Quy Trình Định Lượng E.Coli

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆP THỰC PHẨM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mơn : Phân tích vi sinh thực phẩm
Đề tài:

Quy Trình Định Lượng E.Coli

GVHD: Phan Thị Kim Liên
Nhóm: 4


Danh Sách Nhóm

1.
2.
3.
4.
5.

Đào Thị Mỹ Dung

2005130353

Nơng Phương Hịa

2005130400

Lê Thị Thùy Linh

2005130032

Nguyễn Thị Thảo Nguyên

2005130352

Phan Thị Yến Nhi

2005130109


Nội dung

1

2

3

4

•

Tình hình ngộ độc thực phẩm

•

Đặc điểm E. coli

•

Định lượng E. coli băng phương pháp đếm khuẩn lạc

•

Định lượng E. coli băng phương pháp MPN


1.Tình Hình Ngộ Độc
•
•
•

Một trong những loại ngộc độc thực phẩm gây ra bởi vi sinh vật thường
gặp là ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn E.coli. 
1/6/2014: Hàng trăm công nhân Cơng ty Nienhsing ở Thái Bình nhập viện
là do ăn phải những suất cơm nhiễm vi khuẩn E.coli và Coliforms. 
8/1/ 2015: 206 công nhân của công ty may Namsung Vina bị ngộ độc do
nguồn nước chế biến thức ăn chứa E. coli.


1.Tình Hình Ngộ Độc
•

Vụ ngộ độc thực phẩm khiến 107 cơng nhân Công ty TNHH star Fashion
(Chương Mỹ, Hà Nội) phải nhập viện do ăn phải thực phẩm đã bị nhiễm
vi khuẩn và độc tố E.coli..


2.Đặc điểm E. coli

•
•

E. coli là dạng trực khuẩn Gram (-) kỵ khí tùy nghi, khơng sinh bào tử,
khá phổ biến trong tự nhiên và đặc biệt trong đường tiêu hóa của người
và động vật.
Chúng thuộc loại: glucose và lactose (+); indol và MR (+); VP và Citrate
(-).


2.Đặc điểm E. coli


Định lượng E. coli băng phương pháp đếm
khuẩn lạc


Định Nghĩa Và Nguyên Tắc

•

Phương pháp này được tham chiếu theo ISO 16649-2:2001 được áp
dụng cho tất cả các loại thực phẩm.

Nguyên tắc:
Cấy một lượng mẫu xác định trên môi trường rắn chọn lọc thích hợp
( thạch TBX).


Định Nghĩa Và Nguyên Tắc

Nguyên tắc:
Đếm các khuẩn lạc E. coli điển hình trên mơi trường TBX.
Kết quả biểu thị bằng số E. coli trên 1g mẫu chưa pha loãng.


Dụng Cụ, Thiết Bị, Mơi Trường Và Hóa Chất
Mơi trường và hóa chất

Mục đích

Saline Pepton Water (SPW)

Pha lỗng mẫu

TBX

Ni cấy E. coli

HCL 10%
Chỉnh pH
NAOH 10%


Mơi trường SPW

• Sodium Chloride 8.50 g/l
• Casein Peptone 1.00 g/l
• pH cuối cùng 7.0 ± 0.2 at 25ºC
 Casein Peptone đảm bảo sự hồi sức của vi sinh vật.

 Sodium Chloride cung cấp môi trường đẳng trương.


Mơi trường: Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX)

Mục đích sử dụng:
• TBX Agar là một môi trường chọn lọc cho việc đếm số Escherichia coli -D•

glucuronidase dương trong các sản phẩm thực phẩm.

Kết quả thu được trực tiếp bằng cách đếm khuẩn lạc đặc trưng chỉ sau 24 giờ ủ
và khơng có bước khẳng định.


Môi trường: Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX)

Thành phần:
 Sản phầm thủy phân casein bằng enzym
 Muối mật No.3
 Axit 5-bromo-4-clo-3-indolyl-β-D-glucuronid (BCIG)
 Dimetyl sulfoxit (DMSO)
 Thạch
 Nước
 pH: 7,2


Mơi trường: Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX)

Ngun tắc:
• Muối mật ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn Gram dương và ủng hộ sự

•

phục hồi của Escherichia coli.

