình thái, lập matrix, giải
trình tự một số vùng gen phân lập được, xác định một số chỉ thị DNA mã
vạch và xây dựng cây phát sinh chủng loại của một số loài Giổi ăn hạt ở Việt
Nam.
- Phạm vi thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 4 đến tháng 10 năm 2018
- Phạm vi không gian
- Đề tài nghiên cứu các mẫu Giổi ăn hạt thu thập tại một số khu vực ở
Việt Nam như: Hà Nội, Hịa Bình, Thanh Hóa, S n La, Điện Biên và Gia Lai.
- Đề tài được tiến hành thực hiện tại Viện CNSH Lâm nghiệp (Trường
Đại học Lâm nghiệp).
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Kết quả nghiên cứu sẽ là tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong l nh
vực hóa phân tích các hợp chất tự nhiên, trong l nh vực Lâm nghiệp và quan
trọng là cung cấp nh ng c sở d liệu, chính xác về tên khoa học của các lồi
Giổi ăn hạt ở Việt Nam, góp phần quan trọng trong việc đưa ra nh ng khuyến
nghị về việc bảo tồn và phát tri n loài/các loài Giổi ăn hạt ở Việt Nam.


4

Chƣơng 1
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
1.1. Khái quát về đối tƣợng nghi n cứu

. . .

Ng c an (Magnoliaceae)
- Họ Ngọc lan (danh pháp khoa học: Magnoliaceae) là một họ thực vật

có hoa thuộc bộ Mộc lan (Magnoliales). Họ này bao gồm 2 phân họ đó là:
Phân họ Magnolioideae có chi Ngọc lan (Magnolia ) được biết đến nhiều nhất
và phân họ Liriodendroidae, một phân họ đ n ngành, có chi Liriodendron
(cây tulip cây hoàng dư ng hoặc cây áo cộc) [3
- Họ Ngọc lan là một họ cổ, các hóa thạch thực vật được xác định thuộc
về họ này có niên đại từ 80 đến 95 triệu năm. Các đặc đi m nguyên thủy của
họ Ngọc lan là các hoa lớn, hình dáng tựa như đài hoa và thiếu các đặc đi m
của cánh hoa hay đài hoa thực thụ. Các bộ phận lớn không chuyên biệt của
hoa, tư ng tự như cánh hoa, được gọi trong tiếng Anh là tepal. Khơng giống
như phần lớn thực vật hạt kín mà các bộ phận có hoa của chúng sắp xếp thành
vịng, các lồi trong họ Ngọc lan có nhị và nhụy hoa sắp xếp thành hình xoắn
ốc trên đế hoa hình nón. Sự phân bổ như thế cũng được tìm thấy trong các
thực vật cổ hóa thạch và người ta tin rằng nó là c sở hay ngun thủy cho
các lồi thực vật hạt kín. Hoa của chúng cũng khơng có sự phân biệt rõ ràng
gi a lá đài và cánh hoa như hầu hết các lồi thực vật có hoa tiến hóa muộn
h n; bộ phận "hai mục đích" này xuất hiện ở cả hai vị trí được biết đến như là
một phần của bao hoa. Họ Ngọc lan được cơng nhận có khoảng 225 lồi trong
7 chi, mặc dù một số hệ thống phân loại đưa toàn bộ phân họ Magnoioideae
vào trong chi Magnolia. Sự phân bố của các lồi thuộc họ này phổ biến ở miền
đơng Bắc Mỹ, Mexico, Trung Mỹ, Tây Ấn, khu vực nhiệt đới Nam Mỹ, đông và
nam Ấn Độ, Sri Lanka, Đông Dư ng, Malaysia, Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật
Bản. Họ Ngọc lan phần lớn có hoa lư ng tính (ngoại trừ Kmeria và một số


5

loài Magnolia đoạn Gynopodium) trên đế hoa đối xứng. Cụm hoa đ n độc, hoa
sặc s với các lá đài và cánh hoa khơng th phân biệt, có mùi th m. Các lá đài
này nằm trong khoảng từ 6 tới nhiều nhị hoa với các chỉ nhị ngắn, phân dị
k m từ bao phấn. Lá noãn thường là nhiều, phân biệt nằm trên đế hoa thn
dài. Hình dạng lá đ n mọc so le, đôi khi xẻ thùy. Quả là dạng quả hợp từ
các quả đại thông thường bị p gần khi chúng chín và mở dọc theo bề mặt xa
trục. Hạt có vỏ dày cùi thịt màu đỏ, hay da cam (trừ Liriodendron). Hoa của
Magnoliaceae thụ phấn nhờ bọ cánh cứng, ngoại trừ Liriodendron nhờ ong.
Các lá noãn của hoa chi Ngọc lan rất dày đ tránh tổn thư ng do bọ cánh
cứng khi chúng đậu, bò và kiếm ăn trên đó. Hạt thường phát tán nhờ chim
trong khi hạt của chi Liriodendron phát tán nhờ gió. Do xuất hiện sớm nên sự
phân bố địa l của họ Ngọc lan trở thành rời rạc hay phân mảng do kết quả
của các sự kiện địa chất lớn như các thời kỳ băng hà, trôi dạt lục địa và kiến
tạo s n. Ki u phân bố này đã cô lập một số loài trong khi gi cho một số loài
chỉ ở gần nhau. Các lồi cịn sinh tồn của họ này phân bố rộng khắp trong
vùng ôn đới và nhiệt đới châu Á, từ Himalaya tới Nhật Bản và đông nam qua
Malaysia tới New Guinea. Châu Á là n i có khoảng 2 3 số lồi trong họ Ngọc
lan phần cịn lại trải rộng khắp châu Mỹ với các lồi ơn đới phân bố từ miền
nam Hoa Kỳ và các loài nhiệt đới trải rộng từ Brasil tới Tây Ấn [8].
. . . hân h Ng c lan (Magnolioideae)
Phân họ Ngọc lan được phân loại theo hai tông [23].
* Tông Magnolieae
- Kmeria: có 5 lồi (có th gộp trong chi Magnolia theo ngh a rộng)
- Magnolia: có 128 lồi (theo ngh a hẹp). Nếu coi là chi theo ngh a
rộng sẽ chứa 218 lồi.
- Manglietia: có 29 lồi (có th gộp trong chi Magnolia ngh a rộng).
- Pachylarnax: có 2 lồi (có th gộp trong chi Magnolia ngh a rộng).

6

* Tơng Michelieae
- Elmerrillia: có 4 lồi (có th gộp trong chi Magnolia ngh a rộng).
- Michelia (gồm cả Paramichelia, Tsoongiodendron): có 49 lồi (có th
gộp trong chi Magnolia ngh a rộng) [3 .
1.1.3. hi Giổi (Michelia)
Chi Giổi (Michelia L.) thuộc họ Mộc lan (Magnoliaceae), Chi này có
khoảng 50 lồi cây thân gỗ và cây bụi thường xanh, có nguồn gốc ở miền
nhiệt đới và cận nhiệt đới của Nam Á và Đông Nam Á (miền Ấn Độ – Mã
Lai). Hình dạng, lá của chi Giổi tư ng tự chi Mộc lan (Magnolia), nhưng hoa
của chi Giổi mọc thành cụm gi a các nách lá, h n là mọc đ n ở đầu cành như
chi Mộc lan. Tên khoa học của chi này được đặt theo tên của một nhà thực vật
học người Firenze, Italy là Pietro Antonio Micheli (1679 – 1737) [23].
Joannis De Loureiro, một nhà truyền giáo và nhà tự nhiên học Bồ Đào
Nha, là người đầu tiên cơng bố các lồi thuộc họ Ngọc lan ở Việt Nam. Trong
cơng trình Flora cochichinensis I (1790) ơng đã mơ tả 4 loài thuộc hai chi
Michelia và chi Liriodendron. Tiếp đó, năm 1907 trong tập 1 của bộ thực vật
chí đại cư ng Đông Dư ng (Flore Gesesneerale de L‟Indo - Chine) do
Lecomte, theo Finet A. Eva F. Gagnepain đã mơ tả họ Ngọc lan (Magnoliaceae)
với 7 chi, 15 lồi, một số lồi thu mẫu tại Việt Nam trong đó chi Michelia gồm 4 loài:
Michelia figo Spreng (mẫu thu ở Nam Định) Michelia baviensis Finet et
Gagnepain (mẫu thu ở Ba Vì), Michelia champaca (mẫu thu ở Hà Nội) và
Michelia baillonii (Pierre) Finet et Gagn (mẫu thu ở campuchia). Chevalier
bổ sung vào họ Ngọc lan ở Việt Nam 2 loài mới là Talauma gioi và Michelia
tonkinensis. Dandy đã mô tả nhiều lồi mới từ Châu Á, trong đó có 18 lồi từ
Việt Nam, đặc biệt là có 11 lồi thuộc chi Michelia là: Michelia balansae,
Michelia aenea, Michelia chapensis, Michelia tignifea, Michelia constricta,
Michelia subulife, Michelia ribundavar tonkinensis, Michelia hypolampra,

7

Michelia mediocris, Michelia fulgens và Michelia masticata.
Tiếp đó, năm 1938, 1939 theo Gagnepain mơ tả hai lồi mới là
Michelia braianensis và Manglietia blaoensis đưa tổng số loài thuộc họ Ngọc
lan cho hệ thực vật Việt Nam đến năm 1939 là 3 chi và 39 lồi, trong đó có 3
chi và 22 lồi mới được mơ tả. Đến năm 2003, trong danh lục các loài thực
vật Việt Nam [1] họ Ngọc lan được bổ sung thêm 1 chi Alcimandra và một loài
mới là Manglietia hainanensis Dandy. Như vậy, tại Việt Nam họ Magnoliaceae
có 9 chi, 46 lồi, với chi Giổi có 18 loài và một thứ [7].
. .4. oài Giổi ăn hạt (Michelia spp.)
4

Vị trí ph

oại o i iổi

hạt

Theo danh pháp thực vật từ nh ng năm 1753, năm đầu tiên xuất hiện
cơng trình Species Plantarum của Carl Linnaeus. Sau đó các quy tắc về danh
pháp được kh ng định qua các hội nghị quốc tế về thực vật học trên thế giới,
bắt đầu từ hội nghị Paris (1867) trở đi cho tới ngày nay.
Loài Giổi ăn hạt(Michelia spp.) trong phân loại học thực vật loài này
thuộc chi Giổi (Michelia L.), thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), cụ th có vị
trí trong hệ thống phân loại như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)

Phân lớp Ngọc lan (Magnoliidae)
Bộ Ngọc lan (Magnoliales)
Họ Ngọc lan (Magnoliaceae)
Chi Giổi (Michelia L.)
Loài Giổi ăn hạt (Michelia spp.)


8

1.1.4.2. Sự ph

bố ủ

o i iổi

hạt

* Trên thế giới
Trên thế giới Giổi ăn hạt là lồi được mơ tả lần đầu bởi nhà thực vật
học người Pháp Auguste Jean Baptiste Chevalier từ mẫu chuẩn thu được từ
tỉnh Tuyên Quang của Việt Nam tháng 5 năm 1918 và đến tháng 10 cùng năm
đó được cơng bố trên tạp chí Bulletin Economique (de l'Indochine). Loài Giổi
ăn hạt thuộc họ Ngọc lan (Magnoliaceae), có khoảng 300 lồi phân bố chủ
yếu ở nhiệt đới và á nhiệt đới Bắc bán cầu, thường tập trung ở Đông Nam Á
và Đông Nam Mỹ. Giổi ăn hạt được phân bố chủ yếu ở các ki u rừng á nhiệt
đới thường xanh độ cao trên 700 – 1500 m. Lồi Giổi ăn hạt thuộc chi
Giổi(Michelia L.) có nguồn gốc ở miền nhiệt đới và cận nhiệt đới của Nam Á
và Đông Nam Á, bao gồm cả miền nam Trung Quốc [23].
* Ở Việt N
Ở Việt Nam chi Giổi có khoảng 21 lồi [15], các lồi Giổi ăn hạt (Hình

1.1) được ghi nhận là cây bản địa của nước ta, phân bố rộng khắp từ Lào Cai
đến các tỉnh Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên [6 . Loài Giổi ăn hạt tập trung
nhiều ở các tỉnh phía Bắc như: Lào Cai, Yên Bái, Phú Thọ, Tuyên Quang,
Bắc Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà T nh, Điện Biên, Gia Lai, và Kon Tum
[22]. Giổi ăn hạt là loài cây gỗ đa tác dụng, toàn bộ thân cây, cành, lá, rễ, hoa
quả và hạt đều có giá trị, đặc biệt là hạt Giổi có mùi th m đặc trưng, có chứa
tinh dầu và là loại gia vị truyền thống, nhất là nhân dân vùng núi phía Bắc
(cùng với hạt cây Mắc kh n, giống như hạt tiêu ở các tỉnh phía Nam); hạt còn
được dùng làm thuốc ch a đau bụng, xoa bóp khi đau nhức, tê thấp; vỏ cây
dùng làm thuốc ch a sốt, ăn uống không tiêu …[14].
Theo nghiên cứu hiện nay, ở Việt Nam có nhiều lồi thuộc chi Giổi đã được
cơng nhận và trình bày cụ th trong bảng sau: (bảng 1.1).


9

Bảng 1.1. Phân bố một số loài thuộc chi Giổi ở Việt Nam [70]
STT
1
2
3

4
5
6
7
8

9
10

11
12

13

T n khoa học

T n địa phƣơng

Tình hình phân bố
Yên Bái, Hà Giang, Tuyên
Michelia balansae
Quang, Phú Thọ, V nh
Giổi lơng, Giổi bà
(A.DC) Dandy
Phúc, Hà Nội, Thanh Hố
Nghệ An, Quảng Bình...
Michelia braianensis
Giổi nhung
Gia Lai, Đắk Nơng,
Gagnep.
Lâm Đồng…
Michelia citrata (Noot. Giổi chanh, Giổi Hà Giang, Gia Lai,
& Chalermglin) Q. N. xanh quả to
Lâm Đồng...
Vu & N. H Xia
Michelia foribunda
Giổi nhiều hoa
Hà Giang, Lào Cai,

Finet & Gagnep.
Lâm Đồng…
Michelia foveolata
Giổi lá láng
Hà Nội, S n La, Lào Cai,
Merril ex Dandy
Yên Bái, Hà Giang, Huế…
Michelia fulva HungT. Giổi lông hung
Hà Giang, Cao Bằng, Huế,
Chang & B. L. Chen
Đà Nẵng…
Michelia lacei
Giổi quản hoa
Lào Cai, Hà Giang…
W.W.Smith
Michelia macclurei
Giổi tàu
V nh Phúc, Quảng Ninh,
Dandy
Lâm Đồng, Gia Lai…
Lào Cai, Tuyên Quang,
Michelia martinii
Giổi martin
Quảng Bình, Cao Bằng,
S n La…
Michelia masticata
Giổi mastica Đui Tun Quang, Bắc Kạn,
Dandy
Hồ Bình, Điện Biên, Hà
Giang, Quảng Bình…

Michelia mediocris
Giổi xanh
Hà Nội, Hồ Bình,
Dandy
Hà Giang…
Michelia coriacea
Giổi lá dai
Cao Bằng, S n La,
(Hung T. Chang &
Hà Giang...
B.L. Chen)
Michelia champaca
Hoàng ngọc lan
Hà Nội, Đà Lạt…


10

1.1.4.3. i trị ki h tế kho h

v bảo tồ

ủ loài Giổi

hạt

- Giổi ăn hạt là loài cây lâm sản ngoài gỗ đặc h u của Việt Nam. Giổi
thuộc loại cây thân gỗ lớn (Hình 1.1), cây trưởng thành có th cao h n 30m,
đường kính thân cây tới h n 1m. Thân cây th ng tắp, tròn đều, phân cành cao,
gỗ có mùi th m, có giác lõi phân biệt: giác màu vàng nhạt và lõi vàng nâu,

thớ gỗ mịn, có vân đẹp, sắc n t, khơng cong vênh, ít bị mối mọt, gỗ nhẹ (th
tích 580 kg/m3 gỗ khơ) và khá bền. Chính vì thế gỗ Giổi được nhân dân ưa
chuộng dùng trong xây dựng nhà cửa (làm nhà gỗ, sàn gỗ), đóng đồ đạc nội
thất hay làm nh ng sản phẩm mỹ nghệ… [10].

Hình 1.1 Cây Giổi xanh trong rừng tự nhi n ở Kon Hà Nừng tỉnh Gia Lai
- Hiện nay, số lượng loài Giổi ăn hạt trong tự nhiên đã bị giảm sút
rất nhiều vì bị khai thác, chặt đ lấy gỗ. Do vậy cần đưa loài Giổi ăn hạt thành
một loài cây gỗ bản địa chính trong cơng tác trồng rừng ở một số vùng, đặc
biệt là vùng Trung tâm Bắc Bộ và Bắc Trường S n [6, 10].
- Gỗ Giổi qu như vậy nhưng thứ quý nhất của loài Giổi sở h u giá trị
kinh tế cao nhất lại là hạt Giổi, được mệnh danh là “vàng đen” hay “gia vị
vàng” của núi rừng Tây Bắc. Cây Giổi càng lâu năm sẽ cho càng nhiều hạt và
hạt càng th m ngon. Quả Giổi khi chín sẽ bung ra cho nh ng hạt Giổi chín đỏ
căng mọng. Hạt Giổi khi đem ph i khơ chuy n sang màu cánh gián hoặc đen


11

bóng. Hạt Giổi khơ được sử dụng chủ yếu làm gia vị tư ng tự như ta dùng hạt
tiêu (nhưng th m h n rất nhiều), hay thảo quả Sa Pa (nhưng không hắc), hay
hạt mắc khén của người Thái (nhưng ngon h n)… Người ta có th thu hạt
Giổi trực tiếp trên cây hoặc hạt rụng trên mặt đất rừng dưới tán cây mẹ. Hạt
thu về đãi sạch lớp nội nhũ bao quanh, bảo quản hạt trong điều kiện khơ. Nếu
dùng trong gia đình thường cho vào ống tre và đ n i khô ráo, khi ăn mang
hạt ra giã nát, có th trộn với muối đ chấm hoặc rắc lên thức ăn như hạt tiêu.
Hạt Giổi là một gia vị tuyệt vời trong các món ăn mang hư ng vị truyền thống
mà chỉ đến vùng núi phía Bắc ta mới được thưởng thức loại gia vị này.
- Mặt khác, hạt Giổi có chứa tinh dầu, năm 1997 theo phân tích của
Nguyễn Xn Dũng thì trong tinh dầu từ thịt quả và hạt có chứa safrol: 70,2%

(thịt quả) – 72,9% (hạt) và methyl eugenol: 24,2% (thịt quả) – 18,5% (hạt).
Tinh dầu ở thân chủ yếu chứa camphor 23,8% và ngoài vỏ thân chứa camphor
15,7%, safrol 14,3%, α – caryophyllen 15,6% và elemicin 13,7% [22].
Đánh giá về tiềm năng thị trường của loài Giổi ăn hạt, theo nghiên cứu
về cây giống Lâm nghiệp cho rằng sản lượng, giá trị và nhu cầu sử dụng hạt
Giổi ngày càng tăng lên nhanh chóng trong thời gian vừa qua bởi chúng cung
cấp nguồn dược liệu và thực phẩm gi vai trò quan trọng trong sản xuất và
đời sống thực tiễn. Qua đó một lần n a có th kh ng định giá trị kinh tế của
loài cây Giổi ăn hạt là rất cao, có th coi đây là một trong nh ng lồi cây Lâm
nghiệp có tiềm năng rất lớn vừa mang lại hiệu quả kinh tế cao vừa giúp xóa
đói giảm ngh o cho người dân khu vực miền núi phía Bắc [14].
1.2. Tổng quan về DNA mã vạch (DNA barcode)
. . . Giới thiệu về DNA mã vạch
Nghiên cứu về giới thực vật thì phư ng pháp phân loại thực vật dựa
trên nh ng đặc đi m hình thái từ lâu đã chứng minh được vai trò quan trọng
làm nền tảng cho các nghiên cứu về sinh thái, tiến hóa và đa dạng. Phân loại


12

thực vật căn cứ vào hình thái thì chủ yếu dựa vào sự khác biệt về các đặc
đi m của các c quan, bộ phận đặc biệt là c quan sinh sản của thực vật, đây
là cách thức phân loại truyền thống đã được xây dựng và phát tri n từ rất xưa
cho tới ngày nay. Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy nếu chỉ dựa trên hình thái
chưa phải là phư ng pháp tối ưu trong việc phân loại các mẫu đang trong giai
đoạn phát tri n, các mẫu có đặc đi m giống nhau do hiện tượng tiến hóa đồng
quy, hay các mẫu khơng có đủ các bộ phận [13]. Thậm chí hiện nay phư ng
pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực hiện bởi các chuyên gia về
hình thái học, việc phân loại đơi khi tốn nhiều thời gian và công sức [42].
Một phư ng pháp phân loại mới dựa trên l nh vực sinh học phân tử đã

được ra đời từ gi a nh ng năm 1990, đã khắc phục nh ng hạn chế của
phư ng pháp phân loại thực vật dựa trên hình thái được gọi với thuật ng
“DNA mã vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào nh ng năm 1993. Đó là
phư ng pháp dựa trên các d liệu thông tin về hệ gen trong và ngoài nhân
(hay DNA) hoặc sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng
nghiên cứu, người ta có th lựa chọn các gen hoặc các sản phẩm khác nhau
của hệ gen [67].
Trong phư ng pháp phân loại sinh học phân tử, các kỹ thuật thường
được ứng dụng đ nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa
gi a các lồi, xây dựng cây phát sinh chủng loại cũng như giúp nhận dạng đến
cấp phân loại chi hoặc loài. Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trên thế
giới như VNTR (số lượng thay đổi các chuỗi lặp lại liền kề), RFLP (đa hình
độ dài đoạn cắt hạn chế), DNA barcode (DNA mã vạch) [49].
Thực tiễn đã chứng minh DNA mã vạch bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ
nh ng năm 2002 nghiên cứu của Hebert và cs, kết quả của nhóm nghiên cứu
đã chỉ ra rằng các cá th từ bộ sưu tập của 200 lồi có quan hệ gần gũi với
nhau thuộc bộ cánh vảy có th xác định với độ chính xác 100% bằng cách sử


13

dụng gen ty th cytochrome c oxidase ti u đ n vị I (COI) (enzyme cuối cùng
trong đường hô hấp chuỗi vận chuy n của ty th , màng) [69, 71].
DNA mã vạch là trình tự nucleotide của một chuỗi DNA ngắn, có cùng
nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay
đổi theo q trình tiến hóa [42, 52]. Ngồi ra, việc lựa chọn một vùng trình tự
làm mã vạch cịn cần phải mang nh ng đặc đi m sau: có độ dài thích hợp
(khơng q ngắn đ có độ đa hình về trình tự gi a các taxon, khơng q dài đ
có th giải trình tự theo cách thơng thường, thậm c hí cả khi trong điều kiện
chưa được tối ưu), khơng phải vùng dị hợp đ có th nhân bản trực tiếp trình tự

mà khơng cần tách dịng và thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí
khác biệt gi a các base và khơng có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài
đoạn lặp microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [44].
Dựa vào mức độ thay đổi trong trình tự DNA đ đánh giá sự sai khác di
truyền gi a các sinh vật, tư ng tự như máy quét mã vạch trong siêu thị. Hai
mẫu vật của hai lồi có th có hình thái bên ngồi rất giống nhau, song chúng
có th được phân biệt bằng sử dụng DNA mã vạch. Do đó, DNA mã vạch có
th được sử dụng cho hai mục đích chính: nhận dạng về mặt phân tử cho các
lồi đã được mơ tả và tìm ra các lồi mới chưa được mơ tả [29].
Việc giải mã tồn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn cơng
sức và nhiều kinh phí nên khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng có th trang
bị đ thực hiện được. Thay vào đó, việc xác định một đoạn DNA đã biết, đặc
trưng cho lồi (thậm chí cá th ) đ làm căn cứ phân biệt loài này với loài
khác, cá th này với cá th khác. Đây có th là giải pháp hiệu quả trong phân
tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ của
sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh học. Vì vậy, hướng nghiên cứu DNA
mã vạch đang được phát tri n mạnh mẽ và được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều l nh vực khác nhau như: nghiên cứu về đa dạng sinh vật, giám định loài,


