QUY TRÌNH SẢN XUẤT COLLAGEN VÀ ỨNG DỤNG COLLAGEN TỪ THỰC VẬT

QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ ỨNG DỤNG COLLAGEN
TỪ THỰC VẬT

Ngành:

CƠNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

LỜI MỞ ĐẦU
Collagen là một dạng protein cấu trúc sợi dài và hầu hết các chức năng của nó khác
với dạng protein phổ biến là enzyme (cấu trúc collagen). Những bó collagen hay cịn
gọi là sợi collagen là thành phần chính của thể nền màng tế bào cấu tạo nên hầu hết
cá mô và cấu trúc bên ngồi tế bào, nhưng collagen cũng được tìm thấy trong tế bào.
collagen có cường độ kéo đứt lớn và là thành phần chính của gân, sụn, xương, dây
chằng, da. Collagen tạo ra sự đàn hồi của da và nếu nó thối hóa sẽ gây ra nếp nhăn
tuổi già.
Trong q trình trích ly collagen có cơng đoạn thủy phân. Q trình này tạo ra collagen
thủ phân, được gọi là collagen hydrolysate. Tùy theo mức độ thủy phân mà collagen có
ứng dụng khác nhau. Collagen hydrolysate được ứng dụng phổ biến trong công nghệ thực
phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm và công nghiệp nhiếp ảnh. Chúng được sử
dụng như chất đông, chất gây lắng trong thực phẩm. Chúng được dùng như chất thay
thế cao su, keo dán, xi măng, mực in nhân tạo, là chất tạo kết dính trong diêm quẹt,
trong bộ lọc sáng của đèn thủy ngân,…
Hiện nay collagen được coi như là một loại dược liệu quý để kéo dài tuổi
thanh xuân cho con người. Việc nghiên cứu và sản xuất collagen có nhiều ý nghĩa
đối với ngành sản xuất thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm, …
Trong ngành thực phẩm: collagen được ứng dụng để làm vỏ bao xúc xích,

kẹo, và các ứng dụng của nó dưới dạng gelatin.
Trong y học: collagen được ứng dụng trong việc chế tạo da nhân tạo để
điều trị vết bỏng, ứng dụng trong phẫu thuật chỉnh hình, làm vỏ bọc thuốc, …
Trong mỹ phẩm: collagen có vai trị chống nhăn, giữ cho da mềm và sáng,
hơn nữa collagen còn là nguyên liệu để sản xuất các sản phẩm như: mặt nạ, kem
dưỡng da, dầu gội, …
Nhận thấy nhu cầu rất lớn về collagen ở trên Thế Giới cũng như ở Việt
Nam trong những năm gần đây, việc sử dụng cây thuốc lá như một hệ thống biểu hiện mới
1


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
cho sản xuất collagen I tương đồng của người được trình bày trong báo cáo này. Các cấu
trúc đã được thiết kế từ cDNA mã hóa chuỗi proα1 (I) của người để tạo ra các cây thuốc lá
biến đổi gen biểu hiện collagen I. Các chuỗi proα1 (I) tái tổ hợp được biểu hiện dưới dạng
các trimers có liên kết disulfide và được cho là có thể gấp lại thành một vòng xoắn ba kết
hợp ổn định. Hơn nữa, procollagen tái tổ hợp sau đó được xử lý để collagen như nó xảy ra
ở động vật. Một lượng lớn collagen tái tổ hợp đã được tinh chế từ nguyên liệu thực vật. Dữ
liệu cho thấy cây trồng là một sự thay thế có giá trị cho việc sản xuất collagen tái tổ hợp
cho các mục đích y khoa và khoa học khác nhau.

2


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN..............................................................................4
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.....................................................................18

2.2 Qui trình tách chiết collagen............................................................................................................. 20
2.4 Phương pháp phân tích và kính hiển vi điện tử.................................................................................21
2.5 Lưỡng sắc tròn................................................................................................................................. 22

Tài Liệu Tham Khảo

3


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ COLLAGEN
1.1.

Giới thiệu sơ lược về Collagen
Collagen là loại protein cấu trúc chính yếu, chiếm khoảng 30% tổng lượng

protein trong cơ thể ở các động vật có xương sống. Collagen có nhiều trong gân, da,
xương, hệ thống mạch máu của động vật và có mặt trong các lớp màng liên kết bao
quanh các cơ. Khoảng 10% protein trong cơ ở động vật có vú là collagen; các protein
ngoại bào (hơn 90% trong gân, xương và khoảng 50% trong da) có chứa collagen. Nó có
tác dụng giống như một chất keo liên kết các tế bào lại với nhau để hình thành các mô và
cơ quan nền tảng trong cơ thể.
Collagen cung cấp cho các mơ liên kết những đặc tính nổi trội nhờ vào sự hiện
diện rộng khắp và sự sắp xếp mang tính cấu trúc của nó. Nó phân bố khắp nơi trong
cơ thể, từ chỗ gân nối bắp chân với gót chân cho tới giác mạc. Trong gân và dây
chằng, collagen có tác dụng truyền lực từ cơ sang xương và tích trữ năng lượng đàn
hồi. Sự di chuyển nhịp nhàng, uyển chuyển sẽ không thể thực hiện được nếu thiếu
những tính chất này. Collagen cịn là chất nền hữu cơ có trong xương và men răng
giúp chúng chống lại sự rạn nứt. Nó là thành phần chính trong da, mạch máu, các cơ.