Escherichia coli có một -D-glucuronidase sẽ tách BCIG, hình thành các
khuẩn lạc màu xanh theo cơ chế phản ứng sau đây:


Môi trường: Tryptone-bile-glucuronic medium (TBX)

-glucuronidase
+glucuronate

Oxydative dimerization

Blue precipitate of dichloro-dibromo indigo


Dụng Cụ Thiết Bị



Thiết bị khử trùng khô khử trùng ướt (



Tủ ấm



Tủ sấy hoặc buồng sấy thơng gió



Tủ lạnh



Màng vô trùng



Bộ kẹp đầu tù



Máy đo pH



Pipet



….


Quy trình phân tích
10g/25g đối với mẫu rắn hoặc 10ml/25ml đối với mẫu lỏng + 90/225ml SPW

Đồng nhất mẫu bằng Stomacher

Dịch mẫu 10-1

-2
Dịch mẫu 10

TBX

02 đĩa

02 đĩa
TBX đã đun chảy và làm nguội
0
đến 47 C


Xoay nhẹ trộn đều mẫu , ở nhiệt độ phòng, chờ hỗn hợp đông đặc, lật ngược
0
đĩa và ủ ở tủ ấm 37 C trong 24 giờ.

Đọc kết quả
Chọn các đĩa <= 150 khuẩn lạc ở 2 độ pha loãng liên tiếp

Tính và biểu thị kết quả


Các Bước Tiến Hành
Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu

Pha loãng mẫu

Cấy và ủ mẫu

Đếm và chọn lọc các khuẩn lạc để khẳng định


Các Bước Tiến Hành
Cân mẫu chính xác 10g/25g với mẫu rắn, mẫu lỏng thì đong
10ml/25ml và cho vào túi nhựa vơ trùng

Cho dung dịch pha lỗng SPW 90ml/225ml vơ trùng vào túi nhựa
chứa mẫu
Bước 1
Tiến hành đồng nhất mẫu và dịch pha loãng, lắc đều trong 2-3 phút

Thực hiện các thao tác ở nhiệt độ phòng, và giữ ổn định

Lắc huyền phù và các dịch pha loãng bằng máy vortex để tránh phần
tử có VSV lắng xuống


Sử dụng pipet hút 10ml huyền phù ban đầu cho vào ống nghiệm chứa 9ml dịch pha loãng
SPW

Bước 2
Pha loãng mẫu
-2
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5-10 giây, để thu được dịch pha loãng 10 . Tiếp tục lặp lại
sẽ được các nồng độ tiếp theo tới khi thu được lượng vi khuẩn thích hợp

Chuyển 1ml mẫu thử vào đĩa petri, sử dụng 2 nồng độ pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2
đĩa petri

Bước 3
Cấy và ủ mẫu

 
Cho vào đĩa 15ml môi trường TBX. Lật úp đĩa và ủ trong 24 giờ ở 44


Sau 24 giờ nuôi cấy tiến hành đếm khuẩn lạc dưới 150
tế bào

Bước 4
Đếm và chọn các
khuẩn lạc để
khẳng định

Khuẩn lạc E.coli đặc trưng trên mơi trường TBX có màu
xanh.

Tính giá trị trung bình từ các độ pha lỗng khác nhau để
qui về số E.coli trong 1g mẫu


Đếm Và Chọn Lọc Các Khuẩn Lạc Để Khẳng Định

•β-glucuronidase-positive
Escherichia coli

•Colony characteristic :
blue color


Tính Kết Quả

Tổng số E. coli trong 1g mẫu (X) được tính theo cơng thức:
Trong đó:
 C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên 4 đĩa của 2 độ pha lỗng liên tiếp.
 V: thể tích dịch ni cấy trên mỗi đĩa (ml)
 n1, n2: số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất và thứ 2.
 d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất