ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM

Đề tài:

ĐỊNH TÍNH VIBRIO CHOLERAE
TRONG THỰC PHẨM
GVHD: PHAN THỊ KIM LIÊN
SVTH: NHÓM 9


GIỚI
THIỆU

QUY TRÌNH
PHÂN TÍCH

NỘI
DUNG


Giới thiệu về Vibrio Cholerae
- Thuộc giống Vibrio
- Phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi, có khả năng di dộng
V. cholerae gây bệnh dịch tả do vệ sinh kém, nguồn nước ơ
- Phát triển ở nhiệt độ 420C, có thể tồn tại cả ở nước mặn và
nhiễm, nhưng cũng có thể gây ngộ độc thực phẩm.
nước ngọt
Các chủng V.cholerae gây dịch chủ yếu thuộc 2 nhóm huyết
- Phát triển nhanh trong thực phẩm ở nhiệt độ thường và trong

thanh O1 và O139
thực phẩm giữ lạnh - đông lạnh nhưng ở điều kiện khô không
sống quá 48h
- Rất nhạy với nhiệt nên loại bỏ dễ dàng bằng đun nấu.


1

Giới thiệu về Vibrio Cholerae

Hình ảnh về Vibrio cholerae dưới kính hiển vi sau khi
được nhuộm màu


Cách thức sinh trưởng:

Cholerae lên men khơng sinh khí,
có khả năng làm dịch hóa gelatin
Có khả năng khử nitrat thành nitrit
và phân giải trytophan thành indol
Vibrio cholerae phát triển được ở
vùng có nồng độ muối cao 3%
Có khả năng lên men đường glucose,
sucrose,mannose, khử lysine

Cách thức
sinh trưởng
của Vibrio
cholerae

Nguyên tắc
 Phát hiện V.cholera trong thực phẩm được
thực hiện bằng cách cân một lượng mẫu xác
định và nuôi ủ trong môi trường chọn lọc.
 Những khuẩn lạc giống V.cholera sẽ được
thử nghiệm bằng các phản ứng sinh hóa.

Phạm vi áp dụng: TCVN 7905-1:2008


Mơi Trường & Hóa Chất
Mơi trườ ng và hóa chất

Mục đích

APW ( Alkaline Phosphat Water )

Tăng sinh chọn lọc

TCBS ( Thiosulphate citrate bile salt
sucrose)

Phân lập

TSA

Phục hồi

Đĩa giấy Oxidase

Khẳng định sơ bộ

Dung dịch NaCl


Mơi Trường & Hóa Chất
Mơi trườ ng và hóa chất

Mục đích

Arginine dehydrolase

Thử nghiệm sinh hóa để
khẳng định

Ornithine decacboxylase
Lysine decacboxylase
TW (Tryptone Water )
ONPG
TSI/KIA
Kowac’s

Thuốc thử Indol


Môi Trường APW
Pepton
Natri clorua (NaCl)
Nước

20,0 g
10,0 g
1 000 ml

Phục hồi sức sống các VSV bị tổn thương và nhằm
gia tăng mật độ tương đối của VSV cần phát hiện,
ức chế sự phát triển VSV ko mong muốn.


Môi Trường TCBS
Pepton
Dịch chiết nấm men
Natri xitrat
Natri thiosulfat
Sắt (III) xitrat
Natri clorua (NaCl)
Mật bị khơ
Sacaroza
Bromothymol xanh
Thạch
Nước

10,0 g
5,0 g
10,0 g
10,0 g
1,0 g
10,0 g
8,0 g

20,0 g
0,04 g
Từ 8,0 đến 18 g
1 000 ml


Môi Trường TSA
Dịch chiết thịt
Pepton
Natri clorua (NaCl)
Thạch
Nước

5,0 g
3,0 g
10,0 g
Từ 8 g đến 18 g
1 000 ml

Môi trường giàu chất dinh dưỡng được sử
dụng để phục hồi và bảo quản giống VSV


Môi Trường TSI
Pepton

20,0 g

Dịch chiết thịt

3,0 g

Dịch chiết nấm men

3,0 g

Natri clorua (NaCl)

10,0 g

Lactoza

10,0 g

Sacaroza

10,0 g

Glucoza

1,0 g

Sắt (III) xitrat

0,3 g

Đỏ phenol
Thạch
Nước

0,024 g
Từ 8 g đến 18 g a
1. 000 ml


Quy trình phân tích



Tiến hành phân tích

 Bước 1: Đồng nhất mẫu
Cân vơ trùng 25g mẫu hải sản vào túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu

Cân chính xác 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng ,

lớn thành các mảnh nhỏ rời rồi thêm 225ml nước pepton kiềm

sautrong
đó thêm
225 ml
dung
phađồng
lỗng
APW
túi, nghiền
bằng
máydịch
nghiền
thểAPW.

trong 2 phút. Ủ
0
0
ởTiến
hành
bằng
mẫu.
mẫu
hai chế
độ đồng
nhiệt lànhất
370Cmẫu
1,00C
và 42máy
C ,2dập
C trong
6 – 24h

Thời gian dập mẫu là 60s.