Collagen khơng chỉ có chức năng cơ học, chẳng hạn như ở giác mạc, trật tự cấu trúc
của các sợi collagen tạo nên sự trong suốt.
Collagen được xem như một vật liệu mang tính xây dựng. Sự linh hoạt của nó là
nhờ vào cấu trúc cấp bậc phức tạp, tạo nên sự đa dạng trong tính chất nhằm phục vụ
những chức năng nhất định.

4


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
1.2
Cấu trúc của collagen
1.2.1 Cấu trúc phân tử của collagen
Phân tử collagen (hay còn gọi là tropocollagen) là một protein hình trụ, dài
khoảng 300 nm, đường kính khoảng 1,5 nm.

Hình 1.1 Cấu trúc của phân tử collagen (triple helix).
Nó bao gồm 3 chuỗi polypeptide (gọi là chuỗi α) cuộn lại với nhau. Mỗi chuỗi α
cuộn thành đường xoắn ốc theo hướng từ phải sang trái với 3 gốc trên một vòng xoắn.
Ba chuỗi này xoắn lại với nhau theo hướng từ trái sang phải tạo thành đường bộ ba
xoắn ốc.

5


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
Hình 1.2 Sự hình thành chuỗi xoắn ốc nội phân tử và giữa các chuỗi polypeptide.

Mỗi chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử khoảng 100 kDa, tạo nên tổng khối
lượng phân tử của collagen khoảng 300 kDa. Chuỗi α được cấu tạo bởi khoảng 1000

amino acid. Các chuỗi α khác nhau (α1, α2 và α3) ở thành phần amino acid. Sự phân
bố của các chuỗi α1, α2 và α3 trong các phân tử collagen khác nhau tùy thuộc vào sự
khác nhau về gene.
Collagen khơng có chứa tryptophan, giàu thành phần glycine, proline và
hydroxyproline, là một trong số ít những protein có chứa hydroxylysine. Nó chứa
khoảng 33% glycine, 12% proline và 11% hydroxyproline. Các amino acid sắp xếp
trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân bố như sau:
Bảng 1.1 Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide.

1.2.2

Triplet
Gly – X – X

Tỉ lệ
0,44

Gly – X – I

0,2

Gly – I – X

0,27

Gly – I – I

0,09

Cấu trúc sợi của collagen

Phần lớn collagen trong mạng lưới ngoại bào được tìm thấy ở dạng sợi, bao gồm
những sợi mảnh, nhỏ. Thơng qua q trình tạo sợi, các phân tử collagen tổ hợp với
nhau hình thành nên các vi sợi (microfibril) bao gồm từ 4 ÷ 8 phân tử collagen hoặc
6


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
với số lượng nhiều hơn sẽ tạo thành các sợi (fibril). Những sợi này có đường kính từ
10 ÷ 500 nm tùy thuộc vào loại mơ và giai đoạn phát triển. Các sợi collagen sẽ thiết
lập nên các sợi lớn hơn (fiber) và cao hơn nữa là các bó sợi (fiber bundle).

Hình 1.3 Cấu trúc sợi của collage.

7


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
Hình 1.4 Quá trình tổ hợp tạo sợi của các phân tử collagen.
Các chuỗi collagen sắp xếp song song theo chiều dọc tạo thành các sợi với tính
chu kỳ nhất định. Chúng được sắp xếp so le nhau một khoảng 67 nm và có một
khoảng trống khoảng 40 nm giữa những phân tử liền kề nhau.
Nhờ vào cấu trúc có thứ bậc, độ bền vốn có của các chuỗi xoắn ốc được chuyển sang
các sợi collagen, cung cấp cho các mô độ cứng, độ đàn hồi và những đặc tính cơ học
riêng biệt.

Hình 1.5 Hình ảnh của bó sợi (a) và sợi (b) collagen.
Sợi collagen là các tổ hợp có cấu trúc bán kết tinh của các phân tử collagen. Các
vi sợi kết hợp tạo nên sợi lớn hơn. Các sợi collagen được sắp xếp với những cách thức
kết hợp và mức độ tập trung khác nhau trong các mô khác nhau để cung cấp các đặc

tính khác nhau của mơ.
1.3

Phân loại collagen
Tính đến thời điểm hiện tại, có 42 loại chuỗi polypeptide được nhận dạng. Chúng

được mã hóa bởi 41 loại gene khác nhau, tạo thành 27 loại collagen. Họ collagen được
phân loại thành những phân họ khác nhau dựa vào sự tổ hợp của các siêu phân tử.
Hiện tại, có ít nhất khoảng 13 loại collagen đã được trích chiết. Chúng khác nhau về

8


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
chiều dài của chuỗi xoắn ốc cũng như bản chất và kích cỡ của những phần không xoắn
ốc.

Bảng 1.2 Kết cấu chuỗi và sự phân bố của các loại collagen trong cơ thể người.
Loại collagen

Kết cấu chuỗi

Phân bố

(α1(I))2α2(I), trimer

Da, gân, xương, giác mạc, men răng,

II

(α1(I))3
(α1(II))3

III

(α1(III))3

sụn, mạch máu
Sụn, xương
Mạch máu, van tim, hạ bì, ruột, nướu

IV

(α1(IV))2α2(IV)
α1(V) α2(V) α3(V) hoặc

V

(α1(V))2α2(V) hoặc

VI
VII
VIII
IX
X
XI
XII
XIII

(α1(V))3

α1(VI) α2(VI) α3(VI)
(α1(VII))3
Chưa biết
α1(IX) α2(IX) α3(IX)
(α1(X))3
α1(XI) α2(XI) α3(XI)
(α1(XII))3
Chưa biết

I

răng, thành tử cung
Màng nhầy
Giác mạc, xương, mạch máu, sụn,
nướu răng
Da, cơ tim
Da, phổi, sụn, giác mạc, nhau
Tạo ra từ tế bào màng trong
Sụn
Sụn
Sụn, đĩa đệm cột sống, dịch thủy tinh
Gân, dây chằng
Da, xương

Hơn 90% collagen trong cơ thể là các collagen loại I, II, III và IV. Những bệnh
tật liên quan đến collagen là do sự khuyết tật về gene ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp,
sự sắp xếp cũng như các quá trình khác trong sự sản sinh collagen một cách bình
thường.
9

SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

1.4

Thành phần các acid amin có trong collagen
Mỗi loại collagen gồm có hàng nghìn cấu trúc amino acid, chủ yếu gồm có glycine,

proline, hydroxyproline. Collagen khơng chứa tryptophan, và là một trong số ít các protein
chứa hydroxylysine. Các amino acid sắp xếp trong chuỗi xoắn ốc theo các dãy với sự phân
bố như sau:

Bảng1.3: Sự phân bố các amino acid trong chuỗi polypeptide.

1.5

Tính chất của collagen
Tính chất vật lý:
Collagen là một protein không tan trong nước, nhưng có khả năng giãn nở

nhẹ. Tỉ lệ giãn nở có giới hạn co giãn khoảng 7% cho sợi ướt và 5% cho sợi khô.
Ở 600C dưới tác động của acid hay kiềm hoặc muối, collagen ẩm đột ngột, phồng
lên, co rút khoảng 1/3 hay 1/4 chiều dài của nó. Và nếu tiếp tục đun collagen sẽ tiếp
tục thủy phân thành gelatin.
Tính chất hóa học:

10


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

Collagen là chất duy nhất có thể chuyển thành gelatin khi đun sơi với nước
nóng, đó là kết quả của sự mở vòng xoắn 3 sợi kèm theo sự phá vỡ liên kết hydro.
gelatone và gelatose là sản phẩm phân giải gelatin. Tỷ lệ giữa gelatin, gelatone và
gelatose được quyết định bởi nhiệt độ và thời gian nấu.
Collagen bị thủy phân chậm bởi trysin và pepsin, trong khi đó gelatin dễ bị
phân hủy hơn.
Collagen khi thêm cồn, muối hoặc aceton đặc biệt là heparin thì chúng có
sợi dày và kết tủa lại.
Collagen tan trong glycerin, acid acetid, ure nhưng không tan trong nước
lạnh.
1.6

Chức năng của collagen
Protein này là giá đỡ cho các mô và các cơ quan và liên kết các cấu trúc này

với xương. Collagen cũng có trong cấu trúc của da. Nó tiêu biểu cho sự khỏe mạnh
và độ bền của da, thể hiện qua sự trơn láng, đầy đặn của da khi còn trẻ. Cấu trúc độc
nhất này đã làm cho collagen có sức căng mạnh hơn cả thép. Sự mất cấu trúc 3-D
cũng

có

nghĩa

là

mất

đi

sự

giúp

đỡ

của

khung

sườn

của

da.

Collagen này có nhiều trong các mơ liên kết ở da cá. Tương tự như sợi
collagen trong động vật có vú, các sợi collagen ở các mô của cá cũng tạo nên cấu
trúc mạng lưới mỏng với mức độ phức tạp khác nhau. Tuy nhiên collagen ở cá kém
bền nhiệt hơn nhiều và ít có các liên kết chéo hơn nhưng nhạy cảm hơn collagen ở
động

vật

máu

nóng

có

xương

sống.

(Phan

Thị

Thanh

Quế,2005)

Collagen là loại protein phổ biến nhất trong cơ thể (chiếm khoảng ¼ tổng
lượng protein), là protein chính của mơ liên kết, là một trong các thành phần chính
của da, cơ vân, sụn, dây chằng, gân, xương và răng; đóng vai trị quan trọng trong
việc phát triển các mô trong cơ thể và cũng cố thành mạch, tồn tại trong các giác
mạc và thủy tinh thể của mắt dưới dạng kết tinh. Lớp bì, lớp đệm trong cùng của da
chứa rất nhiều collagen, mà chính các sợi collagen này tạo ra một hệ thống nâng đỡ,
hỗ trợ cho các đặc tính cơ học của da như sức căng, độ đàn hồi, duy trì độ ẩm…
11


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

1.7

Ứng dụng của collagen
Ngày nay collagen được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực y

học và trong các ngành khoa học khác. Ví dụ như các sản phẩm bơng gạc làm từ

collagen của tập đoàn Suwelack sẽ giúp các vết thương nhanh lên da non và mau
lành sẹo, các mỹ phẩm giúp làm đẹp da mặt cho phụ nữ.
1.7.1

Ứng dụng collagen trong thực phẩm

Trong ngành thực phẩm collagen được ứng dụng cụ thể như: sản xuất sợi collagen làm
thực phẩm, sản xuất collagen vi tinh thể, những ứng dụng của collagen giống như gelatin.
Collagen được ứng dụng rộng rãi dưới dạng gelatin:
+ Thực phẩm ( Gottoffer, 1945; Idson và Braswell, 1957)
Dựa vào tính chất tan chảy ở nhiệt độ cao và đông đặc ở nhiệt độ thấp người
ta ứng dụng trong thực phẩm đơng lạnh. Lúc này Gelatin đóng vai trị là một chất
keo bảo vệ ngăn chặn sự kết tinh của đường.

Hình 1.6 Thực phẩm có chứa gelatin
Trong kem và phomát mềm, gelatin ngăn chặn sự mất nước. Ngoài ra trong
sản phẩm bơ sữa gelatin đóng vai trị quan trọng trong việc tạo độ mịn, độ sánh cho

12


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
sản phẩm. Trong kẹo dẻo, gelatin cung cấp cho sản phẩm độ dẻo và dai.
+ Dược phẩm (Chvapil và cộng sự, 1973; Wood, 1977)
Gelatin được sử dụng trong sản xuất bao con nhộng cứng hay mềm. Nó có
tác dụng bảo vệ thuốc chống những tác nhân có hại như ánh sáng và oxi. Thành
phần chính của vỏ là Geltin và các tá dược khác như: glycerol hay sorbitol, những
chất hoạt động bề mặt, chất màu cho phép, hương liệu….

Hình 1.7. Những nang thuốc có chứa gelatin

+ Kỹ thuật chụp ảnh (Cox, 1972; Rose, 1977)
Nguyên liệu chụp ảnh chứa nhiều lớp gelatin được bao phủ lên phim hoặc giấy.
Gelatin vận dụng hơn một trăm năm nay như là chất kết dính, chức năng của
gelatin hữu ích trong việc sản xuất phim ảnh.
1.7.2

Ứng dụng collagen trong y học và dược phẩm

+ Collagen dạng sợi
Collagen dạng sợi được dùng trong việc làm lành các vết thương, vết mổ
trong phẫu thuật. Sợi collagen có thể được xử lý để tạo cấu trúc sợi thẳng, dài dùng
làm những sản phẩm y học cho gân và dây chằng.
+ Màng mỏng collagen

13


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
Collagen dạng màng và lớp mỏng được sử dụng để giữ cố định các vật chất
sinh học, dùng trong sự tái tạo các mô, nối kết lại võng mạc, làm vật thay thế lớp
màng cứng của não…..Nó cịn được dùng cho việc tái tạo dây thần kinh, khơi phục
màng nhĩ, sụn và xương, có tác dụng phục hồi các vết thương.
1.7.3

Ứng dụng collagen trong mỹ phẩm

Collagen đặc biệt quan trọng trong cơ thể, collagen có trong kem dưỡng da,
trong

mặt

nạ

dưỡng

da,

các

loại

sữa

tắm,

dầu

gội

đầu....

Là một loại protein chiếm tới 25% tổng lượng protein trong cơ thể người,
collagen có chức năng chính là kết nối các mô trong cơ thể lại với nhau. Nó giống
như một chất “keo” dính các bộ phận trong cơ thể người lại thành một khối hoàn
chỉnh, nếu khơng có chúng cơ thể người sẽ chỉ là các phần rời rạc. Chỉ riêng điều
này cũng đã chỉ ra tầm quan trọng của collagen đối với sự sống của con người.
Riêng với làn da, ngoài nhiệm vụ liên kết collagen cịn có nhiệm vụ tạo sự
đàn hồi. Đây chính là lý do tại sao collagen ở da có định dạng khác so với collagen
ở các bộ phận khác. Các liên kết sợi collagen ở da lỏng hơn nhằm làm tăng sự đàn

hồi và tính linh hoạt của collagen, tuy nhiên cũng vì vậy mà chúng dễ bị tổn thương
hay đứt gãy do tác động bên ngoài.
Collagen của da khoẻ mạnh và liên kết tốt sẽ giúp da có sự đàn hồi như
không bị rạn khi mang thai, không bị da thừa khi giảm cân, không bị nếp nhăn khi
chuyển động cơ lặp đi lặp lại, không bị chùng nhão da mặt và khơng bị sẹo sau tổn
thương. Chính vì vậy, collagen đóng vai trị đặc biệt quan trọng trong sức khỏe
cũng như sắc đẹp của con người.

14


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
Hình 1.8 Các liên kết sợi ở collagen
Trước kia muốn sử dụng collagen các bác sĩ phải lấy chúng ngay trên cơ thể từ
vùng này dùng cho vùng khác. Tuy nhiên phương pháp này quá tốn kém và phức
tạp. Ngày nay, công nghệ thẩm mỹ hiện đại đã nghiên cứu và ứng dụng thành công
một số loại collagen từ động vật như da bò, da lợn, cá da trơn và một số loại thực
vật để cho ra đời collagen nhân tạo có hiệu quả điều trị thẩm mỹ rất tốt.
Collagen phục hồi: thường được sử dụng trong trường hợp da bị tổn thương
hoặc trong giai đoạn tái tạo sau khi điều trị nám, mụn trứng cá, sẹo, rạn da và tiêu
da thừa sau khi giảm béo. Sản phẩm Phials of Collagen and Elastin với các thành
phần chính là collagen, elastin và vitamin E, trong đó collagen được chiết xuất từ da
heo giúp kích thích tế bào và sửa chữa các khuyếm khuyết ở mơ nhờ đó phục hồi
khả năng đàn hồi của da. Ngoài ra, sản phẩm cịn có thể điều trị các vết rạn do tăng
cân hay mang thai.
Collagen trẻ hoá: được sử dụng cho những phụ nữ từ 35 tuổi bắt đầu có dấu
hiệu lão hoá với sự xuất hiện của các nếp nhăn, da bị mất nước, chùng nhão, chảy
xệ khơng cịn căng mịn như trước nữa, màu sắc da cũng trở nên sạm lại. Sản phẩm
Beautee Collagen Cell Pure với hàm lượng collagen nguyên chất lên tới 25%, có
khả năng bổ sung và duy trì độ ẩm cho da, cung cấp dinh dưỡng và bảo vệ da chống

lại môi trường ô nhiễm bên ngồi. Ngồi ra, sản phẩm cịn có khả năng xố bỏ các
nếp nhăn nơng, cải thiện và làm mờ các nếp nhăn sâu do tuổi tác, phục hồi lại khả
năng đàn hồi tự nhiên cho da, ngăn chặn sự hình thành nếp nhăn trên da, thúc đẩy
trẻ hố tế bào theo cơ chế tự nhiên.
Collagen phục hồi liên kết cơ: thường được sử dụng trước khi đắp mặt nạ và
được đưa sâu vào lớp màng đáy của da bằng dòng xung điện hoặc máy đẩy dưỡng
chất Led Medicare. Phương pháp này chỉ định cho những người cần có trị liệu sâu
do da lão hoá quá lâu hoặc nếp nhăn do chuyển động quá nhiều. Sản phẩm chỉ được
dùng trong các MedicalSpa.

15


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
Collagen trong kem dưỡng da.Trong các sản phẩm dưỡng da cho độ tuổi
ngoài 30 đều bổ sung hàm lượng collagen, tuy nhiên chỉ chiếm một phần rất nhỏ
trong việc khôi phục chuỗi collagen và elastin yếu ớt trên da. Do vậy, để thực sự
điều trị đàn hồi của da, bạn cần có những sản phẩm collagen chuyên nghiệp nhất.
Theo đánh giá của hiệp hội sức khoẻ Hoa Kỳ, nồng độ collagen từ 18 - 27% được
coi là chất lượng cao. Một khoá trị liệu collagen tối thiểu 12 lần sẽ giúp bạn xoá nếp
nhăn và làm săn chắc cơ mặt hồn hảo nhất, có thể kết hợp với các công nghệ thẩm
mỹ tiên tiến khác như sóng radio, RF, sóng xung điện, IPL để collagen phát huy hết
khả năng "cải lão hoàn đồng".
1.8

Các yếu tố ảnh hưởng tới collagen
Ảnh hưởng của pH
Độ tan của collagen thấp nhất ở pH = pI của nó, độ tan của collagen tăng lên

khi pH nằm xa vì khi pH = pI thì phân tử collagen khơng tích điện nên chúng khơng

có lực đẩy tĩnh điện và dễ bị đơng kết. Khi pH khác thì các phân tử collagen tích
điện cùng dấu và đẩy nhau cho nên không bị đông kết, do đó độ tan tăng lên. pH
đẳng điện của collagen (pH = 5-7).
Ảnh hưởng của nồng độ muối
Muối trung tính ở nồng độ thấp làm tăng độ tan của collagen. Khi tăng nồng
độ muối tới một giới hạn nhất định thì độ tan của collagen giảm xuống và nếu nồng
độ muối tiếp tục tăng lên thì collagen có thể đơng kết hồn tồn.
Ảnh hưởng của dung mơi
Khi cho các dung môi như cồn, benzen, aceton, chloroform ... vào dung dịch
collagen thì độ tan của collagen bị giảm và có thể dẫn đến đơng kết do phá vỡ lớp
vỏ thủy hóa.
Ảnh hưởng của khơng khí
Ở các tuổi khác nhau, trong cơ thể sống hay trong ống nghiệm, khơng
khí có một vai trị trong sự thay đổi cấu trúc hóa học của collagen (Sobel và
Hansen, 1989). Sự oxy hóa sẽ làm thay đổi cấu trúc phân tử của các protein,
16


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
nguyên nhân là do sự thay đổi về mặt hóa học và các liên kết của vài amino
acid đã vượt quá thời gian.
Ảnh hưởng của nước
Nước ảnh hưởng đến collagen theo những con đường khác. Nó giữ vai trị
trực tiếp trong các biến đổi hóa học của collagen thơng qua sự thủy phân, sự hydrat
hóa của các gốc tự do, sự ổn định của các liên kết hydro và tỷ lệ của sự hình thành
gelatin.
Bowes và Raistrick (1976) đã nghiên cứu ảnh hưởng của mối liên hệ của độ
ẩm và pH lên phạm vi suy giảm thủy phân của collagen bằng sự phóng thích nitơ
cịn dư ở giai đoạn cuối. Ở 40oC trong tám tuần, sự thủy phân collagen tăng lên với
sự tăng độ ẩm (từ 40% lên 80%) và giảm pH (từ 5,0 xuống 2,5). Họ kết luận rằng

khi sự suy giảm thủy phân càng tiến xa, thì sự biến tính sẽ kéo theo và lần lượt tăng
lên hơn là sự hoạt động thủy phân.
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Đo lường ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự hư hỏng của collagen bị cản trở bởi
vì có sự hao hụt nhiệt độ ở tại hoặc trên nhiệt độ đo lường đưa ra những kết quả
không đáng tin cậy (Bowes và Raistrick, 1964). Mối quan tâm đặc biệt là collagen
bị hư hỏng về mặt vật lý và hóa học sẽ bị hư hỏng ở tỷ lệ nhanh hơn, nhưng điều
này đã không được chứng minh và là một nội dung cho việc nghiên cứu sâu hơn.
Như ta đã biết, sự biến tính phá hủy collagen được điều khiển bởi ít các điều kiện
hơn là sự biến tính đầu tiên khi collagen cịn ngun vẹn. Tính tồn vẹn về mặt vật
lý và hóa học của collagen có thể được biểu thị qua sự ổn định thủy nhiệt, cả khi
giảm nhiệt độ sai lệch đối với các sợi đã bị hư hỏng (Young, 1990).

17


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1

Cấu trúc và chuyển đổi cây thuốc lá
Các dòng cDNA 1α3 và α22, cùng mã hóa chuỗi collagen proα1(I) hồn chỉnh của

người, thu được bằng cách sàng lọc một MG63 (dòng tế bào động mạch xương người,
ATCC, 1427) thư viện cDNA (J. Biol. Chem. , 272, 1997 ) với hai γ- 32 oligonucleotide Pđánh dấu ( nucleotide 152-171 và 4268-4274 bản sao proα1 (I) của con người, đánh số từ
vị trí bắt đầu dịch). Để có được ba cấu trúc được sử dụng trong nghiên cứu
này, đoạn Bam HI- Eco RI 1554 bp từ clona cDNA α22 đã được nhân bản vào
pBluescriptSK (Stratagene) (clone 1). Các Eco RI- Hin đoạn DIII PCR mã hóa các
carboxy cuối của chuỗi proα1 (I) được gắn vào các Eco RI và HindIII của clone 1 để thu

được clone 2. Clone 3 đã được tạo ra bằng cách nhân bản một đoạn 1441
bp Xba I- Bam HI PCR vào plasmid pUC19.
Phần PCR này chứa chuỗi mã hóa cho chuỗi acid amin và amino cuối cùng của xoắn
ba trung tâm của chuỗi proα1 (I). Đoạn Dra III- Bam HI đã được chèn vào vị trí
Dra III- Bam HI của clone 3 để thu được clone 4. Clone 5 đã được tạo ra bằng cách chèn
vào đoạn Xba I- Bam HI của clone 4 đến cùng một vị trí trong clone 2. Một đoạn 473
bp Sac II- NheI PCR mã hóa các peptide tín hiệu và N-propeptide của chuỗi preproα1 (I)
đã được chèn vào một vị trí trong clone 5 và kết quả là xây dựng, α1 (I), mã hóa chuỗi
preproα1 (I) hồn chỉnh.
Điểm hạn chế được tạo bởi PCR Nhe I tạo ra thay thế cho Asn-158 và Phe-159 cho các
phần

dư Lys

và Leu, các dư

lượng được đánh số từ methionine đầu

tiên. Một Sac II- NheI đoạn I PCR mã hóa các peptide tín hiệu máy của PR-protein
(protein bệnh liên quan đến), được gọi là PRS, được chèn vào SacII- NheI của clone 5 để
có được cấu trúc PRS (ΔN-pro). Nó mã hóa các tín hiệu peptide PRS và chuỗi proα1 (I)
hoàn chỉnh, ngoại trừ chuỗi N-propeptit.
Đối với cấu trúc cuối cùng, một 407 bp NheI- NheI PCR đoạn mã hóa N-propeptide
của chuỗi proα1 (I) được chèn vào vị trí NheI của cấu trúc PRS (ΔN-pro). Các kết quả cấu
trúc PRSα1 (I) mã hóa chuỗi proα1 (I) hồn chỉnh, trong đó các tín hiệu peptide tự nhiên
18


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
được thay thế bằng PRS. Tất cả các mảnh PCR đã được sắp xếp. Các cấu trúc được phân

loại bởi Hin dIII và chèn vào plasmid pBIOC21. Plasmid này chứa vị trí mã hóa tái tổ hợp
dưới sự kiểm soát của promoter 35S được cải tiến và trình tự kết thúc 35S của virut hoa
cải.
Vùng lựa chọn gen NPT2 nằm dưới sự kiểm soát của promoter NOS và trình tự kết
thúc NOS của Agrobacterium tumefaciens. Các kết quả cấu trúc được gọi là pBIOC-α1 (I),
pBIOC-PRS (ΔN-pro) và pBIOC-PRSα1 (I), tương ứng. Sự biến đổi đã đạt được bằng
cách lây nhiễm các phiến lá của cây thuốc lá bằng A. tumefaciens tái tổ hợp. Các chất
chuyển kháng kháng Kanamycin được chọn lọc và tái tạo để kiểm tra các cây con biểu
hiện collagen I.

19


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
2.2

Qui trình tách chiết collagen

2.2.1

Quy trình thu nhận Collagen được xây dựng như sau

2.2.2

Thuyết minh qui trình
20


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
Nguyên liệu: Lá và cành của cây thuốc lá chuyển gen. Rửa sạch bằng nước nhiều lần để

loại bỏ các tạp chất bẩn.
Đông lạnh: Lá và cành sau khi được rửa sạch sẽ đem đi đông lạnh trong nitơ hóa lỏng và
đồng nhất trong máy làm đá lạnh (Spex Industries, Metuchen, NJ, USA).
Nghiền: Tạo diện tích tiếp xúc lớn giữa nguyên liệu và dung môi chiết, tăng hiệu quả chiết
collagen.
Chiết collagen: Sau khi nghiền nhỏ nguyên liệu ta tiến hành khảo sát quy trình chiết
collagen bằng acid acetic, enzyme pepsin, và kết hợp enzyme pepsin và acid acetic. Trong
q trình chiết ln đảm bảo nhiệt độ nằm trong khoảng 3-6 oC nhằm tránh biến tính
collagen thành gelatin.
Sau khi loại bỏ vật liệu khơng hịa tan bằng ly tâm, supernatant có chứa collagen tái tổ
hợp được phân đoạn muối ở 0,4 M và 0,9 M NaCl. Các kết tủa 0.9 M NaCl, chứa collagen
tái tổ hợp, đã được phân hủy và thẩm tích với acid acetic 0,1 M và được bảo quản ở -20 °
C cho đến khi được sử dụng.
2.3

Phân tích Western blot
Các mẫu được phân tích bởi 6% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel điện

(SDS-PAGE) theo giảm hoặc khơng giảm điều kiện (khi có chỉ định) tiếp theo là
electrotransfer vào màng polyvinylidene difluoride (Immobilon-P, Millipore) nghỉ đêm tại
10 CAPS mM (pH 11), 5% methanol. Sau khi bão hòa, màng được ủ với kháng thể đa giá
chống lại collagen I (cung cấp bởi Tiến sĩ D Hartman, Viện Pasteur, Lyon, Pháp) tiếp theo
là kháng thể thứ cấp liên hợp với alkaline phosphatase. Immunoblots đã được tiết lộ với
các chất nền alkaline phosphatase conjugate kit từ Bio-Rad. (F. Ruggiero và cộng sự, [132136], 2000).
2.4

Phương pháp phân tích và kính hiển vi điện tử
Để xác định các trình tự amino acid N-cuối, mẫu đã được điện di SDS-PAGE và sau đó

được truyền điện. Các mảng liên quan đã được cắt ra từ màng tế bào và trình tự acid amin

được thực hiện bằng cách tự động Edman suy thoái bằng cách sử dụng bộ phân tích
protein 473A Applied Biosystems.
21


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
Đối với phân tích thành phần axit amin, chất kết tủa 0,9 M NaCl chứa collagen tái tổ
hợp hòa tan trong 0,1 M axit axetic đã được nung nóng ở 60 ° C trong 15 phút trước khi
tinh chế thêm bằng HPLC đảo ngược trên cột thủy ngân C8 RP300 sử dụng gradient nước
acetonitrile trong sự hiện diện của 0,1% axit trifluoroacetic. Các chuỗi α1 (I) tái tổ hợp
tinh khiết xuất hiện như một đỉnh duy nhất và thể hiện khối lượng phân tử dự kiến như
được phân tích bởi SDS-PAGE 6%. Quy trình sàng lọc tương tự đã được tiến hành trên các
mẫu đồng phân collagen I. Thành phần axit amin, được thực hiện trên cả hai mẫu, được
xác định sau khi thuỷ phân dưới chân không (6 N HCl, 115 ° C, 24 giờ) với sự có mặt của
2-mercaptoethanol trong hệ thống Pico Tag (Waters) và một máy phân tích axit amin
Beckman.
Đối với việc quay hiệu ứng màn chắn, mẫu đã được pha loãng đến 10 μg / ml với 0,1
M axit axetic, trộn với glycerol (1: 1), phun lên tấm mica tươi cắt và ngay lập tức đặt trên
thiết bị bay hơi MED 010 (Balzers). Quay bóng được thực hiện như mơ tả trước đây. Quan
sát các bản sao được thực hiện bằng kính hiển vi Philips CM120 tại Trung tâm
Microscopie Electronique Appliquée à Biologie et à la Géologie, Đại học Claude Bernard,
Lyon I.
2.5

Lưỡng sắc trịn
Hình dạng xoắn ba và ổn định nhiệt của homotrimer tái tổ hợp đã được phân tích bằng

dichroism vòng. Quang phổ được ghi ở 10 ° C trong 100 mM axit axetic trên một quang
phổ kế CD6 Jobin Yvon được trang bị một đơn vị nhiệt độ thay đổi. Các mẫu của collagen
tái tổ hợp và, để so sánh, homotrimer bò được hòa tan trong 100 mM axit axetic. Sự biến

màu nhiệt khi cần thiết đã được thực hiện ngay trước khi phân tích. Các phép đo được thực
hiện với một tế bào chiều dài 0,1 cm với tốc độ không đổi là 10 nm / phút với độ phân giải
0.2 nm. Đường cong chuyển nhiệt được đo trên cả hai mẫu ở nồng độ 185 mg / ml bằng
cách giám sát [ θ ] 225 nm là một hàm của nhiệt độ ở một tốc độ làm nóng 10 ° C / h. (F.
Ruggiero

22


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH

CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG COLLAGEN TRONG
THỰC PHẨM
3.1