14

giám định mẫu vật, x t nghiệm bệnh, bản quyền sản phẩm (giống cây trồng,
vật nuôi, sản phẩm nông – lâm – thủy sản) [50].
Có th thấy, DNA mã vạch là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các
nghiên cứu về phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm,
vi sinh vật và virus [41, 43, 64 . Việc xác định loài bằng DNA mã vạch có
hiệu quả cao trong việc phân biệt các lồi sinh vật khi nh ng quan sát hình
thái, sinh trưởng và phát tri n chưa đủ c sở đ định danh hoặc phân biệt loài
[66]. Cho nên, việc sử dụng DNA mã vạch đ nhận dạng các loài trên quy mơ

tồn cầu có

ngh a rất quan trọng. Cho đến nay, sau h n 10 năm nghiên cứu

đã có trên 6000 cơng trình khoa học được cơng bố với khoảng 5 triệu trình tự
DNA mã vạch ở các lồi sinh vật. Đ chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử
dụng DNA mã vạch, cộng đồng các nhà khoa học đã rất nỗ lực trong việc tìm
kiếm được các vùng trình tự DNA mã vạch đ có th phân biệt đồng thời nhiều
loài [47, 56, 78].
. . . ác đặc điểm cơ bản của trình tự DNA mã vạch.
Mỗi đoạn DNA mã vạch có nh ng đặc trưng riêng và có khả năng phân
biệt sinh vật ở các mức độ khác nhau như: chi, họ, loài hay dưới loài. Các
đoạn DNA mã vạch có th là nh ng đoạn nằm trong hệ gen nhân (18S, 5.8S,
26S, ITS…) [26, 35, 36, 63], trong hệ gen ty th (Cytb, CO1…) [26, 29, 43],
hay trong hệ gen lục lạp (matK, rbcL, trnH – psbA...) [44, 46, 57, 69].
Tuy nhiên, chưa có đoạn DNA nào được sử dụng làm mã vạch chung
cho tất cả các lồi sinh vật, thay vào đó cần lựa chọn nh ng đoạn DNA đặc
trưng và việc phối hợp các đoạn DNA mã vạch sẽ đem lại hiệu quả cao h n
[38, 40 . Tùy vào đối tượng giám định mà các đoạn DNA mã vạch sẽ được sử
dụng một cách hợp l [33, 47].
Khi sử dụng trình tự DNA mã vạch trong nghiên cứu thì đặc đi m quan
trọng nhất của chúng là phải phổ biến, đặc hiệu trong các biến dị và dễ dàng


15

sử dụng. Điều này có ngh a là các đoạn gen được sử dụng như một mã vạch
nên thích hợp cho nhiều đ n vị phân loại, có sự biến đổi gi a các loài nhưng
ổn định và bảo thủ cao bên trong lồi hoặc biến đổi khơng đáng k . Do vậy,
DNA mã vạch l tưởng là một đoạn DNA có trình tự ngắn, bắt cặp được với