Tiến hành phân tích
 Bước 2: Tăng sinh
a. Đối với mẫu thơng thường
0
Ủ Tăng
các bình
bị ởchứa
nhiệtđãđộchuẩn
370Cbị1,0

C trong
– 8h. Sau
sinhchứa
lần 1:đãỦchuẩn
các bình
ở nhiệt
độ 637oC
đó, phân lập như qui định, phần cịn lại ủ tiếp 16 – 24h rồi phân lập
lại.trong 6-8h. Sau đó mang đi phân lập.
sinhmẫu
lần hàu
2: Chuyển 1 ml dịch cấy thu được trong tăng sinh
b. Tăng
Đối với
-1
-2
0
0
Ủ lần
một1.dãy
pha
loãng
10
đến
10
ở
nhiệt
độ
37
C

1,0
6 – 8h
(được lấy từ bề mặt) cho vào ống nghiệm chứa C
10trong
ml môi
và 16 – 24h.
Ủ trong
ở nhiệt
trong
Ủ trường
một dãyAPW.
pha lỗng
10-1mơi
đếntrường
10-2 ở APW
nhiệt độ
420Cđộ
,2037oC
C trong
6 – 8h.
24h.


Tiến hành phân tích
 Bước 3: Phân lập và đọc kết quả trên đĩa
- Sau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trên,
 Từ
trường
tăngcấy
sinh.

lấy cấy
1 ít ria
sinhvào
khối
khơng
lắc,mơi
dùng
khun
lấyDùng
dịch que
mẫucấy
trênvịng
bề mặt
mơi
trên mơi
trường
tăng
và cấythạch
ria lên
mặtđộ
thạch
trường
TCBS
thạch.
Ủ sinh
các APW
đĩa TCBS
ở bề
nhiệt
37 0TCBS

C 1,00C
để 18
phân
lập các khuẩn lạc đơn. Ủ 37oC trong 24h.
trong
– 24h.
Sau
khi ủ kiểm
tra trưng
các đĩa.
Trênhơi
môi
trường
- Chọn
5 khuẩn
lạc đặc
(trịn,
dẹt,
bóngthạch
vàng,TCBS
ở giữakhuẩn
đậm và
lạc V.cholera
lớn có màu vàng (dương tính saccaro), đường
có viền
mờ xungtrịn,
quanh).
kính
- cấy
ria2-3mm.

lên mơi trường khơng chọn lọc hay thạch máu, ủ qua đêm ở
Cholerae
TCBS
370C để thu sinh khốiV.
cho
các thử trên
nghiệm
hóa sinh.


Tiến hành phân tích

Bước 4:
4 Phục hồi
Đánh dấu 5 khuẩn lạc điển hình hoặc nghi ngờ từ đĩa trên mơi
trường phân lập TCBS. Nếu trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc điển
hình hoặc nghi ngờ thì lấy tất cả các khuẩn lạc đó cấy ria lên mơi
trường dinh dưỡng TSA có bổ sung 1,5% muối NaCl. Sau đó ủ ở
37oC trong 24h.
Các khuẩn lạc đã chọn cấy ria trên mơi trường TSA được đem đi
thử nghiệm sinh hóa.


Bước 5
TN sinh hóa sơ bộ

Thử
nghiệm
sinh hóa

TN sinh hóa
khẳng định

Kháng huyết
thanh
www.themegallery.com


TN sinh hóa sơ bộ
 Thử nghiệm tính chịu mặn

Tiến hành: Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA
vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng
độ NaCl là: 0; 2; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủ ở nhiệt độ
37oC trong 18 - 24 giờ.
Kết quả: V. cholerae phát triển được trong ống
canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 2% và làm
đục môi trường. Ở nồng độ muối cao hơn
V.cholera khơng phát triển nên kết quả âm tính.


TN sinh hóa sơ bộ
 Thử nghiệm khả năng di động

Tiến hành: Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn từ
môi trường TSA cấy sang ống nghiệm thạch bán
lỏng đâm thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống
môi trường. Ủ ở 37oC trong 24h .
Đọc kết quả: Dương tính: Virio Cholera mọc lan
khỏi đường cấy và làm đục môi trường xung

quanh.


TN sinh hóa sơ bộ
 TN oxidaza
Đặt giấy lọc lên một nắp
đĩa petri, nhỏ 2 -3 giọt
thuốc thử oxidaza. Dùng
que cấy vô trùng lấy các
khuẩn lạc từ môi trường
TSA ria lên vị trí đã nhỏ
thuốc thử oxidaza.
V. cholera làm vết ria có
màu tím thẫm hoặc xanh
thẫm sau 10 giây.


TN sinh hóa sơ bộ
 Nhuộm gram
V. Cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.


TN sinh hóa sơ bộ
• Các phép thử nghiệm sơ bộ.


TN sinh hóa khẳng định
 TN decacboxylaza/ dehydrolaza
Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithine,
lysine, arginine và ống đối chứng khơng có axit amin. Mỗi ống

được phủ 1 – 2 ml dầu khống vơ trùng. Ủ các ống ở nhiệt độ 370C
C trong 18 – 24h

0

→ lysine (+), arginine (-), ornithine (+), control (-)