Ứng dụng collagen vào các sản phẩm thức uống (trà, cà phê) nhằm bổ sung

thêm lượng protein cho cơ thể
Trước đây, người ta đã cố gắng nâng cao chất lượng cà phê bằng các nguồn protein
thương mại. Nguồn protein này có thể là casein, sữa và đậu nành. Nhìn chung, tất cả
những nỗ lực đều không thành công. Độ pH của cà phê mạnh là ở độ pH thấp gần với
điểm đẳng điện (pH 4,6) của casein. Khi dạng hòa tan trong nước của casein được thêm
vào cà phê nóng, casein đông tụ ngay 1ập tức và kết tủa. Điều kiện như vậy là hồn tồn
khơng thể chấp nhận được. Whey protein khơng có điểm đẳng điện tại pH đó. Do đó, các
nhà nghiên cứu đã thử thêm whey protein vào cà phê. Tuy nhiên, nhiệt độ cao của cà phê
cũng làm whey protein biến tính và vón cục. Rõ ràng, giá trị cảm quan của sản phẩm cũng
không thể chấp nhận. Các acid trong cà phê tăng đáng kể sự đông tụ whey protein, tương
tự như khi phô mai Ricotta được sản xuất từ sữa phô mai bằng cách làm nóng sữa tới 8788°C, và thêm một lượng acid acetic vào sữa này. Việc sử dụng whey protein để nâng cao
chất lượng cho cà phê không tốt hơn mấy so với casein. Protein đậu nành cũng bị kết tủa
trong cà phê nóng do nhiệt độ cao và độ pH acid.

Một sáng chế năm 2010 của Connolly và cộng sự liên quan đến sản phẩm thức uống cà
phê có bổ sung protein. Sản phẩm có thể được sản xuất một cách hiệu quả bằng cách bổ
sung thêm protein mà không làm xuất hiện bất kỳ tính chất nào khơng thể chấp nhận được
đối với thức uống pha chế.
Ý tưởng của phát minh này là để sản xuất một loại đồ uống cà phê có chứa một lượng
đáng kể các loại protein bổ sung, nhưng vẫn đảm bảo hương vị và các tính chất cảm quan
như cà phê bình thường. Cách bổ sung này cũng có thể áp dung cho các sản phẩm đồ uống
pha chế khác, chẳng hạn như trà. Những người đã nghiên cứu thì biết rõ là rất khó để bổ
sung thêm một lượng protein cho m ột loại đồ uống nóng. Cà phê là một thức uống được
chuẩn bị và sử dụng ở nhiệt độ cao, thường là nhiệt độ trên 87- 88°C, và ngoài ra, cà phê
23


SVTH: ĐỖ THỊ MAI TRINH
có hàm lượng axit cao (độ pH của một tách cà phê mạnh có pH khoảng 4,5 đến pH 4,8).
Cho nên, thật khó để tìm thấy một loại protein ổn định theo các điều kiện nhiệt độ cao, và
hàm lượng acid cao, chẳng hạn như tìm thấy trong một cốc cà phê. Một loại protein đã
được phát hiện sử dụng trong đồ uống, có tính bền acid, là collagen thủy phân.
Collagen thủy phân được biết không có mùi vị gì đặc trưng, hịa tan được trong nước,
và ổn định trong cả điều kiện pH acid và nhiệt độ cao. Do khơng có mùi vị đặc trưng nên
collagen thủy phân đư ợc thêm vào cà phê hoặc thêm vào các thành phần của cà phê trước
khi pha trong q trình sản xuất mà khơng có b ất kỳ ảnh hưởng nào lên hương vị của đặc
trưng của sản phẩm. Collagen thủy phân (cũng ổn định trong điều kiện mơi trường cà phê
nóng nên khơng bị tách pha trong sản phẩm . Tuy nhiên, collagen không phải là một
protein chứa đầy đủ các thành phần acid amin. Nó thiếu đáng kể các acid amin cần thiết
như tryptophan, tyrosine. Con người không thể sống được nếu chỉ sử dụng collagen như là
nguồn protein duy nhất vì collagen là một loại protein dinh dưỡng nhưng không đầy đủ.
Collagen thủy phân có thể được sử dụng để nâng cao chất lượng dinh dưỡng của cà phê,
nhưng không thể cho rằng cà phê có chứa một lượng protein hồn hảo .
Trong những năm gần đây, đã có những tiến bộ cơng nghệ trong chế biến whey

protein. Bởi vì whey protein biến tính nhiệt một cách dễ dàng và thậm chí sẽ kết tủa trong
sản phẩm thức uống pha sẵn thanh trùng (ready-to-drink beverage – RTD beverage), nước
giải khát, nên chỉ sử dụng tối thiểu trong các đồ uống RTD. Các nhà sản xuất whey protein
thấy rằng sự ổn định nhiệt của whey protein cải thiện đáng kể nếu họ thủy phân whey
protein bang enzyme ở mức độ nhẹ (thường là 2% đến 5% thủy phân liên kết peptide). Các
sản phẩm thủy phân đạt được các mức độ đủ để ngăn chặn sự khơng hịa tan trong nước
của protein, nhưng ở mức độ thủy phân đủ thấp này hương vị của protein không được giữ
nguyên như cũ. Sản phẩm thủy phân protein thường có mùi khó chịu và vị đắng. Sự ra đời
của whey protein thủy phân CË dẫn đến việc sử dụng rộng rãi của whey protein trong sản
phẩm RTD. Các nhà nghiên cứu đã cố gắng nâng cao chất lượng cà phê với các protein
này. Chúng làm việc tốt trong cà phê ở mức độ sử dụng thấp, nhưng vấn đề trở nên phức
tạp ở mức độ sử dụng cao hơn. Ví dụ, nếu thêm 5 gam whey protein (5,8 gam whey
protein isolate hoặc 6,5 g whey protein concentrate 80%) vào 113,4 gam cà phê đậm và
24