cặp mồi được thiết kế đặc hiệu đ dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR.
Một DNA mã vạch đi n hình phải đáp ứng được các u cầu sau: có tính phổ
biến cao (dễ dàng nhân bản và giải trình tự), trình tự có tính đặc hiệu cao và
có khả năng phân biệt được nhiều lồi [47].
Đối với thực vật thì quá trình tìm kiếm một chỉ thị DNA chung cho tất
cả các lồi gặp nhiều khó khăn bởi hệ gen lục lạp mang nhiều đặc đi m thích
hợp với chỉ thị DNA và hệ gen nhân, vùng DNA nằm gi a các gen hay còn
gọi là ITS thường được sử dụng làm chỉ thị DNA trong một số nghiên cứu
[31, 65, 73 . Trong nh ng năm gần đây, rất nhiều vùng gen đã được nghiên
cứu và đề xuất là chỉ thị DNA cho thực vật [34, 52, 69 . Mặc dù, chưa có chỉ
thị DNA nào được đa phần các nhà phân loại học thực vật hoàn toàn chấp
nhận [34, 61, 68]. Song cuối cùng các nhà nghiên cứu cũng đã đi tới một quan
đi m thống nhất là sẽ cần không chỉ một mà nhiều vùng DNA mã vạch đ sử
dụng định danh loài thực vật [34, 52, 69].
. .3. Một số locus được sử dụng trong phương pháp DNA mã vạch ở thực vật
1.2.3.1.Trình tự gen nhân
Trình tự DNA mã vạch được nhân bản từ đoạn DNA hệ gen của bố mẹ
dự kiến sẽ cung cấp nhiều h n thơng tin về các lồi cần xác định. Bao gồm
kết quả lai giống, cho đến khi phiên mã nội vùng đệm (ITS) của DNA
ribosome (rDNA), DNA trong nhân đã được ki m nghiệm như một mã vạch
trong định danh ở thực vật. Tuy nhiên, khó khăn trong việc khuếch đại PCR
từ gen nhân vì gen nhân chủ yếu là đ n gen hoặc có bản sao gen thấp, đặc biệt
từ sự suy thoái chất lượng DNA gennome và khả năng phân biệt dưới loài do


16

bảo tồn gen chức năng qua các giống quy mơ lớn có th hạn chế số lượng
các gen nhân được thử nghiệm trong việc xác định loài bằng phư ng pháp
DNA mã vạch [73, 77].

1.2.3.2.Vùng gen mã hóa ribosome
Gen mã hố ribosome là hệ thống đa gen mã hóa cho axit nucleic của
ribosome. Các gen DNA ribosome mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có
tính đa dạng thích hợp đ phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA
được sắp xếp như các đ n vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm vùng mã hóa
18S, 5.8S, 26S và xen gi a các trình tự khơng mã hoá ITS1 và ITS2 nằm ở hai
bên sườn của vùng 5.8S. Vùng mã hố của ba gen rDNA nói trên được bảo
tồn cao h n hai vùng ITS. Thông thường các đ n vị rDNA được lặp lại hàng
nghìn lần và hình thành một khối lớn sắp xếp tập trung trong nhiễm sắc th .
Một trong nh ng tính năng đáng chú

nhất là các đ n vị riêng lẻ của hệ

thống đa gen khơng tiến hố độc lập mà thay vào đó tất cả các đ n vị tiến hố
một cách phối hợp nhờ vậy nên rDNA đạt mức ổn định cao h n trong cùng
loài nhưng khác biệt gi a các loài. Một số nghiên cứu gần đây ở thực vật sinh
sản h u tính và sinh sản vơ tính cho thấy một số mức độ biến đổi nội bộ trong
số các bản sao của trình tự ITS1 và ITS2 do nhiều nguyên nhân như lai gần,
phân ly, tái tổ hợp, tỷ lệ đột biến cao và hình thành gen giả của các gen chức
năng dẫn đến nh ng thay đổi đó, với các locus khác trong thực vật như là mã
vạch được sử dụng đ phân định chính xác hiệu quả sinh học – thực vật trong
cùng loài với đặc đi m lịch sử đời sống khác nhau (một năm hay lâu năm,
trên cạn hoặc dưới nước…) và nguồn gốc tiến hóa khác nhau [71, 77].
1.2.3.3 Trình tự gen lục lạp
Ở các loài thực vật bậc cao, hệ gen lục lạp gồm phân tử DNA cấu trúc
vịng có kích thước 120 – 160 kb chia làm hai bản sao đ n một bản sao đ n
lớn LSC ( large single – copy region) và bản sao đ n nhỏ SSC ( small single –